CN106492226A - 肿瘤靶向性多肽—蒽环类衍生物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有肿瘤靶向性载体多肽与蒽环类药物，其特征在于：所述多肽‑蒽环型衍生物中包括靶向载体部分和N‑(2‑羟基丙基)‑甲基丙烯酰胺聚合物以及蒽环类抗肿瘤药物部分，蒽环类抗肿瘤药物部分和靶向载体部分通过N‑(2‑羟基丙基)‑甲基丙烯酰胺聚合物进行共价键偶联；其通式如下：AN‑HPMA‑EBP，AN表示蒽环类抗肿瘤药物，HPMA表示N‑(2‑羟丙基)甲基丙烯酰胺聚合物，EBP表示EGFR结合肽。本发明提供的肿瘤靶向性多肽‑蒽环型衍生物能与细胞EGFR结合，选择性地输送蒽环类抗肿瘤药物到达体内细胞EGFR高度或过度表达的靶组织，以增加病灶局部药物浓度，提高疗效和降低毒副作用，达到靶向治疗的目的。

Description

肿瘤靶向性多肽—蒽环类衍生物
技术领域
本发明属于生物与医药技术领域。更具体的说它涉及具有肿瘤靶向性载体多肽与蒽环类药物，通过多聚N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共价连接所形成的偶联化合物及其制备方法。这些共价偶联化合物能主动靶向性定位于表皮生长因子受体阳性表达的各种肿瘤。
背景技术
阿霉素(doxorubicin，DOX)、表阿霉素(epirubicin，EPI)、吡喃阿霉素(therarubicin，THP)、去甲氧柔红霉素(idarubicin，IDA)和米托蒽醌(mitoxantrone，DHAQ)等蒽环类抗肿瘤药物，通过抑制细胞DNA和RNA的合成，发挥药理作用。现已成为多种癌症化疗方案中的核心药物，被全球广泛使用。然而，由于蒽环类药物对肿瘤缺乏选择性，往往对正常组织造成非特异性损害，使人体产生骨髓抑制、胃肠道反应、脱发等毒性副反应。其中最为显著和突出的毒性作用是不可逆的剂量累积性心脏损害，使其在临床上的应用受到了严格地限制。
为了提高药物的疗效并克服毒性副作用，利用肿瘤细胞比正常细胞中有更高表达和/或异常表达的受体作为靶点，以配体的活性片段为载体，与蒽环类药物偶联产生新型药物化合物，借助配体-受体的结合具有高特异性、高选择性和高亲和力等生物学特性，配体活性片段携带药物，主动识别细胞中的靶标受体并与其结合，通过受体的介导进入细胞，从而在肿瘤细胞内积聚高浓度的药物来发挥作用。与此同时，由于该受体在正常组织细胞中没有表达或是低表达，与配体活性片段偶联的药物化合物不能或很少与受体结合，细胞不摄取或仅摄取少量药物，从而改变了药物在体内的分布状态，完成药物在体内的重分布和重分配。因此，利用上述原理，我们针对性地将特定的配体活性片段，引入到蒽环类药物分子中进行修饰和改造，设计并合成出能使它们靶向性分布于癌细胞的新型药物分子，形成了高效、低毒的高选择性抗肿瘤化合物。
选择肿瘤细胞中高度表达或过度表达的受体分子为靶点，是肿瘤靶向治疗的基础。现已证实，与非肿瘤细胞相比，表皮生长因子受体(epidermal growth factorreceptor，EGFR)在肺癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌、卵巢癌、膀胱癌、脑胶质瘤以及头颈部肿瘤等癌细胞中存在高表达或过表达，并发现EGFR的异常过表达与肿瘤细胞的恶变、粘附、转移以及血管生成等密切相关。多年来，针对EGFR的单克隆抗体和小分子酪氨酸激酶抑制剂已被临床广泛用于肿瘤的治疗，因此，EGFR作为阳性表达肿瘤的重要靶标，已被深入研究和临床应用。
表皮生长因子(EGF)是EGFR最重要的配体，它与EGFR的结合具有高特异性、高选择性和高亲和力。研究发现，EGF中CMYIEALDKYAC序列是与EGFR结合的活性区域，故称该活性肽段为EGFR结合肽(EGFR-binding peptide，EBP)。鉴于EGFR在许多恶性肿瘤中都存在着阳性表达，以及EBP与EGFR结合的特异性，本发明将EBP引入到蒽环类抗肿瘤药物分子中进行分子修饰和改造，形成具有针对EGFR分子的肿瘤靶向性蒽环类衍生物。
