CN104745630A - 在昆虫细胞sf9中表达hABCB11的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种在昆虫细胞sf9中表达人hABCB11的方法，是将两端分别包含BamHI和HindIII酶切位点的人ABCB11基因克隆入pFastBac1载体的BamHI和HindIII位点，将得到的重组质粒pFastBac1-hABCB11转化DH10Bac大肠杆菌感受态细胞，获得插入hABCB11基因的重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-hABCB11，脂质体介导上述重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-hABCB11转染sf9昆虫细胞，获得表达hABCB11的重组病毒，进一步培养所述重组病毒，表达hABCB11蛋白。本发明方法为hABCB11蛋白的大量获得提供一条新途径，为hABCB11蛋白的应用开发打下工作基础。

Description

在昆虫细胞sf9中表达hABCB11的方法

技术领域

本发明涉及一种在昆虫细胞sf9中表达hABCB11的方法，属于生物基因工程领域。

背景技术

ABCB11是ABC七大家族转运体中G族的蛋白成员之一，在人的正常细胞和肿瘤组织中均有表达，如小肠上皮顶膜、胎盘合胞体滋养层、肠小管膜、大脑微血管皮细胞、乳腺小叶、和乳腺癌细胞等。ABC蛋白的主要功能是小分子物质及多肽分子跨膜转运。转运膜区会通过改变形态允许某些分子通过。免疫组化显示ABCB11主要在细胞膜和胞浆中表达，不仅具有吸收、分泌和排泄功能，而且具有抑制消化道吸收某些外源性物质，参与形成血脑、胎血屏障等生理功能；同时ABCB11是ATP结合转运蛋白，需要结合水解胞浆中的ATP，以此确保转运底物所需的足够能量，该蛋白及转运膜区的这些特殊反应能够使转运子与底物像齿轮一样吻合并通过水解ATP来转运底物。此外，ABCB11也是与肿瘤多药耐药有关的新的药物排出泵，是肿瘤多药耐药的重要机制之一。因此，对ABCB11的抑制剂或底物的研究具有重要意义。目前尚未有在昆虫细胞中表达hABCB11的相关方法报道。

发明内容

本发明的目的是提出一种在昆虫细胞sf9中表达hABCB11的方法，通过该方法制得的hABCB11可用于hABCB11底物或抑制剂的检测。本发明的目的将通过以下技术方案得以实现：

一种在昆虫细胞sf9中表达人hABCB11的方法，包括如下步骤:

步骤一，人工合成两端分别包含BamHI和HindIII酶切位点的hABCB11基因；

步骤二，将hABCB11基因克隆入pFastBac1载体的BamHI/HindIII位点，得到重组质粒pFastBac1-hABCB11；

步骤三，将重组质粒pFastBac1-hABCB11转化DH10Bac大肠杆菌感受态细胞，与其中的杆状病毒穿梭载体Bacmid重组，获得插入hABCB11基因的重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-hABCB11；

步骤四，脂质体介导重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-hABCB11转染sf9昆虫细胞，获高滴度的hABCB11的重组病毒；

步骤五，hABCB11的重组病毒感染SF9昆虫细胞，大量表达hABCB11蛋白。

本发明进一步地，步骤一所述的两端分别包含BamHI和HindIII酶切位点的人hABCB11基因通过如下方法获得：根据NCBI参考序列信息NM_003742.2，在5‘端添加BamHI酶切位点序列，在3’端添加HindIII酶切位点序列，序列总长度为4189bp 。

本发明进一步地，还包含对所述重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-hABCB11的PCR鉴定方法，步骤如下：分别以T-pFast F:(SEQ ID No.1 )和T-pFast R:(SEQ ID No.2)、T-hABCB11 F:(SEQ ID No.3)和T-hABCB11 R:(SEQ ID No.4)、或\和T-pFast F:(SEQ ID No.1 )和T-hABCB11 R:(SEQ ID No.4)为引物组合对SF9-hABCB11基因组DNA进行PCR扩增，扩增出对应的4505bp、653bp、1641bp目标片段，即为hABCB11基因在SF9昆虫细胞中表达完成。

