CN1300169C - 一种应用膜分离技术精制羊胎活性成分的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及羊胎活性物质的膜分离技术提取分离方法，尤其是用微滤膜和纳滤膜精制提取羊胎活性物质的方法；通过常规的原料采集、清冼分选、打浆、破碎、酶解、用膜技术分离纯化、冷冻干燥步骤，在酶解液中，采用氧化铝、氧化锆或氧化锑无机陶瓷膜，截留粒子范围为0.05～1μm或聚砜、醋酸纤维、聚四氟乙烯或聚丙烯类有机膜，截留粒子范围为0.05～1μm微滤除去杂蛋白、筋膜的碎片、降解酶的残留物，再经芳香聚酰胺类、聚哌嗪酰胺类或聚醚砜类，纳滤截留分子量范围为150～1000的有机复合膜纳滤去除游离氨基酸、大部分水份，浓缩，冷冻干燥得到羊胎冻干粉。
Description
技术领域
本发明是采用膜分离技术提取分离羊胎活性物质的一种方法，尤其是用微滤膜和纳滤膜精制提取羊胎活性物质的方法。
背景技术
胎盘是胎儿与母体进行物质交换的器官，是供给胎儿全营养素的生理性产物，蛋白质含量达70％以上，氨基酸含量丰富，种类齐全，配比合理，脂肪含量15％左右，其中含有丰富的磷脂、脂多糖，并含有多种维生素和人体必需常量、微量元素，以及多种免疫球蛋白、多种抗体，还有与免疫功能密切相关的干扰素和与机体功能正常运转有关的活性多肽。尤其是羊胚胎不同脏器中的生长因子和生长促进因子，这些哺乳动物出生后因为器官或组织退化而不再分泌的“神奇因子”，对机体的作用可同造化等同。它们可使损伤的中枢神经修复再生，可使病变的脏器组织重建功能；可使骨髓造血、表皮更生。可促使性腺分泌，调节内分泌平衡，可补充胸腺素等抗衰防老的因子，以促进机体的新陈代谢，恢复内分泌平衡，增强各脏器的功能，焕发生命活力。其中的活性多肽类成分可以通过肠道全部吸收利用，直接经过血液循环转运至全身不同的器官和组织而发挥生物活性功能，但蛋白质成分则不能直接被吸收利用，必须通过降解成多肽或氨基酸才能被吸收利用，而小分子多肽比氨基酸具有更高的生物活性和营养价值，目前从羊胎中提取的细胞活性物质，还没有一个明确的质量检测标准，现大多采用多肽作为含量测定的监控指标。
目前现有公开技术中国专利：公开号为CN1193515A的《一种制作冻干羊胎素的方法》专利文献采用羊胎原料低温粉碎直接冻干，并在液氮降温保护下进行二次粉碎的方法；公开号为CN1203794A的《羊胎素冻干粉及其生产方法》专利文献采用羊胚胎速冻，低温打浆，往复冻结，冷冻干燥的方法。上述两种方法虽保留了生物的大部分活性，但成品中还存在很多无效杂质成分，提取纯度不高。公开号为CN1307871A的《羊胎素注射剂及制备工艺》专利文献采用羊胎破碎，匀浆，冻融，离心后的上清液超滤，收集小于30000分子量滤过液的方法，其中利用冻融工艺提取的活性成分远不及酶解工艺产出的活性物质多，利用酶法生产羊胎活性物质具有含量高、生产能力强等特点，是一种最直接、经济的生产方法。公开号为CN1238207A的《黑羊胎素补液及其生产方法》专利文献采用羊胎原料粉碎成糊状后调节PH值，加酶水解，经过粗滤，精滤，得到提取物的方法；公开号为CN1273096A的《羊胎素提取工艺》专利文献采用羊胎和胎盘打浆，酶解，超滤膜过滤的方法；公开号为CN1432388A的《羊胎肽口服液及其制备方法》专利文献采用羊胎和胎盘匀浆，超微破碎，蛋白水解，离心超滤，收集分子量10000以下超滤液的方法；中国生化药物杂志，刘士山等，2002年第23卷第5期发表的《羊胚胎盘肽功能测试》非专利文献中采用羊胚胎盘绞碎，匀浆，冻融，经微滤，超滤，纳滤，冻干后制得成品的方法。上述这些方法在用酶解或冻融工艺得到的提取液中，除含有肽类活性成分、蛋白质分子、氨基酸、核酸等外，还有不溶性蛋白质分子、羊胎筋膜碎片、降解酶的残留物等多种杂质成分，而用超滤膜截留小于3万或1万分子量的物质来达到提取纯化的目的，会丢失一些活性蛋白，提取的收率降低；虽然已有文献报道采用了膜分离技术，但未指明所用膜材质及截留分子量。