水溶性N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)聚合物作为高分子抗肿瘤药物材料，具有生物相容性、非免疫原性，以及可根据使用目的对结构进行修饰的特点。以HPMA聚合物为骨架而构成的多聚HPMA-抗肿瘤药物偶合物，可以形成以疏水药物为核心的单分子微团，具有较好的稳定性和药代动力学性质。因此，多聚HPMA-抗肿瘤药物偶合物成为当前大分子靶向药物研究的热点之一。其中，多聚HPMA-阿霉素接合物等几种抗癌药物接合物正进行临床研究。但目前研究只局限于具有“增强透过及滞留效应”(enhanced permeability andretention effect，EPR效应)的被动肿瘤靶向药物。
本发明涉及具有主动肿瘤靶向性的多聚HPMA-蒽环类衍生物及其制备方法。这种主动肿瘤靶向性多聚HPMA-蒽环类衍生物是基于配体-受体反应特异性的原理，通过特别设计，将含有EBP多肽作为载体，通过水溶性HPMA聚合物与蒽环类药物分子偶联，合成出含EBP多肽序列的蒽环类衍生物，能主动靶向性集聚蒽环类药物到EGFR阳性表达的肿瘤细胞中发挥高效、低毒的抗肿瘤药理效应。经体外和动物体内的系列试验，发现合成的衍生物具有：①.良好的肿瘤选择性；②.专一的受体介导通路；③.高效的抗肿瘤活性；④.甚低的机体正常组织毒性；⑤.高度的生物相容性等特点。可以解决蒽环类药物缺乏肿瘤选择性等难题。
发明内容
本发明的目的是为了提高蒽环类抗肿瘤药物的治疗效果及克服毒性副作用，为恶性肿瘤的治疗提供高效、低毒的方案。本发明涉及的衍生物可与细胞EGFR结合，高选择性地输送蒽环类抗肿瘤药物至体内EGFR阳性表达的肿瘤靶组织，发挥靶向治疗肿瘤的作用。
本发明的技术方案是这样实现的：它是含EGFR结合肽(序列：CMYIEALDKYAC，EBP)，是EBP与蒽环类抗肿瘤药物，通过HPMA聚合物结合而形成的蒽环型衍生物，它具有识别细胞细胞EGFR并与该受体结合的能力。其通式如下：AN-HPMA-EBP，AN表示蒽环类抗肿瘤药物，HPMA表示N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺聚合物，EBP表示EGFR结合肽(序列：CMYIEALDKYAC)。
本发明涉及的蒽环类抗肿瘤药物是阿霉素(doxorubicin，DOX)，通过N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)聚合物与含EBP的化合物共价结合所形成的蒽环型衍生物，具有识别细胞EGFR并与该受体结合的能力。其通式如下：DOX-HPMA-EBP。
本发明涉及的蒽环类抗肿瘤药物是表阿霉素(epirubicin，EPI)，通过N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)聚合物与含EBP的化合物共价结合所形成的蒽环型衍生物，具有识别细胞EGFR并与该受体结合的能力。其通式如下：EPI-HPMA-EBP。
本发明涉及的蒽环类抗肿瘤药物是吡喃阿霉素(pirarubicin，THP)，通过N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)聚合物与含EBP的化合物共价结合所形成的蒽环型衍生物，具有识别细胞EGFR并与该受体结合的能力。其通式如下：THP-HPMA-EBP。
本发明涉及的蒽环类抗肿瘤药物是去甲氧柔红霉素(idarubicin，IDA)，通过N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)聚合物与含EBP的化合物共价结合所形成的蒽环型衍生物，具有识别细胞EGFR并与该受体结合的能力。其通式如下：IDA-HPMA-EBP。
本发明涉及的蒽环类抗肿瘤药物是米托蒽醌(mitoxantrone，DHAQ)，通过N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)聚合物与含EBP的化合物共价结合所形成的蒽环型衍生物，具有识别细胞EGFR并与该受体结合的能力。其通式如下：DHAQ-HPMA-EBP。
本发明提供的肿瘤靶向性多肽-蒽环型衍生物能与细胞EGFR结合，选择性地输送蒽环类抗肿瘤药物到达体内细胞EGFR高度或过度表达的靶组织，以增加病灶局部药物浓度，提高疗效和降低毒副作用，达到靶向治疗的目的。
附图说明
图1：多肽—阿霉素衍生物对荷瘤小鼠体内肿瘤生长的抑制作用。
图2：多肽—表阿霉素衍生物对荷瘤小鼠体内肿瘤生长的抑制作用。
图3：多肽—吡喃阿霉素的衍生物对荷瘤小鼠体内肿瘤生长的抑制作用。
