CN1290499C - 石蒜碱用途和总碱提取物及其制备方法与用途 - Google Patents

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Abstract

公开了石蒜碱制备抗SARS病毒的药物的用途；以及含有石蒜碱的石蒜总碱提取物，其制备方法，其用于制备抗SARS病毒的药物的用途和含有它的组合物。

Description

石蒜碱用途和总碱提取物及其制备方法与用途
技术领域
本发明涉及中药领域，具体地涉及石蒜的提取物及其用途。本发明还涉及含石蒜提取物的组合物。
背景技术
石蒜(Bulbus Lycoridis Radiatae)别名老鸦蒜、蒜头草、蟑螂花，来源为石蒜科植物石蒜Lycoris radiata(L’Herit.)Herb.的鳞茎。其生于阴湿山地或丛林下，也有栽培。产华东、中南及西南。化学成分含石蒜碱(lycorine)、加兰他敏(galanthamine)、石蒜胺碱(lycora-mine)等。性温，味辛、甘。主治消肿，解毒，催吐。用于疔疮肿毒、食物中毒、痰涎壅塞、黄疸、水肿腹水。目前对其成分主要集中在皂甙的研究和弱酸弱碱提取，也未见其对抗病毒的研究效果。
2003年我国和世界上许多国家遭到了一次大规模的非典型肺炎(Atypicalpneumonias)的侵袭，由非典型肺炎引起的严重急性呼吸综合征(Severe AcuteRespiratory Sydrome，SARS)已经在22个国家和地区发生。世界卫生组织(WorldHealth Organization，WHO)在疫情发生后迅速建立起由全球10个国家的13个实验室组成的协作研究和监测网络。4月16日，WHO正式确认SARS的病原体是一种新型冠状病毒，这是一种单链RNA病毒。
全球已有8000多例非典型肺炎患者，在某些发病区其死亡率达到15％，给人民群众带来了极大的恐慌。
对于石蒜的有效部位进行了很多研究，其中一种具有下式：
分子式：C16H17NO4。具有CAS号：476-28-8。该石蒜碱在很多文献中有提到，例如江苏新医学院.中药大词典.(上册).第1版.上海科学出版社，1977：590；Haffman DG等，Biochem Pharmacol，1966，15(3)：391；陈牧群，等.药学学报，1965，12(9)：594；和Leven M等J Nat Prol，1982，45(5)：564。但其抗SARS效果并没有报道。
虽然已经公布了许多据称有抗SARS作用的中药制剂和配方，但是，仍然缺乏对于SARS病毒有针对作用的配方和药物。本领域仍然迫切需要开发具有抗SARS病毒活性的中药提取物。
发明内容
因此，本发明的一个目的是提供石蒜碱的用途，它可用于制备抗SARS病毒的药物。
本发明的一个目的是提供石蒜总碱提取物，它含有石蒜碱，能够有效抗SAARS病毒。
本发明的还有一个目的是提供一种制备石蒜总碱提取物的方法。
本发明的还有一个目的是提供含石蒜总碱提取物的组合物。
本发明的一个目的是提供石蒜碱在制备抗SARS病毒的药物中的用途。
在本发明的一个方面，提供了一种石蒜总碱提取物，该提取物含有石蒜总碱50-99％重量。
在该方面的一个优选例中，石蒜总碱含50-90％重量的石蒜碱。
本发明的另一个方面提供了上述石蒜总碱提取物在制备抗SARS病毒的药物中的用途。
本发明的还有一个方面提供了制备上述石蒜总碱提取物的方法，包括步骤：
(a)用50-90v％的氯仿水溶液或氯仿回流提取石蒜药材1-8个小时，获得提取液；
(b)过滤得到固体；
(c)用无水乙醇或50-90v％的乙醇溶液，回流提取1-8个小时，得到药液；
(d)水浴蒸干所述药液，然后在50-100℃烘干，获得固态的石蒜提取物；
(e)将石蒜提取物溶于酸溶液；
(f)中和溶液，至pH为8-11；
(g)用极性有机溶剂提取，得到溶解于有机相的石蒜总碱提取物。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，该方法还包括：
