CN1295330C - 抗病毒活性重组鸡γ－干扰素rChIFN－γ的制取方法及用途 - Google Patents
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Abstract
抗病毒活性重组鸡γ-干扰素的制取方法及用途，涉及一种广谱高效抗病毒基因工程产品的制取方法。将ChIFN-γ基因从真核质粒中经双酶切后克隆到转移载体中，获得重组转移质粒pFASTBACl-ChIFN-γ；取DH10Bac感受态细胞，加入1ng pFASTBACl-ChIFN-γ，转座后，用SOC培养基稀释培养物，涂布Luria平板，培养后，挑取白色菌落，Luria平板进行纯化，阳性质粒命名为Bacmid-ChIFN-γ，提取阳性质粒DNA；取上述阳性质粒DNA转染Sf9细胞，制得高抗病毒活性重组鸡γ-干扰素。本发明还在于将该干扰素用于抑制MDV GA对CEF的致病变作用、抑制NDV F48E8在细胞上的增殖、抗AIV(H5N1)病毒对细胞的致病作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种广谱高效抗病毒基因工程产品的制取方法。
背景技术
鸡γ-干扰素(ChIFN-γ)是由活化的T细胞和NK细胞受有丝分裂原或特异性抗原刺激后产生的一种细胞因子，分子量为17～20KD。IFN-γ具有抗病毒、抗肿瘤细胞生长、分化的生物学活性等，在免疫调节中起重要作用。ChIFN-γ基因由Digby和Lowenthal于1995年首次克隆，随后国内外学者先后用大肠杆菌、COS细胞、杆状病毒、鸡痘病毒、禽腺病毒以及植物烟草花叶病毒表达ChIFN-γ，对其生物学活性进行了大量研究。本实验室也成功克隆出了ChIFN-γ基因，并在大肠杆菌和COS细胞上进行了表达和初步应用，发现原核表达的rChIFN-γ没有抗病毒活性，COS细胞瞬时表达的rChIFN-γ活性较低。
发明内容
本发明目的在于发明一种能高效地表达高抗病毒活性重组鸡γ-干扰素rChIFN-γ的制取方法。
本发明由以下步骤组成：
a、将ChIFN-γ基因从真核质粒pcDNA-ChIFN-γ中用EcoR I和Not I双酶切后克隆到转移载体pFASTBAC1中，获得重组转移质粒pFASTBAC1-ChIFN-γ；
b、取DH10Bac感受态细胞，加入1ng pFASTBAC1-ChIFN-γ，转座后，用SOC培养基10倍梯度稀释培养物，各取100μl涂布Luria平板，37℃培养24～48小时，挑取白色菌落，Luria平板进行四次筛选纯化，阳性质粒命名为Bacmid-ChIFN-γ，提取出阳性质粒DNA用于下一步转染；
c、取上述阳性质粒Bacmid-ChIFN-γDNA转染Sf9细胞。
为了获得更多的高抗病毒活性rChIFN-γ，可以取鸡γ-干扰素重组杆状病毒感染量为MOI＝1，感染96h。
另外，在步骤a中，用EcoR I和Not I双酶切真核质粒pcDNA-ChIFN-γ，回收ChIFN-γ片段，与同样酶切的pFASTBAC1回收产物4℃连接过夜，转化DH5α感受态细菌，筛选出pFASTBAC1-ChIFN-γ。
在步骤b中，Luria平板为含氨苄青霉素板或卡那霉素板或庆大霉素板或四环素板或IPTG板或X-gal抗生素板。
本发明的第二个目的还在于为依上述方法获得的抗病毒活性重组鸡γ-干扰素rChIFN-γ提供用途：
可用于抑制MDV GA对CEF的致病变作用；还可用于抑制NDV F48E8在细胞上的增殖；还可用于抗AIV H5N1病毒对细胞的致病作用。
附图说明
