FI104234B - Menetelmä vasta-ainekonjugaattien valmistamiseksi neoplastisten sairauksien hoitoon - Google Patents

Description

104234

Menetelmä vasta-ainekonjugaattien valmistamiseksi neoplas-tisten sairauksien hoitoon

Keksinnön aihepiiri 5 Esillä oleva keksintö koskee yleisesti immunokon- jugaattien alaa ja tarkemmin ottaen menetelmää konjugaation ZME-vasta-aineesta ja geloniinista rakentamiseksi. Immunokonjugaatteja käytetään syövän hoidossa. Kuvataan melanooman hoitoa konjugaateilla monoklonaalisista vasta-10 aineista (MoAb:t) ja sytotoksisista ryhmistä, kuten ge-loniini, ribosomaalisesti inhiboiva proteiini, muut kasviperäiset sytotoksiset ryhmät, tai sytotoksiset tai syto-staattiset biologisen vasteen modifioijat.

Keksinnön tausta 15 Täsmällisesti kohdennetun syöpäterapian välttämät tömyys on kriittinen, koska riittävä kasvainvaste on riippuvainen kasvaimen sisäisten terapeuttisten lääkkeiden pitoituuksien kuljetuksesta ja ylläpidosta. Paikkaohjatus-ta terapiasta on tullut päämäärä useille tutkijoille, jot-20 ka käyttävät monoklonaalisia vasta-aineita terapeuttisten aineiden spesifisinä kantajina.

Syöpä on yksi johtavista kuolleisuus- ja sairastu-vuussyistä läntisessä maailmassa. On monia syöpätyyppejä, ·.· · joilla kullakin on omat ominaispiirteensä. Kuitenkin syö- ·/”: 25 villä on ainakin yksi yhteinen ominaispiirre. Niihin liit- : tyy puutteita solukasvusäätelyprosessissa.

• · ·

Melanooma, sairastuvuutta aiheuttavin ihosyövistä, • · · · .·. : on helposti etäispesäkkeitä muodostava sairaus, joka is- • · · kee kumpaankin sukupuoleen ja on lähes yhtenäisesti koh- • · · * 30 talokas viiden vuoden kuluessa diagnoosista. Paikallisten pahanlaatuisuuksien kirurginen poistaminen on osoittautu- • · t ' nut tehokkaaksi vain, kun sairaus ei ole levinnyt ensias- • · · V : teen vauriosta. Sitten kun sairaus on levinnyt, kirurgi- .**·. siä menettelyjä on täydennettävä muilla yleisemmillä me- • · · 35 nettelyillä sairastuneiden tai malignien solujen hävittä- 1 • · · · • · · · 2 104234 miseksi. Useimpia tavanomaisesti käytetyistä täydentävistä menettelyistä kuten säteilytys tai kemoterapia ei paikanneta kasvainsoluihin ja vaikka niillä on suhteellisesti suurempi tuhoava vaikutus maligneihin soluihin, ne usein 5 vaikuttavat normaaleihin soluihin jossain määrin.

Monet kasvaimet ilmentävät antigeenejä tai anti-geenimääreitä, joita normaalit solut joko ilmentävät hyvin heikosti tai eivät ilmennä lainkaan. Jotkut kasvainsolut ilmentävät antigeenejä, joita ilmentävät alkiosolutyypit 10 mutta joita eivät ilmennä täysikasvuisen eläimen normaalit solut. Nämä epänormaalisti ilmennetyt antigeenit tunnetaan kasvainliitteisinä antigeeneinä. Nämä antigeenit ovat spesifisiä sikäli, että vaikka nimenomaisen antigeenin voi ilmentää useampi kuin yksi kasvain, sen tavallisesti il-15 mentävät sen ilmentävien nimenomaisten kasvainten kaikki solut tai valtaosa soluista. Kasvainsolu voi ilmentää yhden tai useamman kuin yhden kasvainliitteisen antigeenin. Nämä kasvainliitteiset antigeenit voivat ilmentyä solun pinnalla (solupinta-antigeeni), kasvainsolu voi erittää 20 niitä (erittyvät antigeenit) tai ne voivat jäädä solun sisään (solunsisäinen antigeeni).

Näiden kasvainliitteisten antigeenien läsnäoloa on käytetty kasvaimen toteamiseksi, diagnosoimiseksi ja pai-·.·· kantamiseksi. Joissakin tapauksissa kasvainliitteisten 25 antigeenien läsnäolo kasvainsoluilla on mahdollistanut ; spesifisten lääkkeiden ja muiden hoitokeinojen kohdentami- ··· sen spesifisesti kasvainsoluihin.

···· .·. : Vasta-aineet ovat proteiineja, joita eläimen im- « ·· muunijärjestelmä normaalisti tuottaa vasteena vieraille ♦ ♦ · * 30 antigeeneille tai antigeenimääreille. Vasta-aineet sitou tuvat spesifiseen antigeeniin, jota vastaan ne kohdistu- • ♦ · *·1 vat. Esimerkiksi muiden melanooma-antigeenien vastaisia • · ♦ : vasta-aineita on käytetty spesifisen kasvainpaikantumisen osoittamiseksi ihmisessä systeemisen ja vatsaontelon si- • · · 35 säisen annon jälkeen.

• · 2 • · 2 · 1« 3 104234

Yksi menetelmä kemoterapeuttisten aineiden kohdentamiseksi kasvainsoluihin ja niiden vaikutuksien normaaleihin soluihin vähentämiseksi on tullut mahdolliseksi monoklonaalisten vasta-aineiden kehityksen myötä, jotka 5 kohdistuvat kasvainsoluilla vastaan antigeenejä, joita ei esiinny normaaleilla soluilla. Spesifisiä antigeenejä tai antigeenimääreitä vastaan kohdistuvia monoklonaalisia vasta-aineita voidaan valmistaa suuria määriä.

Vasta-aineet voidaan leimata niiden käytön mahdol-10 listamiseksi malignien sairauksien paikantamiseksi ja hoitamiseksi. Tällaisia kasvainsolupinta-antigeenien vastaisia radioleimattuja monoklonaalisia vasta-aineita on käytetty menestyksekkäästi kasvainten kuvantamiseksi potilaissa ulkoisella skintografiällä (Deland, Semin.Nucl.-15 Med. 19:3 (1989) 158 - 165 [katsaus); Juhl, Hepatoqastro-enteroloqv 36:1 (1989) 27 - 32 (katsaus)]. Lääkkeisiin kytkettyjä vasta-aineita voidaan käyttää kuljetussystee-minä, jolla lääke kohdennetaan spesifiseen kasvainsolu-tyyppiin, jota vastaan vasta-aine kohdistuu, vasta-ainei-20 den ainutlaatuisen kyvyn johdosta paikantua kasvain kohtaan systeemisen annon jälkeen. Vasta-aineita voidaan myös kytkeä toksiineihin, jolloin ne voivat toimia kuljetussys-teeminä toksiinien kohdentamiseksi suoraan spesifisiin ·' : ·’ kasvainsoluihin.

• · · · :***: 25 Sytotoksiset aineet, joita usein käytetään vasta- • · · : ainekonjugaatteihin, kuuluvat pääasiassa kolmeen aine- • · · luokkaan: toksiinit, radionuklidit ja kemoterapeuttiset • · · · : aineet. Vasta-ainekonjugaatit kunkin näistä ainetyypeistä • · · kanssa ovat huomattavan lupaavia terapeuttisina aineina, • · · * 30 jolloin niihin kuitenkin liittyy myös joitakin ainutker taisia ongelmia (Frankel et ai.. Ann.Rev.Med 37 (1986) *.1 1 125 - 142; Reimann et ai. . J. Cl in. Invest. 82,:1 (1988) • · · V · 129 - 138). Immunokonjugaatit, jotka sisältävät kasvitok- .1·1. siineja, tarjoavat samoin ainutkertaisen edun verrattuna • · « 35 muihin vasta-ainekonjugaattien tyyppeihin, koska: • · · « • lii • ••ta • · 4 104234 1. Immunotoksiinien annokset, joita tarvitaan kas-vainvastaiseen aktiivisuuteen, ovat yleensä ottaen paljon alhaisempia kuin vasta-aine-lääkekonjugaateille tarvittava annos.

5 2. Toksiinien konjugointi vasta-aineisiin ei vai kuta vaikuttavan vasta-aineaffiniteettiin.

Geloniini on glykoproteiini (mp. noin 29 -30 000 kd) , joka on puhdistettu GeIonium multiforumin siemenistä. Geloniini kuuluu luokkaan tehokkaita ribosomaali-10 sesti inaktivoivia kasvitoksiineja. Muita tämän ribosomaa-lisesti inaktivoivien kasvitoksiinien luokan jäseniä ovat abriini-, risiini- ja modessiiniketjut. Geloniini, kuten abriini ja risiini, inhiboi proteiinisynteesin vaurioittamalla nisäkäsribosomien 60S-alayksikköä. Vaikka risiinin 15 A-ketju (RTA) on ollut suosittu immunotoksiineissa käytettäväksi, geloniini vaikuttaa olevan stabiilimpi kemialliselle ja fysikaaliselle käsittelylle kuin RTA (Barbieri et ai. . Cancer Surv. 1 (1982) 489 - 520). Lisäksi geloniini itse ei sitoudu soluihin eikä siten ole myrkyllinen (pait-20 si korkeina pitoisuuksina) ja sen käsittely laboratoriossa on turvallista. Ribosomien inaktivaatio on irreversiibeli, siihen ei vaikuta liittyvän kofaktoreita ja se tapahtuu tehokkuudella, joka viittaa siihen, että geloniini vaikut-: taa entsymaattisesti.

25 Lukuiset aiemmat työskentelijät on esittäneet sy- • · · . totoksisten aineiden kytkemistä vasta-aineisiin "immuno- toksiinien" valmistamiseksi, tai raportoineet tästä. Eri- *I‘*. tyisen kiinnostavia ovat olleet immunotoksiinit, joissa • · · monoklonaalisia vasta-aineita on konjugoitu bakteeri- tai • · · *·’ * 30 kasvialkuperää olevien toksiinien kuten risiinin tai ab- riinin entsymaattisesti aktiivisiin osiin (A-ketjut) (Ne- • · · ·.· * velle et ai. . Immunol.Rev. 62 (1982) 75 - 92; Ross et ai. , V : European J.Biochem. 104 (1980) 104; Vitteta et ai., .···. Immunol. Rev. 62 (1982) 158 - 183; Ross et ai. . Cancer Res.

35 42. (1982) 457 - 464; Trowbridge ja Domingo, Nature (Cond.) 294 (1981) 171 - 173).

• · · • · · · • · 5 104234

Geloniini ja risiini ovat aktiivisimpia proteiini-synteesiä inhiboivia toksiineja proteiinipainon nojalla. Geloniini on 10 - 1 000 kertaa aktiivisempi proteiinisynteesin inhiboinnissa kuin risiinin A-ketju. Risiinin ja 5 abriinin kaltaiset peptidit koostuvat kahdesta ketjusta, A-ketjusta, joka on myrkyllinen yksikkö, ja B-ketjusta, joka toimii sitoutumalla soluihin. Vastoin kuin risiini ja abriini geloniini koostuu yhdestä ketjusta, ja koska siitä puuttuu B-ketju soluihin sitoutumiseksi, se sinänsä on 10 suhteellisen myrkytön ehyille soluille (Stirpe et. ai. . J.Biol .Chem. 255 (1980) 6 947 - 6 953) . Nisäkässoluilta ilmeisesti puuttuu kyky sitoutua natiiviin geloniinimole-kyyliin ja/tai sisäistää se. Konjugaatit geloniinistä ja kasvainkohdenteisesta monoklonaalisesta vasta-aineesta, 15 kuten monoklonaalisesta vasta-aineesta ZME, joka kohdistuu vastaan tietyillä kasvainsoluilla kuten melanoomasoluilla esiintyvää antigeeniä, antavat käyttöön sekä spesifisen menetelmän geloniinin sitomiseksi soluun että tien ge-loniini-vasta-ainekompleksin sisäistämiseksi. Yksi eduista 20 käytettäessä toksiinia geloniini verrattuna toksiinien kuten risiinin A-ketjun käyttöön on alentunut myrkyllisyys normaaleille kudoksille risiinin A-ketjuun verrattuna. Geloniini kytkettynä monoklonaaliseen vasta-aineeseen, ·.· | joka kohdistuu anti-kasvainliitteiseen antigeeniin, on 25 aktiivinen ja selektiivinen immunotoksinen aine kasvainte- • · · ; j*j rapiaan.

