CN1302815C - 甲苯胺蓝o药物及其在异常组织的体内染色和化疗中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明包括制备TBO药物产物的改进方法，该方法包括以下步骤：(1)合成吲达胺；(2)将所述吲达胺转化为S-吲达胺基硫代硫酸根；(3)向所述S-吲达胺基硫代硫酸根中加入氧化催化剂、络合剂和酸以制备TBO和C-4-甲基区域异构体及其衍生物。本发明还包括新的组合物，所述组合物用于检测和治疗异常组织，即TBO产物主要含有峰八和/或峰六。以N，N-二甲基对苯二胺为起始物料获得的TBO产物组合物中含有峰八、七、六和五，其比例约为33∶5∶5∶1。以N-二甲基对苯二胺作为起始物料获得的TBO脱甲基化产物组合物中含有峰六、五、三和二，其比例约为33∶5∶5∶1。本发明还包括分析改善的TBO药物产物的HPLC改进方法，其改进包括在第一流动相中加入离子对试剂和形成含有50体积%醇的第二流动相组合物。

Description

甲苯胺蓝O药物及其在异常组织的体内染色和化疗中的用途
本发明是对甲苯胺蓝O组合物的改进，在此以参考的方式引入美国专利6,086,852和6,194,573中所披露的工艺和方法。
技术领域
本发明涉及适合于人体内应用的新型的生物学染色诊断组合物和/或化疗组合物。
更具体地说，本发明涉及新型的甲苯胺蓝O(“TBO”)染料产物，其中含有特定比例的TBO及特定的TBO衍生物。
本发明涉及含有这些新型TBO产物的TBO组合物的新的制造方法。
本发明还涉及新的改进的高效液相色谱(HPLC)分析法，该方法用于确定含有这些新型的TBO产物的TBO组合物的组成。所述改进的HPLC法可以更明确地将对应于有机染料成分的峰与对应于降解产物的峰分开。另外，改进的HPLC分析方法可以显示出活性有机染料组合物相对于降解产物的稳定性。
本发明还涉及在体内应用该新型TBO组合物来识别可疑的异常结构即不正常组织的方法。
本发明还涉及在体内应用该新型TBO组合物的方法，所述组合物用作治疗癌性或癌前期组织的化疗药剂。
在另一方面，本发明还涉及组合物、采用该组合物进行体内诊断的方法、采用该组合物的治疗方法以及该组合物的制造方法，所述组合物特别适合于用作治疗癌性或癌前期组织的化疗药剂。
背景技术
通常，鳞状细胞癌起初为表面病变，表现为红斑和轻微隆起。这些病变被称为增殖性红斑，且被描述为早期红斑样病变，其可以是原位癌或者是浸润癌。由于这些病变常常没有症状，因此应进行活检以确定该组织是否为恶性的。其他被称为黏膜白斑病的病变是纯白色的。在这些病变中，发现只有10％是原位癌或浸润癌。
鳞状细胞癌的常见部位是口底、舌、软腭、扁桃体前柱、臼齿后三角区，据推测，这是因为口腔通常更易于与例如烟草中的致癌物质相接触。
根据近来的研究，病变越深，存活百分比越低。
＜2mm-95％
2～9mm-80％
＞9mm-65％
此外，早期口腔癌患者的5年存活率为75％，但对于晚期患者的5年存活率仅为35％。(Emmanuella，J.，“Head and Neck Cancer：SquamousCell Carcinoma(头颈部肿瘤：鳞状细胞癌)”，Medicine Journal(内科杂志)，第3卷，第1期，2002年1月3日)。因此，为了使头颈部肿瘤获得良好的预后，通过多种方法进行早期检查和治疗对于头颈部肿瘤是很重要的。
已知上皮染色便于对异常上皮细胞、颗粒、变性上皮细胞或变性颗粒进行目视检查。
事实上，已知在早期检查中采用染料TBO作为活检的最佳指示物。该染料被恶性细胞的线粒体所吸收。结果，TBO可以用于筛检试验和定位癌组织，因为它可以有效地将恶性或癌前期病变部位染成深蓝色，而不会将正常粘膜染色。Mashberg的美国专利4,321,251和Tucci等的美国专利5,372,801论述了这种体内诊断试验，这种试验可识别和描绘可疑的异常口腔组织。
常规检查需用间接鼻咽镜和咽喉镜对头部和颈部进行完全的检查。如果发现异常或可疑的组织，通常随后进行细针刺吸活检以用于细胞学检查或切除活检。一旦确诊为癌，则推荐进行全身麻醉下的内窥镜检查，并对韦氏环、下咽部、鼻咽部和其他常见转移部位及任何可疑病变部位进行随机活检。建议进行全身常规血液学检查，以全面评估患者的身体状况以及扩散到远处器官的可能性。(Emmanuella，J.，“Head and NeckCancer：Squamous Cell Carcinoma”，Medicine Journal，第3卷，第1期，2002年1月3日。)
