CN1296097C - 一种聚合物胶束载药系统 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种药物制剂技术，特别是涉及一种聚合物胶束载药系统及其制备，本发明的胶束是甲基聚乙二醇-聚酯嵌段共聚物胶束，特征是，甲基聚乙二醇与聚酯的比例小于50/50，这种嵌段共聚物胶束具有临界胶束浓度低，胶束载药量高，胶束稳定的优点。

Description

一种聚合物胶束载药系统

技术领域：

本发明涉及一种药物制剂技术，特别是涉及聚合物胶束载药系统及其制备。

背景技术：

难溶性药物的给药(特别是注射给药)的最大障碍是溶解度低，难于制备适宜的制剂。往往需要采取各种增加溶解度的办法，如将药物制备成盐、加入潜溶媒、加入助溶剂、以及加表面活性剂增溶。由于成盐往往需要强酸或强碱条件，对许多药物往往不适用；生理安全的潜溶媒很少，且用量有限；通过与药物形成络合物而增加药物溶解度的助溶剂的安全性不易保证；相对而言，由于相对安全的表面活性剂可以获得，因此，通过表面活性剂胶柬增溶往往成为首选。对于水溶性极差的药物往往需要同时采用几种措施，这往往导致许多不足，从而影响药物的作用。例如紫杉醇是一种作用很强的抗肿瘤药物，体外试验表明紫杉醇对各种肿瘤均具有明显的抑制作用，临床上适用于治疗乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌等。然而由于其溶解度低(低于1μg/ml)，其口服几乎不吸收，注射给药则需要特殊的溶剂系统，一种由聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor EL)和乙醇组成的混合溶剂。这种由混合溶剂制备的紫杉醇注射剂溶剂本身具有较大的副作用，特别是聚氧乙烯蓖麻油可以导致严重的过敏反应，甚至危及生命，为防止过敏反应，临床上在使用紫杉醇注射液之前，需要注射皮质甾体激素和/或抗组织胺药物，然而，即便提前注射皮质甾体激素和/或抗组织胺药物，大量的患者仍然存在轻度、中度乃至重度的过敏反应；另一方面，这种注射剂在与稀释剂(如生理盐水)混合时，由于聚氧乙烯蓖麻油胶束的临界胶束浓度(Critical micellar concentration，CMC)高，胶束容易解离，导致药物析出，因此，许多紫杉醇在进入体内前被滤过在滤膜外，导致生物利用度不高，而且紫杉醇注射剂的生物利用度随混合方法的不同药物析出速度、程度均不同，导致生物利用度的个体差异大。基于上述原因，紫杉醇的临床应用受到很大限制。同样的情况也出现在喜树碱、依托泊苷等抗肿瘤药物的注射剂中，例如依托泊苷注射剂由乙醇、丙二醇、聚山梨酯80组成，用前稀释，这种注射液刺激性较大。

鉴于普通表面活性剂胶束的高CMC和可能的毒副作用，近年来，有人研究了两亲性嵌段共聚物的胶束载药系统。见参考文献Torchilin，V.P.，Structure and design ofpolymeric surfactant-based drug delivery systems.J Control Release，2001.73(2-3)：p.137-72.其中甲基聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物胶束系统吸引了广泛关注。见参考文献Yamamoto，Y.，et al.，Long-circulating poly(ethylene glycol)-poly(D，L-lactide)block copolymermicelles with modulated surface charge.J Control Release，2001.77(1-2)：p.27-38.甲基聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物采用开环聚合而得，即将丙交酯和聚乙二醇甲醚混合加热(120-140℃)使丙交酯溶解后，加入催化剂(如辛酸亚锡)，在150-180℃下聚合而得。所得聚合物由于结构中同时含有亲水部分(聚乙二醇)和疏水部分(聚乳酸)，因而在水溶液中可以形成胶束。这种聚合物胶束的CMC相对较低，其增溶体系无须加入潜溶媒。例如，有人采用mPEG∶PLA比例为50/50，60/40，70/30的甲基聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物制备了紫杉醇胶束载药系统，结果表明，胶束的CMC随mPEG的比例降低而下降，其中50/50时CMC为0.16mg/ml，制备的胶束系统体外和动物体内的生物相溶性较好，未见明显毒性，紫杉醇同位素体内分布实验表明，胶束进入体内后迅速解离，释放药物，聚合物在体内可以在15小时内降解。见参考文献Zhang，X.，et al.，Anti-tumor efficacy and biodistribution ofintravenous polymeric micellar paclitaxel.Anticancer Drugs，1997.8(7)：p.696-701.Kim，S.C.，et al.，In vivo evaluation of polymeric micellar paclitaxel formulation：toxicity and efficacy.J Control Release，2001.72(1-3)：p.191-202.。