• · ·

Aiemmissa tutkimuksissa on kuvattu lukuisia gelo- ···· .·. : niiniä sisältäviä vasta-aine-toksiinikonjugaatteja (Lam- • # · I..' bert et al^., J. Biol. Chem. 260 (1985) 12 035 - 12 038; ' 30 Thorpe et ai. . Eur. J. Biochem. 116 (1981) 447 - 454;

Singh et al^., J. Biol. Chem. 264 (1989) 3 089 - 3 095; *·* * Scott et ai. . J. Natl. Cancer Inst. 79 (1987) 1 163 - • V : 1 172; Tedder et ai.. J. Immunol. 137:4 (1986) 1 387 - .***. 1 391) . Vast'ikään Ozawa et ai. (Int. J. Cancer 43 152 - 35 157) ovat rakentaneet geloniini-immunotoksiinin, joka kä- • * « • » » * · • · 6 104234 sittää vasta-ainetta B467, joka sitoutuu orvaskeden kasvutekijän (EGF) solureseptoriin. Tämä B467-geloniinikonju-gaatti oli hyvin sytotoksinen EGF-reseptorin ilmentäville soluille, mutta ei ollut sytotoksinen soluille, joista 5 reseptori puuttui. Sivam et ai. (Cancer Research 47 (1987) 3169 - 3173) ovat valmistaneet konjugaatin melanoomavas-taisesta vasta-aineesta 9.2.2.7 geloniinin kanssa ja verranneet sytotoksista aktiivisuutta in vitro ja in vivo 9.2.2.7-konjugaattiin abriinin ja risiinin A-ketjusta. 10 Nämä tutkimukset osoittivat, että geloniinikonjugaatit osoittavat huomattavia sytotoksisia vaikutuksia selektiivisesti vastaan antigeenipositiivisia soluja in vitro. In vivo -kokeet osoittivat, että geloniinikonjugaatit eivät ole myrkyllisiä aina 2 mg:n kokonaisvasta-aineannokseen/ 15 hiiri ja että geloniini-immunotoksiinin monikertainen antaminen i♦v. hidasti merkittävästi vakiintuneen ihonalaisen ihmiskasvainsiirteen kasvua paljaissa hiirissä. Verrattuna konjugaatteihin abriinin ja risiinin kanssa gelo-niinikonjugaateilla vaikuttaa olevan samanlainen teho, 20 parempi selektiivisyys ja kasvainpaikannus merkittävämpien terapeuttisten ominaisuuksien in vivo ohella.

Koska vasta-aine, johon lääke, toksiini tai radioaktiivinen leima on kytketty, sitoutuu vain kasvainsolui-j· j hin, jotka ilmentävät spesifisen antigeenin, vain kas- 25 vainsolut kuolevat. Päinvastoin säteilyterapian kohdalla • · · ; ;*j säteily radioleimatuista yhdisteistä ei rajoitu yksinomaan • · · kasvainsoluihin, jotka vastaanottavat säteilyn.

• · · · .·. : Esimerkiksi vasta-aineen aineenvaihdunnallisessa tai ent- • · · symaattisessa hajoamisessa radioleima voi vapautua, joi- * · i * 30 loin mahdollistuu sen jakautuminen muihin kudoksiin kuten munuaisiin tai luuytimeen, joka aiheuttaa ei-hyväksyttävää • · · V * säteilyvahinkoa näille elimille. Radioleimatut vasta-ai- • · · V · neet kärsivät ongelmista, jotka rajoittavat tai mutkista- .··*. vat niiden käyttöä terapeuttisina aineina.

• · • · · • · · · • · 7 104234

Yhteenveto keksinnöstä

Esillä oleva keksintö koskee menetelmää immunokon-jugaattien valmistamiseksi vasta-aineesta (jota tässä kutsutaan ZME-018:ksi), joka tunnistaa GP 240 -antigeenin me-5 lanoomasyöpäsoluilla. Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään. Yksi vasta-aineista (225.28S), joita Wilson et ai. käsittelevät (Wilson e£ ai. . Int. J. Cancer 28 (1981) 293) , tunnistaa tämän melanoomamembraaniantigeenin. Tämä anti-10 geeni identifioidaan em. julkaisussa nimellä GP 240. Vasta-aine 225.28S, joka sitoutuu GP 240 -antigeeniin, on nimetty ZMA-018:ksi, joksi sitä tässä jatkossa kutsutaan. Yhdessä suoritusmuodossa vasta-aine kytketään toksiiniin, joka valitaan ryhmästä, jonka muodostavat geloniini, ri-15 siinin A-ketju ja abriinin A-ketju. Toisessa suoritusmuodossa ZME-vasta-aine voidaan kytkeä soluja tappavaan lääkkeeseen kuten adriamysiiniin tai biologisen vasteen modifioi jaan kuten lymfokiiniin tai sytokiiniin. Toisessa suoritusmuodossa vasta-aine voidaan leimata todettavalla lei-20 maila kuten radioleimalla, kemiluminoijalla, fluoresoijal-la tai entsyymileimalla. Soluja tappavat immunokonjugaatit ovat käyttökelpoisia kasvainliitteisen GP 240:n käsittävien kasvainten hoitamiseksi ja uusiutumisen estämiseksi ·,· 1 antamalla näitä soluja tappavia immunokonjugaatteja täl- 25 laista hoitoa tarvitsevalle yksilölle. Todettavasti leima- : j1: tut ZME-immunokonjugaatit ovat käyttökelpoisia kasvainten • · · diagnosoimiseksi ja paikantamiseksi alan ammattilaisille ···· .·. : tutuilla tekniikoilla. Nämä leimatut immunokonjugaatit • · · ovat samoin käyttökelpoisia GP 240 -antigeenin läsnäolon • · · * 30 määrittämiseksi biologisista näytteistä sekä kasvainkohdan paikantamiseksi in vivo alan ammattilaisille tutuilla kei- *·1 1 noilla.

• · · V: Yksi esillä olevan keksinnön päämäärä on antaa käyttöön sytotoksinen koostumus, joka sitoutuisi spesifi- • · · 35 sesti kasvainsoluihin ja tappaisi niitä. Erityisesti esil- · · • « · · • · · · · • · 8 104234 lä olevan keksinnön päämäärä on antaa käyttöön sytotok-sinen koostumus, joka sitoutuisi spesifisesti kas-vainsoluihin ja tappaisi kasvainsolut, jotka ilmentävät GP 240 -antigeenin edellä kuvatun mukaisesti. Vasta-aineen 5 ZME-018 valmisti Hybritech, Inc., käyttäen suola- fraktiointia ja DEAE-kromatografiaa ja se pääteltiin homogeeniseksi SDS-PAGE :11a (Wilson et ai.. Int. J. Cancer 28 (1981) 293 - 300). Keksinnön toinen näkökohta koskee menetelmää ihmisen melanoonasolujen tappamiseksi, tai min-10 kä tahansa muiden kasvainsolujen, jotka ilmentävät ZME-(GP 240 -) antigeenin, saattamalla solut kosketuksiin soluja tappavana tehokkaan määrän immunotoksiinia kanssa.

Esillä olevan keksinnön seuraava päämäärä on antaa käyttöön tällainen koostumus, joka olisi myrkyllinen kas-15 vainsoluille mutta aiheuttaisi (vain) minimaalisen vaurion normaalille kudokselle.

Kuvaus piirroksista

Kuviossa 1 esitetään kytkemis- ja puhdistuskaavio ZME-geloniinille.

20 Kuviossa 2 esitetään ZME-geloniinin puhdistus S- 300-geelipermeaatiokromatografiällä.

Kuviossa 3 esitetään eluutioprofiili, joka saatiin Cibachron-Blue-sefaroosikolonnista, johon panostettiin » ·· | S-300-kromatografiästä materiaali, jonka molekyylipaino 25 oli korkea, ja eluoitiin käyttäen lineaarista suolagra- ; dienttia (0 - 300 mM NaCl) . Osoitettiin kaksi proteiini- ··· piikkiä: läpivirtauspiikki (fraktiot 14 - 20) ja korkealla /*’; suolapitoisuudella eluoitu sitoutunut piikki (fraktiot λ.' 44 - 75) .

• · · • · · , , , ’ 30 Kuviossa 4 esitetään geloniinin ja ZME-gelomim- konjugaatin elektroforeettinen kuvio.

* Kuviossa 5 esitetään vertailevat ELISA-määritystu- ··· ·.· : lostiedot ZME:lle (avoimet ympyrät) ja ZME-geloniinille (umpinaiset ympyrät) .

35 Kuviossa 6 esitetään ZME-geloniinin ja vapaan ge- « · • loniinin sytotoksisuus log-faasi-AAB-527-soluille 72 tun- nin altistuksen jälkeen.

« · 9 104234

Kuviossa 7 esitetään ZME-geloniinin ja vapaan ge-loniinin sytotoksisuus log-faasi-AAB-527-soluille.

Kuviossa 8 esitetään ZME-geloniinin sytotoksisuus antigeenipositiivisille kohdemelanoomasoluille (AAB-527) 5 ja antigeeninegatiivisille T-24-soluille viljelmässä.

Kuviossa 9 esitetään vapaan vasta-aineen vaikutus ZME-geloniinin sytotoksisuuteen.

Kuviossa 10 esitetään IFN-am, IFN-gamman ja TNF:n vaikutus ZME-geloniinin sytotoksisuuteen. Umpinaiset ympy-10 rät osoittavat annos-vasteen ZME-geloniinille yksinään.

Avoimet nelikulmiot osoittavat annos-vasteen yhdistelmälle ZME-geloniini + IFN-gamma. Avoimet kolmiot osoittavat annos-vasteen ZME-geloniinille kiinteän määrän TNF-a:aa läsnä ollessa. Umpinaiset ympyrät, joihin liittyy pisteviiva, 15 esittävät ZME-geloniinin annos-vastekuvaajaa kiinteän mää rän IFN-a:aa läsnä ollessa.

Kuvio 11 esittää ZME-geloniinin vaikutusta anti-geenipositiivisiin (A-375, umpinaiset ympyrät) ja anti-geeninegatiivisiin (CEM, avoimet nelikulmiot) soluihin 20 ihmiskasvainkantasolumäärityksessä.

Kuvio 12 esittää ZME-geloniinin sytotoksista vaikutusta kantasolujen eri solulinjoista, jotka saatiin tuoreista kudosnäytteistä 4:stä eri potilaasta, eloon-: jääntiin.

• · ♦ : 25 Kuvio 13 esittää ZME-vasta-aineen ja ZME-gelonii- t nikonjugaatin kudosjakaumaa ihmismelanoomasiirteitä kä- ··· ♦♦· sittävissä paljaissa hiirissä.