在2001年，世界知识产权组织(WIPO)的WO 01/64110号公开文本披露，TBO是用于选择性杀死癌细胞的有效染料。随后，WIPO的WO01/64255 A1号公开文本披露，这些WIPO公开文本中所披露的TBO组合物的峰八或峰六所代表的化合物与对癌细胞的主要化疗效果有关。因此，相对于该药物中的其它化合物，使峰八和峰六部分所代表的化合物的产量最大化是合乎需要的。
TBO的经典的合成方法详尽地描述于Dandliker等的美国专利416,055中，其授权日为1889年11月30日。这种合成方法被描述为5个连续的步骤：(1)在硫代硫酸钠存在下，用例如重铬酸钾将N，N-二甲基对苯二胺氧化，形成2-氨基-5-二甲基氨基苯基硫代硫酸(系统命名为“取代的S-苯基硫代硫酸根”)；(2)将硫代硫酸与邻甲苯胺缩合，形成相应的吲达胺-硫代硫酸(系统命名为“取代的S-吲达胺基硫代硫酸根”)；(3)例如在沸点温度，在氯化锌的存在下反应约30分钟，使吲达胺-硫代硫酸闭环，从而形成TBO；(4)然后将反应混合物冷却，并例如通过用氯化钠和氯化锌处理，使闭环反应的TBO产物络合和盐析，从而沉淀出TBO络合物，例如为TBO/ZnCl2络合物；最后(5)可以通过重复进行再溶解和再沉淀以完成纯化，例如，可以在热的氯化锌水溶液中进行再溶解并用氯化钠/氯化锌进行再沉淀。
这些TBO组合物含有若干杂质，而且其中有机染料的含量有限。Dandliker等描述的制造方法一般得到染料含量低于80％的组合物。
典型的TBO产物的高效液相色谱(HPLC)分析显示出8个主要的峰，其象征着代表组合物成分的化合物。真正的TBO指定为“峰八”，它是分子为N7，N7-二甲基化的且有一个甲基连接在C-2上的部分，如下所示：
                      (峰八)
目前已经知道，典型的TBO产物的染料含量包括TBO的C-4-甲基区域异构体(regioisomer)(与峰七对应)加上这些物质的N-脱甲基化和N，N-二脱甲基化的衍生物。此外，TBO的N-脱甲基化衍生物(与峰五和六对应)和它的C-4-甲基区域异构体通常占染料含量的大于20％。
明确地说，其他部分包括：
(1)峰七，其中分子为N7，N7-二甲基化的且有一个甲基连接在C-4上，如下所示：
Figure C0282909000072
                      (峰七)
(2)峰六和峰五，其分别为由峰八和峰七经N-脱甲基化所得到的衍生物，如下所示：
Figure C0282909000073
     (峰六)                                (峰五)
和(3)峰三和峰二，其分别为峰六和峰五进一步N-脱甲基化的产物。
在现有技术的TBO组合物中，由于其杂质含量高、染料含量不确定以及真正的TBO含量相对较低，因此，为了得到满足规定要求的用于人类试验TBO组合物，需要开发可重复制备TBO药物的方法，由该方法制备的药物杂质含量低，染料种类含量稳定，有机染料总含量较高，且真正的TBO含量较高。
在开发满足规定的TBO组合物的过程中，Burkett对TBO药物的组成、制备方法、用途和分析方法进行了改善，如美国专利6,086,852和6,194,573中所述。
由于峰八或峰六所代表的化合物已知具有选择性标记以及选择性杀死癌细胞或癌前期细胞的能力，因此非常希望提供可以使这些化合物在TBO药物中含量最大化的方法，而不会过度增加费用及制备程序的复杂程度。
本发明解决了上述问题，方法是提供使分别含有峰八和/或峰六的部分的含量最大化的TBO产物。于是，本发明提供人们最为期盼的组合物，该组合物用于鉴别或治疗异常组织的方法中。
申请人现已发现了该方法、该方法的产物以及其药物产物的使用和分析方法。
根据下面的详细描述，并结合附图，对于本领域技术人员，本发明及其实施中的各种方式是显而易见的。
发明内容
用于制备TBO的最接近现有技术的方法包括下列步骤：(1)在第一反应混合物中氧化N，N-二甲基对苯二胺；(2)向所述第一反应混合物中加入含硫亲核试剂源，以形成第一中间体，即取代的S-苯基硫代硫酸根；(3)将所述第一中间体进一步氧化并将其与邻甲苯胺缩合以形成第二中间体，即取代的S-吲达胺基硫代硫酸根；(4)进一步氧化所述第二中间体以闭合其吲达胺环，以形成存在于第三反应混合物中的含有TBO的反应产物；(5)在形成所述第三混合物之前向反应混合物中加入TBO的络合剂；和(6)从所述第三反应混合物中分离含TBO的反应产物。本发明在现有方法的基础上做了改进，即在第一反应混合物中，在邻甲苯胺的存在下，首先氧化起始物料。根据最终产物中需要以何种峰(峰八或峰六或其组合)作为主要成分的要求，所述起始物料可以是单个以下物质或以下物质的组合：N-二甲基对苯二胺和/或N，N-二甲基对苯二胺。从本文的目标出发，将主要含有峰八或峰六或其组合的组合物称为“TBO产物”。