图4：多肽—去甲氧柔红霉素衍生物对荷瘤小鼠体内肿瘤生长的抑制作用。
图5：多肽—米托蒽醌衍生物对荷瘤小鼠体内肿瘤生长的抑制作用。
具体实施例
实施例1：N-异丁烯酰基甘氨酰甘氨酸-EBP(Ma-GG-EBP)的合成
取90mg甘氨酸(G)-甘氨酸(G)二肽溶入4mL水中，加400mg NaOH，0℃下边搅拌边滴加70μL甲基丙烯酰氯，反应1h后用盐酸调节pH至2.0，再加2mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，-15℃下加126mg二环己基碳二酰亚胺(DCC)，搅拌反应3h，4℃下过夜，离心，过滤除去二环己基脲晶体，真空干燥得甲基丙烯酰甘氨酰甘氨酸对硝基苯酯(Ma-GG-ONp)。另取120mg EBP溶入4mL DMF中，加30mg Ma-GG-ONp和吡啶，室温下反应22h，用0.1N NaOH中止反应，加去离子水透析，冻干，得产物甲基丙烯酰甘氨酰甘氨酰-EBP(Ma-GG-EBP)。
实施例2：DOX-HPMA-EBP的合成
取200mg甘氨酸(G)-苯丙氨酸(F)-亮氨酸(L)-甘氨酸(G)四肽溶入10mL二氯甲烷，加5mg 4-(1,1,3,3-四甲基丁基)邻苯二酚、和32mg碳酸钠，0℃下边搅拌边滴加110μL甲基丙烯酰氯，再加98mg水合肼反应7h，用异丙烷洗脱三次去除未反应的水合肼，加二氯甲烷/醋酸乙酯结晶，得甲基丙烯酰甘氨酰苯丙氨酰亮氨酰甘氨酰肼(Ma-GFLG-NHNH2)，然后在室温下加入8mL甲醇溶解，避光加157mg阿霉素(DOX)，边搅拌边滴加420μL醋酸，反应30h，采用凝胶渗透色谱法纯化，得产物甲基丙烯酰甘氨酰苯丙氨酰亮氨酰甘氨酸阿霉素(Ma-GFLG-DOX)。另取148mg HPMA、42mg Ma-GFLG-DOX、30mg Ma-GG-EBP和1mg偶氮二异丁腈，加入2mL10％丙酮/二甲基亚砜(v/v)，通入氮气，50℃下反应22h，交替使用过量的丙酮和二乙醚冲洗，再加甲醇，透析，真空干燥得聚合物DOX-HPMA-EBP。
实施例3：EPI-HPMA-EBP的合成
取200mg甘氨酸(G)-苯丙氨酸(F)-亮氨酸(L)-甘氨酸(G)四肽溶入10mL二氯甲烷，加5mg 4-(1,1,3,3-四甲基丁基)邻苯二酚、和32mg碳酸钠，0℃下边搅拌边滴加110μL甲基丙烯酰氯，再加98mg水合肼反应7h，用异丙烷洗脱三次去除未反应的水合肼，加二氯甲烷/醋酸乙酯结晶，得甲基丙烯酰甘氨酰苯丙氨酰亮氨酰甘氨酰肼(Ma-GFLG-NHNH2)，然后在室温下加入8mL甲醇溶解，避光加157mg表阿霉素(EPI)，边搅拌边滴加420μL醋酸，反应30h，采用凝胶渗透色谱法纯化，得产物甲基丙烯酰甘氨酰苯丙氨酰亮氨酰甘氨酸表阿霉素(Ma-GFLG-EPI)。另取148mg HPMA、42mg Ma-GFLG-EPI、30mg Ma-GG-EBP和1mg偶氮二异丁腈，加入2mL 10％丙酮/二甲基亚砜(v/v)，通入氮气，50℃下反应22h，交替使用过量的丙酮和二乙醚冲洗，再加甲醇，透析，真空干燥得聚合物EPI-HPMA-EBP。
实施例4：THP-HPMA-EBP的合成
取200mg甘氨酸(G)-苯丙氨酸(F)-亮氨酸(L)-甘氨酸(G)四肽溶入10mL二氯甲烷，加5mg 4-(1,1,3,3-四甲基丁基)邻苯二酚、和32mg碳酸钠，0℃下边搅拌边滴加110μL甲基丙烯酰氯，再加98mg水合肼反应7h，用异丙烷洗脱三次去除未反应的水合肼，加二氯甲烷/醋酸乙酯结晶，得甲基丙烯酰甘氨酰苯丙氨酰亮氨酰甘氨酰肼(Ma-GFLG-NHNH2)，然后在室温下加入8mL甲醇溶解，避光加150mg吡喃阿霉素(THP)，边搅拌边滴加420μL醋酸，反应30h，采用凝胶渗透色谱法纯化，得产物甲基丙烯酰甘氨酰苯丙氨酰亮氨酰甘氨酸吡喃阿霉素(Ma-GFLG-THP)。另取148mg HPMA、42mg Ma-GFLG-THP、30mg Ma-GG-EBP和1mg偶氮二异丁腈，加入2mL 10％丙酮/二甲基亚砜(v/v)，通入氮气，50℃下反应22h，交替使用过量的丙酮和二乙醚冲洗，再加甲醇，透析，真空干燥得聚合物THP-HPMA-EBP。
实施例5：IDA-HPMA-EBP的合成