··#· : Yksityiskohtainen kuvaus keksinnöstä Tässä käytettynä ilmaisulla "monoklonaalinen vasta- • · · 30 aine" tarkoitetaan vasta-ainekoostumusta, jossa vasta-ai- nepopulaatio on homogeeninen. Vasta-aineen lähteen tai • · · '·* * tavan, jolla se valmistettiin, ei tarkoiteta rajoittavan * · · sitä.

«

Melanoomasolut ilmentävät 240 kd:n (GP 240 -) an- • · · 35 tigeenin solupinnallaan. On tuotettu tämän antigeenin « ·*· ·>·· * • · 10 104234 vastaisia vasta-aineita. Vasta-aine ZME-018 (valmistajalta Hybritech, Inc.) on hiiren monoklonaalinen vasta-aine IgG2a, joka tunnistaa 240 kd:n glykoproteiinin, joka esiintyy valtaosassa ihmisen melanoomasoluja. Voidaan tuottaa 5 isotyyppejä IgGlf IgG2a ja IgG2b vastaavia monoklonaalisia vasta-aineita, jotka tunnistavat epitoopin tästä 240 kd:n antigeenistä. Tämä ZME-antigeenin 240 kd:n epitooppi nimetään tämän keksinnön tarkoituksiin ZME-epitoopiksi. Täten kaikki vasta-aineet, jotka tunnistavat tämän ZME-epitoo-10 pin, ovat funktionaalisesti samanarvoisia.

Nämä edustavat hybridoomaviljelmät, joiden solut erittävät samaa idiotyyppiä olevaa vasta-ainetta, eli kaikki tunnistavat ZME-epitoopin, on talletettu talletus-laitokseen the American Type Culture Collection, 12 301 15 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20 852 ("ATCC"), jossa niille on annettu hakunumero _.

Nämä monoklonaaliset vasta-aineet voidaan valmistaa alan ammattilaisten tuntemilla menetelmillä. Näitä vasta-aineita tuottavien hybridoomasoluviljelmien karakterisoin-20 tia ja menettelyä niiden valmistamiseksi kuvataan yksityiskohtaisesti. (Wilson et ai.. Int. J. Cancer 28 (1981) 293; Imai et. ai. . Transplant Proc. 12 (1980) 380 -383) .

Lyhyesti, hybridoomat valmistettiin käyttäen hiirimyeloo-:,· · masolulinjaa Sp2/0-Ag-14 ja pernasoluja hiiristä, jotka • ”ί 25 oli immunoitu melanoomasolulinjalla M21, kuten kuvaavat • ·1: Imai et ai. (Transplant Proc. 12 (1980) 380 - 383) . Hyb-

Ml ridoomat, jotka erittävät monoklonaalista vasta-ainetta ···· ,·, ; (MoAb) 225.28S ja 465.12, on alakloonattu ja niitä on li- • ·· #I··’ säännytetty in vitro ja in vivo. Kummatkin monoklonaaliset • · · * 30 vasta-aineet ovat IgG2a-alaluokkaa ja ne puhdistettiin hii ren vatsaontelonesteestä absorptiolla/eluutiolla proteii- ♦ · · *·1 1 ni-A-Sepharose 4B:stä (Pharmacia, Piscataway, NJ, USA) ♦ 1·1· V 1 ennen niiden käyttöä.

Hybridoomia, jotka tuottavat vasta-aineita, jotka • · « 35 reagoivat ihmisen melanoomasolujen kanssa mutta eivät • · *

M

* • · » · • t » ·1 « · 11 104234 normaalien ihmissolujen kanssa, karakterisoitiin edelleen. ZME-solulinjan ja hybridooman, joka tuottaa funk-tionaalisesti samanarvoisia vasta-aineita, tuottamat vasta-aineet reagoivat ZME-antigeenin kanssa ihmisen mela-5 noomasoluilla. Ne reagoivat myös 70 - 80 %:n testatuista satunnaisesti saaduista melanoomista kanssa, eivätkä osoittaneet mitään reaktiota eri kudoksien suhteen taulukossa 1 esimerkissä 4 esitetyn yhteenvedon mukaisesti.

Tässä mallina esitetyistä hiiren monoklonaalisista 10 anti-ihmismelanoomavasta-aineista käytettynä ilmaisulla "funktionaalinen ekvivalentti" tarkoitetaan monoklonaa-lista vasta-ainetta, (1) joka ristisalpaa mallina esitetyn monoklonaalisen vasta-aineen; (b) joka sitoutuu selektiivisesti ZMA-antigeenin ilmentäviin soluihin kuten ihmisen 15 melanoomasolut; (c) jonka isotyyppi on G tai M; (d) joka sitoutuu ZMA-antigeeniin määritettynä immuunisaostuksella tai sandwich-immuunimäärityksellä; ja (e) joka geloniiniin konjugoituna osoittaa kudosviljelmäinhibitioannosta (TCID) ainakin 50 % vastaan ainakin yhtä AAB-527- tai A375-solu-20 linjoista käytettynä annoksena 80 -100 yksikköä/ml.

Vasta-aine ZME konjugoitiin geloniiniin käyttäen N-sukkinimidyyli-3-(2-pyridyyliditio)propionaattia (SPDP) : ;*: tai 2-iminotiolaania (IT) kytkentäaineena. Konjugaatteja ««« · .·*·. testattiin vastaan AAB-527- ja A375-soluja 72 tunnin ku- « « · . .·. 25 dosviljelmämäärityksessä. Vasta-ainekonjugaatit osoittivat • « ·

hyväksyttävää lisääntymisvastaista aktiivisuutta (TCID

*:**. 50 % alle 100 yksiköllä/ml) vastaan kumpaakin näistä solu- • · · linjoista.

• · · '·* * Lisää yksityiskohtia vasta-aineiden karakterisoin- 1 nista esitetään alla esimerkeissä.

·«· * Immunokemikaalit : Tämän keksinnön mukaiset immunokemialliset johdan- '···' naiset, joiden merkitys on ensiarvoinen, ovat immunotok- siineja (konjugaatteja ZMA-vasta-aineesta ja sytotoksi-. 35 sesta ryhmästä tai biologisen vasteen modifioijasta) ja • · · · » · 12 104234 leimattuja (esim. radioleimattuja, entsyymileimattuja tai fluorokromileimattuja) johdannaisia, joissa leima tarjoaa keinon immuunikompleksien identifioimiseksi, jotka sisältävät leimatun vasta-aineen.

5 Immunotoksiinin sytotoksinen ryhmä voi olla syto- toksinen lääke tai entsymaattisesti aktiivinen toksiini bakteeri- tai kasvialkuperää (geloniini), tai entsymaattisesti aktiivinen fragmentti ("A-ketju") tällaisesta toksiinista. Entsymaattisesti aktiiviset toksiinit ja 10 niiden fragmentit ovat edullisia ja niistä ovat esimerkkejä geloniini, difteria-A-ketju, difteriatoksiinin ei-sitoutuvat aktiiviset fragmentit, eksotoksiini-A-ketju (Pseudomonas aeruginosasta), risiinin A-ketju, abriinin A-ketju, modessiinin A-ketju, alfa-sarsiini, Aleurites for-15 dii -proteiinit, diantiiniproteiinit, Phvtoiacca americana -proteiinit (PAPI, PAII ja PAP-S), Momordica charantia -inhibiittori, kursiini, krotiini, Saponaria officinalis -inhibiittori, mitogelliini, restriktosiini, fenomysiini ja enomysiini. Edullisin on konjugointi geloniiniin.

20 Biologisen vasteen modifioijia, joita voidaan kyt keä ZMA-vasta-aineeseen ja käyttää esillä olevassa keksinnössä ovat mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta lym-; fokiinit ja sytokiinit kuten IL-1, IL-2, interferonit .···. (α, β tai gamma), TNF, LT, TGF-β ja IL-6. Näillä biologi- /.·. 25 sen vasteen modifioijilla on erilaisia vaikutuksia kas- * i i **I vainsoluihin. Näitä vaikutuksia ovat lisääntynyt kasvain- • · · solujen tappaminen suoralla vaikutuksella sekä kasvanut • · · *·1· kasvainsolujen tappaminen lisääntyneillä isäntäpuolustus- * · · *.1 ’ välitteisillä prosesseilla. Vasta-aineen ZME konjugointi 30 näihin biologisen vasteen modifioijiin mahdollistaa selek- • · · ·/· · tiivisen paikannuksen kasvaimiin ja siten aiempaa paremmat lisääntymisvastaiset vaikutukset samalla, kun myrkyllisyy-teen ei-kohdesoluille johtavat ei-spesifiset vaikutukset **’. tukahdutetaan.

35 Sytotoksisia lääkkeitä, jotka ovat käyttökelpoisia *:1 esillä olevassa keksinnössä, ovat mainittuihin kuitenkaan • · · · « 13 104234 rajoittumatta adriamysiini (ja sen johdannaiset), cis-platinakompleksi (ja sen johdannaiset), bleomysiini ja metotreksaatti (ja sen johdannaiset). Nämä sytotoksiset lääkkeet ovat toisinaan käyttökelpoisia uusiutuvien kas-5 vainten ja etenkin melanooman kliiniseen hallintaan, mutta niiden käyttöä mutkistavat vakavat sivuvaikutukset sekä ei-kohdesoluille aiheutunut vahinko. Vasta-aine ZME voi toimia käyttökelpoisena kantajana tällaisille lääkkeille antaen käyttöön tehokkaan keinon sekä kuljetukseen kasvai-10 men luo että tehostuneeseen työntymiseen itse kasvainso-luihin. Lisäksi sytotoksisten lääkkeiden spesifinen vasta-ainekuljetus kasvainten luo tarjoaa suojaa herkille kohdille kuten maksa, munuainen ja luuydin kemoterapeuttisten aineiden haitalliselta vaikutukselta. Vasta-aineeseen ZMA 15 kuljetussysteeminä konjugoitujen lääkkeiden käyttö mahdollistaa itse lääkkeen alhaisemman annostuksen, koska kaikki lääkeryhmät on konjugoitu vasta-aineisiin, jotka konsent-roituvat kasvaimeen.

Monoklonaalisen vasta-aineen konjugaatteja voidaan 20 valmistaa käyttäen erilaisia bifunktionaalisia proteiini- kytkentäaineita. Esimerkkejä tällaisista reagensseista ovat SPDP, IT, imidoesterien kuten dimetyyliadipimidaatin ; bifunktionaaliset johdannaiset. HCl:ää, aktiivisia este- • · · · .·”. reitä kuten disukkinimidyylisuberaatti, aldehydejä kuten « · * , ,·. 25 glutaarialdehydi, bis-atsidoyhdisteitä kuten bis(p-atsi- **!t dobentsoyyli) heksaanidiamiini, bis-diatsoniumjohdannaisia *!*'. kuten bis-(p-diatsoniumbentsoyyli) etyleenidiamiini, di- • · · *·./ isosyanaatteja kuten tolyleeni-2,6-di-isosyanaatti ja bis- • · · *·* aktiivisia fluoriyhdisteitä kuten 1,5-dif luori-2,4-dinit- 1 2 3 4 5 6 • · robentseeni (voidaan käyttää).

2 • · · V · Käytettäessä konjugaatteja ihmisen melanoomasolujen 3 : tappamiseksi in vitro terapeuttisiin tai diagnostisiin 4 y*·' tarkoituksiin ne tyypillisesti lisätään soluviljelykasvu- 5 • · alustaan pitoisuutena ainakin noin 10 nM. Koostaminen ja 6 antotapa eivät ole in vitro -käyttöön kriittisiä. Normaa- • · · • · · 14 104234 listi käytetään vesipohjaisia koostumuksia, jotka sopivat viljely- tai perfuusioväliaineeseen.