以N，N-二甲基对苯二胺作为起始物料，则得到的TBO产物组合物中含有峰八、七、六和五，其比例约为33∶5∶5∶1。
而以N-二甲基对苯二胺作为起始物料，则得到的TBO脱甲基化产物组合物中含有峰六、五、三和二，其比例约为33∶5∶5∶1。
因此，含有起始物料N-二甲基对苯二胺和/或N，N-二甲基对苯二胺以及邻甲苯胺的反应混合物在导入含硫亲核试剂源之前发生氧化反应。上述改变导致产生了完全出乎意料的TBO产物组合物，这种组合物分别使峰八和峰六的产出最大化。人们一直在寻找这些组合物，但至今未能获得。
对于以N，N-二甲基对苯二胺作为起始物料，本发明涉及一种新的物质组合物，其中含有TBO和它的C-4-甲基区域异构体及所述异构体的N-脱甲基化衍生物。更具体地说，所述组合物的HPLC分析(在290nm)显示，代表所述异构体的HPLC峰的组合面积与代表所述N-脱甲基化衍生物的峰的组合面积的比至少为约7∶1。
在另一个实施方式中，代表TBO的HPLC峰面积与代表它的C-4-甲基区域异构体的峰面积的比至少为约6∶1。
在另一个实施方式中，TBO至少占所述组合物的总有机染料含量的73重量％。
对于以N-二甲基对苯二胺作为起始物料，本发明涉及一种新的物质组合物，其中含有TBO的N-脱甲基化衍生物和它的C-4-甲基区域异构体。更具体地说，所述组合物的HPLC分析(在290nm)显示，代表所述N-脱甲基化衍生物的HPLC峰的组合面积与代表所述进一步N，N-脱甲基化衍生物的峰的组合面积的比至少为约7∶1。
在另一个实施方式中，在所述组合物中，代表在环C-2位置具有甲基的N-脱甲基化衍生物的HPLC峰的面积与代表在环C-4位置具有甲基的N-脱甲基化衍生物的峰面积的比至少为约6∶1。
在另一个实施方式中，在环的C-2位置具有甲基的N-脱甲基化衍生物至少占所述组合物的总有机染料含量的73重量％。
在另一个实施方式中，所述组合物的总有机染料成分包括主要是TBO和在环的C-2位置具有甲基的N-脱甲基化衍生物的混合物。
所描述的组合物在异常组织的识别方法及化疗方法中很重要。
在本发明的另一个实施方式中，在光动力学疗法中采用TBO产物以改变TBO产物的化疗效果的强度。在此过程中，将控制入射光线与施用TBO产物相结合。自20世纪60年代以来，作为涉及光和药物的综合疗法，化疗中的光动力学反应是已知的。在施用药品时，将光线照射在该区域上，并通过其特定的波长性质和强度来改变光线，以活化或强化药物的作用。
制造TBO产物的方法包括下列步骤：合成吲达胺，将吲达胺转化为S-吲达胺基硫代硫酸根，用氧化剂进一步氧化S-吲达胺基硫代硫酸根，最后用络合试剂络合反应物以形成TBO组合物。为了更准确地鉴别该新的TBO产物的组成，还披露了一种用于分析TBO染料产物的改进的HPLC方法，借此，流动相已经采用特定的流动相组合物，并添加了离子对试剂。所披露的HPLC方法使得可以用全新的分辨率水平将与有机染料产物相关的HPLC峰和与降解产物相关的峰分离开来。
本发明提供了TBO的新用途，其中，将TBO产物例如峰八和/或峰六的更纯的组合物施用于癌组织，以选择性地消除或弱化癌细胞或癌前期细胞。此外，就我们所知，本发明提供了在已制得的TBO组合物中最纯的TBO组合物的制备方法。因此，本发明提供了在用于定位癌性或癌前期组织的临床方法中使用的更纯的染料。
另外，本发明披露了一种更灵敏的HPLC方法，该方法用于在TBO与TBO衍生物组分的分离和识别中提供改善的分辨率。该改进建立在已知的用于分析TBO染料产物的HPLC方法的基础之上，该已知方法包括：制备TBO样品溶液，形成包括有机酸的水溶性盐的流动相，用流动相流体平衡高效液相色谱柱，向高效液相色谱柱中注射样品溶液。所做的改进包括：(1)形成包含离子对试剂的流动相组合物，和(2)形成含有50体积％醇的第二流动相组合物。
附图说明
图1是290nm处的HPLC色谱图，描述了以N，N-二甲基对苯二胺为起始物料时，本发明的TBO产物组合物的特征峰；
图2是290nm处的HPLC色谱图，描述了前述使TBO的分离和产出最大化的TBO产品组合物的特征峰；
图3是方法流程图，描述了本发明用于制造TBO产物的一个优选实施方式，其中包括用于制造本发明的以N，N-二甲基对苯二胺为起始物料的新型的TBO产物组合物；
