CN1307201C - 一种力达霉素与单克隆抗体3G11、3G11Fab’片段的偶联物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种辅基蛋白N端修饰的LDM与抗Ⅳ型胶原酶单抗3G11和Fab’片段的偶联物及其制备方法和在实体瘤靶向治疗中的应用，通过改变Fab’的生产条件，最终提高了所说偶联物的产率和反应的可重复性，体外实验证明，与游离LDM相比，其抗肿瘤作用有更强的选择性；动物体内试验证明，其比游离的LDM有更强的抗肿瘤作用和更低的毒性，表明所说偶联物更适于规模生产及用于临床实体肿瘤的靶向治疗。

Description

一种力达霉素与单克隆抗体3G11、3G11 Fab’片段的偶联物

技术领域：

本发明涉及一种辅基蛋白修饰的力达霉素与单克隆抗体及其片段的偶联物；本发明还涉及所说偶联物的制备方法及其在纤维肉瘤等肿瘤靶向治疗中的应用。

背景技术：

肿瘤治疗的三种主要手段是手术治疗、化学治疗和放射治疗。由于化疗药物缺乏选择性，其杀死病人肿瘤细胞的同时也杀死正常细胞而导致治疗的失败。应运而生的免疫偶联物，是将针对肿瘤细胞表面特定分子靶点有导向作用的单克隆抗体与化疗药物“弹头”偶联，在体内利用单克隆抗体将化疗药物带到肿瘤部位发挥选择性的杀伤作用。可用作“弹头”的物质还包括放射性核素和毒素。已经有多种单抗和免疫偶联物相继用于临床肿瘤治疗，其中如抗CD33抗体和烯二炔类抗肿瘤抗生素Calicheamicin的免疫偶联物Mylotarg，经美国FDA批准已用于急性髓性白血病的治疗。单克隆抗体药物的研究与开发正在成为生物技术药物领域的新热点。

烯二炔类抗肿瘤抗生素力达霉素(LDM，又称C-1027)，是中国医学科学院医药生物技术研究所利用本单位建立的抗肿瘤药物筛选方法——精原细胞法，经过筛选大量发酵液样品发现的。LDM的产生菌是从我国湖北省潜江县的土壤中分离得到的，定名为Streptomyces globisporus C-1027(已提交“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”保藏，保藏编号为CGMCC No.0704)。LDM分子是由一个发色团(Chromophore)和一个酸性蛋白构成的新化合物。发色团含有一个九元环烯二炔核心结构，分子量为843Da，蛋白部分由110个氨基酸组成，分子量为10500Da。LDM对癌细胞有高效杀伤活性，动物体内实验表明，对小鼠移植性肿瘤和裸鼠移植的人肝癌等肿瘤的生长有显著抑制作用(中国抗生素杂志1994，19<2>：164)。肿瘤的生长和扩散需要大量的细胞膜和细胞外蛋白酶修饰膜整合素，溶解周围基质并从肿瘤细胞表面和周围结构中释放关键性的生长因子。在此过程中有两类主要的蛋白酶系统参与，它们是基质金属蛋白酶类(MMPs)和丝氨酸蛋白酶类，它们的基因和基因产物在多种肿瘤中过度表达，因此这些酶类成为向肿瘤分子运送高效细胞毒分子的极好的靶标。IV型胶原酶又称为明胶酶，是MMPs家族中的重要成员，包括明胶酶A(MMP-2)和明胶酶B(MMP-9)两种，它们可以降解基底膜中作为其它组分构建支架的IV型胶原，从而有利于肿瘤细胞破坏和穿透基底膜，进行侵袭和转移。本发明涉及的单抗3G11(其杂交瘤3G11细胞株已提交“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”保藏，保藏编号为CGMCC No.0831，CN1421460A)，是采用淋巴细胞杂交瘤技术制备的。以IV型胶原酶免疫BALB/c小鼠后，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞融合，经克隆筛选后获得杂交瘤细胞株分泌的抗体。该抗体分子量为150KDa左右，可以与IV型胶原酶结合并中和其活性。本实验室研究发现，用3G11进行免疫组织化学和免疫细胞化学染色，人的纤维肉瘤HT-1080，肺癌A549，结肠癌HT-29，肝癌HepG2呈现不同程度的阳性染色，表明IV型胶原酶在上述肿瘤中有不同程度的表达。