Sytotoksisia radiolääkeaineita ZME-antigeenin käsittävien kasvainten kuten melanooman diagnosoimiseksi ja 5 hoitamiseksi voidaan valmistaa konjugoimalla korkean lineaarisen energiasiirron (LET) emittoivia isotooppeja vasta-aineisiin. Tässä käytettynä ilmaisun "sytotoksinen ryhmä" tarkoitetaan kattavan tällaiset isotoopit.

Leimoihin, joita käytetään leimattujen muunnosten 10 valmistamiseksi vasta-aineista, kuuluvat ryhmät, jotka voidaan todeta suoraan, kuten fluorokromit ja radioleimat sekä ryhmät, kuten entsyymit, jotka on saatettava reagoimaan tai joista on muodostettava johdannainen niiden toteamiseksi. Esimerkkejä tällaisista leimoista ovat 1 2 3 4 5 6P, 15 125I, 3H, 14C, fluoreseiini ja sen johdannaiset, rodamiini ja sen johdannaiset, dansyyli, umbelliferoni, lusiferia, 2,3-dihydroftalatsaiinidionit, piparjuuriperoksidaasi, alkali-nen fosfataasi, lysotsyymi ja glukoosi-6-fosfaattidehydro-genaasi. Vasta-aineisiin voidaan liittää tällaisia leimoja 20 tunnetuilla menetelmillä. Esimerkiksi kytkentäaineita kuten aldehydejä, karbodi-imidejä, dimaleimidiä, imidaatte-ja, sukkinimidejä, bis-diatsotoitua bentsadiinia ja vas- : taavia voidaan käyttää vasta-aineiden kytkemiseksi edellä • · · < .···. kuvattuihin fluoresoija-, kemiluminoi ja- ja entsyymi- • · · . .·. 25 leimoihin.

• · «

Vasta-aineita ja leimattuja vasta-aineita voidaan *;**, käyttää erilaisissa immuunikuvannus- tai immuunimääritys- • · · *·^· menettelyissä ZMA-antigeenin ilmentävien kasvainten kuten • ♦ ♦ ’·* * melanooman läsnäolon potilaassa toteamiseksi tai tällaisen syövän tilan tarkkailemiseksi potilaassa, josta se on jo 2 »·· 3 ί.ί · diagnosoitu. Käytössä syövän tilan tarkkailemiseksi voi- 4 :*Γ: daan käyttää kvantitatiivista immuunimääritysmenettelyä.

5 Tällaisia tarkkailumäärityksiä suoritetaan ajoittain ja tuloksia verrataan sen määrittämiseksi, onko potilaan kas- 6 vainkuorma kasvanut vai laskenut. Tavanomaisia määritys- » • · · · 15 104234 tekniikoita, joita voidaan käyttää, ovat suorat ja epäsuorat määritykset. Suorissa määrityksissä kudosnäytettä tai soluja potilaasta inkuboidaan leimatulla vasta-aineella. Jos näytteen ZMA-antigeenin käsittäviin soluihin 5 kuuluu melanoomasoluja, leimattu vasta-aine sitoutuu näihin soluihin. Kudos tai solut pestään ei-sitoutuneen leimatun vasta-aineen poistamiseksi, minkä jälkeen kudosnäytteestä tarkastetaan leimattujen immuunikompleksien läsnäolo .

10 Diagnostiseen käyttöön vasta-aineet tyypillisesti annetaan käyttöön pakkauksen muodossa. Nämä pakkaukset käsittävät tyypillisesti: vasta-aineen leimatussa muodossa sopivissa säilytysastioissa, reagensseja inkubointeihin ja pesuihin ja substraatteja tai johdannaismuodostusaineita 15 riippuen leiman luonteesta. Mukaan voidaan sisällyttää myös antigeeni-ZME-verrokkeja ja ohjeita.

Esillä olevan keksinnön mukaisten immunotoksiinien antaminen yksilölle, jolla on diagnosoitu olevan ZME-an- tigeenimääreen käsittävä kasvain, mahdollistaa sytotoksi- 20 sen aineen kohdistamisen ja konsentroinnin kohtaan, jossa sitä tarvitaan tappamaan kasvainsoluja. Näin kohdistamalla sytotoksiset aineet ei-spesifinen myrkyllisyys muille eli- : mille, kudoksille ja soluille eliminoidaan tai sitä « · · · lasketaan.

• · • · . .·. 25 In vivo -terapiassa käytettyinä immunotoksiineja **·. annetaan potilaalle terapeuttisesti tehokkaina määrinä *!*’. (eli määrinä, jotka poistavat potilaan kasvainkuorman tai *..* alentavat sitä) . Ne annetaan normaalisti ruoansulatuska- • · · ’·* navan ulkopuolisesti, edullisesti laskimonsisäisesti. An- 30 nos ja annostusohjelma riippuvat syövän luonteesta (prima- ··· V * arinen vai etäispesäkkeitä muodostava) ja sen populaatios- • · · ί#ί ! ta, nimenomaisen immunotoksiinin ominaispiirteistä, esim.

.···, sen terapeuttisesta indeksistä, potilaasta ja potilashis- • · toriasta. Annettu immunotoksiinimäärä on tyypillisesti • · . 35 noin 0,1 - noin 10 mg/kg potilaan painoa.

• * · • · · · « · 16 104234

Ruoansulatuskanavan ulkopuolista antoa varten im-munotoksiinit koostetaan ruiskeena annettavaan yksikkö an-nostusmuotoon (liuos, suspensio, emulsio) yhdistettynä farmaseuttisesti hyväksyttävään, ruoansulatuskanavan ul-5 koisesti käytettyyn nestemäiseen kantajaan. Tällaiset nestemäiset kantajat ovat luontaisesti myrkyttömiä ja ei-terapeuttisia. Esimerkkejä tällaisista nestemäisistä kantajista ovat vesi, suolaliuos, Ringerin liuos, dekstroo-siliuos ja 5-%:inen ihmisseerumialbumiini. Voidaan samoin 10 käyttää nestemäisiä ei-vesikantajia kuten rasvaöljyjä ja etyylioleaattia. Liposomeja voidaan käyttää kantajina. Kantaja voi sisältää pieniä määriä lisäaineita, kuten aineita, jotka parantavat isotoonisuutta ja kemiallista stabiilisuutta, esim. puskureita ja säilytysaineita. Im-15 munotoksiini koostetaan tyyppillisesti tällaisiin nestemäisiin kantajiin pitoisuuksiksi noin 0,1 mg/ml -10 mg/ml.

Geloniinitoksiini puhdistettiin GeIonium multiflo-rumin siemenistä Stirpen et ai. menetelmällä. Lyhyesti, 20 geloniini uutettiin siemenistä homogenisoimalla puskuroidussa suolaliuoksessa (pH 7,4.) Supernatantti haihdutettiin kuiviin dialyysin vastaan 5 mM natriumfosfaatti-; liuosta (pH 6,5) jälkeen ja geloniinia puhdistettiin edelleen ioninvaihtokromatografisesti kuten kuvataan esi- • · * . 25 merkissä 1. Geloniinitoksiinin puhtaus määritettiin kor- • ♦ ♦ keapainenestekromatografisesti (HPLC) ja natriumdodesyy- *!**. lisulfaattipolyakryyliamidigeelielektroforeesilla (SDS - *..* AGE) . Geloniinitoksiini kulki yhtenä nauhana likimääräisen • · · ’·* * molekyylipainon ollessa 29 - 30 000 daltonia.

30 Geloniinitoksiinin aktiivisuus mitattiin kuten ku- ··· V · vataan esimerkissä 2 proteiinisynteesi-inhibitiosta soluja • · · · sisältämättömässä systeemissä.

.···. Vasta-aine ZME-018, jota modifioitiin SPDP:llä ku- ten kuvataan esimerkissä 5, konjugoitiin iminotiolaanilla . 35 modifioituun geloniiniin kuten kuvataan esimerkissä 3 ja « • » · » • « « · « • · 17 104234 6. Geloniiniin konjugoitua vasta-ainetta puhdistettiin kuten kuvataan esimerkissä 7 kolonnikromatografisesti Sephadex-G-75-kolonni s sa.

Geloniiniin konjugoidun vasta-aineen myrkyllisyys 5 määritettiin proteiinisynteesin inhibitiosta ja sen li-sääntymisvastainen aktiivisuus määritettiin in vitro - ja in vivo -kokeilla.

Seuraavat esimerkit antavat yksityiskohtaisen kuvauksen tämän keksinnön mukaisten immunotoksiini-monoklo-10 naalisten vasta-aineiden valmistuksesta, karakterisoinnista ja käytöstä. Näiden esimerkkien ei tarkoiteta rajoittavan keksintöä millään tavalla.

Esimerkki 1

Geloniinin puhdistus 15 Gelonium multiflorum -siemenet kuorittiin ja päh kinät jauhettiin homogenisaattorissa 8 tilavuudessa 0,14 M NaCl-liuosta, joka sisälsi pitoisuuden 5 mM natriumfos-faatti (pH 7,4). Homogenaatti jätettiin yöksi 4 °C:seen, jona aikana sitä jatkuvasti sekoitettiin, se jäähdytettiin 20 jäissä ja sitä sentrifugoitiin 35 000 x g:ssä 20 minuutin ajan 0 °C:ssa. Supernatantti poistettiin, sitä dialysoitiin vastaan 5 mM natriumfosfaattiliuosta (pH 6,5) ja se kon-; sentroitiin käyttäen pmlO-suodatinta. Näyte asetettiin .···. kerrokseksi CM-52-ioninvaihtokolonnille (20 x 1,5 cm), • · · . .·. 25 jota oli tasapainoitettu 5 mM natriumfo • · · sfaattiliuoksella (pH 6,5). Materiaali, joka sitoutui

**.**, ioninvaihtohartsiin, eluoitiin käyttäen 400 ml 0 - 0,3 M

• · · ’;/* lineaarista NaCl-gradienttia nopeudella 25 ml tunnissa • · · *·' ’ 4 °C:ssa. Kerättiin 5 ml:n fraktioita. Fraktioita tarkkail- 1 tiin 280 nmtssä spektrofotometrissä. Geloniini eluoitui • · · V * fraktioissa noin 55 - 70 ja oli viimeinen suuri eluoituva : piikki. Fraktiot 55 - 70 yhdistettiin pooliksi, jota dia- ·*·.. lysoitiin vastaan kahteen kertaan tislattua vettä ja joka haihdutettiin kylmäkuivaamalla. Kunkin valmisteen puhtaus . 35 ja molekyylipaino tutkittiin korkeapainenestekromatogra- • · » • · · · • « * · · • · 18 104234 fialla käyttäen TSK 3 000 -geelipermeaatiokolonnia ja 50 mM natriumfosfaattipuskuria, pH 7,4, sekä elektroforeesia 15-%:isessa natriumdodesyylisulfaattipolyakryyliamidi-geelissä (SDS-PAGE). Geloniini liikkui yhtenä nauhana, 5 joka vastasi likimääräistä molekyylipainoa 29 - 30 000 daltonia.