图4是制备TBO组合物的方法中步骤1的化学反应，其中N，N-二甲基对苯二胺是起始物料，用反应物和中间体的化学结构式来表示；
图5是制备TBO组合物的方法中步骤2的化学反应，其中N，N-二甲基对苯二胺是起始物料，用反应物和中间体的化学结构式来表示；和
图6是制备TBO组合物的方法中步骤3的化学反应，其中N，N-二甲基对苯二胺是起始物料，用反应物和产物的化学结构式来表示。
具体实施方式
附图图解了本发明的优选实施方式，其中以N，N-二甲基对苯二胺为起始物料。附图不应当解释为将对本发明限制而排除以N-二甲基对苯二胺作为起始物料，而是用这些附图来提供一种对于非常相似的反应的模式，在这类反应中，可以使N，N-二甲基对苯二胺反应，形成主要含有峰六的TBO产物。
参考附图1和2，本发明的组合物包括指定为峰八10(下文称为“峰八”)的组分，所述组分在总产物中占有较大的重量百分比，且峰八的比例大于峰七12、峰六14、峰五16、峰三和峰二的比例。
更具体地说，本发明涉及峰八10的重量百分比最大的组合物的制备和最终分析，其中TBO和C-4-甲基区域异构体(峰八10和峰七12)的组分的重量是TBO的N-脱甲基化组分和C-4-甲基区域异构体(峰六14和峰五16)的重量的7倍。更具体地说，所产生的峰八10大于峰七12，其比例为6∶1。
峰八10和峰六14分别与TBO和相应的N-脱甲基化衍生物对应，其中甲基在环C-2的位置。相反，峰七12和峰五16分别与TBO的C-4-甲基区域异构体和相应的N-脱甲基化衍生物对应，其中甲基在环C-4的位置。已经确信，在癌症患者的检查和治疗中，峰八10对于组织染色和癌症治疗比其他组分更有效。
在光动力学疗法中，对于特定的癌症类型以及患者的敏感度，TBO产物混合物与光线组合的最佳参数的确定是特异的。在使用内窥镜等器械时，可以根据波长和/或强度来调整入射光线。因此，为获得最佳的药物作用，本领域的技术人员拥有足够的知识以确定与TBO产物混合物组合的最佳的光线特征。
本发明TBO组合物的制备方法是制备TBO产物的现有已知方法的改进。更具体的说，所述改进需要将美国专利6,194,573中Burkett所描述的制备方法中的第二步和第三步颠倒。步骤的颠倒使得在引入含硫亲核试剂源之前，在稳定溶液中将N，N-二甲基对苯二胺和邻甲苯胺混合，结果产生完全出乎意料的TBO组合物。此外，在癌症的检测和治疗中非常需要所得的该组合物，该组合物对于化学和药理学领域的技术人员是无法预见的。
通常，该方法需要氧化含有稳定剂的N，N-二甲基对苯二胺与邻甲苯胺的溶液。氧化之后加入酸。随后，加入络合剂、氧化剂和含硫亲核试剂源。此时产生了中间体S-吲达胺基硫代硫酸根40。然后用氧化剂将S-吲达胺基硫代硫酸根40氧化，随后加入络合剂、氧化催化剂和酸。
提供图3作为下列已标记为步骤1～4的步骤参考，其中详细描述了本发明涉及TBO组合物的制备的优选实施方式。
步骤#1-吲达胺的合成
在圆底烧瓶中将5g二盐酸N，N-二甲基对苯二胺粉末加入到155g的USP(美国药典)纯水中，并在300rpm下搅拌。该N，N-二甲基对苯二胺反应混合物20应维持≤10℃，搅拌10分钟。
通过将6.3g盐酸(6N)缓慢加入到2.8g的邻甲苯胺中来制备盐酸邻甲苯胺。盐酸邻甲苯胺溶液22应搅拌至澄清，如果出现晶体，应加入最少量的USP纯水以将盐酸邻甲苯胺晶体再溶解。
将盐酸邻甲苯胺溶液22加入至二盐酸N，N-二甲基对苯二胺反应混合物20中，随后再加入2g HCl(6N)24。反应混合物应维持在低于约10℃，并在冰浴上搅拌45分钟。
使用滴液漏斗将29.25g重铬酸盐溶液28缓慢(超过20分钟)滴加到盐酸邻甲苯胺和二盐酸N，N-二甲基对苯二胺的反应混合物26中，所述重铬酸盐溶液28通过将9.39g重铬酸钾加入到108g的USP纯水中制备。一旦重铬酸盐溶液28已全部添加完毕，应将二盐酸吲达胺反应混合物30维持在低于约10℃，并在冰浴上搅拌60分钟。本领域技术人员应当理解，反应混合物包括二盐酸吲达胺及其衍生物。
应当理解，目前对于起始物料(N，N-二甲基对苯二胺和/或N-二甲基对苯二胺)和邻甲苯胺，据信盐酸均为适合的稳定剂。因此，上一步骤描述了用盐酸分别使其处于稳定形态的二盐酸N，N-二甲基对苯二胺粉末成分和盐酸邻甲苯胺溶液。然而，本发明并不局限于任何特殊的稳定剂，因此可以用任何适合的稳定剂来代替盐酸，本领域技术人员可以理解，这类稳定剂包括一系列已知稳定剂中的任何一个。