目前，已经发表的制备紫杉醇-甲基聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物胶束系统的方法分为三个阶段：首先将药物、嵌段共聚物溶于一种共同的溶剂中；然后蒸去溶剂得到药物-嵌段共聚物蜡样固体分散体；最后，将蜡样固体在60℃下不断涡旋振摇至分散均匀。由于制得的胶束分散系统稳定性较差，有人进一步将分散于水中的胶束冷冻干燥制备冻干粉备用。由于这种方法需要不断涡旋振摇蜡样固体分散体，操作复杂，即便是冻干粉的分散也费时费事，在临床应用时十分不便。胶束是一种热力学不稳定体系，将固体采用分散法制备胶束需要巨大的能量，而这种通过涡旋振摇制备胶束的方法对于制备低甲基聚乙二醇比例的甲基聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物胶束其能量往往难以胜任，因此，至今用于制备胶束系统的甲基聚乙二醇-聚酯嵌段共聚物都是甲基聚乙二醇与聚酯比例大于50/50者，而比例小于50/50者只是用于制备微球或毫微球。

肿瘤的靶向治疗始于二十世纪四十年代的“魔弹”设想。由于抗肿瘤药物的巨大毒副作用，药物研究人员希望药物具有靶向性，即仅对肿瘤细胞发生毒性作用。毫微粒载药系统(如脂质体、毫微球、胶束)由于载药量大，被认为可以延长药物的体内平均驻留时间，提高治疗的靶向性。然而，对于脂质体制剂，由于网状内皮系统(RES)的吞嗤，当它们进入体内后迅速从大循环中被清除，因此，脂质体制剂可以解决难溶性药物的溶解性问题，但是，并不能降低毒副作用，提高药物的治疗指数和靶向性。近年来，含有甲基磷脂酰胆碱的阿霉素隐性脂质体(Stealthy liposome)被证明可以提高药物的生物半衰期，可以降低阿霉素的心脏毒性。隐性毫微球的研究也有类似的结果。最近，胶束被认为是具有更好的靶向给药系统得到广泛研究，与脂质体、毫微粒不同，胶束粒径更小，在体内更易于释放药物，尤其是聚合物胶束由于表面存在的PEG水化层和小的粒径，更易于避免被RES系统吞嗤。然而，由于表面无具有与靶部位特异亲合的分子，其主动靶向性仍然较低。

对肿瘤特异亲合分子的研究表明：许多物质对各种组织有特异亲和力，可以用于组织或细胞或分子水平的肿瘤靶向。此类分子包括具有组织或细胞特异性的蛋白质或多肽、生长因子、维生素及其类似物(如叶酸)、多糖、糖肽或糖蛋白、甾体及其类似物、激素、辅助因子、遗传分子、某些药物分子。如对脑特异的含有CNSRLHLRC，CENWWGDVC，WRCVLREGPAGGCAWFNRHRL，和CLSSRLDAC片段的多肽、蛋白质；对肾特异的含有CLPVASC和CGAREMC片段的多肽、蛋白质；对肺特异的含有CGFECVRQCPERC，CGFELETC，CTLRDRNC和CIGEVEVC片段的多肽、蛋白质；对皮肤特异的含有CVALCREACGEGC片段的多肽、蛋白质；对脾特异的含有SWCEPGWCR片段的多肽、蛋白质；对小肠特异的含有YSGKWGW片段的多肽、蛋白质，对子宫特异的含有GLSGGRS片段的多肽、蛋白质；对肾上腺特异的含有LMLPRAD片段的多肽、蛋白质；对视网膜组织特异的含有CRDVVSVIC和CSCFRDVCC片段的多肽、蛋白质；具有抑制整合蛋白表达细胞与细胞外基质蛋白结合作用的多肽、蛋白质，这类蛋白质或多肽含有CRGDC，CRGDCL，NGR(AHA)，DGR(AHA)，CRGDCA，RCDVVV，SLIDIP，TIRSVD，KRGD，RRGP和RGDL片段；具有肿瘤特异性的抗体；对实体瘤血管内膜特异的含有CDCRGDCFC和CNGRCVSGCAGRC片段的多肽、蛋白质；以及其他对肿瘤细胞有特异亲和力的分子。