Esimerkki 2

Geloniiniaktiivisuuden määritys

Geloniiniaktiivisuutta tarkkailtiin soluvapaalla 10 proteiinisynteesin inhibitiomäärityksellä. Soluvapaa pro teiinisynteesin inhibitiomääritys suoritettiin lisäämällä peräkkäin 50 /iltaan kaniinin retikulosyyttilysaattia, joka sulatettiin juuri ennen käyttöä, sekoittaen kunkin lisäyksen jälkeen seuraavat ainesosat: 0,5 ml 0,2 M Tris-HCltää 15 (pH 7,8), 8,9 ml etyleeniglykolia ja 0,25 ml 1 M HCltää.

(Otettiin) 20 μΐ suola-aminohappoenergiaseosta (SAEM), joka koostui seuraavista: 0,375 M KC1, 10 mM

Mg(CH3C02)2, 15 mM glukoosi, 0,25 - 10 mM aminohappoja (ei leusiinia) , 5 mM ATP, 1 mM GTP, 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 10 μΐ kreatiniinifosfaattikreatiniinifosfokinaasia, 8 μΐ 14C-leusiinia (Amersham, 348 mCi mmol), ja lisättiin 1,5 μΐ liuoksia, jotka sisälsivät vaihtelevia pitoisuuksia gelo-: niiniseosta. Seosta inkuboitiin 60 minuutin ajan 30 °C:ssa.

IM · 14C-leusiininottoa tarkkailtiin seosnäytteestä saostamalla • 11 . .·, 25 syntetisoitu proteiini lasikuitusuodattimille, pesemällä • · · |j# 10-%:isella TCAtlla ja asetonilla ja tarkkailemalla radio- *!**, aktiivisuutta beta-laskijalla käyttäen Aquasol-tuikenes- tettä. Geloniiniä, jonka spesifinen aktiivisuus ei alitta- • · « nut 4 x 109 yksikköä/mg, käytettiin konjugoinnissa vasta-30 aineisiin. Geloniiniaktiivisuusyksikkö on se määrä gelo- ··· V · niiniproteiinia, joka aikaansaa 50 %:n inhibition [14C] - ··· V · leusiinin otossa proteiiniin soluvapaassa määrityksessä.

.·♦·. Esimerkki 3 • ·

Geloniinin modifiointi iminotiolaanilla . 35 Geloniini fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa konsentroitiin pitoisuuteen noin 2 mg/ml Centricon 10-mik- « • · 19 104234 rokonsentraattorissa. Trietanoliamiinihydrokloridia (TEA/HCl), pH 8,0, ja EDTA:ta lisättiin loppupitoisuuteen 60 mM TEA/HCl ja 1 mM EDTA, pH 8,0. 2-iminotiolaanivaras-toliuosta (20 mM) lisättiin loppupitoisuuteen 1 mM ja 5 näytettä inkuboitiin 90 minuutin ajan 4 °C:ssa typpikaa-suvirrassa.

Iminotiolaaniylimäärä poistettiin geelisuodatuk-sella Sephadex G-25 -kolonnissa (1 x 24 cm) , jota oli esitasapainoitettu 5 mM bis-trisasetaattipuskurilla, pH 10 5,8, joka sisälsi pitoisuudet 50 mM NaCl ja 1 mM EDTA.

Fraktioista analysoitiin proteiinisisältö mikrotiitteri-levyillä käyttäen Bradfordin värisitoutumismääritystä. Lyhyesti, 40 μΐ näytettä, 100 μΐ fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS) ja 40 μΐ väritiivistettä lisättiin ku-15 hunkin kuoppaan. Absorbanssi 600 nm:ssä luettiin Dynatech Microelisa Autoreader -lukijalla. Geloniini eluoituu tyhjät ilavuudessa (fraktiot noin 14 - 20). Nämä fraktiot yhdistettiin pooliksi ja konsentroitiin käyttäen Centricon 10 -mikrokonsentraattoria.

20 Esimerkki 4

Monoklonaalisen vasta-aineen ZME-melanooma-antigeenille valmistus ja karakterisointi : : : Vasta-ainetta erittävät hybridoomat

Yhteen 8 viikon ikäiseen naaraspuoliseen BALB/c-St- • « · . 25 hiireen (SCRF Breeding Colony, La Jolla, Kalif.) ruisku- tettiin vatsaontelon sisäisesti (i .p.) 107 ihmisen me- [·**. lanooma-M21-solua ja 2 viikkoa myöhemmin annettiin tehos- • · · *..1 teenä i ,p. 5 x 106 M21-solua. Yhdelle 50 viikon ikäiselle • e e urospuoliselle NZB/B-hiirelle (SCRF Breeding Colony) an-30 nettiin pohjusteeksi 5 x 10® BW5-melanoomasolua ja tehos- ··· * teenä 5 ruiskeena 5 x 10® BW5-, M51-, Colo 38 -, BW5- ja ·♦· V : M21-melanoomasolua kuukauden välein. Kolmen päivän kulut- .1··. tua tehosteruiskeesta hiiri uhrattiin ja perna poistet- • · tiin, pernasolut irrotettiin skapellilla solulietteen saa- • · . 35 miseksi. Pernasolulietettä käsiteltiin 0,17 M NH4C1- • · · · · 20 104234 liuoksella 0,01 M Trisrissä, pH 7,2, 10 minuutin ajan lyysin aikaansaamiseksi punaisissa verisoluissa. Sitten nämä pernasolut fuusioitiin SP2/0Agl4-soluihin kuten ovat kuvanneet Gefter et ai. (Somat. Cell Genet. 3. (1977) 231) 5 suorittaen seuraavat vähäiset modifikaatiot: 5 x 107 pernasolua ja 107 SP2/0Agl4-solua hybridisoitiin käyttäen 0,3 ml 30-%:ista (v/v) polyetyleeniglykoli-1 000- (PEG-) liuosta (Baker Chemical Co., Phillipsburg, N.J.) MEM:issä. Inkuboinnin PEG:llä jälkeen solut pestiin ja niitä viljel-10 tiin pitoisuutena 2 x 106 solua/ml D-MEMrissa yön yli. Seu-raavana päivänä solut lietettiin 40 ml:aan HAT-kasvualustaa ja (lietettä) pipetoitiin noin 400 kuoppaan (0,1 ml/kuoppa) mikrotiitterilevyille (Costar nro 3 596, Cambridge, Mass.). Yksi pisara (noin 25 μΐ) HAT-15 kasvualustaa lisättiin viikon välein. 2-3 viikon kuluttua jatkotutkimuksiin valittuja hybridoomia viljeltiin D-MEMrissä, joka sisälsi 10 % FBSrää. Hybridoomia lisäänny-tettiin kudosviljelmässä ja niitä kasvatettiin vatsaontelossa BALB/c-hiiressä, jolle oli pohjusteena annettu 20 0,5 ml Pristane-valmistetta (Pfaltz and Bauer, Inc. Stam ford, Conn.). Käytettyä kasvualustaa ja vatsaontelonestet-tä käytettiin vasta-ainelähteenä.

: Hybridoomaklooneja kasvatettiin in vitro tunnettu- » M · jen kudosvil jelytekniikoiden mukaan, jollaisia kuvaavat , .·. 25 Cotten et ai. . Eur. J. Immunol. 3 (1973) 136.

i · ·

Hybridoomia, jotka tuottivat vasta-aineita, jotka *!1’. reagoivat ihmisen melanoomasolujen kanssa mutta eivät • · · •>#1 normaalien ihmissolujen kanssa, karakterisoitiin edelleen.

i · · '·’ 1 Kuten esitetään taulukossa 1, ne eivät reagoineet 30 useimpien testatuista normaaleista kudoksista kanssa. ZME- ·♦· V · solulinjan ja funktionaalisesti samanarvoisia vasta-ainei- ! ta tuottavien hybridoomien tuottamat vasta-aineet reagoi- .···. vat ZME-antigeenin kanssa ihmisen melanooma- kuten M-21- • · soluilla.

• · ♦ · 1 « · • · · ♦ · ♦ · « 21 104234

Taulukko 1

Normaalin kudoksen reaktiivisuus vasta-aineen ZME-018 (225.285)1 kanssa 5 Kudos Reaktiivisuus**

Rakko 0/3

Aivokuori 0/2

Rusto 0/2

Paksusuoli 0/2 10 Nännit 1/2 Pöhjukaissuoli 0/1

Kohdun limakalvo 0/1

Munuainen 0/2

Maksa 0/1 15 Keuhko 0/4

Imusolmuke 0/3

Rintarauhanen 0/3

Munasarja 0/1

Haima 0/1 20 Ääreisveri

Imusolujärjestelmä 0/4 Ääreishermo 0/1 ; Eturauhanen 0/2 «Il «

Sylkirauhanen 0/3 • · · . .·. 25 Luustoon kiinnittynyt lihas 0/1 **.!. Iho 0/5 T1. Perna 0/1 • · · *;./ Maha 0/3 • · ·

Kilpirauhanen 0/2 30 Nielurisa 0/1 ··« V 1 Kivekset 0/5 ··· * · ♦ • · · ,···, 1P. Giacominilta et ai. . Cancer Research 44 (1984) • · 1 281 - 1 287; **Antigeenipositiivisten näytteiden lukumää- • ♦ . 35 rä/testattujen näytteiden lukumäärä ·»· • · · · 22 104234

Esimerkki 5

Monoklonaalisen vasta-aineen ZME-018 modifiointi SPDP:llä N-sukkinimidyyli-3-(2-pyridyyliditio)(propionaat-5 tia) (SPDP) dimetyyliformamidissa valmistettiin varasto- liuokseksi 3 mg/ml kuivassa dimetyyliformamidissa. Koska kiteinen SPDP voi hydrolysoitua, kemiallisesti reaktiivisen ristikytkijän todellinen pitoisuus määritettiin spek-trofotometrisillä menetelmillä analysoimalla absorbanssi 10 260 nm:ssä duaalisädespektrofotometrillä. SPDP-varasto- liuoksen pitoisuus lasketaan seuraavasta yhtälöstä:

Muutos absorbanssissa (260 nm) X (3.01) = mmol/ml/SPDP 0,02 x 103 ml mmol 0,01 15

Yksi mg monoklonaalista vasta-ainetta ZME

1,0 ml:ssa fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS) lisättiin lasiputkeen. SPDP-varastoliuosta lisättiin putkeen hitaasti noin 5-kertainen mooliylimäärä (noin 10 μΐ varas-20 toliuosta) samalla jatkuvasti sekoittaen. Seosta inkuboi-tiin 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa sekoittaen joka 5. minuutti inkubointiaikajakson aikana.

; Reagoimatta jäänyt SPDP-ylimäärä poistettiin näyt- • . I · teestä geelisuodatuskromatografisesti Sephadex G-25 -ko- t i »

, .·, 25 lonnissa (1 x 24 cm) , jota oli esitasapainoitettu 100 mM

• · · natriumfosfaattipuskurilla, pH 7,0, joka sisälsi pitoi- *1**. suuden 0,5 mM EDTA (puskuri A). Fraktioita (0,5 ml) ke- • · · *· *· rättiin ja niistä analysoitiin proteiinisisältö käyttäen • · · *·’ * Bradfordin värisitoutumismääritystä (Bradford, Anal .Bio- 1 2 3 4 5 6 • · chem. 72 (1976) 248 - 254) . Absorbanssia (600 nm) tark- 2 ··· ί.Σ ϊ kailtiin 96-kuoppaisella levyllä käyttäen Bio-TEK Micro- :T: plate Autoreader -lukijaa. Vasta-aine eluoitui tyhjätila- 3 y..' vuudessa (fraktiot 14 - 20) ja nämä fraktiot yhdistettiin 4 • · pooliksi, joka varastoitiin 4 °C:seen. Proteiini konsen- 5 • •«I» 6 troitiin Centricon-30-mikrokonsentraattorissa. Centricon- • · * • at» 104234 23

retentaatti pestiin 100 mM natriumfosfaattipuskurilla, pH

7,0, joka sisälsi EDTArta (0,5 mM) . Vasta-aine konsentroitiin noin 0,5 - 0,75 ml:n lopputilavuuteen.