图4中提供了上述步骤1中的化学反应图式，并用分子的形式对反应物和产物进行了说明。
步骤#2-S-吲达胺基硫代硫酸根的合成
通过将8.75g十六水合硫酸铝加入至15g的USP纯水中来制备硫酸铝溶液32，进而得到酸。将该酸添加到二盐酸吲达胺反应混合物30中并搅拌10分钟。除了十六水合硫酸铝以外的酸也是适合的。
通过将12.22g氯化锌加入至15g的USP纯水中来制备氯化锌溶液34，进而利用氯化锌溶液34得到络合剂。将该络合剂添加到二盐酸吲达胺反应混合物30中并搅拌10分钟。应当理解，虽然所述优选实施方式包括氯化锌，但其它络合剂也是适合的，并包含在本发明中。
通过将9.39g重铬酸钾加入到108g的USP纯水中制备重铬酸盐溶液36，进而通过准备29.25g的该重铬酸盐溶液36而得到氧化剂。用滴液漏斗将该氧化剂缓慢(超过20分钟)加入至二盐酸吲达胺反应混合物30中，并在冰浴上搅拌20分钟。
通过将6.53g五水合硫代硫酸钠加入到15g的USP纯水来制备硫代硫酸钠溶液38，进而得到含硫亲核试剂源。将该含硫亲核试剂源缓慢加入到二盐酸吲达胺反应混合物30中，并在冰浴上搅拌60分钟。所形成的沉淀含有S-吲达胺基硫代硫酸根40及其衍生物。本领域技术人员应当理解，也可用其他的含硫亲核试剂源来代替硫代硫酸钠溶液38。
图5中提供了上述步骤2中的化学反应图式，用分子的形式对反应物和产物进行了说明。可以观察到用虚线将S-SO3 -与两个碳原子相连接，虚线表示S-SO3 -可以连接在任意一个碳上。
步骤#3-TBO和TBO锌复盐的合成
将S-吲达胺基硫代硫酸根40维持在10℃以下。用滴液漏斗将氧化剂缓慢(超过20分钟)加入S-吲达胺基硫代硫酸根40中，并搅拌20分钟。目前相信，29.25g的重铬酸盐溶液42适合于用作氧化剂。
向经氧化的S-吲达胺基硫代硫酸根反应混合物44中加入络合剂，优选加入27.0g的氯化锌溶液46，并搅拌5分钟，所述氯化锌溶液46通过将12.22g氯化锌加入到15g的USP纯水中制备。加入氧化催化剂，优选为17.3g的硫酸铜溶液48，并搅拌5分钟，所述硫酸铜溶液48通过将2.38g硫酸铜加入到15g的USP纯水中制备。
将温度设定点变为60℃。一旦反应达到60℃，加入酸，将pH值降到2.9，所述酸优选为硫酸溶液50(9N)。每次加酸后搅拌5分钟。将温度设定点变为97℃。一旦反应混合物达到97℃，搅拌35分钟。将反应混合物52缓慢冷却至室温。达到室温后，将含有粗TBO产物混合物54的产物放入5℃冷却器中。保存5～15小时。取出，并将部分粗TBO产物混合物54通过0.45μm的过滤器过滤。将经过滤的溶液放入小瓶中以通过RP-HPLC(反相高效液相色谱)TBO分析方法进行分析。
图6中提供了上述步骤3中的化学反应图式，用分子的形式对反应物和产物进行了说明。
应当理解，可以采用其它络合剂、含硫亲核试剂、氧化剂、氧化催化剂和/或酸，并且上述步骤应当解释为，其中披露了目前据信为本发明优选实施方式的络合剂、还原剂、氧化剂、氧化催化剂和/或酸。
步骤#4-纯化
本领域技术人员应当理解，最终反应混合物含有TBO和C-4-甲基区域异构体及其衍生物。如美国专利6,194,573中所述的溶液的纯化方法56对于本领域技术人员是已知的，因此，在此以参考的方式将其引入。
为本领域技术人员所理解并采用合适的实验室装备和安全规程。美国专利6,086,852中所述的实验室装备适合于进行上述操作，因此，在此以参考的方式将其引入。
上述用于制备TBO的步骤与在先披露的方法的不同之处在于：盐酸邻甲苯胺溶液22与起始物料二盐酸N，N-二甲基对苯二胺溶液20的结合发生在用于制备二盐酸吲达胺反应混合物30的初始步骤中，且该结合步骤发生在加入硫代硫酸钠38之前。此外，上述用于制备TBO的步骤与在先披露的方法的不同之处在于，在向盐酸邻甲苯胺22和起始物料二盐酸N，N-二甲基对苯二胺20的反应混合物中添加任何其他试剂之前，加入盐酸24和重铬酸钾28。
本发明还包括用于对经改善的组合物进行分析的改进的HPLC法。用于分析的改进的HPLC法更明确地显示出基于通过新的HPLC法所测定的各个峰的面积的重量比。下列比例与以N，N-二甲基对苯二胺为起始物料的TBO产物有关：
a.)峰八10/峰七12为约6∶1。
b.)峰(八10+七12)/峰(六14+五16)为约7∶1。
c.)峰五16+峰六14+峰七12+峰八10约占染料含量的95重量％。
d.)峰五16+峰六14+峰七12+峰八10约占包含杂质的总产物的75重量％。
e.)峰(三+六14+八10)/峰(二+五16+七12)为约7∶1。