发明内容：

本发明提供一种两亲性聚合物，由甲基聚乙二醇，聚酯制成，其特征在于，在共聚物组成的配比中，甲基聚乙二醇与聚酯的质量比低于50/50。其中的聚酯选自，聚乳酸、聚乙醇酸(polyglycolide))、乙交酯-丙交酯共聚物(poly(lactide-co-glycolide)，PLGA)。

本发明提供一种两亲性聚合物胶束的制备方法，其特征在于，通过以下步骤制各，

a.将药物和两亲性嵌段聚合物溶于极性有机溶剂中，

b.滴加水至溶液中，或将溶液滴入水中使成微乳，

c.蒸去极性有机溶剂。

其中所述极性有机溶剂选自，乙腈、乙醇、二甲亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷、氯仿。

本发明提供一种两亲性聚合物胶束载药系统，是由以上制备方法制备的胶束定向排列(亲水基团向外，亲脂基团向内)的药物运载系统组成，药物载运于胶束中。

本发明的载药系统，其所载的药物选自，抗肿瘤药物、抗生素、心血管药物、抗糖尿病药物、非甾体抗炎药。

本发明还提供一种肿瘤靶向聚合物胶束给药系统，其特征在于，该系统由抗肿瘤药物，本发明的两亲性聚合物与具有肿瘤靶向特性的表面活性剂组成。其中所述具有肿瘤靶向作用的表面活性剂是由亲水性具有肿瘤亲和力的分子与疏水性分子组成的两亲分子。其中具有肿瘤亲和力的亲水性分子包括以下物质，具有组织或细胞特异性的蛋白质或多肽、生长因子、维生素及其类似物、多糖、糖肽或糖蛋白、甾体及其类似物、激素、辅助因子、遗传分子、对脑特异的含有CNSRLHLRC，CENWWGDVC，WRCVLREGPAGGCAWFNRHRL，和CLSSRLDAC片段的多肽、蛋白质；对肾特异的含有CLPVASC和CGAREMC片段的多肽、蛋白质；对肺特异的含有CGFECVRQCPERC，CGFELETC，CTLRDRNC和CIGEVEVC片段的多肽、蛋白质；对皮肤特异的含有CVALCREACGEGC片段的多肽、蛋白质；对脾特异的含有SWCEPGWCR片段的多肽、蛋白质；对小肠特异的含有YSGKWGW片段的多肽、蛋白质，对子宫特异的含有GLSGGRS片段的多肽、蛋白质；对肾上腺特异的含有LMLPRAD片段的多肽、蛋白质；对视网膜组织特异的含有CRDVVSVIC和CSCFRDVCC片段的多肽、蛋白质；具有抑制整合蛋白表达细胞与细胞外基质蛋白结合作用的多肽、蛋白质，这类蛋白质或多肽含有CRGDC，CRGDCL，NGR(AHA)，DGR(AHA)，CRGDCA，RCDVVV，SLIDIP，TIRSVD，KRGD，RRGP和RGDL片段；具有肿瘤特异性的抗体；对实体瘤血管内膜特异的含有CDCRGDCFC和CNGRCVSGCAGRC片段的多肽、蛋白质；以及其他对肿瘤细胞有特异亲和力的分子，疏水性分子选自中、长链脂肪酸、中、长链脂肪醇、硬脂酸、硬脂醇、鲸蜡酸、鲸蜡醇、月桂酸、月桂醇。其中所述抗肿瘤药物，选自紫杉醇、多烯紫杉醇、喜树碱、依托泊苷。