图1为重组转移质粒pFastBacl-ChIFN-γ双酶切电泳鉴定图谱。
图2为转染SF9细胞5天前后的对比IFA图谱。
图3为重组鸡γ-干扰素(rChIFN-γ)活性测定汇总表图。
具体实施方式
1.方法
1.1杆状病毒重组鸡γ-干扰素转移载体pFASTBAC1-ChIFN-γ的构建
用限制性内切酶EcoR I和Not I(购自宝生物大连公司)双酶切真核质粒pcDNA-ChIFN-γ，回收ChIFN-γ片段，与同样酶切的pFASTBAC1回收产物4℃连接过夜，转化DH5α感受态细菌，筛选出的重组质粒命名为pFASTBAC1-ChIFN-γ。
1.2重组杆状病毒表达质粒Bacmid-ChIFN-γ的构建和鉴定
取DH10Bac感受态细胞，加入lng pFASTBAC1-ChIFN-γ，转座后，用SOC培养基10倍梯度稀释培养物，各取100μl涂布Luria平板，37℃培养24~48小时，挑取白色菌落，Luria平板(含氨苄青霉素、卡那霉素、庆大霉素、四环素、IPTG和X-gal抗生素板)进行四次筛选纯化，阳性质粒命名为Bacmid-ChIFN-γ，提取阳性质粒DNA用于下一步转染。
1.3Sf9细胞的转染及间接免疫荧光(IFA)检测
将重组质粒Bacmid-ChIFN-γ用脂质体转染试剂按GIBCO BRL公司说明书中的转染程序转染Sf9细胞，27℃培养5h后换用含血清的Grace’s培养液。同时转染野生病毒DH10Bac(购自GIBCO公司)，作为阴性对照。3d后观察细胞病变，收集转染后72h的细胞上清，500g离心5min，收集上清4℃避光保存，即为P1代。转染5d后，细胞用-20℃预冷的丙酮-乙醇(3∶2)固定5min，PBS洗3次，室温吹干，加入1∶100稀释的鼠抗鸡干扰素-γ高免血清，37℃孵育30min，PBS洗3次，加入1∶150稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG，37℃孵育30min，PBS洗3次。荧光显微镜下观察记录，同时设野生型病毒基因组转染Sf9细胞、Sf9正常细胞作为阴性对照。
1.4重组杆状病毒的扩增和表达条件的优化
将病毒分别以不同的MOI(每个细胞的病毒感染量)感染Sf9细胞并于感染后不同时间收集表达产物上清。用10倍梯度稀释重组干扰素(每孔100μl)致敏次代鸡胚成纤维细胞24h，然后加入100TCID50(100μl)的VSV，24h～48h后观察细胞半数保护情况，按照刘长暖等的方法测定鸡干扰素-γ的活性，用Reed-Muench法进行计算，最终确定重组病毒的最佳感染量和最佳蛋白表达时间。以每ml干扰素样品的最高稀释度仍能保护半数细胞(50％)免受病毒攻击的稀释度的倒数值定义为1个干扰素单位(U)。
1.5重组鸡γ-干扰素(rChIFN-γ)抗病毒活性测定
按照步骤1.4测定的结果将表达产物进行系列稀释，每孔加100μl，将单层鸡胚成纤维细胞分别致敏24h和48h后，然后再分别接种1、10和100×TCID50的NDV F48E8株，10～104TCID50禽流感病毒(H5N1)，24h后观察半数细胞保护情况；用同样方法致敏单层鸡胚成纤维细胞后接种不同空斑数的MDV GA株，待病毒吸附5h后，加入1％琼脂和维持液混合液覆盖，5天后观察空斑增殖抑制情况。设野生型病毒感染的细胞培养上清和正常细胞培养上清作为病毒致病的阳性对照。结果用SPSS软件对统计数据进行单因素方差分析。
2结果
2.1转移质粒的酶切鉴定将ChIFN-γ基因从真核质粒pcDNA-ChIFN-γ中用EcoR I和Not I双酶切后克隆到转移载体pFASTBAC1中，经过DNA纯化和双酶切鉴定，证明获得的重组转移质粒pFASTBAC1-ChIFN-γ正确(如图1所示)。经测序分析，进一步证明基因序列正确无误。