本实验室曾利用抗IV型胶原酶单抗3G11及其Fab’片段与LDM制备免疫偶联物。体内实验证明，所说偶联物在体内比单独使用LDM有更强的抗肿瘤活性，并申请了专利(申请号：02153655.4，公开号：CN 1421460A)。其偶联方法涉及利用LDM辅基蛋白的伯氨基进行偶联，LDM辅基蛋白含有110个氨基酸，其中两个氨基酸含有伯氨基，分别为69位赖氨酸的侧链ε-氨基和N端1位丙氨酸α-氨基，两种伯氨基都可以和小分子交联剂的琥珀酰亚胺基团反应，反应产物可分为三种：辅基蛋白赖氨酸++ε-氨基修饰的LDM，辅基蛋白N端1位丙氨酸α-氨基修饰的LDM，和辅基蛋白两位点均修饰的LDM。接下来修饰后的LDM混合物继续和含有巯基的3G11反应，生成在相应位点偶联的LDM-3G11偶联物和3G11-LDM-3G11偶联物，以及少量以LDM为中介的-3G11-LDM-3G11-……复杂偶联物，或者修饰后的LDM混合物继续和铰链区含有巯基的Fab’反应，生成相应位点偶联的Fab’-LDM偶联物和少量复杂偶联物。这样就造成了产品的不均一性，并且很难对反应进程进行控制，导致降低最终目偶联物的产率。

通常情况下，使用前偶联方法所涉及的Fab’制备方案，其最终Fab’偶联物在总蛋白中的比率都不超过20％，并且在前Fab’的制备方案中使用半胱氨酸和巯基乙醇(不使用二硫苏糖醇)还原F(ab’)₂时，虽然可以最大限度地减少过度还原生成的重链和轻链，生成高产量的Fab’片段，但在这种条件下生成的Fab’片段的巯基基团缺乏马来酰亚胺基团反应活性，从而失去下一步反应的活性，最终也导致目的偶联物产率降低。另外前偶联方法中使用透析方法除去反应混合物中的小分子，会导致脱盐时间过长、透析过程中反应物失去下一步反应的活性。

本发明的目的，在于以合适的方法制备LDM辅基蛋白69位特异的单抗3G11-LDM偶联物和单抗片段Fab’-LDM偶联物，并且将此两种偶联物应用于肿瘤的靶向治疗。

本发明的目的，更具体地讲还在于利用转胺的办法选择性地封闭LDM分子辅基蛋白中N端1位丙氨酸α-氨基，使LDM仅能通过69位赖氨酸ε-氨基和含巯基蛋白进行偶联，以解决产品不均一的缺陷和控制反应过程以及提高目的偶联物的产率。另外，通过优化F(ab’)2还原生成Fab’所使用的还原剂、还原剂的量和还原时间，可以解决Fab’片段巯基基团的马来酰亚胺基团反应活性的问题。

发明内容：

由于赖氨酸ε-氨基和N端1位丙氨酸α-氨基在性质上很相近几乎都是最强的亲核集团，很难选择性地封闭其中的一个。本发明所涉及的转胺方法，以往仅被用于研究蛋白或多肽α-氨基的功能(Dixon，H.B.F.和Moret，V.，Biochem.J，1965)，尚未见有封闭蛋白N端氨基酸用于位点特异的偶联的相关报道。本发明系首次将此转胺反应用于LDM位点特异的偶联。本发明所涉及的转胺机理在于肽链末端丙氨酸α-氨基和赖氨酸ε-氨基碱强度不同，通过使用一个依赖于临近酰胺键参与的反应达到N末端丙氨酸α-氨基的选择性修饰，这个反应就是转胺反应(Transamination)，其反应原理是在金属阳离子为中介的条件下，乙醛酸钠使力达霉素辅基蛋白N末端丙氨酸发生电子转移和化学键重排，分别转变为2-羰基乙酰/丙酮酰结构和氨基乙酸结构，以封闭LDM分子辅基蛋白中N端1位的丙氨酸α-氨基，如结构式(一)所示。