(h)干燥，得到粉末状总碱提取物。
在本发明该方面的一个实施例中，步骤(c)中优选用无水乙醇或70％以上的乙醇，最优选为无水乙醇；提取2-6个小时，最优选为4小时。
在本发明该方面的一个实施例中，极性有机溶剂优选是氯仿。
在本发明该方面的还有一个实施例中，酸溶液优选是0.01N-0.1N的盐酸溶液。
本发明还提供了一种石蒜提取物，该提取物含石蒜总碱50-99％重量；其中所述石蒜总碱含石蒜碱50-99％重量。
本发明的还有一个方面提供了一种抗SARS病毒的药物组合物，它含有1-99wt％上述石蒜总碱提取物和1-99wt％药学上可接受的载体。
附图说明
图1A-C显示了施用本发明的石蒜提取物后VERO细胞的显微镜观察结果。
图2显示了石蒜提取物对SARS病毒细胞病变作用的抑制作用剂量曲线。
图3显示了石蒜提取物药物浓度毒性曲线。
图4显示了石蒜总碱的HPLC色谱图。
图5A-B显示了石蒜碱和峰2的HPLC图谱。
图6A-6F显示了石蒜碱对SARS病毒感染VERO细胞病变的影响。
图7显示了石蒜碱对SARS病毒细胞病变效果的抑制作用剂量曲线。
图8显示了石蒜碱药物浓度毒性曲线。
具体实施方式
本发明经过研究发现，石蒜中的石蒜碱单体是其主要的抗SARS有效成分，在此基础上开发了有效提取石蒜碱的方法，从而完成了本发明。
石蒜是常规的中药材，可将其鳞茎晒干或研磨成粗粉使用。该药材可从各石蒜产地或中药商店购得，例如安徽安国药材市场等。
经过药物筛选和体外细胞病变实验，可知石蒜碱具有抗SARS病毒活性。以VERO细胞作为宿主检测石蒜碱抵抗SARS病毒细胞病变的效果，发现加入石蒜碱后能在0.3×10-4mg/ml以上的浓度下，对SARS病毒对VERO细胞的攻击有明显抑制作用。此外，其EC50小，仅1.846×10-5mg/ml，半数有效浓度较低，而经过毒性测试，发现其在低于0.3×10-2mg/ml的情况下都无毒性，因此可安全使用。
本发明中的“石蒜提取物”指步骤(d)中获得的石蒜粗提物，其含有未经提取的总碱。该步骤也可以省去，直接将步骤(c)得到的药液浓缩后与酸混合，这是本领域技术人员公知的一般实验操作。
用本发明的石蒜总碱提取方法，得到的提取物中含石蒜总碱50％以上，其中石蒜碱含量为6.8％以上(重量)。
在本发明方法的步骤(c)得到的石蒜提取物中，含石蒜提取物50％以上，较佳为60-90％，石蒜碱得率为4.4％以上(基于药材总重量)。
可用分光光度计通过紫外分光光度法或比色法在280nm波长处检测石蒜碱的浓度。该方法是本领域技术人员熟知的常用方法。
本发明的分离方法由于操作步骤简单，没有制备TLC，电泳等昂贵步骤，可用于大批量工业生产。
本发明的提取物、总碱提取物和石蒜碱可直接使用，或与药物学上可接受的载体和添加剂一起，制成药物组合物。例如添加甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂，制备口服给药的片剂、锭剂、水或油悬液、可分散性粉末或颗粒、乳剂、硬或软胶囊、或糖浆或酏剂。片剂含有与适用于制造片剂的无毒的可接受的赋形剂混合的活性成分。这些赋形剂可以是例如惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；成粒剂及崩解剂，例如褐藻酸；粘合剂，如淀粉、明胶或阿拉伯胶；和润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可无糖衣或用已知技术包衣，来延迟在胃肠道内的解体和吸收，从而在较长时间内提供持续作用。例如，可施用延时物质，如一硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。口服使用的制剂还可制成硬明胶胶囊，其中活性成分与惰性固态稀释剂，如碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合，或制成软明胶胶囊，其中活性成分和水或油性介质，例如花生油、液态石蜡或橄榄油混合。