本发明的目的在于，提供一种新的制备聚合物胶束载药系统的方法，该方法采用微乳化-溶剂蒸发法，即聚合物和药物溶于一种极性溶剂中，滴加水使成微乳，蒸去极性溶剂即得胶束载药系统。该方法的优点是可以操作简单，重现性好，得率较高，同时适用于各种规模的聚合物胶束载药系统的制备，包括实验室规模和大生产。

本发明还提供甲基聚乙二醇与聚酯的比例小于50/50的甲基聚乙二醇-聚酯嵌段共聚物(methoxypolyethylene glycol-block-polyester)胶束，这种嵌段共聚物胶束具有临界胶束浓度(critical micellar concentration，CMC)低，胶束载药量高，胶束稳定的优点。

本发明还提供两亲性嵌段共聚物与各种具有肿瘤靶向的表面活性剂组成的胶束。该系统具有靶向性更高的特点。

(一)本发明的聚合物载药胶束采用微乳化-溶剂蒸发法制备，可经过如下步骤：1、将嵌段聚合物、药物溶于极性溶剂中，极性溶剂包括乙腈、乙醇、二甲亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺、甲醇等。2、在搅拌下缓慢滴加水使成W/O微乳，此时油相与水相的相体积比通常大于50/50。3、在搅拌下进一步滴入足量的水，使微乳因相体积比的变化发生相转化，生成O/W微乳，时油相与水相的相体积比通常小于50/50。4、在60℃左右、真空条件下蒸去有机溶剂得载药胶束系统。对于注射剂视药物的稳定性可以进一步过滤灭菌或热压灭菌。

上述制备方法中蒸馏是关键，既要确保除去极性溶剂，又要保证包封率。蒸馏温度应在嵌段聚合物的玻璃化温度左右，温度过低溶剂不易离开胶束，而温度过高将导致内相粘度降低，药物可能游离析出，使包封率下降；真空度不宜过高，通常应控制在不起泡的范围内，待大部分溶剂蒸完后，提高真空度和温度使溶剂除尽。

采用上述方法制得的胶束载药系统的粒径大小在10-100nm范围内，这样的粒径范围可以确保胶束进入血管外组织(这是下面要提及的靶向给药系统所必须的)，同时不会有引起毛细血管栓塞的危险。特别是该粒径的分散系统可以轻易通过滤过方法灭菌(如采用孔径为0.22μm的滤膜滤过灭菌)。

(二)目前报道的甲基聚乙二醇-聚酯嵌段共聚物胶束载药系统都是选择甲基聚乙二醇与聚酯比例大于50/50的甲基聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物(大于50/50是指甲基聚乙二醇的量大于聚酯的量)，然而由于CMC高，制剂中共聚物的浓度必须大于CMC，即便如此，其物理稳定性仍然不理想。本发明改进了这种状况，将聚乙二醇比例降低到小于50/50，嵌段聚合物的CMC也随之降低，同时对于同一分子量的甲基聚乙二醇，其在共聚物中的比例越低，制得的共聚物分子量越大，疏水部分越大，因而可以提高载药量和物理稳定性。