Esimerkki 6 5 SPDPrllä modifioidun monoklonaalisen vasta-aineen ZME-018 konjugointi iminotiolaanilla modifioituun gelo-niiniin

Yksi mg puhdistettua geloniinia (2 mg/ml PBS:ssä), joka oli valmistetu kuten kuvattiin esimerkissä 1, modi-10 fioitiin iminotiolaanilla kuten kuvattiin esimerkissä 3. Monoklonaalinen vasta-aine ZME, jota oli modifioitu kuten kuvattiin esimerkissä 5, sekoitettiin samaan painoon esimerkin 3 mukaan modifioitua geloniinia. Tämä suhde vastasi geloniinin 5-kertaista mooliylimäärää vasta-aineeseen ver-15 rattuna. Seoksen pH säädettiin 7,0:ksi lisäämällä 0,05 M TEA/HCl-puskuria, pH 8,0, ja seosta inkuboitiin 20 tunnin ajan 4 °C:ssa typpisuojakaasussa. Jodiasetamidia (0,1 M) lisättiin loppupitoisuuteen 2 mM mahdollisesti jäljellä olevien vapaiden sulfhydryyliryhmien salpaamiseksi ja in-20 kubointia jatkettiin vielä tunnin ajan noin 25 °C:ssa. Reaktioseos varastoitiin 4 °C:seen odottamaan puhdistusta geelisuodatuksella.

. .·. Esimerkki 7 • · · • t · · '···' Geloniini-monoklonaalinen vasta-aine 15A8-komplek- • · 25 sien puhdistus **·1 Ei-konjugoitu geloniini ja tuotteet, joiden mole- • · · kyylipaino oli alhainen, poistettiin esimerkin 6 mukai- *. 1: sista reaktioseoksista geelisuodattamalla Sephadex S-300 • ·· ·.· 1 -kolonnissa (1,6 x 31 cm), jota oli esitasapainoitettu 30 PBS:llä.

Reaktioseokset esimerkistä 6 konsentroitiin noin 1 ml:ksi käyttäen Centricon 30 -mikrokonsentraattoria, minkä jälkeen ne panostettiin Sephadex-kolonniin. Kolonni • · *···1 pestiin PBS:llä. Kerättiin 1 ml:n fraktioita ja 50 μ1:η * 1 35 näytteistä analysoitiin proteiini Bradfordin värisitoutu- ··· mismäärityksellä (Bradford, Anal.Biochem. 72 (1976) 248) .

« · « · · 24 104234

Kuten esitetään kuviossa 2, vapaa ja geloniiniin konjugoitu vasta-aine eluoitui tyhjässä tilavuudessa (fraktiot noin 28 - 40), kun taas ei-konjugoitu geloniini eluoituu fraktioissa noin 45 - 65.

5 Ei-konjugoidun ZME-018:n poistamiseksi korkeaa mo- lekyylipainoa vastaava piikki (fraktiot 28 - 40) S-300- kolonnista panostettiin Blue Sepharose CL-6B -affiniteet-tikromatografiakolonniin (1 x 24 cm) , jota oli esitasa-painoitettu 10 mM fosfaattipuskurilla (pH 7,2), joka si-10 sälsi pitoisuuden 0,1 M NaCl. Näytteen panostamisen jälkeen kolonni pestiin 30 ml :11a puskuria ei-konjugoidun vasta-aineen täydelliseksi eluoimiseksi. Kolonnia eluoi-tiin käyttäen lineaarista suolagradienttia 0,1 - 2 M NaCl 10 mM fosfaattipuskurissa, pH 7,2. Eluoitujen fraktioiden 15 proteiinisisältö määritettiin Bradfordin värisitoutumis-määrityksellä.

Kuviossa 2 esitetään S-300-kolonnin eluutioprofii-li, joka osoittaa, että geloniini voidaan erottaa gelo-niini-vasta-ainekonjugaatista ja ei-konjugoidusta vasta-20 aineesta, jotka molemmat eluoituvat yhdessä ensimmäisessä piikissä (fraktiot noin 28 - 40). Tämä eluutiokuvio varmistettiin elektroforeettisesti käyttäen 50 μ1:η näytteitä : 5 - 20 %:n gradientin käsittävissä ei-pelkistävissä SDS- • · · * polyakryyliamidigeeleissä kuten esitetään kuviossa 4. Kyt- • · · , .·, 25 kentäseos panostettiin vyöhykkeeseen 3. Esitetään nauhat # » · **|φ vapaalle geloniinille (vyöhyke 2) , vapaalle vasta-aineelle ****. (vyöhyke 1) ja yhdelle molekyylille geloniinia vasta-aine- * ♦ · molekyyliä kohden kytkettynä ja kahdelle molekyylille ge- ♦ ♦ ♦ *·* * loniinia vasta-ainemolekyyliä kohden kytkettynä. Tyhjäti- 1 • · lavuuspiikki S-300-kolonnista, joka sisältää vapaan vasta- • · · • m· : aineen ja vasta-aine-geloniinikonjugaatin, panostettiin vyöhykkeeseen 4.

Ei-konjugoitu vasta-aine poistettiin geloniiniin • · konjugoidusta vasta-aineesta affiniteettikromatografiällä . 35 Blue Sepharose CL-6B -kolonnissa (1 x 24 cm) , jota oli • « · ·*·· « 25 104234 esitasapainoitettu 10 mM fosfaattipuskurilla, pH 7,2, joka sisälsi pitoisuuden 0,1 M NaCl. S-300-eluaattinäytteen panostuksen jälkeen kolonni pestiin 30 ml :11a samaa puskuria ei-konjugoidun vasta-aineen täydelliseksi eluoimi-5 seksi.

Kolonniin sitoutunut geloniiniin konjugoitu vasta- aine eluoitiin käyttäen lineaarista suolagradienttia 0,1 - 2 M NaCl 10 mM fosfaattipuskurissa, pH 7,2. Vasta-aine- geloniinikompleksi eluoitui pitoisuudessa noin 0,7 M NaCl 10 kuten esitetään kuviossa 3, joka esittää eluutioprofiilia

Blue Sepharose -kolonnille. Eluoitujen fraktioiden pro- teiinisisältö määritettiin Bradfordin värisitoutumismää- rityksellä. Proteiinia sisältävät fraktiot yhdistettiin pooliksi ja eluutiokuvio vahvistettiin elektroforeetti- 15 sesti 5 -* 20 %:n gradientin käsittävässä ei-pelkistävässä polyakryyliamidigeelissä. ZME-geloniinikompleksin elektro- foreettinen kuvio esitetään kuviossa 4. Läpivirtauspiikki (fraktiot 14 - 20) sisältää vain vapaata vasta-ainetta (kuvio 4, vyöhyke 5), kun taas fraktiot 50 - 80, jotka 20 eluoidaan korkealla suolapitoisuudella, sisältävät ei-kon- jugoitua geloniinia tai vasta-ainetta sisältämätöntä ZME- geloniinikonjugaattia (kuvio 4, vyöhyke 6) . Lopputuote . sisälsi ZME-vasta-ainetta kytkettynä 1, 2 ja 3 gelonii- • * · · ,···. nimolekyyliin. Keskimääräinen geloniinisisältö oli 1,5 mo- • · 'W 25 lekyyliä vasta-ainemolekyyliä kohden.

i · · “I Esimerkissä 2 kuvattua kaniinin retikulosyytti-in • · · ·;··. vitro-translaatiosysteemiä käytettiin oleellisesti puhtaan • · · ’· geloniini-ZME-vasta-ainekompleksin geloniiniaktiivisuuden • ·· ·.* * arvioimiseksi. Yhdeksi aktiivisuusyksiköksi tässä määri- 30 tyksessä määriteltiin se määrä proteiinia, joka tarvittiin : tuottamaan 50 %:n inhibitio proteiinisynteesissä verrattu- na käsittelyä vaille jätettyihin verrokkeihin. Käyttäen tätä määritystä natiivin geloniinin ja ZME-geloniinikonju-*··*. gaatin spesifisiksi aktiivisuuksiksi määritettiin 2 x 35 108 U/mg ja vastaavasti 8,2 x 105 U/mg. Oleellisesti puhdas • « · • · 104234 26 geloniini-ZME-vasta-aine on aktiivinen retikulosyytti-lysaattimäärityksessä. Alkuperäisen näytteen 1:1 000-lai-mennos aikaansai noin 50 %:n inhibition proteiinisynteesissä, eli 50 %:n laskun 4C-leusiinin sisäl-5 lytyksessä proteiiniin. Täten alkuperäisen valmisteen aktiivisuus oli 1 000 U/ml.

Esimerkki 8

Soluviljelymenetelmät ZME-antigeeninegatiivisia ihmisen rakkosyöpä-10 (T-24-) soluja, ihmisen kohdunkaulasyöpäsoluja tai ZME- antigeenipositiiviisia ihmisen etäispesäkkeitä muodostavan melanoomakasvaimen soluja A375M tai AAB-527 pidettiin viljelmässä käyttäen minimivaatimuskasvualustaa (MEM), jota oli täydennetty 10 %:lla lämpöinaktivoitua nautasikiösee-15 rumia sekä pitoisuuksilla 100 mM ei-oleellisia aminohappoja, 2 mM L-glutamiini, 1 mM natriumpyruvaatti, vitamiineilla ja antibiooteilla. Viljeltyjä soluja seulottiin rutiininomaisesti ja ne todettiin vapaiksi mykoplasmatar-tunnasta.

20 A. Solulisääntymismääritys

Solulinjoja ylläpidettiin viljelmässä täydellisessä kasvualustassa 37 °C.-ssa inkubaattorissa, jossa kostutettu . ilma käsitti 5 % C02:ta. Määrityksiä varten TNF:n, im- • · · · .···, munotoksiinien, IFN-a:n ja IFN-gamman yhdistelmillä "’•t 25 viljelmät pestiin, irrotettiin käyttäen verseeniä ja • · · *” uudelleenlietettiin täydelliseen kasvualustaan tiheydeksi • · · 25 x 103 solua/ml. 200 ml:n näytteitä jaettiin 96-kuop- • · · *· parsille mikrotiitterilevyille, minkä jälkeen solujen an- 9 ·· * nettiin kiinnittyä. Tästä saadaan tuloksena niukasti 30 siirrostettu solupopulaatio. 24 tunnin kuluttua kasvu- alusta korvattiin kasvualustalla, joka sisälsi vaihtelevan pitoisuuden joko immunotoksiineja, toksiineja, TNF: ää, IFNq:ta tai IFNa:ta. Soluja inkuboitiin 72 tunnin ajan ja '*··. analysoitiin suhteellinen solui isääntyminen käyttämällä 35 kristalliviolettivärjäystä.