因此在操作工艺和提取纯度方面，以上方法均存在缺陷。故寻找一种收率较高，纯度较好，肽类活性成分含量较多的提取方法对促进羊胎活性物质的提取实现工业化生产显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于提高产品的得率、纯度和活性成分肽的含量，提供一种操作简单，污染小，易保存，适于大生产的精制分离方法，采用无机陶瓷膜或有机膜微滤和复合膜纳滤技术进行分离纯化提取羊胎活性物质。
现有羊胎活性成份的提取方法为：将羊胚胎和胎盘进行清洗净选，破碎，加水低温匀浆，经酶解后，得到酶解液，利用超滤截留一定分子量的活性成份。
本发明所采用的技术方案为：
在酶解液中，利用无机陶瓷膜或有机膜微滤除去酶解液中10万以上分子量的杂蛋白、筋膜的碎片和降解酶的残留物，得到澄清羊胎提取液，再经有机复合膜纳滤去除游离氨基酸、大部分水份进行纯化、浓缩，冷冻干燥得到羊胎冻干粉。
本发明所涉及的膜材料可以是：无机陶瓷膜材质为氧化铝、氧化锆或氧化锑等氧化物；有机膜材质为聚砜、醋酸纤维、聚四氟乙烯或聚丙烯类等有机高分子材料；有机复合膜材质为芳香聚酰胺类、聚哌嗪酰胺类或聚醚砜类。所涉及的微滤截留粒子范围为0.05～1μm，纳滤截留分子量范围为150～1000。
本发明优选的技术方案为：
所述的无机陶瓷膜材质为氧化锆，截留粒子范围为0.08～0.2μm。
所述的有机膜为聚砜膜，截留粒子范围为0.08～0.2μm。
所述的有机复合膜为芳香聚酰胺类或聚醚砜类，其分子量为150-1000。
所述的纳滤膜，分离浓缩的流程都是在常温下进行。
本发明与现有技术相比具有如下特点：
1.该提取工艺采用酶解—膜分离联合，操作简单，提取得率高，产品保留的活性成分更多，去除了大部分无效杂质。
2.以水作提取溶剂，在膜分离纯化的过程中，反应温和，避免了活性成分的丢失，且经纳滤浓缩后的透过水可反复利用。
3.采用无机陶瓷膜分离效率高，抗污染性强，易于再生清洗。
4.采用纳滤膜过滤浓缩，减少了原体积3-4倍的量，缩短了浓缩干燥的时间，节省了能源，提取成本大为降低。
5.操作简单，效率高，节约能源，适于工业化大生产。
具体实施方式
实施例1
将新鲜的或冷冻的经检疫合格的羊胚胎及胎盘，绞碎成肉酱，低温打浆，称取上述提取浆液2000克投入酶解罐中，启动搅拌器进行搅拌，升温到50℃，称取3克中性蛋白酶，水解40分钟，在75℃进行酶灭活5分钟，立即用截留量为0.1μm的氧化锆陶瓷膜将上述提取液进行微滤，滤过压力为0.1Mpa，收集透过液再进行纳滤浓缩，纳滤器采用聚醚砜类复合膜，截留分子量范围为150-180，滤过压力为0.1-0.2Mpa，去除大部分水分得到羊胎浓缩液500毫升，再进行冷冻干燥，羊胎提取物的收率为6.5％，所测肽含量为33.8％。
实施例2
羊胚胎和胎盘预处理、低温匀浆、酶解工艺同实施例1，立即离心过滤，转速4000-5000转/分钟，时间为20分钟，用截留量为0.1μm的聚砜膜将上述离心上清液进行微滤，滤过压力为0.1Mpa，收集透过液再进行纳滤浓缩，纳滤器采用聚醚砜类复合膜，截留分子量范围为150-180，滤过压力为0.1-0.2Mpa，去除大部分水分得到羊胎浓缩液520毫升，再进行冷冻干燥，羊胎提取物的收率为6.1％，所测肽含量为32.4％。
实施例3
羊胚胎和胎盘预处理、匀浆、酶解工艺同实施例1，立即离心过滤，转速4000-5000转/分钟，时间为20分钟，用截留量为0.08μm的聚砜膜将上述离心上清液进行微滤，滤过压力为0.1Mpa，收集透过液再进行纳滤浓缩，纳滤器采用聚酰胺类复合膜，截留分子量范围为300-1000，滤过压力为0.1-0.4Mpa，去除大部分水分得到羊胎浓缩液700毫升，进行冷冻干燥，羊胎提取物的收率为5.9％，所测肽含量为30.8％。
