CN108181467A - 一种稳定的用于fama法检测的抗原片的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测水痘带状疱疹病毒(VZV)抗体的膜抗原荧光抗体试验(FAMA法)抗原片制备及保存方法，包括将水痘‑带状疱疹病毒株感染2BS细胞，置35℃、5％CO2培养箱培养至病毒复制高峰，经胰蛋白酶消化，进行细胞计数，选择适宜的细胞数量制备病毒细胞悬液，并将悬液滴入12孔载玻片上，经37℃、5％CO2培养箱培养、冷丙酮固定、清洗干燥后，在细胞表面滴加保护液封片、抽真空的过程，该片置2‑8℃冰箱能保存一年以上。

Description

一种稳定的用于FAMA法检测的抗原片的制备方法
技术领域
本发明涉及一种稳定的用于FAMA法检测抗原片的制备方法及其所制备的抗原片。具体涉及一种用水痘带状疱疹病毒感染细胞至细胞病变后，消化制成细胞悬液，滴片、待干燥后，滴加保护液，待干燥后，真空封膜，可在2-8℃长期保存的一种制备方法。
背景技术
FAMA法是目前国际上公认的水痘带状疱疹病毒抗体检测的金标准，具有灵敏度高，特异性强的特点。但是，抗原片的制备和保存却是本实验的决定性的环节。
传统的FAMA法，各实验室均采用水痘带状疱疹病毒Oka株感染二倍体细胞制备抗原片，并且使用传统方法制备的抗原片保存期短，在2-8℃情况下，抗原片病毒很快失活不能与特异性抗体相结合。而一种水痘病毒抗体检测用抗原片的制备方法专利中，利用VZV84-7株感染VERO细胞制备抗原片，可在低温或超低温冰箱存放至1年，但是，一般实验室无法满足该条件，限制了该方法的应用。该方法制备的抗原片在2-8℃情况下保存会很快使病毒细胞片失活，而在实验中大批量、同一批次抗原片的使用，是很困难的，各实验室均采取了用多次制备的抗原片，来检测同一批大批量VZV血清样本，误差较大。直至目前也尚未查到如何延长抗原片的保存及抗原片的制备新方法的文献报道。
发明内容
本发明提供一种利用保护剂提高VZV病毒抗原片稳定性的方法及所获得的抗原片。
在一些可选的方式中，提供一种应用于膜抗原荧光抗体试验(FAMA法)的稳定抗原片制备方法，其是将水痘带状疱疹病毒感染VZV易感细胞后获得的抗原片滴加保护液，干燥后，抽真空密封保存。
在一些可选的实施方式中，所述方法中所述保护液含有2-8％的蔗糖、海藻糖、乳糖、葡聚糖和/或甘露糖中的一种或几种。
在一些可选的实施方式中，所述方法中所述抗原片是经水痘带状疱疹病毒感染VZV易感细胞，置35℃、5％CO2培养箱培养至病毒复制高峰，经胰蛋白酶消化，经细胞计数，选择约2.5～3.5×105/ml细胞数量制备病毒细胞悬液，将细胞悬液滴入12孔载玻片上，经37℃、5％CO2培养箱培养、冷丙酮固定、清洗干燥后制备获得。
在一些可选的实施方式中，所述方法的制备过程是采用水痘-带状疱疹病毒VZVOka株感染2BS细胞制备抗原片。
在一些可选的实施方式中，所述方法的保护液中含有1％-3％的乳糖和2％-4％的海藻糖。
在一些可选的实施方式中，所述方法的保护液中含有1％-3％的乳糖、2％-4％的海藻糖和1％-3％的葡聚糖。
在一些可选的实施方式中，所述方法的保护液中含有2％的乳糖、3％的海藻糖和2％的葡聚糖。
在一些可选的实施方式中，所述方法向样品孔加入上述保护液10-30微升，室温或2-8℃条件下封闭4小时以上。
在一些可选的实施方式中，所述方法配制保护液的缓冲液为pH值为7.0-7.4的PBS或TBS。
本发明还提供利用根据如前所述的方法制备的VZV病毒抗原片。
具体实施方式
以下实施方式进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制，在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明的方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
用FAMA法检测水痘抗体，最关键的技术在于抗原片的制备及该片的保存。长期实验室操作证明，制备高质量的抗原片、保护好该片的细胞完整，试验结果才能准确可靠，试验中的重复性也随之提高。
本发明提供了一种制备抗原片的方法，其制备过程与传统方法相同，但在制片完成后，细胞表面覆盖一层保护液。用此方法制备的抗原片可在2-8℃保存一年甚至更长时间，质量无明显变化。
本发明优选水痘-带状疱疹病毒OKa株感染2BS细胞制备抗原片。经保护液的覆盖，突破了抗原片只能冻存，不能冷藏的保存条件，一次性可大量制备抗原片，在制片的过程中，使病毒细胞处于一个更适宜的条件下，并保持高度的完整性及特异性，制备的抗原片合格率更高，镜检更快捷，并为批量化检测，提供了有利条件。
为实现上述目的，本发明提供的一种FAMA法抗原片的制备过程及保存方法，包括如下步骤：
水痘-带状疱疹病毒OKa株，滴度4.9～5.5lg PFU/ml以0.01～0.05MOI感染生长至单层的2BS细胞，细胞密度约3×105/ml之间。病毒感染液为含1％谷氨酰胺、2％新生牛血清的MEM，用5.6％NaHCO3调pH值至7.5±0.1。将感染后细胞置35℃、5％CO2恒温培养箱培养至病毒复制高峰；经0.25％胰蛋白酶消化后，细胞计数；加入含1％谷氨酰胺5％新生牛血清pH值7.4±0.1的MEM培养液，调节细胞浓度至1.2～1.8×105个/ml，制备细胞悬液。将细胞悬液滴入12孔载玻片中，每孔20～25μl，将载玻片置于湿盒中，放37℃、5％CO2培养箱孵育30分钟后，用冷丙酮室温固定15分钟，取出后，PBS漂洗三次，晾干后，每孔滴入含有6％-10％糖类保护液10-30μl，待自然干燥后，抽真空密封，可2-8℃保存。
实施例1
将以上述方式制备的VZV抗原片细胞的表面每孔滴加30μl含有2％乳糖和3％海藻糖的保护液(溶解糖的溶液为20mmol/l的PBS，pH值7.4)，待干燥，抽真空封片，2-8℃保存备用。
实施例2
将以上述方式制备的VZV抗原片细胞的表面每孔滴加30μl含有2％的乳糖、3％的海藻糖和2％的葡聚糖的保护液(溶解糖的溶液为50mmol/l的PBS，pH值7.0)，待干燥，抽真空封片，2-8℃保存备用。
实施例3
将以上述方式制备的VZV抗原片细胞的表面每孔滴加20μl含有1％乳糖和4％海藻糖保护液(溶解糖的溶液为20mmol/l的PBS，pH值7.4)，待干燥，抽真空封片，2-8℃保存备用。
实施例4
将以上述方式制备的VZV抗原片细胞的表面每孔滴加10μl含有6％蔗糖的保护液(溶解糖的溶液为20mmol/l的PBS，pH值7.2)，待干燥，抽真空封片，2-8℃保存备用。
实施例5
将以上述方式制备的VZV抗原片细胞的表面每孔滴加20μl含有10％蔗糖的保护液(溶解糖的溶液为50mmol/l的PBS，pH值7.4)，待干燥，抽真空封片，2-8℃保存备用。
实施例6
将以上述方式制备的VZV抗原片细胞的表面每孔滴加20μl含有8％海藻糖的保护液(溶解糖的溶液为20mmol/l的PBS，pH值7.0)，待干燥，抽真空封片，2-8℃保存备用。
实施例7
将以上述方式制备的VZV抗原片的细胞表面每孔滴加30μl含有8％乳糖保护液(溶解糖的溶液为50mmol/l的PBS，pH值7.2)，待干燥，抽真空封片，2-8℃保存备用。
实施例8
将以上述方式制备的VZV抗原片的细胞表面每孔滴加30μl含有8％葡聚糖保护液(溶解糖的溶液为20mmol/l的PBS，pH值7.0)，待干燥，抽真空封片，2-8℃保存备用。
比较例1
将上述方式制备的VZV抗原片的细胞片，按常规方法病毒细胞滴入12孔片之后，不加保护液，待干燥，抽真空封片，2-8℃保存备用。
比较例2
将以上述方式制备的VZV抗原片细胞的表面每孔滴加30μl含有6％人白蛋白的保护液(保护液的溶液为50mmol/l的pH值7.4的PBS)，待干燥，抽真空封片，2-8℃保存备用。
比较例3
将以上述方式制备的VZV抗原片细胞的表面每孔滴加30μl含有20％甘油的保护液(溶解糖的溶液为50mmol/l的PBS，pH值7.0)，待干燥，抽真空封片，2-8℃保存备用。
试验结果：
实施例1-8与比较例1-3制备的抗原片倒置显微镜下观察细胞形态，细胞形态大小均匀，饱满者符合下一步实验要求。采用同一批细胞，分别用上述方法保存，按时间点抽取片子，进行统一样本的抗体滴度测定。
不同实施例和比较例保存2-8℃和25℃抗体检测结果。
抗原片保存于4℃测定抗体检测结果
注：使用同一VZV抗体、同一浓度荧光抗体(二抗)测定
不同实施例和比较例保存室温抗体检测结果。
抗原片保存于25℃测定抗体检测结果
注：使用同一VZV抗体、同一浓度荧光抗体(二抗)测定
通过不同实施例获得的抗原片在不同温度保存比较结果来看，向常规VZV抗原片添加保护液后的抗原片能够保持更持久的稳定性。其中较高浓度的含糖保护液的稳定效果更佳。