M» lit* • · 27 104234 B. Kristalliviolettivärjäys

Solut pestiin 3 kertaan PBS:llä, joka sisälsi kalsiumia ja magnesiumia, kiinnitettiin ja värjättiin 20-%:isella (v/v) metanoliliuoksella, joka sisälsi 0,5 % 5 (v/v) kristalliviolettia. Sitoutunutta väriä eluoitiin 150 μΐ-.lla. Sörensenin sitraattipuskuria (0,1 M natrium-sitraattiliuos, pH 4,2 - 50 % (v/v) etanolia) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Absorbanssi mitattiin 600 nm:ssä käyttäen Bio-Teck-mikrolevylukijaa. Suhteellinen soluli-10 sääntyminen (RCP) laskettiin seuraavasti: RCP = Keskimääräinen absorbanssi (lääkekäsiteltv) x 100 Keskimääräinen absorbanssi (ei-lääkekäsitelty) C. Ihmiskasvainpesäkemääritys 15 Kasvainkudosnäytteitä saatiin melanoomapotilaista kliinisesti indikoitujen kudosnäytteenottomenettelyjen puitteissa. Kasvainsolulietteet valmistettiin aseptisesti (Leibovitz et. ai. . Int. J. Cell Cloning 1 (1983) 478 - 485) . Lisäksi testattiin myös A375P-melanooma- ja CEM- 20 leukemiasolulinjat, jotka saatiin talletuslaitoksesta the

American Type Culture Collection (Rockville, MD). ZME-ge- loniinin vaikutusten tuoreisiin melanoomasolulietteisiin . ja solulinjoihin testaus suoritettiin HTCA:ssa käyttäen • · · · .···. standardoituja menettelyjä kasvainsolumaljoitukseen puoli- • t 25 kiinteään kasvualustaan (agaroosi) , kun läsnä oli täydel- • · · linen kasvualusta, joka sisälsi 10 % vasikansikiöseerumia, • · · ·"·. jolloin kukin 0,5 ml:n viljelymalja sisälsi 100 000 solua • · · *· '· tuoreista kasvaimista ja 10 000 solua solulinjöistä (Ham- • ·· *.· * burger et ai.. Science 197 (1977) 461 - 463; Salmon et 30 aL, N. Enal. J. Med. 298 (1978) 1321 - 1327; Salmon et :T: ai.. J. Clin. Oncol. 7 (1989) 1346 - 1350). Edellä kuvatun :*·*: mukaisesti valmistettua ZME-geloniinia testattiin lisää- .1. mällä viljelymaljoihin pian kasvainsolumaljoituksen jäi- • · *·**. keen. ZME-geloniinia lisättiin kolminkertaisiin maljoihin 35 kunakin 4 pitoisuutena 0,025 ng/ml - 250 ng/ml. Rinnan • · · • · · · • · 104234 28 testattiin ei-käsiteltyjen verrokkimaljojen ohella ei-kon-jugoitu monoklonaalinen ZME-18-vasta-aine ja vapaa gelo-niini. Solulinjoja ja kasvainsoluviljelmiä inkuboitiin keskimäärin 10 päivän ajan 37 °C:ssa inkubaattorissa, jossa 5 kostutettu ilma sisälsi 5 % C02:ta, ja suoritettiin pesäke-muodostuksen arviointi käyttäen elinkelpoisuusvärjäystä (Shoemaker et ai.. Cancer Res. 45 (1985) 2 145 - 2 153) ja automatisoitua kuva-analyysi-instrumenttia, joka oli optimoitu pesäkelaskentaan (Salmon et ai., Int.J.Cell Cloning 10 2 (1984) 142 - 160). ZME-018:lla käsiteltyjen viljelmien prosentuaalinen eloonjäänti verrattuna samanaikaisiin käsittelemättömiin verrokkeihin määritettiin samoissa kokeissa. Annos-vastekuvaajät piirrettiin sitten graafisesti .

15 Esimerkki 9

Geloniinin konjugoidun ja ei-konjugoidun ZME-vasta-aineen sitoutumisen kohdesoluihin vertailu

Tutkittiin geloniiniin konjugoidun ja ei-konjugoidun ZME-vasta-aineen kykyä sitoutua kohdesoluihin. ZME-20 geloniini-immunotoksiinin sitoutumista antigeenipositii- visiin (AAB-527-soluihin) tai antigeeninegatiivisiin (T-24-soluihin) testattiin ELISA-määrityksellä.

; ·'; 50 000 kohdesolua (AAB-527-solua) tai ei-kohdesolua • · * · .···, (T-24-solua) lisättiin mikrotiitterilevyn kuhunkin kuop- • · /"t 25 paan. Soluja kuivattiin levyillä yön yli 37 °C:ssa. Sitten • · · **1^ solut pestiin käyttäen kolme vaihtokertaa kylmää PBS:ää ja ”**. kuivattiin ilmassa yön yli. Solupinnan antigeenimääreet • ♦ · *·*· säilyvät antigeenisesti aktiivisina tässä käsittelyssä.

:.* * Solujen kiinnityksen jälkeen levyt pestiin pesu- 30 puskurilla (9,68 g Tris, 64,8 g natriumkloridia, 16 ml : Tween 20 -valmistetta, 800 mg timerasolia 8 litrassa kah- teen kertaan tislattua vettä) . Vasta-ainenäytteitä lai-y..m mennettiin pesupuskuriin, joka sisälsi 1 %:n nautaseeru- mialbumiinia (w/v) (laimennuspuskuri). Kuoppiin lisättiin 35 50 μΐ eri pitoisuuksia väliltä 0,02 - 50 μg/ml joko kon- • · · · • · 29 104234 jugoitua tai ei-konjugoitua ZME-vasta-ainetta. Inkuboitiin 1 tunnin ajan 4 °C:ssa, minkä jälkeen supernatantit poistettiin ja kuopat pestiin kahdesti pesupuskurilla.

Kuhunkin kuoppaan lisättiin 50 μΐ kuoppaa kohden 5 piparjuuriperoksidaasiin konjugoitua vuohen anti-hiiri-IgG:tä, joka saatiin valmistajalta Bio-Rad ja jota laimennettiin 1:1 000 (v/v) (HPGAM) laimennuspuskuriin. Le

vyjä inkuboitiin 1 tunnin ajan 4 °C:ssa ja kuopat pestiin kahdesti pesupuskurilla. Kun levyjä oli inkuboitu 10 50 μΐ-.lla substraattiliuosta (80 mM sitraattifosfaatti (pH

5,0), 1 mM 2,2'-atsino-bis-(3-etyylibentstiätsoliini-6- sulfonihappo)- (ABTS-) diammoniumsuola (Sigma Chemical Co.) ja 4 μΐ 30-%:ista vetyperoksidia) pimeässä 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, 25 μΐ 4 N rikkihappoa li-15 sättiin kuhunkin kuoppaan. Absorbanssi 492 nm:ssä määritettiin ELISA-lukijalla.

Kuten esitetään kuviossa 5, sekä natiivi ZME että ZME-geloniinikonjugaatti sitoutuivat hyvin kohdesoluihin 60 minuutin altistuksen jälkeen. Yllättäen ZME-geloniini-20 konjugaatti sitoutui kohdesoluihin paremmin kuin natiivi vasta-aine. Tämä lisäys ei johtunut vasta-aineen modifioinnista SPDP:llä, koska SPDP:llä modifioitu ZME käyt- ; täytyi identtisesti natiiviin ZME:hen nähden. Lisäys ei • · · · .···. myöskään johtunut kohdesolujen sitoutumisesta molekyylin 25 geloniiniosaan, koska kohdesolujen esikäsittelyllä natii- 4 4· **1^ villa geloniinilla ei ollut mitään vaikutusta sen paremmin *·*’. vasta-aineen kuin immunotoksiininkaan sitoutumiseen.

4 · ·

Ei ZME eikä ZME-geloniini sitoutunut antigeenine- 4 4· *·* ‘ gatiivisiin T-24-soluihin ELISA-määrityksellä arvioituna.

30 Esimerkki 10 • 44 · Geloniinin ja geloniini-ZMA-vasta-ainekompleksin sy to toksisuus 4 ZME-geloniinikonjugaatin sytotoksisuustutkimuksia « · suoritettiin antigeenipositiivisilla soluilla jatkuvan *. 35 (72 tuntia) altistuksen immunotoksiinille tai natiiville • • 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 104234 30 geloniinille jälkeen. Kuten esitetään kuviossa 6, altistettaessa antigeenipositiivisia AAB-527-soluja pitoisuudelle noin 0,1 nM ZME-geloniinia havaittiin 50 %:n solu-kuolema. Altistettaessa soluja natiiville geloniinille 5 tarvittiin 100 nM:n geloniinipitoisuus soluluvun alentamiseksi 50 %:iin käsittelemättömästä verrokista.

Kohdesoluja käsiteltiin sitten eri pitoisuuksilla ZME-geloniinia tai geloniinia yksinään esimerkin 2 mukaan määritetyllä yksikköpohjalla. Kuten esitetään kuviossa 7, 10 50 %: n sytotoksisuus saatiin käyttämällä 50 yksikköä/ml ZME-geloniinikonjugaattia, kun taas 1 x 107 yksikköä/ml vapaata geloniinia tarvittiin samaan vaikutukseen pääsemiseksi .

ZME-geloniinin vaikutus määritettiin vastaan anti- 15 geeninegatiivisia T-24-soluja log-faasiviljelmässä. Kuten esitetään kuviossa 8, geloniini yksinään tuotti 50 %:n sytotoksisuuden AAB-S27-soluissa pitoisuutena 100 μg/ml, joka on samankaltainen kuin AAB-S27-soluilla tavattu. ZME- geloniini tuotti 50 %:n sytotoksisuuden kohde-T-24-soluis- 20 sa pitoisuutena 10 μg/ml. Kuitenkaan ZME-geloniini-immuno- toksiini ei ollut sytotoksinen vastaan ei-kohde-T-24-solu- ja edes korkeimpana testattuna pitoisuutena.

. Edelleen sen osoittamiseksi, että ZME-geloniinisy- .···. totoksisuutta välitti ZME-solupinta-antigeeni, kiinteä • · /[·. 25 annos ZME-geloniinia, jolla saadaan 80 %:n sytotoksisuus, • · · **I lisättiin kohde-log-faasimelanoomasoluihin viljelmässä, ”·1. kun läsnä oli vapaata ZME-vasta-ainetta tai epäoleellista • · · *· '· vasta-ainetta (15A8, vasta-aine, joka ei sitoudu melanoo- • ·· *.1 1 masoluihin) . Kuten esitetään kuviossa 9, kasvavien määrien 30 ZME-vasta-ainetta läsnäolo tukahdutti ZME-geloniinikonju- • · · ! gaatin sytotoksisuuden, kun taas 15A8-vasta-aineella ei ollut mitään vaikutusta. Täten ZME-geloniinikonjugaatin « sytotoksisuuden välitti suoraan ZME-vasta-aineen sitoutu-minen ZME-antigeeniin kohdesolulla.

• · • · · · • · · · « 31 104234

Esimerkki 11 ZME-geloniinin sytotoksisuuden modulointi IFN-a:lla, IFN-gammalla ja TNF:llä Käsittelyn erilaisilla biologisen vasteen modi-5 fioijilla vaikutusten immunotoksiinin sytotoksisuuteen osoittamiseksi log-faasimelanoomasoluja käsiteltiin 24 tunnin ajan kiinteillä annoksilla IFN-a:aa (200 u/ml), IFN-gammaa (20 000 u/ml) tai rTNF-a:aa (20 000 u/ml). Näillä annoksilla määritettiin aiemmin olevan minimaalinen 10 (noin 20 %:n) sytotoksinen vaikutus näitä soluja vastaan. Sitten soluja käsiteltiin 72 tunnin ajan erilaisilla annoksilla ZME-geloniinia. Kuten esitetään kuviossa 10, käsittely rlFN-gammalla johti 2-kertaiseen kasvuun herkkyydessä ZME-geloniini-immunotoksiinille. Kuitenkin esikäsit-15 tely sekä rIFNa:lla että TNF johti molemmissa tapauksissa 2-log-lisäykseen herkkyydessä immunotoksiinille. Kiinteiden annosten rIFNd:aa, rlFN-gammaa tai rTNF:ää lisääminen antigeenipositiivisiin soluihin johti ZME-geloniinitoksii-nin lisääntyneeseen sytotoksisuuteen. Käsittely rTNF-a:lla 20 aikaansai suurimman kohoamisen immunotoksiinin sytotoksi-suudessa rIFN-a:n ja rlFN-gamman seuratessa sitä.