本发明的偶联方案，通过优化反应条件提高了目的偶联物的偶联比率，通常在总蛋白中的比率可以达到50％，并缩短了反应时间。其中所涉及的方法，在其它单克隆抗体Fab’的制备和Fab’免疫偶联物的制备中曾经被采用，但是从未在3G11和Fab’与LDM免疫偶联物的制备中使用过。上述优化条件包括：在3G11-LDM的偶联方案中使用10KDa-30KDa截留分子量的Amicon ultra浓缩离心管和PD-10脱盐柱，代替透析袋进行缓冲液交换和除去过量的小分子及LDM。

结构式(一)

在Fab’-LDM的偶联方案中也使用了3G11-LDM偶联方案中同样的改进方法，而最重要的改进是调整了关键步骤即F(ab’)2还原生成Fab’所使用的还原剂和还原剂的使用量。本发明改变F(ab’)₂还原剂为L-半胱氨酸，改变还原剂的浓度为25-40mM，还原时间调整为15分钟，经凝胶成像仪分析，目的偶联物的产率提高至产物总蛋白的约50％，远远高于原偶联方案20％的产率，并且可重复性好。

本发明是以转胺的方法制备辅基蛋白N端修饰的LDM并且以之为“弹头”药物，分别与单抗3G11及其Fab’片段制成3G11-LDM偶联物和Fab’-LDM偶联物，并观察其在动物体内的抗肿瘤作用。结果显示，与同等剂量的游离LDM相比，3G11-LDM偶联物和Fab’-LDM偶联物的抗肿瘤作用显著增强。因此，3G11-LDM偶联物和Fab’-LDM偶联物有望成为新型抗肿瘤靶向药物。

1.LDM位点特异的单抗3G11-LDM偶联物

1.1本发明所涉及的LDM位点特异的单抗3G11-LDM偶联物为辅基蛋白N端修饰的LDM与抗IV型胶原酶单抗3G11以0.8～1.5∶1的分子比，通过小分子交联剂的中间链进行连接所形成的免疫偶联物。本发明所涉及的偶联物是通过N-琥珀酰亚胺3-(2-吡啶二硫)丙酸酯(SPDP)、N-琥珀酰亚胺6-[3’-(2-吡啶二硫)丙酰胺]己酸酯(LCSPDP)、间-马来酰亚胺基苯甲酸-N-羟基磺酸基琥珀酰亚胺酯(SMBS)、磺酸基琥珀酰亚胺4-(对-马来酰苯基)丁酸酯(SSMPB)等四种交联剂及小分子巯基引入剂2-亚胺基四氢噻吩(2-IT)作为中介与抗IV型胶原酶单抗3G11及其Fab’片段偶联形成。本发明所涉及的3G11-LDM偶联物也可以通过其它小分子交联剂连接形成。对3G11-LDM偶联物进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺还原电泳分析，结果表明，LDM连接位点可能为重链或轻链，根据连接批次的不同总的连接比率为0.8～1.5∶1。

1.2以2-IT和SMBS及SSMPB作为交联剂分子的单抗3G11-LDM偶联物的制备

(1)、LDM的转胺作用：LDM在乙醛酸钠、硫酸镍存在的转胺缓冲液中室温搅拌反应1h。经过脱盐、浓缩离心得到N端1位丙氨酸α-氨基封闭的LDM。

(2)、将上述修饰后的LDM加入二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基亚砜(DMSO)溶解的小分子交联剂SMBS或SSMPB，将两者混合室温反应。PD-10脱盐柱除去未反应的SMBS或SSMPB，浓缩离心后立即用于偶联。