本发明进一步地，还包括重组hABCB11蛋白功能的鉴定方法，步骤如下：将ABCB11蛋白的转运底物加入表达ABCB11蛋白的细胞膜中，参与ATP/AMP反应，反应终止后将细胞膜中微囊泡外的转运底物洗去，通过液质联用、荧光测定法或同位素标记底物法中的一种来测定微囊泡内的转运底物浓度，从而判定ABCB11蛋白的活性。

本发明进一步地，所述微囊泡内的转运底物浓度越大，ABCB11的活性越高。

本发明进一步地，所述的重组病毒培养基为无血清无抗生素的昆虫细胞培养基。

本发明的应用和实施使其显著技术效果为： 

①参照序列合成了hABCB11基因，进而将其克隆入pFastBac1载体，并进一步获得含hABCB11基因的重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-hABCB11，通过脂质体介导转染sf9昆虫细胞，成功实现了hABCB11基因在昆虫细胞中的表达，为hABCB11的大量获得提供一条新途径，为人ABCB11蛋白的应用开发打下工作基础； 

②通过本发明方法可获得高滴度的重组的杆状病毒，进而直接感染昆虫细胞，有利于大规模生产其外源蛋白；

③利用本发明方法制得的重组人hABCB11蛋白制作成药物体外测试试剂盒，可实现hABCB11蛋白底物或抑制剂药物体外吸收测试的全自动高通量筛选，与现有体外细胞ABCB11模型测试方法相比，灵活性更高、重复性更好。

以下便结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步的详述，以使本发明技术方案更易于理解、掌握。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

一种在昆虫细胞sf9中表达人hABCB11的方法，包括如下步骤：

步骤一，人工合成两端分别包含BamHI和HindIII酶切位点的hABCB11基因。

步骤二，将hABCB11基因克隆入pFastBac1载体的BamHI/HindIII位点，得到重组质粒pFastBac1-hABCB11；所述的两端分别包含BamHI和HindIII酶切位点的人hABCB11基因通过如下方法获得：根据NCBI参考序列信息NM_003742.2，在5‘端添加BamHI酶切位点序列，在3’端添加HindIII酶切位点序列，序列总长度为4189bp ，可将该序列信息发送至基因合成公司进行人工合成基因。

步骤三，将重组质粒pFastBac1-hABCB11转化DH10Bac大肠杆菌感受态细胞，与其中的杆状病毒穿梭载体Bacmid重组，获得插入hABCB11基因的重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-hABCB11；该重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-hABCB11的鉴定方法包括但不限于PCR鉴定，具体步骤详述如下：

分别以T-pFast F:(SEQ ID No.1 )和T-pFast R:(SEQ ID No.2)、T-hABCB11 F:(SEQ ID No.3)和T-hABCB11 R:(SEQ ID No.4)、T-pFast F:(SEQ ID No.1 )和T-hABCB11 R:(SEQ ID No.4)为引物组合对SF9-hABCB11基因组DNA进行PCR扩增，扩增出对应的4505bp、653bp、1641bp目标片段，即为hABCB11基因在SF9昆虫细胞中表达完成。

所述的重组病毒培养基为无血清无抗生素的昆虫细胞培养基。

步骤四，脂质体介导重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-hABCB11转染sf9昆虫细胞，获高滴度的hABCB11的重组病毒；

步骤五，hABCB11的重组病毒感染SF9昆虫细胞，大量表达hABCB11蛋白。

本发明具体实施例的，还包括重组hABCB11蛋白功能的鉴定方法，步骤如下：将ABCB11蛋白的转运底物加入表达ABCB11蛋白的细胞膜中，加入ATP/AMP反应，反应终止后将细胞膜中微囊泡外面的转运底物洗去，细胞微囊泡是各类细胞遭受一系列应激(激活或凋亡)时,从细胞质膜上脱落而释放的膜性小囊泡,可通过液质联用、荧光测定法或同位素标记底物法中的一种来测定微囊泡内的转运底物浓度，从而判定ABCB11蛋白的活性，所述微囊泡内的转运底物浓度越大，ABCB11的活性越高。