类似地，下列比例与以N-二甲基对苯二胺为起始物料的TBO产物有关：
a.)峰六/峰五为约6∶1。
b.)峰(六+五)/峰(三+二)为约7∶1。
c.)峰二+三+五+六约为染料含量的95重量％。
d.)峰二+三+五+六约为包含杂质的总产物的75重量％。
e.)峰(三+六)/峰(二+五)为约7∶1。
图1和2分别为由本文所披露的经改进的HPLC分析法和由在先已知的HPLC分析法所得到的色谱图。对图1和2的观察显示了通过各个方法所得出的不同流动梯度的比较，还可以看出，在本发明的图1中，相对于峰七12、峰六14和峰五16，峰八10的面积增加了。色谱领域的技术人员还可以观察到，本发明产生了对TBO产物组合物的高分辨率，以及具有稳定性指示。此外，本文所披露的HPLC分析法的高的分辨率使得能够进一步对TBO降解产物进行鉴别。到目前为止，这种鉴别很难通过现有的方法来实现。
HPLC分析的新方法
该实验室方法描述了用于对TBO产物混合物及其衍生物进行检测和定量分析的分析程序。色谱领域的技术人员应当理解，除了柱子和HPLC分析仪，各种不同种类的移液管和容量瓶也是必要的。关于柱子和HPLC分析仪，合适的是具有5μm填料的250×4.6mm的C18 WaterSymmetry Column(水匀柱)和HP1100、1050或等同的HPLC分析仪。
经改进的HPLC分析是对已知的现有方法进行改进，改进之处是在流动相中添加庚磺酸、钠盐作为离子对试剂。这里，离子对试剂特别有助于TBO组合物的分离。另外，庚磺酸、钠盐可有助于其他化合物的分离，尤其是酸性或阳离子化合物的分离。在先技术披露的离子对试剂无法达到与TBO有机染料相关的峰和与降解产物相关的峰之间的分辨率。
相对于在先已知的HPLC分析方法，另一个重要的改进为包括含有醇和流动相溶剂的第二流动相，其中HPLC流动相溶剂/醇流动相为50∶50。
而且，另一个重要改进包括将流速从1.5mL/min调整到1.0mL/min(毫升/分钟)，以提高活性物峰与降解产物之间的分辨率。
色谱领域的技术人员理解，使HPLC分析的分辨率和精确度最优化的其他特定参数随操作条件而变化。由于这些参数会随分析环境状况的不同而变化，因此它们包括在本发明中。
尽管不能将优选实施方式解释为对本发明的限制，但涉及TBO产物的HPLC分析的优选实施方式包括下列特定的参数：(1)290nm波长；(2)1.0mL/min流速；(3)注射体积：20μL；(4)温度：40℃；(5)双流动相：
[A]：10mM乙酸铵，其pH值为3.5，且含有1.0g/L的1-庚磺酸，钠盐；和
[B]：50∶50乙氰/甲醇；和
(6)下列流动梯度：
  时间(分钟)  流动相B的百分比(％)
  0.0  30.0
  15.0  30.0
  20.0  29.0
  56.0  29.0
  63.0  50.0
  75.0  50.0
  76.0  30.0
  83.0  30.0
HPLC的准备：
下面对HPLC分析的优选实施方式进行描述，所述HPLC分析是用于对TBO组合物的分离成分进行分析。实施经改进的HPLC法所必须的试剂包括：纯水、流动相溶剂(例如HPLC级乙腈(ACN))、缓冲盐(例如乙酸铵(CH3COONH4))、试剂级的酸(例如冰醋酸)、试剂级的碱(例如氢氧化铵(NH4OH))、二级标准物质(Secondary Standard)(Z97231A.DS)或等同物质、以及庚磺酸、钠盐。
通常通过将适当的缓冲盐与水混合来制备流动相A，优选将约0.77g乙酸铵溶解在1.0L水中并混合。用酸或碱调整pH为3.5，例如加入冰醋酸或钠盐并混合。最后，将溶液通过0.45μm的过滤器过滤。
流动相B通常通过在量筒中加入相同体积的流动相溶剂和醇并混合来制备，优选在1000mL的量筒中加入500mL的乙氰和500mL的甲醇。虽然在优选实施方式中规定流动相溶剂与醇的体积比为50∶50，但应当清楚，本发明包括了这样一种第二流动相，其中，根据操作条件和其他参数的不同，流动相溶剂与醇的体积比不同。
根据90∶10的流动相A∶流动相溶剂溶液，样品稀释剂通常通过将10.0mL乙氰加入到90.0mL纯流动相A(不含庚磺酸、钠盐)中并混合来制备。应当理解，样品稀释剂并不局限于含有乙氰，本领域已知的各种流动相溶液都是适合的。
根据步骤1～3，为了分析，称出约150mg的TBO产物加入到100mL的容量瓶中，在样品稀释剂中制备0.15mg/mL的样品溶液。用样品稀释剂稀释至刻度并混合。用移液管将10mL该初始储备溶液移至第二个100mL的容量瓶中，并用该样品稀释剂稀释至刻度并混合。