(三)对肿瘤特异亲合分子的研究表明：许多亲水性物质对各种组织有特异亲和力，可以用于组织或细胞或分子水平的肿瘤靶向。此类分子包括具有组织或细胞特异性的蛋白质或多肽、生长因子、维生素及其类似物(如叶酸)、多糖、糖肽或糖蛋白、甾体及其类似物、激素、辅助因子、遗传分子、某些药物分子。如对脑特异的含有CNSRLHLRC，CENWWGDVC，WRCVLREGPAGGCAWFNRHRL，和CLSSRLDAC片段的多肽、蛋白质；对肾特异的含有CLPVASC和CGAREMC片段的多肽、蛋白质；对肺特异的含有CGFECVRQCPERC，CGFELETC，CTLRDRNC和CIGEVEVC片段的多肽、蛋白质；对皮肤特异的含有CVALCREACGEGC片段的多肽、蛋白质；对脾特异的含有SWCEPGWCR片段的多肽、蛋白质；对小肠特异的含有YSGKWGW片段的多肽、蛋白质，对子宫特异的含有GLSGGRS片段的多肽、蛋白质；对肾上腺特异的含有LMLPRAD片段的多肽、蛋白质；对视网膜组织特异的含有CRDVVSVIC和CSCFRDVCC片段的多肽、蛋白质；具有抑制整合蛋白表达细胞与细胞外基质蛋白结合作用的多肽、蛋白质，这类蛋白质或多肽含有CRGDC，CRGDCL，NGR(AHA)，DGR(AHA)，CRGDCA，RCDVVV，SLIDIP，TIRSVD，KRGD，RRGP和RGDL片段；具有肿瘤特异性的抗体；对实体瘤血管内膜特异的含有CDCRGDCFC和CNGRCVSGCAGRC片段的多肽、蛋白质；以及其他对肿瘤细胞有特异亲和力的分子。本发明将该类分子与亲脂性分子(如硬脂酸)共价结合，得到一种新的表面活性剂，在制备聚合物胶束时加入这种表面活性剂，可以使其定向排列于胶束表面，靶向分子朝外，既而可以达到肿瘤靶向的目的。

(四)本专利中涉及的嵌段聚合物胶束可以用于载运各种疏水性药物，包括抗肿瘤药物(如紫杉醇、5-氟尿嘧啶、依托泊苷、苯丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥、六甲三聚氰胺、甲氨碟呤、甲环亚硝脲、去甲长春花碱、替尼泊苷、高三尖杉酯碱、羟喜树碱等)、抗生素(如氯霉素、红霉素、依托红霉素、琥乙红霉素、麦迪霉素、交沙霉素、克拉霉素、罗他霉素、磺胺嘧啶、甲氧苄氨嘧啶、呋喃妥因、利副平、利福昔明、异丁哌利福霉素、氨苯砜、醋氨苯砜、眯康唑等)、心血管药物(如硝苯地平、尼卡地平、尼群地平、尼伐地平、桂利嗪、哌克昔林、吗多明、洋地黄毒甙、地高辛、毛花甙丙、去乙酰毛花甙、普罗帕酮、胺碘酮、硝酸甘油、戊四硝酯、环扁桃酯、烟酸生育酚酯等)、抗糖尿病药物(如甲苯黄丁脲、格列本脲、格列吡嗪等)、非甾体抗炎药(如氯马澌汀、赛庚啶、苯噻啶、酮替芬、曲尼司等)。

嵌段聚合物CMC的测定：虽然光散射技术和凝胶色谱法可以用于测定CMC，但是精确、可靠的CMC测定方法公认是荧光光谱法，本专利中的CMC值的获得即采用该法。荧光光谱法需要适用一种荧光探针物质(fluorescence probe)，常用的是芘。芘是一种疏水性芳香化合物，对环境极性敏感。当两亲分子的浓度低于CMC时，溶液中不会形成胶束，芘溶解在极性的水中；随着两亲分子的浓度高于CMC，胶束形成，芘向胶束内核的疏水部分分配，从而进入非极性环境，继而在其荧光光谱中可以观察到一系列变化，如荧光强度将增加，发射光谱中振动精细结构(the vibrational fine structure of the emission spectra)发生变化，激发光谱中(0，0)波段红移。因此，通过以芘的发射光谱中I₁/I₃比(在固定的激发波长下扫描，I₁、I₃分别代表发射光谱中第一和第三强峰的荧光强度比)或激发光谱中I₃₃₈/I₃₃₃比(激发光谱中波长分别为338nm和333nm的荧光强度比)对两亲分子的浓度作图即可获得两亲分子的表观CMC。图中斜率发生变化的点即是形成胶束的临界点，对应的两亲分子的浓度即是CMC。荧光光谱法测定两亲分子的CMC时，芘的浓度应非常低(通常为10^-7M)，只有这样才能在临界胶束浓度点检测出斜率的变化，另外，测定时应排除其他疏水性物质对荧光光谱的作用。有时可以采用各向异性(anisotropy)荧光光谱法。