本发明方法参照序列合成了hABCB11基因，进而将其克隆入pFastBac1载体，并进一步获得含hABCB11基因的重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-hABCB11，通过脂质体介导转染sf9昆虫细胞，成功实现了hABCB11基因在昆虫细胞中的表达，为hABCB11的大量获得提供一条新途径，为人ABCB11蛋白的应用开发打下工作基础；通过本发明方法可获得高滴度的重组的杆状病毒，进而直接感染昆虫细胞，有利于大规模生产其外源蛋白；利用本发明方法制得的重组人hABCB11蛋白制作成药物体外测试试剂盒，可实现hABCB11蛋白底物或抑制剂药物体外吸收测试的全自动高通量筛选，与现有体外细胞ABCB11模型测试方法相比，灵活性更高、重复性更好。

【实施例l】 pFastBac1-hABCB11表达载体的构建

(1)获得两端分别包含BamHI和HindIII酶切位点的hABCB11基因：

根据NCBI参考序列信息NM_003742.2，选定其中长度为4177bp的序列为目标序列，在目标序列的5‘端添加BamHI酶切位点序列和在3’端添加HindIII酶切位点序列，序列总长度为4189bp，序列详细信息可见附表中的(SEQ ID No.5)，把该序列信息发送至基因合成公司进行人工合成基因（苏州金唯智生物科技有限公司）。

BamHI酶切位点序列GGATCC< NM_003742.2碱基序列4177bp>AAGCTT HindIII酶切位点序列。

(2)hABCB11基因克隆入pFastBac1载体：

利用BamHI和HindIII核酸内切酶（New England Biolabs Inc.）分别对步骤（1）得到的hABCB11基因和pFastBac1载体（英潍捷基（上海）贸易有限公司）进行双酶切，获得hABCB11基因目的片段和pFastBac1载体线性片段，用DNA连接酶（New England Biolabs Inc.）处理连接两片段，得到连接产物。

(3)连接产物转化和重组质粒鉴定：

将步骤（2）得到的连接产物10μl加入200μl感受态DH5a大肠杆菌（英潍捷基（上海）贸易有限公司）中，轻摇混匀，置冰上30分钟；42℃热处理90秒，迅速置冰上5分钟；加入800μL 37℃预热的LB培养液，置于37℃，220rpm振摇1小时；500rpm离心后全部涂布于含100μg/mL 氨苄西林的LB平板，37℃倒置培养过夜。挑取单独菌落接种含100μg/mL 氨苄西林的LB培养基37℃过夜振荡培养，提取质粒DNA进行PCR鉴定。

分别以T-pFast F:(SEQ ID No.1 )和T-pFast R:(SEQ ID No.2)、T-hABCB11 F:(SEQ ID No.3)和T-hABCB11 R:(SEQ ID No.4)、T-pFast F:(SEQ ID No.1 )和T-hABCB11 R:(SEQ ID No.4)为引物组合对提取的重组质粒DNA进行常规PCR扩增，扩增出对应的4505bp、653bp、1641bp目标片段，即为真正含有整合了目的基因的重组表达载体pFastBac1-hABCB11。引物设计如下：

(SEQ ID No.1)：名称：T-pFast F，序列：GATAACCATCTCGCAAATAA；

(SEQ ID No.2)：名称：T-pFast R，序列：AATGCAGTGAAAAAAATGCT；

(SEQ ID No.3)：名称：T-hABCB11 F，序列：CCACCATTGGTCTGAGTGTG；

(SEQ ID No.4)：名称：T-hABCB11 R，序列：GGGGTCATAGAATCGCTGAA。

【实施例2】重组杆状病毒的获得

将pFastBac1-hABCB11重组质粒DNA转化DH10Bac大肠杆菌感受态细胞（英潍捷基（上海）贸易有限公司）(其中含有一个杆状病毒穿梭载体简称Bacmid，以及一个辅助质粒)，以获得插入hABCB11基因的重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-hABCB11。

