CN1421460A

CN1421460A - 力达霉素与单克隆抗体及其Fab'片段的偶联物以及在结肠癌等肿瘤靶向治疗中的应用

Info

Publication number: CN1421460A
Application number: CN 02153655
Authority: CN
Inventors: 甄永苏; 王风强; 李亮; 刘秀均; 尚伯杨; 戴垚
Original assignee: Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS
Current assignee: Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS
Priority date: 2002-12-03
Filing date: 2002-12-03
Publication date: 2003-06-04
Anticipated expiration: 2022-12-03
Also published as: CN1240721C

Abstract

本发明涉及力达霉素与单克隆抗体及其Fab’片段的偶联物以及在结肠癌等肿瘤靶向治疗中的应用，抗IV型胶原酶单抗3G11及其Fab’片段，以2－亚胺基四氢噻吩(2－IT)和N－羟基琥珀酰亚胺基－间－(N－马来酰亚胺基)苯甲酸酯(MBS)或其它交联剂分子作为中介体，分别与力达霉素(LDM)偶联，获得了单抗3G11－LDM偶联物和Fab’－LDM偶联物，以单抗3G11对人的结肠癌、肺癌、食管癌、胃癌和乳腺癌恶性肿瘤进行免疫组织化学染色，显示IV型胶原酶在上述消化道肿瘤中的表达和活性增加，间接ELISA方法测定单抗3G11及其Fab’片段与人结肠癌HT－29、肺癌PG、鳞癌KB、鼠结肠癌26(C26)和肝癌22(H22)均有较强的免疫结合能力，单抗3G11对移植于裸鼠的人FG肺癌可产生清晰的免疫显像，体内实验用于治疗小鼠结肠癌与肝癌，单抗3G11－LDM偶联物和Fab’－LDM偶联物均显示出比同等剂量的游离LDM更强的肿瘤生长抑制作用，因此，3G11－LDM偶联物和Fab’－LDM偶联物可能用于结肠癌等恶性肿瘤的靶向治疗。

Description

力达霉素与单克隆抗体及其Fab’片段的偶联物以及在结肠癌等肿瘤靶向治疗中的应用

技术领域：

本发明涉及一种由力达霉素与单克隆抗体及其片段组成的免疫偶联物以及制备方法和在结肠癌等肿瘤靶向治疗中的应用。

背景技术：

单克隆抗体(单抗)对相应的抗原具有高度特异性。可以针对特定的分子靶点，制备与之特异性结合的单抗。因此，单抗在肿瘤的靶向治疗中有巨大的潜力与应用前景。单抗治疗剂或称单抗药物一般包括两类，一是抗肿瘤单抗；二是抗肿瘤单抗偶联物或称免疫偶联物。免疫偶联物分子由单抗与“弹头”药物两部分构成。单抗所针对的分子靶点通常为肿瘤细胞表面的肿瘤相关抗原或特定的受体。可用作“弹头”的物质主要有三类，即放射性核素、药物及毒素，与单抗连接分别构成放射免疫偶联物、化学免疫偶联物和免疫毒素。自1997年以来，Rituxan、Herceptin和Mylotarg在美国相继获批准应用于临床肿瘤治疗，单抗药物的研究与开发显示出新的发展势头，成为生物技术药物领域的新热点。

研制单抗靶向药物需要有明确的、与肿瘤治疗高度相关的分子靶点。在此基础上要考虑单抗药物的人源化、小型化和高效化。人源化是指对抗体分子特别是其Fc片段进行改造，以降低在人体使用时产生的人抗鼠抗体反应(HAMA)。小型化是使用抗体的片段(Fab、Fab’或scFv)与“弹头”物质构建偶联物。小型化的单抗药物较易通过毛细血管内皮层和肿瘤细胞外间隙，可能到达实体瘤深部；而由于除去了Fc片段，小型化的单抗药物还可降低HAMA反应。高效化是构建对肿瘤细胞有极强杀伤力的单抗药物。由于使用小剂量和短疗程即可显示疗效，高效化单抗药物也可能降低HAMA反应。完整的单抗分子含有Fc片段，有利于调动机体免疫系统攻击肿瘤细胞的效应功能；如果利用完整的单抗分子与高效“弹头”药物构建高效化的偶联物，有可能既降低HAMA反应又能保留Fc片段的效应功能。因此，研制以完整单抗为基础的免疫偶联物在肿瘤靶向治疗中仍具有重要意义。