(3)、经辛酸硫酸铵沉淀及Protein G纯化后的单抗3G11经浓缩离心管交换缓冲液为0.16M硼酸缓冲液(pH8.0)，调节浓度为20mg/mL，，加入2-IT于室温下反应20min。经PD-10脱盐柱除去过量的2-IT。经浓缩离心管浓缩离心后立即和(2)混合反应30min。反应后过凝胶Superdex 200柱除去未反应的修饰后的LDM。浓缩离心第一峰洗脱液得到3G11-LDM。

1.3以2-IT和SPDP及LCSPDP作为交联剂分子的单抗3G11-LDM偶联物的制备

与1.2所述的最大区别为：其中的交联剂换作SPDP及LCSPDP，并与LDM室温反应30min。反应缓冲液也随交联剂的不同作相应的改变。

2.LDM位点特异的单抗片段Fab’-LDM偶联物

2.1本发明所涉及的单抗片段Fab’-LDM偶联物为抗IV型胶原酶单抗3G11的Fab’片段与辅基蛋白N端修饰的抗肿瘤抗生素LDM以分子比为1∶1～1.4通过如前所述4种小分子交联剂进行连接所形成的免疫偶联物。SDS-PAGE电泳显示，Fab’-LDM偶联物的分子量约为65KDa和75KDa，与Fab’片段相比恰好增加了一个或两个LDM分子的分子量(11349Da)。

2.2以SMBS及SSMPB作为交联剂分子的单抗3G11 Fab’-LDM偶联物的制备

(1)、LDM的转胺作用和1.2(1)部分相同。

(2)、LDM分子中小分子交联剂的引入和1.2(2)部分相同。

(3)、纯化的单抗3G11在37℃经无花果蛋白酶(0.06U/mg抗体)，切割5h。反应液以Sephadex G-150柱层析纯化，收集F(ab’)₂片段。纯化的F(ab’)₂片段交换缓冲液并调整浓度为10mg/mL，加入50-80mM半胱氨酸，37℃反应15min。PD-10脱盐柱脱盐，立即用于偶联。将(2)和(3)产物混合搅拌室温反应30min，经过Superdex 200凝胶柱层析分离纯化，收集浓缩第一峰得到Fab’-LDM偶联物。

2.3以SPDP及LCSPDP作为交联剂分子的单抗3G11Fab’-LDM偶联物的制备

(1)LDM的转胺作用和1.2(1)部分相同。

(2)LDM分子中小分子交联剂的引入和1.3部分相同。

(3)Fab’片段的生产和2.2(3)部分相同。将(2)、(3)产物混合搅拌室温反应过夜，经过Superdex 200凝胶柱层析分离纯化，收集浓缩第一峰得到Fab’-LDM偶联物。

3.LDM位点特异的3G11-LDM偶联物与单抗片段Fab’-LDM偶联物的免疫活性与抗肿瘤效果

本发明所涉及的单抗3G11进行免疫组织化学和免疫细胞化学染色，人的纤维肉瘤HT-1080，肺癌A549，结肠癌HT-29，肝癌HepG2呈现不同程度的阳性染色，表明IV型胶原酶在上述肿瘤中有不同程度的特异性表达。MTT检测表明，单抗3G11和Fab’及LDM位点特异的免疫偶联物对人的纤维肉瘤HT-1080，肺癌A549，结肠癌HT-29，肝癌HepG2细胞有不同程度的选择性细胞毒作用。动物体内实验证明，LDM位点特异的3G11-LDM偶联物与单抗片段Fab’-LDM偶联物静脉注射给药时，对裸鼠移植人纤维肉瘤HT-1080有显著的治疗效果，其抑瘤率明显高于单独使用LDM组。