取200mg甘氨酸(G)-苯丙氨酸(F)-亮氨酸(L)-甘氨酸(G)四肽溶入10mL二氯甲烷，加5mg 4-(1,1,3,3-四甲基丁基)邻苯二酚、和32mg碳酸钠，0℃下边搅拌边滴加110μL甲基丙烯酰氯，再加98mg水合肼反应7h，用异丙烷洗脱三次去除未反应的水合肼，加二氯甲烷/醋酸乙酯结晶，得甲基丙烯酰甘氨酰苯丙氨酰亮氨酰甘氨酰肼(Ma-GFLG-NHNH2)，然后在室温下加入8mL甲醇溶解，避光加160mg去甲氧柔红霉素(IDA)，边搅拌边滴加420μL醋酸，反应30h，采用凝胶渗透色谱法纯化，得产物甲基丙烯酰甘氨酰苯丙氨酰亮氨酰甘氨酸去甲氧柔红霉素(Ma-GFLG-IDA)。另取148mg HPMA、42mg Ma-GFLG-IDA、30mg Ma-GG-EBP和1mg 2,2’-偶氮二异丁腈(AIBN)，加入2mL 10％丙酮/二甲基亚砜(v/v)，通入氮气，50℃下反应22h，交替使用过量的丙酮和二乙醚冲洗，再加甲醇，透析，真空干燥得聚合物IDA-HPMA-EBP。
实施例6：DHAQ-HPMA-EBP的合成
取90mg甘氨酸(G)-苯丙氨酸(F)-亮氨酸(L)-甘氨酸(G)四肽溶入4mL水中，加400mg NaOH，0℃下边搅拌边滴加70μL甲基丙烯酰氯，反应1h后用盐酸调节pH至2.0，再加2mL DMF，-15℃下加126mg二环己基碳二酰亚胺(DCC)，搅拌反应3h，4℃下过夜，离心，过滤除去二环己基脲晶体，真空干燥得甲基丙烯酰甘氨酰苯丙氨酰亮氨酰甘氨酸对硝基苯酯(Ma-GFLG-ONp)。再取150mg米托蒽醌(DHAQ)以适量DMF溶解，4℃下边搅拌边缓缓滴加至Ma-GFLG-ONp的DMF溶液，缓慢加入三乙胺，反应液通入氮气，室温反应4h后，4℃放置过夜，减压除去DMF，甲醇溶解残渣，硅胶柱色谱纯化，得产物甲基丙烯酰甘氨酰苯丙氨酰亮氨酰甘氨酸米托蒽醌(Ma-GFLG-DHAQ)，真空干燥备用。另取148mg HPMA、42mg Ma-GFLG-DHAQ、30mgMa-GG-EBP和1mg 2,2’-偶氮二异丁腈(AIBN)，加入2mL 10％丙酮/二甲基亚砜(v/v)，通入氮气，50℃下反应22h，交替使用过量的丙酮和二乙醚冲洗，再加甲醇，透析，真空干燥得聚合物DHAQ-HPMA-EBP。
实施例7：体外DOX-HPMA-EBP细胞毒性试验
取对数生长期的EGFR高表达人乳腺癌细胞MDA-MB-453、人肺癌细胞HCC97和EGFR低表达人神经胶质瘤细胞U13MG，胰酶消化，用含血清的培养液收集细胞，离心、重悬、计数。96孔培养板中间十列的各孔中加入200μL细胞悬液，每孔细胞数为5×103个细胞。将200μL培养液加入第1列和第12列的8个孔中。第1列为不含细胞的空白对照。细胞在37℃CO2培养箱中培养24小时后分DOX-HPMA-EBP实验组和DOX阳性对照组。实验组以DOX-HPMA-EBP中DOX的浓度计，用不含血清的细胞培养液5倍系列稀释，共形成8个浓度梯度。阳性对照用不含血清的细胞培养液将DOX进行5倍系列稀释，形成8个浓度，做好标记。小心移去第2至11列各孔培养液。在第2列和第11列的8个孔中加入200μL不含血清的新鲜培养液，这些细胞作为对照。而在第3至10列各孔细胞中加入200μL含不同浓度受试物的培养液，每个浓度至少4孔。细胞继续在37℃、CO2培养箱中培养48小时。加200μL新鲜培养液，在第1-11列所以孔中各加入20μL、5mg/mL四甲基偶氮唑盐(MTT)。37℃孵育4小时后，弃去孔中培养液和MTT，在第1-11列所有孔中各加入100μL二甲基亚砜(DMSO)。酶标仪检测各孔OD值(检测波长570nm)。第2列和第11列各孔中得出的平均吸光值作为对照吸光值，对照组吸光值减少一半时的药物浓度为半数抑制浓度(IC50)。本发明以IC50来判断各受试物的对不同EGFR表达水平的人癌细胞杀伤敏感性，实验数据以均数±标准差(χ±s)表示的结果见下表：
表1：DOX-HPMA-EBP及DOX的体外细胞毒性(IC50)(单位：μM)
从上表可见，DOX-HPMA-EBP的细胞毒性在EGFR高表达细胞(MDA-MB-453和HCC97)中较DOX高(IC50值低)，而在EGFR低表达的U13MG细胞中，DOX-HPMA-EBP的细胞毒性比DOX低(IC50值高)。
实施例8：体外EPI-HPMA-EBP细胞毒性研究