2.2rChIFN-γ在Sf9细胞上表达取上述重组DNA质粒(Bacmid-ChIFN-γ)转染Sf9细胞，五天后按上述方法进行IFA，结果表明，荧光显微镜下可以见到Sf9胞浆内和胞膜上都有亮绿色的荧光，而野生病毒转染的Sf9细胞、正常Sf9细胞没有可见荧光。这一结果证明rChIFN-γ在Sf9细胞中得到良好表达(如图2所示)。
2.3Sf9细胞上清中含有高效价的rChIFN-γ活性取不同的MOI分别感染Sf9细胞，于感染后不同时间收集细胞上清，按10倍梯度稀释，致敏次代CEF，24h后，加入100TCID50的VSV，再间隔24h后观察细胞保护情况。结果发现，rChIFN-γ的表达是随时间和MOI的变化而变化的，当MOI＝1时，rChIFN-γ表达量呈明显稳定的上升趋势，且活性也相对最高，96h达到表达高峰，MOI＝2时也是如此，但表达量略低于MOI＝1，而MOI＝4，6，8，10，rChIFN-γ表达在感染后72h达到了高峰，由于细胞裂解较多，所以采样时rChIFN-γ活性不是很高，从感染后96h～144h，细胞全部裂解，所以在96h收集破碎细胞和细胞上清测定蛋白活性。连续四次实验结果表明干扰素感染量为MOI＝1为最佳感染量，感染后96h为最佳收获时间，测得的干扰素的活性高达1.58×106U/0.1ml。将四次的测定结果取平均值后进行绘图，如图3所示。表达的干扰素对温度比较敏感，在4℃避光可保存3个月，活性仍能保持在1×106U/0.1ml，37℃放置1天活性就会下降到1×105U/0.1ml，58℃处理1h活性就下降到1×104U/0.1ml，放液氮和-20℃冻融一次后的活性下降到1×105U/0.1ml，但能保持该活性半年不变。表达的干扰素对pH也比较敏感，研究发现干扰素在pH＝5～7，4℃处理1h时，活性为1×106U/0.1ml左右，但pH小于5，大于7时干扰素活性下降到1×103～1×104U/0.1ml。
3应用
3.1高抗病毒活性重组鸡γ-干扰素(rChIFN-γ)能抑制MDV GA对CEF的致病变作用，但对NDV F48E8仅能抑制其在细胞上的增殖
用不同量的高抗病毒活性rChIFN-γ分别致敏CEF 24h和48h，接种不同剂量TCID50的F48E8毒，结果发现在24h内重组干扰素对细胞几乎没有保护作用，细胞均表现出病变。用血凝实验测定细胞上清中的病毒血凝价，从感染后第3天开始，连续5天，直到阳性感染细胞全部死亡，然后将各稀释度第5天的血凝价平均值列表，如表1，从表1中也可以看出，对照组和试验组的细胞都有血凝价，经统计学分析组与组之间差异不显著。当用GA(1.6×104PFU/ml)稀释到一定的空斑数后，感染致敏过24h的CEF，吸附5h后加琼脂覆盖维持5天，台盼蓝(0.3％)染色计数空斑。结果发现高抗病毒活性rChIFN-γ致敏过的CEF病毒形成的空斑数明显少于对照组(正常上清)，结果如表2，从表2中结果可以看出高抗病毒活性rChIFN-γ对MDV GA的空斑抑制作用与干扰素的用量呈正相关，经SPSS软件统计分析干扰素加入组与组之间差异显著。
表1 rChIFN-γ干扰素抑制NDV的血凝测定结果
HA结果记为2n，表格中的结果为n值
表2 rChIFN-γ对马立克氏病病毒的空斑抑制作用
| 干扰素用量(U) | 平均空斑数(PFU) | 空斑抑制率(％) | ||
| 160PFU感染组 | 1600PFU感染组 | 160PFU感染组 | 1600PFU感染组 | |