制备质量控制标准样品，方法是称出约150mg的TBO，并加入100.0mL的容量瓶中，制备在样品稀释剂中的0.15mg/mL的样品溶液。用样品稀释剂稀释至刻度并混合。用移液管将10mL该初始储备溶液移至第二个100mL的容量瓶中，并用样品稀释剂稀释至100.0mL体积并混合。从标准操作程序和质量控制方面考虑，通常制备两个标准样品。
为了评估HPLC系统的适用性，首先将20μL的标准溶液注射入HPLC中，以得到峰五16的容量因子(k)≥峰八10。对于任何活性峰(五16、六14、七12和八10)拖尾因子均应小于等于2.5。此外，任何活性峰及其最近的峰之间的分辨率不低于1.0。
分析第二标准溶液并用工作标准对配制精度进行评估；第二标准溶液必须为理论浓度的97.0～103.0％。
在运行结束时注射两次标准溶液，确保其落入初始标准总面积的96.0～104.0％之内。
HPLC分析：
首先，向HPLC仪中注射至少5份20μL的标准溶液以对于重复注射，得到总峰面积相应于活性峰面积具有≤2.0％的相对标准偏差(RSD)。随后，在与标准溶液校准时所使用的相同的色谱条件下，将各个样品的多份配制物注射入HPLC仪中。
在样品配制物中，TBO产物混合物峰的相对保留时间(RRT)应该与标准配制物中TBO产物混合物活性峰的相对保留时间相一致。峰之间的比例必须在0.98～1.02的范围内。
计算单个峰的重量/总重量的百分数的方法如下：
*峰五16[TBO]，％w/w＝(Cn/Csx)(Rsx/Rstd)(标准溶液中峰五16的重量％)
其中：
Cn＝在标准配制物中TBO的浓度(mg/mL)。
Csx＝在样品配制物中TBO产物混合物的浓度(mg/mL)。
Rsx＝在样品配制物中TBO产物混合物的峰五16的平均面积。
Rstd＝在标准配制物中TBO的峰五16的平均面积。
*用峰六14、峰七12和峰八10在标准溶液中的相应的重量百分比对这些峰进行重复计算。
通过将全部4个主要峰(五16、六14、七12和八10)的总量相加来计算TBO产物混合物的总重量百分比的方法如下：
总检测值＝峰五16的重量％+峰六14的重量％+峰七12的重量％+峰八10的重量％
计算色谱纯度(面积％纯度)的方法如下：
面积％纯度＝[样品中峰(五16、六14、七12、八10)之和的平均值]/(样品中所有峰之和的平均值)×100％
本发明已经在以上方面进行了描述，并且明确提出了目前优选的最佳模式，以使本领域技术人员能够理解并实施本发明。

Claims (16)

1.制造甲苯胺蓝O产物的方法，该方法顺序包括以下步骤：
(a)在邻甲苯胺的存在下，氧化包括选自由N，N-二甲基对苯二胺和N-二甲基对苯二胺所组成的组中的至少一种化合物的起始物料，以形成含有第一中间体吲达胺的第一反应混合物；
(b)向所述第一反应混合物中加入含硫亲核试剂源，以形成含有第二中间体S-吲达胺基硫代硫酸根的第二反应混合物；
(c)进一步氧化所述第二反应混合物，以形成存在于第三反应混合物中的含有甲苯胺蓝O的反应产物；
(d)从所述第三反应混合物中分离含甲苯胺蓝O的反应产物，其中，在步骤(d)之前，向所述第一反应混合物、第二反应混合物和第三反应混合物中的至少一种反应混合物中加入甲苯胺蓝O的络合剂。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述的合成吲达胺的步骤还包括在酸和氧化剂的存在下，氧化邻甲苯胺溶液和N，N-二甲基对苯二胺溶液的步骤。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述的合成吲达胺的步骤还包括在酸和氧化剂的存在下，氧化邻甲苯胺溶液和N-二甲基对苯二胺溶液的步骤。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述的合成吲达胺的步骤还包括在酸和氧化剂的存在下，氧化邻甲苯胺溶液及N，N-二甲基对苯二胺和N-二甲基对苯二胺溶液的步骤。
5.一种新的组合物，其中包括：
在环的C-2位置具有甲基的甲苯胺蓝O，该甲苯胺蓝O至少占所述组合物的总有机染料含量的73重量％。
6.权利要求5所述的组合物在制备用于鉴别异常组织的制剂中的用途。
7.权利要求5所述的组合物在制备用于治疗异常组织的制剂中的用途。
8.如权利要求7所述的用途，其中还包括：
将化疗试剂与权利要求5所述的组合物混合的步骤。
9.一种新的组合物，该组合物包括：