本专利中涉及的胶束粒径的测定方法是动态光散射法(dynamic lightscattering，DLS)。

药物的包封率是指包封于胶束中的药物占加入的药物的比例，它起决于制备时加入的药量和两亲分子的亲油/亲水比。

具体实施方式：

下面为本专利的实施例，但下述实施例并不限置本专利的权利范围。

实施例1

本实施例为制备依托泊苷的甲基聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物的制备及分子量、CMC的测定

材料与方法

D，L-丙交酯：购自Sigma公司，用前采用无水乙酸乙酯在60℃重结晶三次，室温下在P₂O₅中真空干燥24小时。依托泊苷、辛酸亚锡和甲基聚乙二醇(分子量2000)均购自Sigma公司。

1.甲基聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物的合成：

采用开环聚合方法，分别制备质量比例为5/95，或20/80，或50/50的甲基聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物。A)称取甲基聚乙二醇0.5g和丙交酯9.5g制备5/95甲基聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物：B)称取甲基聚乙二醇2g和丙交酯8g制备20/80的甲基聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物；C)称取甲基聚乙二醇5g和丙交酯5g制备50/50的甲基聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物。将甲基聚乙二醇和丙交酯置于密闭的反应器中，在氮气气流下升温至120-140℃使固体熔化，加入辛酸亚锡50mg，升高温度至150-180℃反应3-6小时。冷却，得白色固体粗品。粗品以二氯甲烷5ml溶解后，在搅拌下加入100ml乙醚中，滤过，反复三次，产品真空干燥24小时，即可。

2.甲基聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物分子量的测定：

甲基聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物分子量的测定采用凝胶色谱法测定。GPC色谱柱为Styragel(HR 5E，4.6×300mm，Waters)，检测器为微分折射计检测仪(Differential Refractometer Detector，JASCO，RI-930)，流动相为二甲基甲酰胺(DMF)，流速1.5ml/min，柱温为60℃，样品为0.1％的上述三种不同比例的嵌段共聚物的二甲基甲酰胺(DMF)溶液，进样量100μl。色谱柱用聚苯乙烯标准品(Aldrich，Milwaukee，Wis.)标准曲线校准。

图1、2、3分别为甲基聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物的GPC色谱图，可以看见在色谱图中均有两个色谱峰，其中保留时间短的峰是胶束的峰(该峰随样品适度稀释而变小甚至消失)，而单体的保留时间位于后(该峰在适度稀释时无明显变化)。表1是根据标准曲线计算的分子量。

表1  三种甲基聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物及其胶束分子量、CMC测定结果

mPEG/PLA	单体分子量		胶束分子量	胶束中分子数	CMC(μg/ml)
						理论值	测定值
	50/5020/805/95	40001200040000						177625876189869	156661014789201429005	882516	45.611.920.35

3.甲基聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物NMR、DSC的测定：

上述三种甲基聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物的NMR(D-氯仿为溶剂)图谱以5.2ppm(PLA)和3.6ppm(PEG)峰面积比确认聚合物中的甲基聚乙二醇与聚乳酸的质量比分别为5/95(图4)，20/80(图5)，和50/50(图6)。DSC测得三种聚合物的玻璃化温度分别为36.7(图7)，46.3(图8)，50.2℃(图9)。

4.甲基聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物CMC的测定：

甲基聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物CMC采用芘稳态荧光光谱法测定(steady-state pyrene fluorescence method)。以丙酮为溶剂配制芘的浓度为6×10^-6M的溶液，分别取1ml各10份置于10个10ml量瓶中，用氮气流挥去丙酮，分别加入聚合物的水溶液适量并稀释至刻度使聚合物浓度成0.1，0.2，0.5，1.0，5.0，10.0，50.0，100.0，500.0，1000.0，2000.0μg/ml的溶液。上述溶液置于65-70℃水浴中保温1小时，取出，室温下置暗处放置过夜。在荧光光度计(LPS-220(B)，MD-5020，Photon Technology International，USA)上绘制芘的发射光谱(360-460nm，激发波长390nm)和激发光谱(300-360nm，发射波长390nm)。记录各溶液激发光谱的I₃₃₈/I₃₃₃。以I₃₃₈/I₃₃₃对聚合物对数浓度作图，计算CMC(表1)。