(1)重组pFastBac1-hABCB11转化进入DH10Bac大肠杆菌感受态细胞 (转座)：

①取1ug重组表达载体pFastBac1-hABCB11加入l00uL DH10Bac大肠杆菌感受态细胞（英潍捷基（上海）贸易有限公司），轻摇混匀，放入冰水浴30分钟，置于42℃热处理45秒，然后迅速移至冰水中放置2分钟。

②在该管中加入灭菌的LB液体培养基900ul，37℃摇床220rpm振荡培养1小时，使之发生转座。

③用②步骤所得LB培养液制备10倍系列的细胞稀释液，以10、100，和1000倍不同的稀释度稀释，各取100μL分别涂布于含50μg/mL卡那霉素、7μg/mL庆大霉素、10μg/mL四环霉素、100μg/mL X-gal、40μg/mL IPTG的LB平板。

④将LB平板于37℃倒置培养48小时，观察蓝白斑的生长情况。发生转座后的DH10Bac细菌因其LacZ基因被插入失活，而使含有重组Bacmid的大肠杆菌菌落成为白色。未被插入的空白DH10Bac细菌则生长成为蓝色菌落。

(2)重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-hABCB11的提取：

阳性表形的确定:

①用10μl的枪头轻轻挑取10个分隔较大的单独白色菌落，划线于同样含有卡那霉素、庆大霉素、四环霉素、X-gal、IPTG的LB平板上，37℃培养过夜。

②如果所得菌落仍然均为白斑，说明所挑菌落均为真正含有整合了目的基因的阳性克隆Bacmid-hABCB11；

③从再划线平板上挑取单独的阳性白色单克隆置于含卡那霉素、庆大霉素、四环霉素的液体培养液中，37℃摇床220rpm振荡培养24小时。

④将此培养液按照质粒DNA抽提试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）的说明进行重组杆状病毒穿梭载体的质粒DNA抽提。

(3)重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-hABCB11的PCR鉴定：

分别以T-pFast F(SEQ ID No.1)、T-pFast R(SEQ ID No.2)；T-hABCB11 F (SEQ ID No.3)、T-hABCB11 R(SEQ ID No.4)；T-pFast F(SEQ ID No.1)、T-hABCB11 R(SEQ ID No.4)为引物组合对提取的重组质粒DNA进行常规PCR扩增，能够扩增出对应的4505bp、653bp、1641bp目标片段的即为真正含有整合了目的基因的重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-hABCB11。

【实施例3】重组杆状穿梭载体病毒Bacmid-hABCB11转染sf9细胞

(1)转染sf9单层细胞：

在细胞培养的六孔板中每孔以2mL的无血清无抗生素的昆虫细胞培养基（英潍捷基（上海）贸易有限公司）接种9×10⁵个SF9细胞，培养过夜，待细胞密度长至60%～70%时进行转染。在无菌的小离心管中配制以下溶液：

A液: 2μg重组Bacmid-hABCB11质粒DNA加100μL无血清无抗生素的昆虫细胞培养基；

B液: 6μL脂质体转染试剂Cellfectin（英潍捷基（上海）贸易有限公司）加100μL无血清无抗生素的昆虫细胞培养基；

然后将A液和B液轻轻混合均匀，室温放置15分钟，同时去除六孔板中每个孔中的培养液，以无血清无抗生素的昆虫细胞培养基洗涤一遍，弃净培养液。在上述混合液中补加800μL无血清无抗生素的昆虫细胞培养基，至总体积约1mL，再加入每个孔中，置于27℃孵育。5小时后去除DNA混合液，每孔加入2mL无血清无抗生素的昆虫细胞培养基，在27℃培养箱中培养72小时之后观察细胞感染病毒状况。

(2)重组杆状病毒的获得与扩大：

①待被转染的细胞大部分出现体积明显增大、破裂状况后，在每个孔中收集含有重组杆状病毒颗粒的培养上清液，1000g离心10分钟去除细胞和大碎片，将上清过滤除菌后避光4℃保存，此为P1代病毒，可用于再次感染SF9单层细胞以获取高滴度的病毒液。