在环C-2位置具有甲基的甲苯胺蓝O的N-脱甲基化衍生物，该衍生物至少占所述组合物的总有机染料含量的73重量％。
10.权利要求9所述的组合物在制备用于鉴别异常组织的制剂中的用途。
11.权利要求9所述的组合物在制备用于治疗异常组织的制剂中的用途。
12.如权利要求11所述的用途，其中还包括：
将化疗试剂与权利要求9所述的组合物混合的步骤。
13.一种新的组合物，该组合物包括：
在环的C-2位置具有甲基的甲苯胺蓝O；在环的C-2位置具有甲基的甲苯胺蓝O的N-脱甲基化衍生物；其中所述甲苯胺蓝O和所述的N-脱甲基化衍生物至少占所述组合物的总有机染料含量的73重量％。
14.权利要求13所述的组合物在制备用于鉴别异常组织的制剂中的用途。
15.权利要求13所述的组合物在制备用于治疗异常组织的制剂中的用途。
16.如权利要求15所述的用途，其中还包括：
将化疗试剂与权利要求13所述的组合物混合的步骤。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1225278A (zh) * 1997-11-13 1999-08-11 济拉公司 体内染色组合物,其制法及用于确认发育异常组织的方法
US6086852A (en) * 1997-11-13 2000-07-11 Zila, Inc. In vivo stain composition, process of manufacture, and methods of use to identify dysplastic tissue

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH071257B2 (ja) * 1985-09-09 1995-01-11 エスエス製薬株式会社 混合ビタミン剤中の水溶性ビタミン類の同時定量法
JPS6410171A (en) * 1987-07-03 1989-01-13 Shimadzu Corp Analysis of amino acid
ES2133143T3 (es) * 1991-10-31 1999-09-01 Zila Inc Composicion de tincion biologica, procedimiento de preparacion y procedimiento de utilizacion para la deteccion del cancer epitelial.
WO1999025388A1 (en) * 1997-11-13 1999-05-27 Zila, Inc. In vivo stain composition, process of manufacture, and methods of use to identify dysplastic tissue
AU2000237154A1 (en) * 2000-02-28 2001-09-12 Zila, Inc. Method for detecting and killing epithelial cancer cells
JP4424838B2 (ja) * 2000-08-31 2010-03-03 株式会社トクヤマ 四級アンモニウム塩の分析方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1225278A (zh) * 1997-11-13 1999-08-11 济拉公司 体内染色组合物,其制法及用于确认发育异常组织的方法
US6086852A (en) * 1997-11-13 2000-07-11 Zila, Inc. In vivo stain composition, process of manufacture, and methods of use to identify dysplastic tissue
US6194573B1 (en) * 1997-11-13 2001-02-27 Zila, Inc. Process for manufacture of in vivo stain composition
US6372904B2 (en) * 1997-11-13 2002-04-16 Zila, Inc. Process for manufacture of in vivo stain composition

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