Claims (10)

1.一种应用于膜抗原荧光抗体试验(FAMA法)的稳定抗原片制备方法，其特征在于，水痘带状疱疹病毒感染VZV易感细胞后制备获得的抗原片滴加保护液，待干燥后，抽真空密封保存。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述保护液中含有2-8％的蔗糖、海藻糖、乳糖、葡聚糖和/或甘露糖中的一种或几种。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，其中所述抗原片是经水痘带状疱疹病毒感染VZV易感细胞，置35℃、5％CO2培养箱培养至病毒复制高峰，经胰蛋白酶消化，经细胞计数，选择约2.5～3.5×105个/ml细胞数量制备病毒细胞悬液，将细胞悬液滴入12孔载玻片上，经37℃、5％CO2培养箱培养、冷丙酮固定、清洗干燥后制备获得。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，其中制备过程是采用水痘-带状疱疹病毒OKa株感染2BS细胞制备抗原片。
5.根据权利要求4所述的保护液，其特征在于，所述保护液中含有1％-3％的乳糖和2％-4％的海藻糖。
6.根据权利要求4所述的保护液，其特征在于，所述保护液中含有1％-3％的乳糖、2％-4％的海藻糖和1％-3％的葡聚糖。
7.根据权利要求6所述的保护液，其特征在于，所述保护液中含有2％的乳糖、3％的海藻糖和2％的葡聚糖。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，每孔加入上述保护液10-30微升，室温或2-8℃条件下封闭4小时以上。
9.根据权利要求2所述的方法，其配制保护液的缓冲液为PBS或TBS。
10.利用根据权利要求1-9任一项所述的方法制备的VZV病毒抗原片。
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