②在细胞培养的六孔板中每孔以2mL的无血清无抗生素的昆虫细胞培养基接种9×10⁵个SF9细胞，培养过夜，待细胞密度长至60%～70%时进行转染。孔中加入适量P1病毒液，在27℃培养箱中培养48小时。镜检细胞病变状况，待被转染的细胞大部分出现体积明显增大、破裂状况后，收集培养上清液，1000g离心10分钟去除细胞和大碎片，将上清过滤除菌后避光4℃保存，此即为P2代病毒。

③在细胞培养锥形瓶中以50mL无血清无抗生素的昆虫细胞培养基接种SF9细胞，27℃摇床120rpm振荡培养培养至细胞密度达到2×10⁶个/mL，加入适量P2代病毒液，继续培养，待被转染的细胞大部分出现体积明显增大、破裂状况后，收集培养上清液，1000g离心10分钟去除细胞和大碎片，将上清过滤除菌后避光4℃保存，此为P3代高滴度病毒液。

【实施例4】重组hABCB11蛋白的获得

(1)大量培养表达重组hABCB11的SF9细胞：

在细胞培养锥形瓶中以500mL无血清无抗生素的昆虫细胞培养基接种SF9细胞，27℃摇床120rpm振荡培养培养至细胞密度达到2×10⁶个/mL，加入适量P3代病毒液，培养48-72小。2000g离心10分钟去除上清，将沉淀细胞-80℃保存，此为表达重组hABCB11的SF9细胞。

(2)含有重组hABCB11的细胞膜的分离提纯：

①细胞破碎：

采用了氮气减压破碎法将SF9细胞进行破碎。在压力容器内，大量的氮气在高压下溶解于细胞中。当气体压力突然降低，细胞液内的氮气释放出来的，形成气泡，使细胞膜撑开破裂，达到破坏细胞膜，释放细胞内物质的目的。氮气减压方法特别适合处理哺乳动物和其他膜结合细胞。具体的操作流程为：

a、把收集到的细胞沉淀用TBS溶液稀释，置于耐高压容器里面；

b、充入高压氮气(1000PSI)，冰浴静置15分钟，让细胞内外达到压力一致；

c、通过阀门缓慢把细胞液释放出来，收集于接收容器当中。

②蛋白分离：

通过对上述收集的细胞破碎液进行3次离心，即可得到高浓度、高纯度的SF9细胞膜蛋白，过程简单，蛋白无需经过复杂的处理，蛋白的活性高。具体的操作流程为：

a：初步离心：对上述收集的细胞破碎液进行4000g离心10分钟，取出上清液保存，丢弃沉淀；

b：超高速蔗糖密度梯度离心：把15ml浓度34%的蔗糖溶液加入离心管，把15ml经过初步离心的上清液加到蔗糖溶液的上面，100000g离心30分钟，取出上清液与蔗糖中间的白色条带部分保存；

c：将b步中的保存的溶液用TBS稀释，100000g离心30分钟，丢弃上清液，将沉淀复溶于蛋白保存液中，即为可作为体外检测运用的药物转运体蛋白膜。

【实施例5】重组hABCB11蛋白的功能验证

底物测定法：

ABCB11转运体蛋白利用ATP作为能量，能够与它的底物结合并实现跨膜转运。利用细胞膜蛋白在特定溶液环境中能够形成闭合的微囊泡的特性，把ABCB11蛋白的转运底物加入表达ABCB11蛋白的细胞膜中，分别加入ATP/AMP反应，终止反应后把微囊泡外面的底物洗去，用①液相色谱仪/质谱仪联用法，②荧光测定法，③同位素标记底物法等方法来测定微囊泡内的底物的浓度，从而判定ABCB11蛋白的活性值。底物浓度越大，则ABCB11的活性值越高。本实例中采用液相色谱仪/质谱仪联用法。

（1）将分离提纯得到的重组hABCB11蛋白进行蛋白浓度测定（用BCA蛋白定量法），并根据所测浓度用蛋白保存液稀释至5mg/mL。

（2）取上述浓度的蛋白10uL，加入含有4mM ATP（或4mM AMP），10uM TCA（牛磺胆酸钠盐，为ABCB11的转运底物）的反应缓冲液40uL中开始反应，并于0分钟，1分钟，5分钟加入终止液，终止反应。