取MDA-MB-453细胞、HCC97细胞和U13MG细胞胰酶消化，用含血清的培养液收集细胞，离心、重悬、计数。96孔培养板中间十列的各孔中加入200μL细胞悬液，每孔细胞数为5×103个细胞。将200μL培养液加入第1列和第12列的8个孔中。第1列为不含细胞的空白对照。细胞在37℃CO2培养箱中培养24小时后分EPI-HPMA-EBP实验组和EPI阳性对照组。实验组以EPI-HPMA-EBP中EPI的浓度计，也用不含血清的细胞培养液5倍系列稀释，共形成8个浓度梯度。阳性对照用不含血清的细胞培养液将EPI进行5倍系列稀释，形成8个浓度，做好标记。小心移去第2至11列各孔培养液。在第2列和第11列的8个孔中加入200μL不含血清的新鲜培养液，这些细胞作为对照。而在第3至10列各孔细胞中加入200μL含不同浓度受试物的培养液，每个浓度至少4孔。细胞继续在37℃、CO2培养箱中培养48小时。加200μL新鲜培养液，在第1-11列所以孔中各加入20μL、5mg/mL MTT。37℃孵育4小时后，弃去孔中培养液和MTT，在第1-11列所有孔中各加入100μL DMSO。酶标仪检测各孔OD值(检测波长570nm)。第2列和第11列各孔中得出的平均吸光值作为对照吸光值，对照组吸光值减少一半时的药物浓度为半数抑制浓度(IC50)。本发明以IC50来判断各受试物的对不同肿瘤细胞的细胞毒性，实验数据以均数±标准差(χ±s)表示的结果见下表：
表2：EPI-HPMA-EBP及EPI的体外细胞毒性(IC50)(单位：μM)
EPI在高、低不同EGFR表达的细胞中的毒性无明显差异。与EPI不同，在EGFR高表达细胞(MDA-MB-453和HCC97)中，EPI-HPMA-EBP的毒性比EPI高(IC50值低)，在EGFR低表达的U13MG细胞中，EPI-HPMA-EBP的细胞毒性比EPI低(IC50值高)。
实施例9：体外THP-HPMA-EBP细胞毒性研究
取MDA-MB-453、HCC97和U13MG细胞胰酶消化，用含血清的培养液收集细胞，离心、重悬、计数。96孔培养板中间十列的各孔中加入200μL细胞悬液，每孔细胞数为5×103个细胞。将200μL培养液加入第1列和第12列的8个孔中。第1列为不含细胞的空白对照。细胞在37℃、CO2培养箱中培养24小时后分THP-HPMA-EBP实验组和THP阳性对照组。实验组以THP-HPMA-EBP中THP的浓度计，也用不含血清的细胞培养液5倍系列稀释，共形成8个浓度梯度。阳性对照用不含血清的细胞培养液将THP进行5倍系列稀释，形成8个浓度，做好标记。小心移去第2至11列各孔培养液。在第2列和第11列的8个孔中加入200μL不含血清的新鲜培养液，这些细胞作为对照。而在第3至10列各孔细胞中加入200μL含不同浓度受试物的培养液，每个浓度至少4孔。细胞继续在37℃CO2培养箱中培养48小时。加200μL新鲜培养液，在第1-11列所以孔中各加入20μL、5mg/mL MTT。37℃孵育4小时后，弃去孔中培养液和MTT，在第1-11列所有孔中各加入100μL DMSO。酶标仪检测各孔OD值(检测波长570nm)。第2列和第11列各孔中得出的平均吸光值作为对照吸光值，对照组吸光值减少一半时的药物浓度为半数抑制浓度(IC50)。
在体外培养的高、低不同EGFR表达的人癌细胞系中加入THP-HPMA-EBP作用48小时，采用MTT还原法进行检测，计算半数抑制浓度(IC50)，并与THP组比较，以判断受试物对不同EGFR表达水平的细胞杀伤敏感性。实验数据以均数±标准差(χ±s)表示的结果见下表：
表3：THP-HPMA-EBP和THP的体外细胞毒性(IC50)(单位：μM)
THP在高、低不同EGFR表达的细胞中的毒性无明显差异，而THP-HPMA-EBP在EGFR高表达细胞(MDA-MB-453和HCC97)中的毒性比THP高(IC50值低)，但在EGFR低表达的U13MG细胞中，THP-HPMA-EBP的细胞毒性比THP低(IC50值高)。
实施例10：体外IDA-HPMA-EBP细胞毒性研究
96孔培养板孔中，按每孔5×103个细胞数分别加入MDA-MB-453、HCC97或U13MG细胞，分IDA-HPMA-EBP实验组和IDA对照组。在培养板的第3至10列各孔细胞中加入不同浓度的IDA-HPMA-EBP或IDA(以其中所含IDA的浓度计)，每浓度至少4孔。细胞继续在37℃、CO2培养箱中培养48小时。加20μL、5mg/mL MTT。37℃孵育4小时，再加100μL DMSO，然后，然后用酶标仪检测各孔OD值。计算各组半数抑制浓度(IC50)，实验数据以均数±标准差表示，其结果见下表：