力达霉素(LDM，又名C-1027)是中国医学科学院医药生物技术研究所利用本单位建立的抗肿瘤药物筛选方法—精原细胞法，经过筛选大量的发酵液样品发现的。LDM的产生菌是从我国湖北省潜江县的土壤中分离得到的，定名为Streptomyces globisporus C-1027(此前已提交“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”保藏，保藏编号为CGMCC No.0704)。LDM分子是由一个发色团(Chromophore)和一个酸性蛋白构成的新化合物。发色团含有一个九元环烯二炔核心结构，分子量为843Da，蛋白部分由110个氨基酸组成，分子量为10506Da。LDM对癌细胞有强烈的杀伤活性，动物体内试验表明，对小鼠移植性肿瘤和在裸鼠移植的人肝癌等肿瘤的生长有显著抑制作用(中国抗生素杂志1994，19<2>：164)。以LDM为“弹头”药物分别与抗肝癌单抗3A5的Fab片段(药学学报1993，28<4>：260-265)或Fab’片段(中国医学科学院学报2001，23<6>)：563)构成的偶联物在动物试验显示较强的抗肿瘤作用。关于LDM与完整单抗构建的偶联物，至今尚无报道。以上报道的3A5是以BEL-7402肝癌细胞免疫大鼠并经杂交瘤技术制备的大鼠单抗，与本发明以IV型胶原酶为抗原制备的小鼠单抗3(11完全不同。

基质金属蛋白酶(MMPs)与恶性肿瘤的生长、侵袭、转移存在着密切的关系。癌细胞或其邻近的间质细胞通过分泌多种基质金属蛋白酶来降解基底膜和细胞外基质组分，从而有利于肿瘤的侵袭和转移过程。研究表明，MMPs的表达及活性的高低与肿瘤的恶性程度相关，而且MMPs在肿瘤的血管生成中也有重要影响。因此，MMPs成为引人注目的肿瘤治疗的分子靶点。IV型胶原酶，又称为明胶酶，包括MMP-2和MMP-9两个组分，是MMPs家族中的重要成员，它可以降解基底膜中作为其它组分构建支架的IV型胶原，从而有利于肿瘤细胞破坏和穿透基底膜，进行侵袭和转移。据报道，抑制IV型胶原酶或其它MMPs的分泌及其活性的小分子药物在体内具有抑制肿瘤生长和转移的作用(J Natl Cancer Inst 2001，93：178)。本发明人实验室曾利用IV型胶原酶单抗3D6与平阳霉素制成偶联物，并在动物体内试验证明偶联物比平阳霉素有更强的抑瘤作用(中国抗生素杂志2002，27<8>：496)。利用IV型胶原酶单抗与高效“弹头”药物力达霉素制成偶联物，至今尚无报道。