（3）把终止后的反应液全部转移到96孔过滤板中，真空抽滤；用反应终止液清洗过滤板5次。

（4）分3次往过滤板中各孔加入10% SDS溶液50uL，用96孔板收集全部滤液。

（5）96孔板中各孔加入100uL ACN（乙腈），混匀后用液相色谱仪/质谱仪联用法测定TCA浓度。

本发明尚有多种实施方式，凡采用等同变换或者等效变换而形成的所有技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

<110>  苏州杰诺曼博生物科技有限公司

 

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<170>  PatentIn version 3.3

 

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<213>  pFastBac1上游引物

 

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<212>  DNA

<213>  pFastBac1下游引物

 

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<210>  3

<211>  20

<212>  DNA

<213>  hABCB11基因上游引物

 

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<210>  4

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<212>  DNA

<213>  hABCB11基因下游引物

 

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ggggtcatag aatcgctgaa                                                 20

 

 

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<211>  4189

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

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ctggaaagga aaggtgttta cttcactcta gtgactttgc aaagccaggg aaatcaagct   2100

 

cttaatgaag aggacataaa ggatgcaact gaagatgaca tgcttgcgag gacctttagc   2160

 

agagggagct accaggatag tttaagggct tccatccggc aacgctccaa gtctcagctt   2220

 

tcttacctgg tgcacgaacc tccattagct gttgtagatc ataagtctac ctatgaagaa   2280

 

gatagaaagg acaaggacat tcctgtgcag gaagaagttg aacctgcccc agttaggagg   2340

 

attctgaaat tcagtgctcc agaatggccc tacatgctgg tagggtctgt gggtgcagct   2400

 

gtgaacggga cagtcacacc cttgtatgcc tttttattca gccagattct tgggactttt   2460

 

tcaattcctg ataaagagga acaaaggtca cagatcaatg gtgtgtgcct actttttgta   2520

 

gcaatgggct gtgtatctct tttcacccaa tttctacagg gatatgcctt tgctaaatct   2580

 

ggggagctcc taacaaaaag gctacgtaaa tttggtttca gggcaatgct ggggcaagat   2640

 

attgcctggt ttgatgacct cagaaatagc cctggagcat tgacaacaag acttgctaca   2700

 

gatgcttccc aagttcaagg ggctgccggc tctcagatcg ggatgatagt caattccttc   2760

 

actaacgtca ctgtggccat gatcattgcc ttctccttta gctggaagct gagcctggtc   2820

 

atcttgtgct tcttcccctt cttggcttta tcaggagcca cacagaccag gatgttgaca   2880

 

ggatttgcct ctcgagataa gcaggccctg gagatggtgg gacagattac aaatgaagcc   2940

 

ctcagtaaca tccgcactgt tgctggaatt ggaaaggaga ggcggttcat tgaagcactt   3000

 

gagactgagc tggagaagcc cttcaagaca gccattcaga aagccaatat ttacggattc   3060

 

tgctttgcct ttgcccagtg catcatgttt attgcgaatt ctgcttccta cagatatgga   3120

 

ggttacttaa tctccaatga ggggctccat ttcagctatg tgttcagggt gatctctgca   3180

 

gttgtactga gtgcaacagc tcttggaaga gccttctctt acaccccaag ttatgcaaaa   3240

 

gctaaaatat cagctgcacg cttttttcaa ctgctggacc gacaaccccc aatcagtgta   3300

 

tacaatactg caggtgaaaa atgggacaac ttccagggga agattgattt tgttgattgt   3360

 

aaatttacat atccttctcg acctgactcg caagttctga atggtctctc agtgtcgatt   3420

 

agtccagggc agacactggc gtttgttggg agcagtggat gtggcaaaag cactagcatt   3480

 

cagctgttgg aacgtttcta tgatcctgat caagggaagg tgatgataga tggtcatgac   3540

 