表4：IDA-HPMA-EBP和IDA的体外细胞毒性(IC50)(单位：μM)
由上表可知，IDA-HPMA-EBP在EGFR高表达细胞(MDA-MB-453和HCC97)中的毒性比IDA高(IC50值低)，而在EGFR低表达的U13MG细胞中，IDA-HPMA-EBP的细胞毒性比IDA低(IC50值高)，说明IDA-HPMA-EBP的细胞毒性与细胞EGFR的表达水平有关。但是，IDA在高、低不同EGFR表达的细胞中的毒性无明显差异，提示IDA的细胞毒性与细胞EGFR的表达水平无关。
实施例11：体外DHAQ-HPMA-EBP细胞毒性研究
96孔培养板孔中，按每孔5×103个细胞数分别加入MDA-MB-453、HCC97或U13MG细胞，24小时后分DHAQ-HPMA-EBP实验组和DHAQ阳性对照组，按不同浓度配制DHAQ-HPMA-EBP和DHAQ(以其中所含DHAQ浓度计)为受试物。在第2列和第11列的8个孔中加入不含血清的新鲜培养液为对照。而在第3至10列各孔细胞中加入不同浓度受试物，每浓度至少4孔。细胞继续在37℃、CO2培养箱中培养48小时。加20μL、5mg/mL MTT。37℃孵育4小时，再加100μLDMSO，然后，然后用酶标仪检测各孔OD值。计算各组半数抑制浓度(IC50)，实验数据以均数±标准差表示，其结果见下表：
表5：DHAQ-HPMA-EBP和DHAQ的体外细胞毒性(IC50)(单位：μM)
结果显示，DHAQ-HPMA-EBP在EGFR高表达细胞(MDA-MB-453和HCC97)中的毒性比DHAQ高(IC50值低)，而在EGFR低表达的U13MG细胞中，DHAQ-HPMA-EBP的细胞毒性比DHAQ低(IC50值高)，表示DHAQ-HPMA-EBP的细胞毒性与细胞EGFR的表达水平有关。但是，DHAQ在高、低不同EGFR表达的细胞中的毒性无明显差异，表明DHAQ的细胞毒性与细胞EGFR的表达水平无关。
实施例12：动物体内DOX-HPMA-EBP抗肿瘤活性研究
取鼠肝癌H22细胞，用RPMI-1640培养液调整细胞数为1.5×107个/mL，将0.2mL细胞悬液接种至BALB/c小鼠(体重18～22g)后肢皮下，2周后选择肿瘤生长良好且无坏死的动物，颈椎脱臼处死，无菌条件下取出实体瘤，切成直径约2mm大小的瘤块，用穿刺针移植至鼠后肢外侧皮下。肿瘤移植后1周，选择肿癌生长良好的小鼠为移植瘤动物模型，随机分为DOX-HPMA-EBP实验组、DOX阳性对照组和生理盐水溶媒阴性对照组。分别在肿瘤移植后的第7、14和21天，经静脉注射给药。实验组给药剂量按DOX-HPMA-EBP中的DOX含量为15mg/kg，阳性对照组给1mg/kg DOX。实验期间每天记录动物的存活情况，每周测量瘤体的长径(a)和短径(b)2～3次，根据公式：V＝(a×b2)/2计算肿瘤体积变化等。各组动物肿瘤移植后1周(第1次给药时)的初治肿瘤体积，至肿瘤移植后5周(第35天)实验末肿瘤体积的观察结果见图1。
试验结果显示，阴性对照组和DOX阳性对照组小鼠，在H22肝癌细胞移植后4周开始，陆续出现死亡，到第5周，近半数实验动物死亡。而此时，DOX-HPMA-EBP实验组动物0死亡。DOX组肿瘤瘤体体积的变化情况，癌移植1周(第7天)首次治疗时检测的肿瘤体积平均为208±60mm3，5周(第35天)后的肿瘤体积增加到907±72mm3，但与生理盐水组的肿块大小(1630±120mm3)相比，肿块体积缩小。DOX-HPMA-EBP实验组动物初次治疗时(第7天)的肿瘤体积平均为234±56mm3，经过3次治疗后，从第21天开始，肿瘤体积明显缩小。到第35天时，肿瘤大小为583±47mm3，与生理盐水组的肿块大小(1630±120mm3)相比，肿块体积缩小差异显著。
实施例13：动物体内EPI-HPMA-EBP抗肿瘤活性研究
用RPMI-1640培养液调整鼠肝癌H22细胞数为1.5×107个/mL，取0.2mL细胞悬液接种至BALB/c小鼠(体重18～22g)皮下，2周后处死动物取出实体瘤切成小瘤块，用穿刺针将肿瘤移植至动物后肢皮下。1周后选择肿癌生长良好的为移植瘤动物模型，随机分EPI-HPMA-EBP实验组、EPI阳性对照组和生理盐水阴性对照组。分别在肿瘤移植后的第7、14和21天，实验组动物以其中EPI含量按15mg/kg的剂量静脉注射给药，而EPI对照组按1mg/kg剂量静脉注射。实验期间每天记录动物的存活情况，每周测量瘤体的长径(a)和短径(b)2～3次，根据公式：V＝(a×b2)/2计算肿瘤体积变化等。各组动物肿瘤移植后1周(第1次给药时)的初治肿瘤体积，至肿瘤移植后5周(第35天)实验末肿瘤体积的观察结果见图2。