本发明涉及的单抗3G11(其杂交瘤3G11细胞株已提交“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”保藏，保藏编号为CGMCC No.0831)，是采用淋巴细胞杂交瘤技术制备的。以IV型胶原酶免疫BALB/c小鼠后，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞融合，经克隆筛选后所获得的杂交瘤细胞株分泌的抗体。该抗体分子量为150kDa左右，可以与IV型胶原酶特异性结合并中和其活性，本实验室研究发现，用抗IV型胶原酶单抗3G11进行免疫组织化学染色，人的肺癌、结肠癌、食管癌、胃癌和乳腺癌等肿瘤组织染色结果呈阳性。对人结肠癌组织及其邻近正常组织进行比较观察时发现，正常组织包括肠腺细胞与间质细胞与单抗3G11的免疫组织化学染色为阴性，而结肠癌组织则呈现不同程度的阳性染色，表明IV型胶原酶在结肠癌细胞呈特异性表达。经ELISA检测表明，单抗3G11与人肺癌PG细胞、人结肠癌HT-29细胞、小鼠肝癌H22细胞和小鼠结肠癌C26细胞呈阳性反应。在裸鼠移植的人肺癌PG肿瘤模型，用¹³¹碘标记的单抗3G11静脉注射可见清晰的肿瘤显像。最近研究还表明，LDM对移植于裸鼠的人肺癌PG肿瘤的生长有明显抑制作用。本发明是以抗肿瘤抗生素力达霉素(LDM)作为弹头药物，分别与单抗3G11及其Fab’片段制成3G11-LDM偶联物和Fab’-LDM偶联物，并观察了其在动物体内试验的抗肿瘤作用。结果显示，与同等剂量的游离LDM相比，3G11-LDM偶联物和Fab’-LDM偶联物的抗肿瘤作用显著增强。因此，3G11-LDM偶联物和Fab’-LDM偶联物有可能成为治疗肿瘤的新型抗肿瘤靶向药物。

本发明的目的是以合适的方法制备单抗3G11-LDM偶联物和单抗片段Fab’-LDM偶联物，并将此偶联物应用于肿瘤的治疗。

发明内容：

1.单抗3G11-LDM偶联物

1.1本发明所涉及的单抗3G11-LDM偶联物为抗IV型胶原酶单抗3G11的完整抗体分子与抗肿瘤抗生素LDM以1∶1的分子比，通过小分子交联剂进行连接所形成的化学免疫偶联物。其中的一种偶联物分子结构是通过连接分子2-亚氨基四氢噻吩(2-IT)和N-羟基琥珀酰亚胺基-间-(N-马来酰亚胺基)苯甲酸酯(MBS)等进行连接形成的；本发明所涉及的3G11-LDM偶联物的另一种分子结构可以是通过连接分子如N-羟基琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫基)-丙酸酯(SPDP)等进行连接所形成的化学免疫偶联物。3G11-LDM偶联物经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定，分子量在160kDa左右。其中单抗3G11的分子量为150kDa左右，LDM的分子量为11349Da，3G11-LDM偶联物的分子量相当于两者之和，说明偶联物中单抗3G11和LDM的分子比为1∶1。

1.2以2-IT和MBS作为交联分子的单抗3G11-LDM偶联物的制备利用抗IV型胶原酶单抗3G11作为携带抗肿瘤药物的导向载体：(1)经辛酸硫酸铵沉淀及羟基磷灰石柱纯化后的单抗3G11，置截留分子量为10kDa的透析袋中，用0.05M硼酸缓冲液(pH8.0)进行透析，调节其浓度为5mg/ml。取溶于0.05M硼酸缓冲液(pH8.0)浓度为4mg/ml的2-IT溶液10μl加入上述5mg/ml的3G11溶液中，在充氮气的条件下于室温反应40min。反应结束后，置截留分子量为30kDa的离心浓缩管中，以0.05M磷酸盐缓冲液(PB)(pH6.8)进行缓冲液交换，并离心除去未反应的2-IT。(2)取力达霉素溶解于0.05M PB(pH6.8)中配成5mg/ml的浓度，搅拌下加入溶于二甲基甲酰胺的浓度为10mg/ml的MBS，室温反应40min。反应结束后，置截留分子量为10kDa的透析袋中，以0.05MPB(pH6.8)充分透析16h。透析完毕后立即与经2-IT修饰的单抗3G11进行偶联反应，室温反应6h或过夜。反应液置截留分子量为30kDa的超滤离心浓缩管中，离心超滤3-4次，去除未反应的MBS修饰的力达霉素，得到3G11-LDM的偶联物。