实施例2

依托泊苷-甲基聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物胶束的制备及粒径测定

1.依托泊苷-甲基聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物胶束的制备

分别称取50mg依托泊苷和100mg甲基聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物置于烧瓶中，加入乙腈50ml，搅拌至溶解。在不断搅拌下，缓慢滴加25ml水，继续搅拌15分钟，进一步滴加75ml水。在60℃、真空下缓慢蒸去乙腈(旋转蒸发仪)，待无明显乙腈蒸出后，升高温度和真空度，继续蒸至样品体积约80ml，样品用水调整体积至100ml。产品以0.22mm微孔滤膜滤过除菌。

2.依托泊苷-甲基聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物胶束的粒径测定

采用动态光散射法(DynaPro 99，Proteinsolutions，USA)测定胶束粒径，散射角为90°，数据以球形模型采集，用DynaPro Version 5.1.25软件计算。结果测得甲基聚乙二醇-聚乳酸比例为50/50，20/80，5/95的嵌段共聚物的胶束粒径分别为65.63nm，50.48nm，50.02nm。

实施例3

RGD-硬脂酸酰胺的制备

硬脂酸-N-琥珀酰亚胺的制备：取0.02摩尔硬脂酸和0.02摩尔N-羟基琥珀酰亚胺，于0℃不断搅拌使溶于20ml四氢呋喃中。加入0.02摩尔二环己基碳二亚胺，于室温下搅拌过夜。过滤除去溶剂，残渣用碳酸氢钠洗涤，并用甲醇重结晶。二甲基RGD的制备：取500mg RGD(Arg-Gly-Asp tripeptide，Bachem)溶于20ml甲醇中，保温于0℃。加入2ml亚硫酰(二)氯在室温下搅拌过夜。减压蒸去溶剂即得二甲基RGD。

二甲基RGD-硬脂酸酰胺的制备：取等摩尔得摩尔二甲基RGD溶液(二甲基甲酰胺为溶剂)和硬脂酸-N-琥珀酰亚胺溶液(乙二醇二甲醚为溶剂)混匀，加三乙胺适量使反应开始，室温下反应48小时。减压除去溶剂。

RGD-硬脂酸酰胺的制备：取二甲基RGD硬脂酸酰胺溶于甲醇，缓缓滴入1MNaOH溶液，继续反应3小时。滴加1N HCl调节溶液至pH7.0。经硅胶色谱柱层析(甲醇为洗脱剂)，收集RGD-硬脂酸酰胺部分。除去甲醇即可。

实施例4

依托泊苷-甲基聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物-RGD-硬脂酸酰胺胶束的制备

分别称取50mg依托泊苷、4.5mg RGD-硬脂酸酰胺和100mg甲基聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物置于烧瓶中，加入乙腈50ml，搅拌至溶解。在不断搅拌下，缓慢滴加25ml水，继续搅拌15分钟，进一步滴加75ml水。在60℃、真空下缓慢蒸去乙腈(旋转蒸发仪)，待无明显乙腈蒸出后，升高温度和真空度，继续蒸至样品体积约80ml，样品用水调整体积至100ml。产品以0.22mm微孔滤膜滤过除菌。

实施例5

依托泊苷-甲基聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物-RGD-硬脂酸酰胺胶束细胞毒(Cytotoxicity)实验

细胞毒试验采用MTS(3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxy-phenyl)-2-(4-sulfophonyl)-2H-tetrazolium，inner salt，Promega))比色法。取依托泊苷、RGD-硬脂酸酰胺、甲基聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物适量，分别配制依托泊苷浓度为6mg/ml的依托泊苷注射液(照市售处方配制溶剂：PEG 300 650mg，聚山梨酯80 80mg，苯甲醇30mg，枸橼酸2mg，乙醇30.5％v/v)、依托泊苷-甲基聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物胶束分散液、依托泊苷-甲基聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物-RGD-硬脂酸酰胺胶束分散液，分别热压灭菌。分别用注射用水稀释至一定浓度试验。