实施例4
羊胚胎和胎盘预处理、匀浆、酶解工艺同实施例1，用截留量为0.08μm的氧化锆陶瓷膜将上述酶解液进行微滤，滤过压力为0.1Mpa，收集透过液再进行纳滤浓缩，纳滤器采用聚酰胺类复合膜，截留分子量范围为300-1000，滤过压力为0.1-0.4Mpa，去除大部分水分得到羊胎浓缩液650毫升，进行冷冻干燥，羊胎提取物的收率为5.9％，所测肽含量为32.5％。
实施例5
羊胚胎和胎盘预处理、低温匀浆、酶解工艺同实施例1，立即离心过滤，转速4000-5000转/分钟，时间为20分钟，用截留量为0.2μm的聚砜膜将上述离心上清液进行微滤，滤过压力为0.1Mpa，收集透过液再进行纳滤浓缩，纳滤器采用聚醚砜类复合膜，截留分子量范围为150-180，滤过压力为0.1-0.2Mpa，去除大部分水分得到羊胎浓缩液660毫升，再进行冷冻干燥，羊胎提取物的收率为6.1％，所测肽含量为31.6％。
实施例6
羊胚胎和胎盘预处理、低温匀浆、酶解工艺同实施例1，用截留量为0.2μm的氧化铝陶瓷膜将上述酶解液液进行微滤，滤过压力为0.1Mpa，收集透过液再进行纳滤浓缩，纳滤器采用聚醚砜类复合膜，截留分子量范围为150-180，滤过压力为0.1-0.2Mpa，去除大部分水分得到羊胎浓缩液640毫升，再进行冷冻干燥，羊胎提取物的收率为6.7％，所测肽含量为33.4％。
实施例7
羊胚胎和胎盘预处理、低温匀浆、酶解工艺同实施例1，用截留量为0.1μm的氧化锆陶瓷膜将酶解液进行微滤，滤过压力为0.1Mpa，收集透过液再进行纳滤浓缩，纳滤器采用聚酰胺类复合膜，截留分子量范围为300-1000，滤过压力为0.1-0.4Mpa，去除大部分水分得到羊胎浓缩液590毫升，再进行冷冻干燥，羊胎提取物的收率为6.4％，所测肽含量为32.9％。
实施例8
羊胚胎和胎盘预处理、低温匀浆、酶解工艺同实施例1，用截留量为0.08μm的氧化铝陶瓷膜将酶解液进行微滤，滤过压力为0.1Mpa，收集透过液再进行纳滤浓缩，纳滤器采用聚酰胺类复合膜，截留分子量范围为300-1000，滤过压力为0.1-0.4Mpa，去除大部分水分得到羊胎浓缩液720毫升，再进行冷冻干燥，羊胎提取物的收率为6.3％，所测肽含量为31.6％。
Claims (7)
1.一种羊胎活性成分的膜技术分离精制方法，包括原料采集、清冼分选、打浆、破碎、酶解、用膜技术分离纯化、冷冻干燥，其特征在于：在酶解液中，利用无机陶瓷膜或有机膜微滤除去杂蛋白、筋膜的碎片、降解酶的残留物，再经有机复合膜纳滤去除游离氨基酸、大部分水份，浓缩，冷冻干燥得到羊胎冻干粉。
2.根据权利要求1所述的羊胎活性成分的膜技术分离精制方法，其特征在于：无机陶瓷膜材质为氧化铝、氧化锆或氧化锑，截留粒子范围为0.05～1μm。
3.根据权利要求2所述的羊胎活性成分的膜技术分离精制方法，其特征在于：无机陶瓷膜材质为氧化锆，截留粒子范围为0.08～0.2μm。
4.根据权利要求1所述的羊胎活性成分的膜技术分离精制方法，其特征在于：有机膜材质为聚砜、醋酸纤维、聚四氟乙烯或聚丙烯类，截留粒子范围为0.05～1μm。
5.根据权利要求4所述的羊胎活性成分的膜技术分离精制方法，其特征在于：有机膜为聚砜膜，截留粒子范围为0.08～0.2μm。
6.根据权利要求1所述的羊胎活性成分的膜技术分离精制方法，其特征在于：有机复合膜材质为芳香聚酰胺类、聚哌嗪酰胺类或聚醚砜类，纳滤截留分子量范围为150～1000。
7.根据权利要求6所述的羊胎活性成分的膜技术分离精制方法，其特征在于：有机复合膜材质为芳香聚酰胺类或聚醚砜类，纳滤截留分子量范围为150～1000。
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