1.3以SPDP或长链的N-羟基琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫基)-丙酶酯(LC-SPDP)作为交联分子的3G11-LDM偶联物的制备：(1)取LDM 2mg溶于磷酸盐缓冲液(PBS)(pH7.4)中，配成4mg/ml的浓度，然后加入摩尔数为10倍过量的SPDP或LC-SPDP(15mg/ml，溶于二甲基甲酰胺中)，室温反应30min。反应结束后置浓度为0.1mol/L醋酸缓冲液(pH4.5)中充分透析。取透析内液，加入二巯基苏糖醇(DTT)至终浓度为10mmol/L，室温反应30min，然后置PBS中充分透析。(2)另取单抗3G11 2mg溶于0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.8)中，加入摩尔数为10倍过量的SPDP或LC-SPDP，室温反应30min，于PBS液中充分透析。(3)合并(1)和(2)中的透析内液，室温反应过夜。然后经SephadexG-75柱分离，收集第一峰，得到3G11-LDM的偶联物。

2.单抗片段Fab’-LDM偶联物

2.1本发明所涉及的单抗片段Fab’-LDM偶联物为抗IV型胶原酶单抗3G11的Fab’片段与抗肿瘤抗生素LDM以1∶1的分子比，通过小分子的交联剂进行连接所形成的化学免疫偶联物。单抗3G11的Fab’片段通过其分子铰链区的巯基与经过异型双功能交联剂MBS修饰的LDM偶联，可以得到Fab’-LDM偶联物。SDS-PAGE电泳结果显示，Fab’-LDM偶联物的分子量约为65000Da，与Fab’片段相比恰好增加了一个LDM分子的分子量(11345Da)，推测偶联物中Fab’与LDM的分子比为1∶1。

2.2单抗3G11 Fab’片段的制备纯化的单抗3G11用0.05mol/LTris·HCl缓冲液(含浓度为2mmol/L的EDTA)(pH7.4)充分透析，以相同缓冲液调整其浓度为4mg/ml。37℃预温30min后，加入预先用相同缓冲液溶解并在37℃预温30min的无花果蛋白酶(0.06U/mg抗体)，并加入1/9体积浓度为10mmol/L的半胱氨酸激活反应，置37℃缓慢搅拌反应5h。然后，以1/10体积浓度为100mmol/L的NEM终止反应。反应液以Sephadex G-150柱层析纯化，收集F(ab’)₂片段。纯化的F(ab’)₂片段以0.1mol/L Tris·HCl缓冲液(含10mmol/L EDTA)(pH7.5)透析，并经超滤浓缩成6～10mg/ml。然后以10～15mmol/L的β-巯基乙醇37℃还原1h或10mmol/L半胱氨酸37℃还原2h，还原产物以0.05mol/L磷酸缓冲液(PB)(pH6.8)在充氮气的条件下，充分透析得到Fab’片段，立即用于与力达霉素交联。

2.3单抗片段Fab’-LDM偶联物的制备力达霉素20mg以0.05mol/L PB(pH6.8)溶解，配制成5mg/ml的浓度，然后加入摩尔数为10倍过量的MBS，室温避光反应40min，反应液置截留分子量为10kDa的透析袋中，于0.05mol/LPB(pH6.8)中充分透析16h，除去过量的MBS。透析完毕，立即与巯基化的Fab’片段混合，避光条件下室温反应过夜，以NEM终止反应。反应液置截留分子量为30kDa的超滤离心浓缩管中，离心超滤3-4次，去除未反应的MBS修饰的LDM，得到单抗片段Fab’-LDM偶联物。