结果显示，EPI组动物在肿瘤移植1周(第7天)首次治疗时，检测的肿瘤体积平均为212±56mm3，5周(第35天)后的肿瘤体积增加到715±89mm3，与生理盐水组的肿块大小(1630±120mm3)相比，肿块体积缩小。EPI-HPMA-EBP实验组动物初次治疗时(第7天)的肿瘤体积平均为192±75mm3，到第35天时，肿瘤大小为150±40mm3，与生理盐水组的肿块大小(1630±120mm3)相比，肿块体积明显缩小。
实施例14：动物体内THP-HPMA-EBP抗肿瘤活性研究
取鼠肝癌H22细胞，用RPMI-1640培养液调整细胞数为1.5×107个/mL，将0.2mL细胞悬液接种至BALB/c小鼠(体重18～22g)后肢皮下，2周后选择肿瘤生长良好且无坏死的动物，颈椎脱臼处死，无菌条件下取出实体瘤，切成直径约2mm大小的瘤块，用穿刺针移植至鼠后肢外侧皮下。肿瘤移植后1周，选择肿癌生长良好的小鼠为移植瘤动物模型，随机分为THP-HPMA-EBP实验组、THP阳性对照组和生理盐水阴性对照组。分别在肿瘤移植后的第1、7和14天，经静脉注射给药。实验组以THP-HPMA-EBP中的THP含量按15mg/kg的剂量静脉给药，THP对照组按1mg/kg的剂量静脉给药。实验期间每天记录动物的存活情况，每周测量瘤体的长径(a)和短径(b)2～3次，根据公式：V＝(a×b2)/2计算肿瘤体积变化等。各组动物肿瘤移植后1周(第1次给药时)的初治肿瘤体积，至肿瘤移植后5周(第35天)实验末肿瘤体积的观察结果见图3。
由图3所示，THP组动物在肿瘤移植后第7天的肿瘤体积平均为160±60mm3，35天后的肿瘤体积平均为1057±78mm3，与生理盐水组相比，肿块体积缩小。THP-HPMA-EBP实验组动物初次治疗时(第7天)的肿瘤体积平均为198±62mm3，到第35天时，肿瘤大小为166±70mm3，与生理盐水组的肿块大小相比，肿块体积明显缩小。
实施例15：动物体内IDA-HPMA-EBP抗肿瘤活性研究
取鼠肝癌H22细胞，用RPMI-1640培养液调整细胞数为1.5×107个/mL，将0.2mL细胞悬液接种至BALB/c小鼠(体重18～22g)后肢皮下，2周后选择肿瘤生长良好且无坏死的动物，颈椎脱臼处死，无菌条件下取出实体瘤，切成直径约2mm大小的瘤块，用穿刺针移植至鼠后肢外侧皮下。肿瘤移植后1周，选择肿癌生长良好的小鼠为移植瘤动物模型，随机分为IDA-HPMA-EBP实验组、IDA阳性对照组和生理盐水阴性对照组。分别在肿瘤移植后的第1、7和14天，经静脉注射给药。实验组给药剂量按IDA-HPMA-EBP中的IDA含量为15mg/kg，阳性对照组给1mg/kg的IDA。实验期间每天记录动物的存活情况，每周测量瘤体的长径(a)和短径(b)2～3次，根据公式：V＝(a×b2)/2计算肿瘤体积变化等。各组动物肿瘤移植后1周(第1次给药时)的初治肿瘤体积，至肿瘤移植后5周(第35天)实验末肿瘤体积的观察结果见图4。结果表明，IDA组动物初治肿瘤体积平均为292±57mm3，实验末肿瘤体积为1157±78mm3，与生理盐水组相比，肿块体积缩小。IDA-HPMA-EBP组初治肿瘤体积为282±22mm3，实验末肿瘤大小为173±65mm3，与生理盐水组相比，肿块体积明显缩小。
实施例16：动物体内DHAQ-HPMA-EBP抗肿瘤活性研究
取鼠肝癌H22细胞，用RPMI-1640培养液调整细胞数为1.5×107个/mL，将0.2mL细胞悬液接种至BALB/c小鼠(体重18～22g)后肢皮下，2周后选择肿瘤生长良好且无坏死的动物，颈椎脱臼处死，无菌条件下取出实体瘤，切成直径约2mm大小的瘤块，用穿刺针移植至鼠后肢外侧皮下。肿瘤移植后1周，选择肿癌生长良好的小鼠为移植瘤动物模型，随机分为DHAQ-HPMA-EBP实验组、DHAQ阳性对照组和生理盐水阴性对照组。分别在肿瘤移植后的第1、7和14天，经静脉注射给药。DHAQ-HPMA-EBP组给药剂量为15mg/kg，DHAQ组给1mg/kg的DHAQ。实验期间每天记录动物的存活情况，每周测量瘤体的长径(a)和短径(b)2～3次，根据公式：V＝(a×b2)/2计算肿瘤体积变化等。各组动物肿瘤移植后1周(第1次给药时)的初治肿瘤体积，至肿瘤移植后5周(第35天)实验末肿瘤体积的观察结果见图5。