发明效果：

本发明利用抗IV型胶原酶单抗3G11及其Fab’片段与纤维肉瘤、肺癌、结肠癌肝癌等恶性肿瘤组织的免疫反应性，与“弹头药物”辅基蛋白修饰的力达霉素分别制成LDM辅基蛋白69位特异的3G11-LDM偶联物和Fab’-LDM偶联物；通过改变Fab’的生产条件，最终提高了偶联物的产率和反应的可重复性；体外实验证明，3G11-LDM偶联物和Fab’-LDM偶联物与游离LDM相比，其抗肿瘤作用有更强的选择性；动物体内试验证明，部分3G11-LDM偶联物和Fab’-LDM偶联物比游离的LDM有更强的抗肿瘤作用和更低的毒性。因此，本发明所涉及的3G11-LDM偶联物和Fab’-LDM偶联物更适于规模生产及用于临床实体肿瘤的靶向治疗。

附图说明：

图1：偶联产物的SDS-PAGE图谱，

其中，泳道1-9：Ab-SMPB-LDM，Ab-SMBS-LD，Ab-LCSPDP-LDM，Ab-SPDP-LDM，低分子量Marker，Fab’-SMPB-LDM，Fab’-SMBS-LDM，Fab’-LCSPDP-LDM，Fab’-SPDP-LDM。

图2：单抗3G11与人纤维肉瘤组织和人肝癌组织的免疫组织化学染色

其中：A为染色过程中一抗用PBS代替的HT-1080纤维肉瘤组织的免疫组化染色；B为用3G11作一抗的HT-1080纤维肉瘤组织的免疫组化染色；C为染色过程中一抗用PBS代替的HepG2肝癌组织的免疫组化染色；D为用3G11作一抗的HepG2肝癌组织的免疫组化染色。

图3：人肺癌细胞和结肠癌细胞的免疫组织化学染色

其中：A为染色过程中一抗用PBS代替的A549肺癌细胞的免疫组化染色；B为用3G11作一抗的A549肺癌细胞的免疫组化染色；C为染色过程中一抗用PBS代替的HT-29结肠癌细胞的免疫组化染色；D为用3G11作一抗的HT-29结肠癌细胞的免疫组化染色。

图4：LDM对纤维肉瘤HT-1080、肺癌A549、结肠癌HT-29和肝癌HepG2细胞增殖的抑制作用(MTT法)，图例为

HT-1080

A549  HT-29

HepG2

图5-8：分别为：Fab’-SPDP-LDM，Fab’-LCSPDP-LDM，Fab’-SMBS-LDM，Fab’-SSMPB-LDM对纤维肉瘤HT-1080、肺癌A549、结肠癌HT-29和肝癌HepG2细胞增殖的抑制作用(MTT法)，图例为

HT-1080 A549  HT-29

HepG2

图9-12：3G11-SPDP-LDM，3G11-LCSPDP-LDM，3G11-SMBS-LDM和3G11-SSMPB-LDM对纤维肉瘤HT-1080、肺癌A549、结肠癌HT-29和肝癌HepG2细胞增殖的抑制作用(MTT法)，图例为 HT-1080 A549

  HT-29 HepG2

图13：3G11免疫偶联物1.6mg/kg对裸小鼠纤维肉瘤HT-1080生长的抑制作用(图13-A)；以及对荷瘤裸小鼠的生命延长作用(图13-B)。

其中：图13-A图例为

Control 3G11

LDM

3G11-SPDP-LDM  3G11-SMBS-LDM

图13-B图例为

Control

3G11  LDM

3G11-SPDP-LDM 3G11-SMBS-LDM

图14：Fab’免疫偶联物0.6mg/kg对裸小鼠纤维肉瘤HT-1080生长的抑制作用(图14-A)；以及对荷瘤裸小鼠的生命延长作用(图14-B)。

其中：图14-A图例为

Control  Fab’