3.单抗3G11-LDM偶联物与单抗片段Fab’-LDM偶联物的免疫活性与抗肿瘤效果

本发明所说的单抗3G11在不同人体肿瘤组织的免疫组织化学染色实验结果显示，结肠癌、肺癌、乳腺癌、食管癌、胃癌等恶性肿瘤组织对单抗3G11呈现阳性染色，而在结肠癌周围的正常组织为阴性染色，说明IV型胶原酶在多种恶性肿瘤组织中的表达具有特异性。ELISA检测表明，单抗3G11及其Fab’片段对结肠癌、肺癌、肝癌细胞显示免疫反应性。实验证明，本发明所说的单抗3G11-LDM偶联物和单抗片段Fab’-LDM偶联物保留了与IV型胶原酶和上述各种肿瘤细胞的结合能力。本发明所说的3G11-LDM偶联物和Fab’-LDM偶联物对肿瘤细胞的杀伤作用实验显示，偶联物比单独使用LDM对肿瘤细胞的细胞毒性更强，且与偶联物的浓度成依赖关系。动物体内试验证明，本发明所说的3G11-LDM偶联物和Fab’-LDM偶联物静脉注射给药时，对小鼠肝癌、结肠癌有显著的治疗效果，其抑瘤率明显高于单独使用LDM。

以下所举3G11-LDM偶联物的抗肿瘤活性的实施例，对本发明而言只是说明性的，而非限制性的。实施例1：

单抗3G11在不同人肿瘤组织的免疫组织化学染色石蜡切片常规脱蜡入水，3％H₂O₂灭活内源性过氧化酶，浸入0.01M枸橼酸缓冲液(pH6.0)微波抗原修复，I抗为单抗3G11，室温孵育1小时，采用链霉卵白素—生物素—酶联复合物(SABC)方法进行染色，再以DAB试剂盒室温显色约30秒至5分钟，常规苏木素轻度复染，脱水透明封片。

染色结果观察判断标准为：IV型胶原酶染色为细胞胞浆着色，胞浆内有棕黄色深染颗粒为阳性细胞。采用半定量法分析，人工分级标准以细胞染色深浅程度分为0：阴性(-)、1：弱阳性(+)、2：阳性(++)、3：强阳性(+++)、4：极强阳性(++++)。

图像定量分析染色切片经显微摄像扫描存入计算机内，并以LEICAQ500IW型图像分析系统进行定量分析。每张切片分别选取20个视野，自动检测并计算出每一视野中的平均阳性细胞百分率、阳性面积百分率及阳性染色强度＝255-平均灰度值(灰度值范围在0-255之间，0代表最黑处，255代表最亮处)。

单抗3G11在对人体大肠癌、肺癌、乳腺癌、食管癌、胃癌、肾癌等恶性肿瘤组织显示较高的阳性反应率(表1)(图1，图2)。实验中的组织切片均设有空白对照(以PBS替代单抗3G11)、阴性对照(以无关的单抗F9替代单抗3G11)，染色结果均为阴性。证明单抗3G11与肿瘤的免疫组织化学染色具有特异性。

表1单抗3G11在不同人体肿瘤组织中的免疫组织化学染色

肿瘤样本阳性染色例数阴性染色例数染色阳性率(％)

大肠癌 30 8 78.9(30/38)

胃癌 7 5 58.3(7/12)

食管癌 4 2 66.7(4/6)

乳腺癌 7 9 43.8(7/16)

肺癌 2 0 (2/2)

肾癌 3 0 (3/3)

膀胱癌 0 3 (0/3)

另外，观察5例结肠癌及其邻近正常组织的免疫组织化学染色，正常组织(包括肠腺细胞和间质细胞的染色为阴性，而癌细胞则显示不同程度的阳性染色(表2)。在细胞内棕色深染颗粒位于腺体样排列的肿瘤细胞的顶端，个别病例见于周围间质内(图3)。结果显示了IV型胶原酶在结肠癌组织中表达的特异性。