从图5所知，DHAQ组动物首次治疗时，肿瘤大小为215±61mm3，实验末肿瘤大小为1053±117mm3，与生理盐水组相比，肿块体积缩小。DHAQ-HPMA-EBP组动物初次治疗时肿瘤体积平均为186±50mm3，第35天时的肿瘤大小为183±85mm3，与生理盐水组相比，肿块体积明显缩小。

Claims (10)

1.一种肿瘤靶向性多肽-蒽环型衍生物，其特征在于：所述多肽-蒽环型衍生物中包括靶向载体部分和N-(2-羟基丙基)-甲基丙烯酰胺聚合物以及蒽环类抗肿瘤药物部分，蒽环类抗肿瘤药物部分和靶向载体部分通过N-(2-羟基丙基)-甲基丙烯酰胺聚合物进行共价键偶联；其通式如下：AN-HPMA-EBP，AN表示蒽环类抗肿瘤药物，HPMA表示N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺聚合物，EBP表示EGFR结合肽。
2.根据权利要求1所述的肿瘤靶向性多肽-蒽环型衍生物，其中所述的蒽环类抗肿瘤药物是阿霉素。
3.根据权利要求1所述的肿瘤靶向性多肽-蒽环型衍生物，其中所述的蒽环类抗肿瘤药物是表阿霉素。
4.根据权利要求1所述的肿瘤靶向性多肽-蒽环型衍生物，其中所述的蒽环类抗肿瘤药物是吡喃阿霉素。
5.根据权利要求1所述的肿瘤靶向性多肽-蒽环型衍生物，其中所述的蒽环类抗肿瘤药物是去甲氧柔红霉素。
6.根据权利要求1所述的肿瘤靶向性多肽-蒽环型衍生物，其中所述的蒽环类抗肿瘤药物是米托蒽醌。
7.一种如权利要求1-6中任一项所述肿瘤靶向性多肽-蒽环型衍生物的制备方法，其特征在于：将蒽环类抗肿瘤药物与GFLG寡肽间隔基共价连接形成偶合物，再将EBP与GG二肽间隔基共价结合，然后与HPMA多聚物相连接，合成出所述的肿瘤靶向性多肽-蒽环型衍生物。
8.根据权利要求7所述肿瘤靶向性多肽-蒽环型衍生物的制备方法，其特征在于：所述蒽环类抗肿瘤药物与GFLG寡肽间隔基共价连接键为酰胺键酰腙键。
9.根据权利要求7所述肿瘤靶向性多肽-蒽环型衍生物的制备方法，其特征在于：所述蒽环类抗肿瘤药物与GFLG寡肽间隔基共价连接键为酰胺键。
10.根据权利要求7所述肿瘤靶向性多肽-蒽环型衍生物的制备方法，其特征在于：所述EBP与GG二肽间隔基共价结合键为酰胺键。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1649625A (zh) * 2002-03-01 2005-08-03 图兰恩教育基金管理人 治疗剂或细胞毒性剂与生物活性肽的偶联物
CN104877092A (zh) * 2015-01-26 2015-09-02 西北师范大学 含有缩醛键的双重靶向的两亲共聚物及其制备和作为抗肿瘤药物载体的应用
CN105963706A (zh) * 2016-04-15 2016-09-28 四川大学 一种超支化hpma共聚物-dox偶联物及其制备方法和应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1649625A (zh) * 2002-03-01 2005-08-03 图兰恩教育基金管理人 治疗剂或细胞毒性剂与生物活性肽的偶联物
CN104877092A (zh) * 2015-01-26 2015-09-02 西北师范大学 含有缩醛键的双重靶向的两亲共聚物及其制备和作为抗肿瘤药物载体的应用
CN105963706A (zh) * 2016-04-15 2016-09-28 四川大学 一种超支化hpma共聚物-dox偶联物及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EVA KOPANSKY,ET AL.: "Peptide-directed HPMA copolymer-doxorubicin conjugates as targeted therapeutics for colorectal cancer", 《JOURNAL OF DRUG TARGETING》 *

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