LDM

Fab’-SPDP-LDM Fab’-LCSPDP-LDM

Fab’-SMBS-LDM Fab’-SSMPB-LDM

图14-B图例为

Control Fab’  LDM Fab’-SPDP-LDM

Fab’-LCSPDP-LDM

Fab’-SMBS-LDM

Fab’-SSMPB-LDM

实施方案：

以下所举实施例，对本发明而言只是说明性的而非限制性的。

实施例1：

1.1以2-IT和SMBS及SSMPB作为交联剂分子的单抗3G11-LDM偶联物的制备

反应所使用缓冲液均通氮气充分排除氧气，所有反应均在充氮气的条件下进行。

(1)、LDM的转胺作用：取1.0mg LDM溶解于现配的2M醋酸钠(NaAc)，10mM醋酸(HAc)，0.1～0.2M乙醛酸钠(CHOCOONa)，5mM硫酸镍(NiSO₄)(pH7.0)转胺缓冲液中室温搅拌反应1h。用25mL 20mM磷酸(H₃PO₄)缓冲液(pH7.0)充分平衡的PD-10脱盐柱除去转胺缓冲液，取2.5-6.0mL部分，经5KDa截流分子量Amicon Ultra4浓缩离心管7000rpm 20min浓缩离心至200μL，得到N端1位丙氨酸α-氨基封闭的LDM。

(2)、将上述修饰后的LDM加入10μL二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基亚砜(DMSO)溶解的0.4mg的小分子交联剂SMBS或SSMPB，将两者混合室温反应1h。过经25mL 20mM H₃PO₄，10mM乙二胺四乙酸(EDTA)缓冲液(pH7.0)充分平衡的PD-10脱盐柱除去未反应的SMBS或SSMPB，取2.5-6.0mL部分，经5KDa截流分子量Amicon Ultra4浓缩离心管7000rpm 20min浓缩离心至200μL，立即用于偶联反应。

(3)、经辛酸硫酸铵沉淀及Protein G纯化后的单抗3G11 2mg(12.5nmol)，经截流分子量为3KDa的浓缩离心管Amincon Ultra 4中加入0.16 M硼酸缓冲液(pH8.0)离心3次，以交换缓冲液并调节浓度为20mg/mL，2-IT用0.16 M硼酸缓冲液(pH8.0)配制成1mg/mL，取8.6μL(62.5nmol)稀释成100μL缓慢加入匀速搅拌的抗体溶液中(本反应中所涉及的缓冲液均充氮气排出氧气，反应均在充氮气的条件下进行)，于室温下反应20min。经预先用25mL 20mM H₃PO₄10mMEDTA缓冲液(pH7.0)充分平衡的PD-10脱盐柱除去过量的2-IT(取2.5-6.0mL部分)。经截流分子量为3KDa的浓缩离心管Amincon Ultra 47000rpm 20min浓缩离心至200μL。立即和(2)混合反应30min。反应后过凝胶Superdex 200柱除去未反应的修饰后的LDM。浓缩离心第一峰洗脱液得到3G11-LDM。

1.2以2-IT和SPDP及LCSPDP作为交联剂分子的单抗3G11-LDM偶联物的制备：

(1)、LDM的转胺作用与1.1的不同点是，PD-10柱平衡及洗脱缓冲液为20mMH₃PO₄，150mM NaCl(pH7.5)。

(2)、与1.1不同的是，其中的交联剂换作用40μL DMF或DMSO溶解的0.4mgSPDP及LCSPDP，与LDM室温反应30min。PD-10柱平衡及洗脱缓冲液为20mMH₃PO₄，150mM NaCl，1mM EDTA(pH7.5)。