表2单抗3G11在结肠癌及其邻近正常组织的免疫组织化学染色

病例序号癌细胞染色情况邻近正常腺体细胞

染色情况

1 ++++ -

2 +++ -

3 + -

4 ++++ -

5 ++ -实施例2：

单抗3G11与肿瘤细胞的免疫反应性以ELISA方法进行检测，单抗3G11与人肺癌PG细胞、人结肠癌HT-29细胞、人口腔鳞癌KB细胞、小鼠肝癌H22细胞一以及小鼠结肠癌26细胞呈现良好的免疫结合活性(图4)。在裸鼠腋窝皮下接种人肺癌PG肿瘤组织小块(直径约1mm)，待肿瘤生长至直径约1cm时，静脉注射采用Iodogen法标记的单抗3G11(¹³¹I-3G11，约200μCi)，于不同时间点进行免疫显像。结果可见，在PG肺癌的部位有清晰的显像(图5)。实施例3：

用ELISA进行检测，单抗3G11与LDM连接后的偶联物3G11-LDM保留了与各种肿瘤细胞结合的能力(图6)。

用四氮唑蓝(MTT)法测定，3G11-LDM偶联物或Fab’-LDM偶联物显示对肿瘤细胞更强的杀伤作用(图7，图8)。3G11-LDM偶联物及游离LDM对体外培养的肝癌H22细胞的IC50(50％抑制浓度)分别为5.1×10^-12mol/L和6.2×10^-11mol/L。Fab’-LDM偶联物的IC50为9.3×10^-12mol/L，游离LDM的IC50为2.5×10^-11mol/L，Fab’-LDM偶联物对H22细胞的增殖抑制作用强于游离LDM，两者IC50之比为2.7。实施例4：

3G11-LDM偶联物静脉注射对小鼠结肠癌C26的疗效取动物皮下传代的小鼠结肠癌C26瘤组织，以生理盐水按1∶3的比例稀释制成悬液，按0.2ml/只接种于BALB/c小鼠腋窝皮下。接种72小时后静脉注射给药，共给药一次。对照组给予生理盐水。实验第10天测量各组动物的肿瘤体积，并按肿瘤体积计算抑瘤率。结果表明(表3)，3G11-LDM偶联物0.025mg/kg，0.05mg/kg和0.10mg/kg剂量的抑瘤率分别为54.5％，70.3％和81.2％；而游离LDM剂量0.05mg/kg的抑瘤率为56.4％，单抗3G11剂量0.75mg/kg的抑瘤率为25.7％，偶联物与单抗混合组(3G11+LDM)的抑瘤率为38.6％。3G11-LDM偶联物的抑瘤率显著高于等剂量的游离LDM。

表3 3G11-LDM偶联物与游离LDM对小鼠移植性结肠癌C26的生长抑制作用

药物	剂量(mg/kg)	动物数	体重(g)	瘤重(mg)	抑瘤率(％)
		动物数	体重(g)	瘤重(mg)		开始/结束	开始/结束	Xaver±SD
		对照3G11LDM3G11+LDM3G11-LDM3G11-LDM3G11-LDM	0.750.050.75+0.050.0250.050.10	10/1010/1010/1010/1010/1010/1010/10		开始/结束	开始/结束	Xaver±SD	18.4/18.218.0/17.918.1/18.318.5/18.118.2/17.918.1/16.418.6/16.3	1.01±0.190.75±0.200.44±0.160.62±0.130.46±0.090.30±0.060.20±0.06	25.756.438.654.570.381.2*