agcaaaaaag taaatgtcca gttcctccgc tcaaacattg gaattgtttc ccaggaacca   3600

 

gtgttgtttg cctgtagcat aatggacaat atcaagtatg gagacaacac caaagaaatt   3660

 

cccatggaaa gagtcatagc agctgcaaaa caggctcagc tgcatgattt tgtcatgtca   3720

 

ctcccagaga aatatgaaac taacgttggg tcccaggggt ctcaactctc tagaggggag   3780

 

aaacaacgca ttgctattgc tcgggccatt gtacgagatc ctaaaatctt gctactagat   3840

 

gaagccactt ctgccttaga cacagaaagt gaaaagacgg tgcaggttgc tctagacaaa   3900

 

gccagagagg gtcggacctg cattgtcatt gcccatcgct tgtccaccat ccagaacgcg   3960

 

gatatcattg ctgtcatggc acagggggtg gtgattgaaa aggggaccca tgaagaactg   4020

 

atggcccaaa aaggagccta ctacaaacta gtcaccactg gatcccccat cagttgaccc   4080

 

aatgcaagaa tctcagacac acatgacgca ccagttacag gggttgtttt taaagaaaaa   4140

 

aacaatccca gcaggaggga ttgctgggat tgttttttct ttaaagctt               4189

Claims (6)

1.一种在昆虫细胞sf9中表达人hABCB11的方法，其特征在于包括如下步骤:

步骤一，人工合成两端分别包含BamHI和HindIII酶切位点的hABCB11基因；

步骤二，将hABCB11基因克隆入pFastBac1载体的BamHI/HindIII位点，得到重组质粒pFastBac1-hABCB11；

步骤三，将重组质粒pFastBac1-hABCB11转化DH10Bac大肠杆菌感受态细胞，与其中的杆状病毒穿梭载体Bacmid重组，获得插入hABCB11基因的重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-hABCB11；

步骤四，脂质体介导重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-hABCB11转染sf9昆虫细胞，获高滴度的hABCB11的重组病毒；

步骤五，hABCB11的重组病毒感染SF9昆虫细胞，大量表达hABCB11蛋白。

2.根据权利要求1所述的在昆虫细胞sf9中表达hABCB11的方法，其特征在于：步骤一所述的两端分别包含BamHI和HindIII酶切位点的人hABCB11基因通过如下方法获得：根据NCBI参考序列信息NM_003742.2，在5‘端添加BamHI酶切位点序列，在3’端添加HindIII酶切位点序列，序列总长度为4189bp 。

3.根据权利要求1所述的在昆虫细胞sf9中表达hABCB11的方法，其特征在于：还包含对所述重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-hABCB11的PCR鉴定方法，步骤如下：分别以T-pFast F:(SEQ ID No.1 )和T-pFast R:(SEQ ID No.2)、T-hABCB11 F:(SEQ ID No.3)和T-hABCB11 R:(SEQ ID No.4)、或\和T-pFast F:(SEQ ID No.1 )和T-hABCB11 R:(SEQ ID No.4)为引物组合对SF9-hABCB11基因组DNA进行PCR扩增，扩增出对应的4505bp、653bp、1641bp目标片段，即为hABCB11基因在SF9昆虫细胞中表达完成。

4.根据权利要求1所述的在昆虫细胞sf9中表达hABCB11的方法，其特征在于：还包括重组hABCB11蛋白功能的鉴定方法，步骤如下：

将ABCB11蛋白的转运底物加入表达ABCB11蛋白的细胞膜中，加入ATP/AMP反应，反应终止后将细胞膜中微囊泡外的转运底物洗去，通过液质联用、荧光测定法或同位素标记底物法中的一种来测定微囊泡内的转运底物浓度，从而判定ABCB11蛋白的活性。

5.根据权利要求4所述的在昆虫细胞sf9中表达hABCB11的方法，其特征在于：所述微囊泡内的转运底物浓度越大，ABCB11的活性越高。

6.根据权利要求1所述的在昆虫细胞sf9中表达hABCB11的方法，其特征在于：所述的重组病毒培养基为无血清无抗生素的昆虫细胞培养基。