1.3以SMBS及SSMPB作为交联剂分子的单抗3G11 Fab’-LDM偶联物的制备

(1)、LDM的转胺作用和1.1(1)部分相同。

(2)、LDM分子中小分子交联剂的引入和1.1(2)部分相同。

(3)、纯化的单抗3G11用0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(含浓度为2mmol/L的EDTA)(pH7.4)离心浓缩交换缓冲液，以相同的缓冲液调整其浓度为5mg/mL。37℃预温30min，加入预先用相同缓冲液溶解并在37℃预温30min的无花果蛋白酶(0.06U/mg抗体)，并加入1/9体积浓度为10mmol/L的半胱氨酸激活反应，置37℃缓慢搅拌反应5h，然后加入1/10体积的NEM终止反应。反应液以SephadexG-150柱层析纯化，收集F(ab’)₂片段。纯化的F(ab’)₂片段1mg使用20mM H₃PO₄，10mM EDTA(pH7.0)缓冲液超滤浓缩3次交换缓冲液，并调整浓度为10mg/mL，37℃预温10min，加入37℃预温并用相同缓冲液溶解的等体积的50-80mM半胱氨酸，37℃反应15min。立即用20mL 20mM H₃PO₄，10mM EDTA(pH7.0)缓冲液充分平衡的PD-10脱盐柱脱盐，取2.5-6.0mL部分立即直接用于偶联。将(2)和(3)产物混合搅拌室温反应30min，经过Superdex 200凝胶柱层析分离纯化，收集浓缩第一峰得到Fab’-LDM偶联物。

1.4以SPDP及LCSPDP作为交联剂分子的单抗3G11 Fab’-LDM偶联物的制备

(1)LDM的转胺作用和1.1(1)部分相同。

(2)LDM分子中小分子交联剂的引入和1.1(2)部分相同。

(3)Fab’片段的生产和1.3(3)部分基本相同，所不同的是还原用的缓冲液为20mM H₃PO₄，150mM NaCl，1mM EDTA(pH7.5)。将(2)、(3)产物混合搅拌室温反应过夜，经过Superdex 200凝胶柱层析分离纯化，收集浓缩第一峰得到Fab’-LDM偶联物。

实施例2：

单抗3G11-LDM偶联物与单抗片段Fab’-LDM偶联物的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，以凝胶成像系统分析各条带在总蛋白中的含量，并鉴别偶联物产率和偶联物连接比率(图1)(表1，2)，结果表明，3G11-LDM偶联物和Fab’-LDM偶联物的产率可以达到70％左右。3G11-LDM偶联物中LDM和3G11的比例在1∶1左右，Fab’-LDM偶联物中LDM和Fab’的比例为1∶1或1∶2。

表1 3G11-LDM偶联物的原料投入和产出比较。

偶联物组别	投入LDM/3G11(M/M)	投入2-IT/3G11(M/M)	偶联物中LDM/3G11	偶联物中3G11收率(％)
					3G11-SPDP-LDM3G11-LCSPDP-LDM3G11-SMBS-LDM3G11-SSMPB-LDM	7777	5555	1.11±0.180.96±0.191.17±0.141.32±0.25	70.8±4.775.9±7.371.3±5.168.5±7.8

表2 Fab’-LDM偶联物的原料投入和产出比较。

偶联物组别	投入LDM/Fab’(M/M)	偶联物中LDM/Fab’	偶联物中Fab’收率(％)	偶联物收率(％)
					Fab’-SPDP-LDMFab’-LCSPDP-LDMFab’-SMBS-LDMFab’-SSMPB-LDM	4.84.84.84.8	111或21或2	67.3±6.465.5±7.774.9±8.363.5±6.8	50.4±3.347.1±4.149.6±3.249.3±4.5

实施例3：

单抗3G11在不同裸鼠移植人纤维肉瘤HT-1080，肝癌HepG2组织的免疫组织化学染色

石蜡切片常规脱蜡至水，3％H₂O₂灭活内源性酶，浸入0.01M柠檬酸缓冲液(pH6.0)微波抗原修复，一抗为单抗3G11，室温孵育1h，链霉卵白素-生物素-酶联复合物(SABC)方法进行染色，以DAB试剂盒室温显色约30s至5min，常规苏木素轻度复染，脱水透明封片。实验中的组织切片均设有空白对照(以PBS代替3G11)，染色结果为阳性证明单抗3G11与肿瘤组织的免疫组织化学染色具有特异性(图2)。