Huomattava lisäys ZME-geloniinin sytotoksisessa . ·’· vaikutuksessa havaittiin esikäsiteltäessä rIFN-a:lla ja • · · · .···. rTNFrllä mutta ei rlFN-gammalla. Joskin on havaittu, että • * /[·. 25 IFN-α ja IFN-gamma voivat säätää ylös joitakin melanooma- i · · **j# pinta-antigeeneja kuten P-97, aineella oli vain vähäinen ·;·*. vaikutus ZME:n tunnistamaan antigeeniin (GP 240) , jonka • · · *· *· molekyylipaino on korkea (Murray et ai.. Proc. Am. Assoc.- ··· ’ Cancer Res. 27 (1986) 313; Greiner et ai.. Cancer Res. 44 30 (1984) 3 208 - 3214; Greiner et aLs., Cancer Res. 46 (1986) : 4 984 - 4 990; Groacomini £t al. . J. Immunol. 133 (1984) :T: 1 649 - 1 655; Imai £t alj_, J. Immunol. 127 (1981) 505 - 509; Murray et al. . J. Biol. Res. Mod. 2 (1988) 152 - 161) . Tämän vuoksi ZME-geloniiniaktiivisuuden TNF-a- ja 35 IFN-a-indusoidun lisäyksen mekanismi ei ole selvä, mutta M » I • · 32 104234 siihen voisi liittyä muutoksia vasta-aineen sisäistymis-nopeudessa, muutoksia immunotoksiinin soluprosessoinnissa tai minkä tahansa useammasta interferonivälitteisestä entsyymistä modulointi.

5 Koska geloniini-ZME-immunotoksiini tappoi vain so luja, jotka sisälsivät ZME-antigeenin pinnallaan, tämä im-munotoksiini on tehokas menetelmä ZME-kasvainliitteisen antigeenin sisältävien solujen kohdentamiseksi ja tappamiseksi samalla kun minimoidaan tai estetään vahinko tai 10 vaurio normaaleille, ei-kasvainliitteisen antigeenin käsittäville soluille.

Esimerkki 12 ZME-geloniini-ixnmuno toksiinin vaikutus ihmiskas-vainpesäkemäärityksessä (HTCA) 15 ZME-geloniinin aktiivisuutta tutkittiin myös käyt täen ihmiskasvainpesäkemääritystä vastaan soluja, jotka saatiin neljän melanoomaa sairastavan potilaan kudosnäytteistä .

In vitro -sytotoksisuus ihmissoluja vastaan vil-20 jelmässä määritettiin myös HTCA:ssa kuten kuvattiin esimerkissä 8C. Eri annoksia ZME-geloniini-immunotoksiinia lisättiin antigeenipositiiviseen (A-375-melanooma-) ja . antigeeninegatiiviseen CEM-soluiinjaan. Eloonjääneet pe- • ► · · ,···. säkkeet määritettiin 72 tunnin kuluttua lisäyksestä. Kuten • · *’· 2 5 esitetään kuviossa 11, immunotoksiiniannokset 0,25 - I I I ' ' • · · 2 500 ng/ml johtivat antigeenipositiivisen solulinjan pe- *···. säke eloonjäännin lähes täydelliseen suppressioon (umpi- • · · *♦ |· naiset ympyrät) . ZME-018 ja vapaa geloniini yksinään tai V * yhteen yhdistettyinä eivät olleet sytotoksisia. Mitään 30 vaikutusta vastaan antigeeninegatiivista solulinjaa (CEM) ··· ϊ ϊ t ei ollut edes immunotoksiinipitoisuuksista korkeimmalla :*·*: testatulla (avoimet nelikulmiot) .

♦ ZME-geloniinin vaikutus vastaan 4 erilaista tuo-*··. retta kudosnäytettä esitetään kuviossa 12. 80 - 90 %:n 35 lasku pesäkkeen muodostavien melanoomasolujen eloonjään- ♦ · · ♦ ♦ ♦ · « · · · · • · 33 104234 nissä tavattiin kahdessa näytteessä korkeimmalla testatulla immunotoksiiniannoksella (250 ng/ml). Yksi potilas osoitti solukasvun 50 %:n inhibitiota tällä annoksella, kun taas yksi potilas ei osoittanut mitään immunokonju-5 gaatin sytotoksisuutta. Vain vaatimaton (25 %) vähennys pesäkeluvussa havaittiin kolmannella näytteellä. Kasvun tehostuminen havaittiin neljännessä näytteessä korkeimmalla immunotoksiiniannoksella. Lisäksi kasvun tehostumista havaittiin yhdessä näytteessä alhaisilla annoksilla, 10 kun taas korkeammat annokset tuottivat huomattavaa sytotoksisuutta. Kuten solulinjakokeissa, ei-konjugoidun ZME-018:n ja vapaan geloniinin lisäämisellä ei ollut sytotok-sista vaikutusta testattuina annoksina.

Vaikkakaan HTSCA-määritys ei ole erehtymätön, noin 15 75 % kliinisesti aktiivisista kasvainvastaisista aineista on positiivisia tässä testisysteemissä. HTSCA:ssa inaktiiviset aineet ovat toistaiseksi osoittautuneet inaktiivisiksi kliinisesti. Tämän vuoksi ZME-geloniinikonjugaatin aktiivisuus HTSCA:ssa osoittaa 75 %:n todennäköisyydellä 20 positiivista kliinistä arvoa.

Esimerkki 13 ZME-vasta-aineen kudosjakauma ; ·*· 125I-leimatun ZME-vasta-aineen kudosjakaumaa ver- .···. rattiin oleelliseen immunotoksiiniin (ZME-geloniini) ja i » /]·, 25 epäoleelliseen immunotoksiiniin (15A8-geloniini) . Kutakin • i < *" vasta-ainetta tai vasta-ainekonjugaattia annettiin laski- ·*··, monsisäisesti häntälaskimoon 5 paljaalle hiirelle, joilla • « · *·*· oli ihmismelanoomasiirteitä. Kullekin eläimelle annettiin ·· ·.* * 0,5 /iCi:llä 125I:tä leimattuna kokonaisprotennia 10 mg 30 100 /xl:n kokonaistilavuudessa fosfaattipuskuroitua suola- • · · : J ί liuosta.

Kuten esitetään kuviossa 13, epäoleellinen 15A8-geloniinikonjugaatti ei paikantunut spesifisesti kasvain- | · ·”. kudoksiin (T/B-suhde 0,5). Sitä vastoin sekä oleellinen 35 ZME että ZME-geloniinikonjugaatti osoittivat spesifistä « · · «f • · 34 104234 paikantumista (T/B-suhteet 2,0 ja vastaavasti 1,5). Tilastollisesti merkittävää eroa ei ollut 125I:n otossa kasvaimeen ZME- tai ZME-geloniiniannon jälkeen. Alan ammattilainen ymmärtää vaikeuksitta, että esillä oleva keksintö 5 sopii hyvin sekä mainittujen että luontaisesti sisältyvien päämäärien täyttämiseksi ja lopputulosten ja etujen saamiseksi. Tässä kuvatut yhdisteet, menetelmät, menettelyt ja tekniikat edustavat tällä hetkellä edullisia suoritusmuotoja, ne on tarkoitettu esimerkkiluonteisiksi eikä niitä 10 ole tarkoitettu esillä olevan keksinnön kattaman alueen rajoituksiksi. Alan ammattilaisille tulee mieleen muutoksia siihen ja muita käyttöjä, jotka kuuluvat keksinnön henkeen ja määritellään oheisten patenttivaatimusten kattavuudella .

• « · » · · • φ · · • « • « • · · • · · ··« • · · ··· · • · • · · • · 1 • · # 1♦ • · · « « · • « · « · · • · · • » · • i · • · · · · t « • « • · « · » • 1 · · • · 1 1 · • ·

Claims (4)

1. 35 104234 Patenttivaa timuks e t
2. 1. Menetelmä konjugaation ZME-vasta-aineesta ja geloniinista rakentamiseksi, tunnettu siitä, että 5 se käsittää seuraavat vaiheet: puhdasta geloniinia modifioidaan 2-iminotiolaanil- la; ZME-018-vasta-ainetta modifioidaan N-sukkinimidyy- li-3-(2-pyridyyliditio)(propionaatilla) (SPDP); 10 muodostetaan seos samoista painoista mainittua mo difioitua geloniinia ja mainittua modifioitua ZME-018-vasta-ainetta; seoksen pH neutraloidaan lisäämällä 0,05 M TEA/HCl-puskuria, pH 8,0; 15 neutraloitua seosta inkuboidaan noin 20 tunnin ajan noin 4 °C:ssa typpikaasussa; inkuboituun seokseen lisätään 2-jodiasetamidia mahdollisesti jäljellä olevien vapaiden sulfhydryyliryhmien salpaamiseksi, minkä jälkeen mainittua seosta inkuboidaan 20 edelleen vielä noin tunnin ajan noin 25 °C:ssa; ja mainittu edelleen inkuboitu seos puhdistetaan gee-lisuodatuksella. . 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, • · « • . · · ,···. tunnettu siitä, että puhtaan geloniinin modifioin- • · 25 ti iminotiolaanilla käsittää seuraavat vaiheet: • · · • · t puhdas geloniini konsentroidaan fosfaattipuskuroi- ·· · ·"*. dussa suolaliuoksessa; • · · *· *· konsentroitua geloniinia käsitellään lisäämällä • M V * trietanoliamiinihydrokloridia (TEA/HCl) ja EDTA:ta kon- 30 sentroituun geloniiniin loppupitoisuuteen noin 60 mM :Τϊ TEA/HCl ja noin 1 mM EDTA, pH 8,0; käsiteltyä geloniinia modifioidaan lisäämällä 2-iminotiolaania ja inkuboimalla noin 90 minuutin ajan noin • t ··*, 4 °C:ssa typpikaasuvirrassa; ja • t * * · · tili • · · > « • · 36 104234 iminotiolaaniylimäärä poistetaan modifioidusta ge-loniinista.
3. 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ZME-018-vasta-aineen modifi- 5 ointi SPDPrllä käsittää seuraavat vaiheet: SPDP valmistetaan metyyliformamidiin; muodostetaan seos lisäämällä SPDP:tä ZME-018-vasta-aineeseen noin 5-kertainen mooliylimäärä; seosta inkuboidaan noin huoneenlämpötilassa sekoit-10 taen seosta noin 5 minuutin välein; ja reagoimatta jäänyt SPDP-ylimäärä poistetaan inku-boidusta seoksesta.
4. 4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se käsittää edelleen seuraa- 15 vat vaiheet: modifioitu ZME-018-vasta-aine eluoidaan tyhjätila-vuudessa ja varastoidaan noin 4 °C:seen; varastoitu ZME-018-vasta-aine konsentroidaan mik-rokonsentraattorissa; 20 konsentroitu ZME-018-vasta-aine pestään natriumfos- faattipuskurilla, joka sisältää EDTA:ta; ja pesty ZME-018-vasta-aine konsentroidaan. « i < • · · « I I I • · • · « « « III • « · « M» • · · · • · • · · • · · • · • · · • · · I · « *#· • * · • I · • · · • · · • · · ··· * · • · • · · • · « · · I··· • · 37 104234