| 对照组104104104104 | 15810200 | 1597213120580 | 1.2593.7598.75100100 | 0.1986.6992.5096.38100 |
3.2高抗病毒活性重组鸡γ-干扰素(rChIFN-γ)有显著的抗AIV(H5N1)病毒对细胞的致病作用
按上述方法致敏并感染AIV病毒，然后用血凝实验测定细胞上清中的血凝价，从感染后24h开始，连续10天测得的血凝价平均列表，如表3，从表3中可以看出rChIFN-γ对AIV H5N1有明显抑制作用，且rChIFN-γ的量为100U以上时，对104TCID50 AIV病毒都能表现出很好的抑制效果。
表3rChIFN-γ104TCID50 AIV的抑制结果
HA结果记为2n，表格中的结果为n值
3.3结论
以本发明所述方法对表达条件的优化使感染后昆虫细胞上清中的高抗病毒活性rChIFN-γ活性就达到1~1.58×106-7U/ml[每ml干扰素样品的最高稀释度仍能使细胞50％免受病毒的攻击的稀释度的倒数值定义为1个干扰素单位]，且昆虫细胞上清易于收获。
本发明用杆状病毒表达的高抗病毒活性rChIFN-γ进行抗病毒初步研究发现其具有很强的抗病毒能力，但对不同病毒的抗病毒能力差异显著，对NDV(F48E8株)有一定的抑制作用；rChIFN-γ对禽流感的抑制作用最为明显，对不同接种量的病毒都有明显的抑制作用；对MDV(GA株)的空斑抑制作用也非常明显。
Claims (7)
1、抗病毒活性重组鸡γ-干扰素rChIFN-γ的制取方法，其特征在于由以下步骤组成：
a、将ChIFN-γ基因从真核质粒pcDNA-ChIFN-γ中用EcoR I和Not I双酶切后克隆到转移载体pFASTBAC1中，获得重组转移质粒pFASTBAC1-ChIFN-γ；
b、取DH10Bac感受态细胞，加入1ng pFASTBAC1-ChIFN-γ，转座后，用SOC培养基10倍梯度稀释培养物，各取100μl涂布Luria平板，37℃培养24～48小时，挑取白色菌落，Luria平板进行四次筛选纯化，阳性质粒命名为Bacmid-ChIFN-γ，提取出阳性质粒DNA用于下一步转染；
c、取上述阳性质粒Bacmid-ChIFN-γDNA转染Sf9细胞。
2、根据权利要求1所述抗病毒活性重组鸡γ-干扰素rChIFN-γ的制取方法，其特征在于在步骤c中，取鸡γ-干扰素重组杆状病毒感染量为MOI＝1，感染96h。
3、根据权利要求1所述抗病毒活性重组鸡γ-干扰素rChIFN-γ的制取方法，其特征在于在步骤a中，用EcoR I和Not I双酶切真核质粒pcDNA-ChIFN-γ，回收ChIFN-γ片段，与同样酶切的pFASTBAC1回收产物4℃连接过夜，转化DH5α感受态细菌，筛选出pFASTBAC1-ChIFN-γ。
4、根据权利要求1所述抗病毒活性重组鸡γ-干扰素rChIFN-γ的制取方法，其特征在于在步骤b中，Luria平板为含氨苄青霉素板或卡那霉素板或庆大霉素板或四环素板或IPTG板或X-gal抗生素板。
5、如权利要求1所述方法获得的抗病毒活性重组鸡γ-干扰素rChIFN-γ用于抑制鸡马立克病毒MDV GA对鸡胚成纤维细胞CEF的致病变作用。
6、如权利要求1所述方法获得的抗病毒活性重组鸡γ-干扰素rChIFN-γ用于抑制鸡新城疫病毒NDV F48E8在细胞上的增殖。
7、如权利要求1所述方法获得的抗病毒活性重组鸡γ-干扰素rChIFN-γ用于抗禽流感病毒AIV H5N1对细胞的致病作用。
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