单抗3G11对肺癌A549，结肠癌HT-29细胞的免疫组化染色  培养细胞贴片生长，10％福尔马林固定10-30min。蒸馏水洗。30％H₂O₂1份+甲醇50份混合，室温浸泡30min，以灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水洗3次，以下的染色步骤和组织切片染色步骤相同。实验中的细胞片均设有空白对照(以PBS代替3G11)，染色结果为阳性证明单抗3G11与肿瘤细胞的免疫组织化学染色具有特异性(图3)。

实施例4：

用四氮唑蓝(MTT)法测定LDM位点特异的3G11-LDM偶联物或Fab’-LDM偶联物对肿瘤细胞的杀伤作用肿瘤细胞以含10％小牛血清的RPMI1640培养液体外培养三代后使用。取对数生长期肿瘤细胞按2000/100μl/#加于96孔培养板中。37℃含5％CO₂的孵箱中培养24h之后，用无血清RPMI1640稀释药物，并将药物加入培养板100μl/#，每个浓度加三个孔，设无药对照和无细胞对照。37℃含5％CO2的孵箱中培养48-72h。加MTT(无血清RPMI1640稀释2mg/ml)50μl/#，37℃含5％CO₂的孵箱中培养4h，轻轻吸去培养液。加入150μl/#DMSO振摇15min，测550/560nm吸光值。计算细胞存活率％＝(加药组-无细胞对照组)/(无药对照-无细胞对照)×100％(图4-12)。

实施例5：

3G11-LDM及Fab’-LDM偶联物静脉注射对裸鼠移植人纤维肉瘤HT-1080的疗效

取裸鼠皮下传代的人纤维肉瘤HT-1080新鲜鱼肉状肿瘤组织无菌条件下修剪成2mm×2mm大小，以穿刺针无菌条件下种于裸鼠右侧腋窝皮下。接种后24h和8天各给药一次，对照组相应给予生理盐水。实验第3天开始测量各组动物的瘤径，并按照肿瘤体积计算抑瘤率。结果表明(图13，14；表3，4)，3G11-LDM及Fab’-LDM偶联物的抑瘤效果显著，并且3G11-LDM及Fab’-LDM治疗组的荷瘤裸鼠的存活时间显著长于游离力达霉素组。

表3 3G11免疫偶联物对裸小鼠移植性纤维肉瘤HT-1080的生长抑制作用

表4 Fab’免疫偶联物对裸小鼠移植性纤维肉瘤HT-1080的生长抑制作用

Claims (5)

1、一种力达霉素与单克隆抗体3G11或3G11 Fab’片段的免疫偶联物，其特征在于所说偶联物是由辅基蛋白N端第1位丙氨酸的α-氨基转变为α-酮基的力达霉素，通过其辅基蛋白69-位赖氨酸的ε-氨基和3G11或3G11 Fab’片段经小分子交联剂连接形成的，LDM和单抗3G11的分子比为0.8-1.5∶1，LDM和Fab’的分子比为1∶1或1∶2。

2、一种制备如权利要求1所述免疫偶联物的方法，其特征在于辅基蛋白N端修饰的力达霉素仅利用辅基蛋白69位赖氨酸的伯胺基，以SPDP、LCSPDP、SMBS、SSMPB四种交联剂及小分子巯基引入剂2-IT作为中介，与抗IV型胶原酶单抗3G11及其Fab’片段偶联形成。

3、如权利要求2所述免疫偶联物的制备方法，其特征在于利用乙醛酸钠在金属阳离子为中介的条件下，使力达霉素辅基蛋白N端1位丙氨酸发生电子转移和化学键重排，转变为2-羰基乙酰/丙酮酰结构，以封闭LDM分子辅基蛋白中的N端1位丙氨酸α-氨基。

4、如权利要求2所述免疫偶联物的制备方法，其特征在于将抗IV型胶原酶单抗3G11的F(ab’)₂经25-40mML-半胱氨酸，在37℃还原15分钟，即得到铰链区含有巯基的Fab’片段。

5、如权利要求1所述免疫偶联物3G11-LDM或Fab’-LDM在制备抗实体瘤靶向治疗药物中的应用。

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