试验细胞分别为MDA-MB-435乳癌细胞(HTB)和人正常纤维原细胞(NHEK)。分别将三种处方用注射用水稀释成1000，500，250，100，50，25，10，5，2.5，1,0μmol/ml的系列溶液试验。用空白溶剂或胶束分散液作对照。

结果表明见表2：依托泊苷注射液(CE)及其空白溶剂(CS)毒性较大，且对正常细胞和肿瘤细胞的毒性相仿；依托泊苷-甲基聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物胶束分散液(BPE)及其空白分散液(BP)毒性最低(空白分散液对肿瘤细胞和正常细胞均无明显毒性)，且正常细胞对依托泊苷-甲基聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物胶束分散液的耐受略高于肿瘤细胞；依托泊苷-甲基聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物-RGD-硬脂酸酰胺胶束分散液(RBPE)对NHEK的IC50为283.12μmole/ml，对HTB的IC50为62.25μmole/ml，而空白甲基聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物-RGD-硬脂酸酰胺胶束分散液(RBP)。

表2  各种依托泊苷制剂或空白制剂对NHEK和HTB的IC50(μmole/ml)

药品	CE	CS	BPE	BP	RBPE	RBP
							NHEK	31.3	38.82	333.33	＞1000	283.12	750.00
HTB	80.77	81.77	71.43	＞1000	62.25	622.22

实施例6

紫杉醇-甲基聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物胶束的制备

分别称取50mg紫杉醇和100mg甲基聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物置于烧瓶中，加入乙腈50ml，搅拌至溶解。在不断搅拌下，缓慢滴加25ml水，继续搅拌15分钟，进一步滴加75ml水。在60℃、真空下缓慢蒸去乙腈(旋转蒸发仪)，待无明显乙腈蒸出后，升高温度和真空度，继续蒸至样品体积约80ml，样品用水调整体积至100ml。产品以0.22mm微孔滤膜滤过除菌。

实施例7

紫杉醇-甲基聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物-RGD-硬脂酸酰胺胶束的制备

分别称取50mg紫杉醇、4.5mg RGD-硬脂酸酰胺和100mg甲基聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物置于烧瓶中，加入乙腈50ml，搅拌至溶解。在不断搅拌下，缓慢滴加25ml水，继续搅拌15分钟，进一步滴加75ml水。在60℃、真空下缓慢蒸去乙腈(旋转蒸发仪)，待无明显乙腈蒸出后，升高温度和真空度，继续蒸至样品体积约80ml，样品用水调整体积至100ml。产品以0.22mm微孔滤膜滤过除菌。

附图说明：

图1  50/50甲基聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物的GPC图

图2  20/80甲基聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物的GPC图

图3  5/95甲基聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物的GPC图

图4  50/50甲基聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物的NMR图

图5  20/80甲基聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物的NMR图

图6  5/95甲基聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物的NMR图

图7  50/50甲基聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物的DSC图

图8  20/80甲基聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物的DSC图

图9  5/95甲基聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物的DSC图

Claims (5)

1.一种两亲性二嵌段聚合物，由甲基聚乙二醇，聚酯制成，其特征在于，在共聚物组成的配比中，甲基聚乙二醇与聚酯的质量比低于50/50，其中的聚酯选自聚乳酸、聚乙醇酸或乙交酯-丙交酯共聚物。

2.一种两亲性二嵌段聚合物胶束的制备方法，其特征在于，通过以下步骤制备，

a.将药物和权利要求1的聚合物溶于极性有机溶剂中，

b.滴加水至溶液中，或将溶液滴入水中使成微乳，

c.蒸去极性有机溶剂。

3、权利要求2的制备方法，其中所述极性有机溶剂选自乙腈、乙醇、二甲亚砜、二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷、氯仿。

4.一种两亲性二嵌段聚合物胶束载药系统，其特征在于，由权利要求2或3的制备方法制备的胶束以亲水基团向外，亲脂基团向内定向排列的药物运载系统组成，药物载运于胶束中。

5、权利要求4的载药系统，其所载的药物选自抗肿瘤药物、抗生素、心血管药物、抗糖尿病药物、非甾体抗炎药。

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