皮下接种肿瘤，第3天静脉注射给药一次；

*P＜0.01与对照组比较，**P＜0.01与力达霉素组比较实施例5：

3G11-LDM偶联物静脉注射对小鼠肝癌H22的疗效实验用体重为18-22g的昆明种雌性小鼠120只，随机分组，每组10只。取小鼠肝癌H22腹水，以生理盐水稀释制成细胞数为7.5×10⁶/ml的悬液，按0.2ml/只接种于小鼠腋窝皮下。接种肿瘤24h后静脉给药，一周后再给药一次，共2次。对照组静脉注射生理盐水0.2ml/只。实验期间，每3～4天测量一次肿瘤的长径a和与之垂直的短径b，并记录动物体重和动物死亡情况。按公式V＝1/2ab²计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线，并计算抑瘤率。观察偶联物不同给药方案对小鼠移植性肝癌的治疗作用。结果显示(图9)，3G11-LDM偶联物0.025mg/kg、0.05mg/kg和0.1mg/kg三个剂量均能显著地抑制小鼠移植性肝癌H22的生长，3G11-LDM偶联物比游离LDM显示更强的肿瘤生长抑制作用。按肿瘤体积进行比较，实验第11天，0.025mg/kg、0.05mg/kg和0.1mg/kg剂量的3G11-LDM偶联物的抑瘤率分别为66.3％，87.8％和97.2％；而0.05mg/kg剂量的游离LDM的抑瘤率为67.1％。3G11-LDM偶联物0.05mg/kg剂量与同等剂量的游离LDM相比较，抑瘤作用显著增强(P＜0.05)。实施例6：

Fab’-LDM偶联物静脉注射对小鼠肝癌H22的疗效实验用体重为18-22g的昆明种雌性小鼠120只，随机分组，每组10只。取小鼠肝癌H22腹水，以生理盐水稀释制成细胞数为7.5×10⁶/ml的悬液，按0.2ml/只接种于小鼠腋窝皮下。接种肿瘤24h后静脉给药，一周后再给药一次，共2次。对照组静脉注射生理盐水0.2ml/只。实验期间，每3～4天测量一次肿瘤的长径a和与之垂直的短径b，并记录动物体重和动物死亡情况。按公式V＝1/2ab²计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线，并计算抑瘤率。观察偶联物不同给药方案对小鼠移植性肝癌的治疗作用。结果显示(图10)，Fab’-LDM偶联物治疗组小鼠的肿瘤生长受到显著抑制)。实验第15天，按肿瘤体积计算抑瘤率，Fab’-LDM偶联物0.025mg/kg、0.05mg/kg和0.1mg/kg剂量组的抑瘤率分别为84.5％、93.9％和96.0％，而游离LDM剂量0.05mg/kg的抑瘤率为78.3％。至实验第21天，Fab’-LDM偶联物0.025mg/kg，0.05mg/kg和0.1mg/kg三个剂量组的抑瘤率分别为76.7％，93.3％和94.8％；而游离LDM剂量0.05mg/kg的抑瘤率为76.1％。与同等剂量的游离LDM相比，Fab’-LDM偶联物显示更强的肿瘤生长抑制作用(P＜0.01)。

发明效果：

本发明利用抗IV型胶原酶单抗3G11与结肠癌、肺癌、乳腺癌、食管癌、胃癌等恶性肿瘤组织的免疫反应性及其在体内的特异性分布的特点，与高活力“弹头”药物力达霉素分别制成3G11-LDM偶联物和Fab’-LDM偶联物；确定了3G11-LDM偶联物和Fab’-LDM偶联物的制备方法；体外试验确定，3G11-LDM偶联物或Fab’-LDM偶联物与游离LDM相比，对肿瘤细胞显示更强的杀伤作用；动物体内试验证明，3G11-LDM偶联物或Fab’-LDM偶联物对肿瘤生长有很强的抑制作用，其抗肿瘤效果明显高于游离的LDM或抗体本身。因此，预期单抗3G11-LDM偶联物及其片段Fab’-LDM偶联物可能开发成为新型的抗肿瘤靶向药物用于临床肿瘤治疗，并取得良好的效果。

附图说明：图1单抗3G11与人结肠癌组织的免疫组织化学染色

其中：图右侧为结肠癌组织，可见腺体样排列的癌细胞内有染色阳性颗粒分

布于细胞顶端；图左侧为正常结肠粘膜的腺体。图2单抗3G11与人肺癌组织的免疫组织化学染色

其中：肺癌细胞呈阳性，周围有较多的淋巴细胞。图3单抗3G11与一例人结肠癌组织的免疫组织化学染色

其中：图右侧为腺体样排列的癌细胞内有染色阳性颗粒分布于细胞顶端；图

左侧为正常结肠粘膜的腺体。图4单抗3G11与肺癌PG细胞、结肠癌HT-29细胞、肝癌H22细胞、结肠癌C26

细胞和口腔鳞癌KB细胞的免疫反应性

其中：◆--PG ■--HT-29 △--H22 ×--KB *--C-26图5接种于裸鼠的人巨细胞肺癌PG肿瘤96小时的放射免疫显像。图6单抗3G11-LDM偶联物与结肠癌HT-29细胞、肝癌H22细胞、结肠癌C26

细胞和口腔鳞癌KB细胞的免疫反应性

其中：◆--HT-29 ■--KB ▲--C-26 □--H-22图7单抗3G11-LDM偶联物对H22细胞增殖的抑制作用(MTT法)

其中：▲--LDM ■--3G11-LDM图8单抗片段Fab’-LDM偶联物对H22细胞增殖的抑制作用(MTT法)

其中：◆--LDM ■--Fab’-LDM图9单抗3G11-LDM偶联物对肝癌H22肿瘤生长的抑制作用

其中：○-对照 ■--3G11(0.75) △--LDM(0.05)

□--3G11+LDM(0.75+0.05) ◆--3G11-LDM(0.025)

●--3G11-LDM(0.05) ▲--3G11-LDM(0.10)

(括号内数字表示所用剂量mg/kg)图10单抗片段Fab’-LDM偶联物对肝癌H22肿瘤生长的抑制作用

其中：○--对照 ■--Fab’(0.25) △--LDM(0.05)

●--Fab’-LDM(0.025)

□--Fab’-LDM(0.05) ▲--Fab’-LDM(0.10)

(括号内数字表示所用剂量mg/kg)本发明的细胞株保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏地址：北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所保藏日期：2002年11月7日保藏编号：0831分类名：杂交瘤3G11细胞株

Claims

1.力达霉素(LDM)与抗IV型胶原酶单克隆抗体3G11及其Fab’片段构成的免疫偶联物，其特征在于单抗3G11-LDM偶联物或Fab’-LDM偶联物是分别由单抗3G11蛋白分子上的氨基或Fab’片段上的巯基与LDM辅基蛋白分子上的氨基之间通过小分子交联剂作为接头形成的，单抗3G11或Fab’与LDM免疫偶联物的分子比为1∶1，其中用于连接LDM与单抗3G11或Fab’的小分子接头可以是2-亚胺基四氢噻吩(2-IT)和N-羟基琥珀酰亚胺基-间-(N-马来酰亚胺基)苯甲酸酯(MBS)，也可以是N-羟基琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫基)-丙酸酯(SPDP)等其它小分子异型双功能交联剂。

2.如权利要求1所述免疫偶联物的制备方法，其特征是将力达霉素先以异型双功能交联剂如N-羟基琥珀酰亚胺基-间-(N-马来酰亚胺基)苯甲酸酯(MBS)修饰，然后加入经2-亚胺基四氢噻吩(2-IT)巯基化的单抗3G11，或加入巯基化的Fab’片段，反应后经纯化得到产物分别为3G11-LDM偶联物或Fab’-LDM偶联物；或者是将力达霉素以其它异型双功能交联剂如N-羟基琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫基)-丙酸酯(SPDP)或长链的N-羟基琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫基)-丙酸酯(LC-SPDP)等异型双功能交联剂作为中介体与单抗3G11进行偶联反应，反应后经纯化得到产物。

3.力达霉素(LDM)与抗IV型胶原酶单克隆抗体3G11及其Fab’片段构成的免疫偶联物3G11-LDM和Fab’-LDM在制备结肠癌等恶性肿瘤靶向治疗剂中的应用。