本发明的药物组合物还可含有其他抗SARS成分，例如目前可得的抗SARS药物等或其它中药制剂。
本发明的药物组合物可以用各种途径施用，例如口服、注射、透皮吸收，优选是口服或静脉滴注。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例
实施例1石蒜提取物的提取和检测
1.材料和仪器
材料：于2001年11月购于安徽安国，由北京中医药大学阎玉凝教授鉴定并编号入库。
仪器：
索式提取器(中式普通型)；粉碎机(北京光明仪器厂FZ-102)；旋转蒸发仪(上海申胜仪器公司)；四孔水浴锅(北京仪器厂)；无水乙醇(分析纯，化学试剂厂)；氯仿(分析纯，北京化学试剂厂)；电子天平(精确0.1g，北京医用天平厂DT-500)；实验滤纸。
2.步骤：
取143g石蒜药材，用粉碎机粉碎，装入纸筒。
将索式提取器中平底烧瓶装入800ml的氯仿，将准备好的石蒜药材放入索氏提取器中，上面装上冷凝管，下面装上平底烧瓶，置于电热套上。整个提取装置用铁架台固定。
电热套加热大约在50℃，让氯仿回流提取石蒜粉末大约4h。提取结束后将纸筒取出，通风橱晾干，备无水乙醇提取用。
取另一个平底烧瓶，装上大约800ml的无水乙醇，将装有氯仿提取后滤渣的纸筒放入索式提取器中。电热套加热大约在50℃，回流提取大约4h。
留在平底烧瓶的滤液用旋转蒸发仪浓缩，除掉约90％溶剂后，倒入小的瓷玻璃中，水浴锅低温慢慢蒸发至干。可得到石蒜的提取物约6.3g。
所得到的提取物6.3g放在同位素瓶(15ml)中，并放置在-20℃保存。
经检测，主要有效部位石蒜提取物的石蒜碱得率为4.0％重量(相对药材投入量)。
实施例2 石蒜提取物抗SARS活性试验
材料和方法
受试药物：实施例1所制得的石蒜提取物。
细胞：非洲绿猴肾传代细胞(Vero)。
病毒：SARS病毒北京一号(BJ-01)。
试剂：DMEM培养基(GIBCO公司产品)，链霉素，L-谷氨酰胺(美国Invitrogen公司)，新生胎牛血清(美国Hyclone公司)，Hepes，MTS(美国Promega公司)，PMS，青霉素(Sigma公司)，碳酸氢钠(购自京科化学试剂公司进口分装)。
细胞培养液及试剂配制：DMEM培养液：含10％新生胎牛血清、3％L-谷氨酰胺、1％青霉素、链霉素、7.5％碳酸氢钠，10mM Hepes；
MTS/PMS染色液：按Promega公司的操作指南配制。
MTS：甲臢化合物[3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲酯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑(金翁)
PMS：吩嗪硫酸二甲酯
试验方法：
药物对细胞毒性试验
按4,000细胞/孔密度接种96孔细胞培养板，每孔加入培养液100ul，37℃，5％CO2孵育细胞24小时后加入受试药物。石蒜提取物以细胞培养液稀释后最终浓度分别为2、1、0.3、0.1、0.03、0.01、0.003、0.0003mg/ml，共9个浓度。每个浓度加2孔。设正常细胞对照。37℃5％CO2孵育细胞96小时后，显微镜下观察细胞病变，加MTS/PMS，每孔20ul，37℃下5％CO2孵育3小时，然后加50ul 10％SDS终止反应，紫外分光光度仪检测O.D(490hm)值，以样品读数不小于细胞对照的90％作为无毒性指标。
药物对SARS病毒感染VERO细胞病变(CPE)的影响
按4,000细胞/孔密度接种96孔细胞培养板，每孔培养液100ul，37℃5％CO2孵育24小时，细胞融合成单层后加入受试药物，药物终浓度0.3、0.1、0.05、0.03、0.02、0.01、0.003、0.0001、0.0001、0.00001mg/ml的浓度梯度加入，共10个浓度，每个浓度加2孔，随后每孔加入2ul SARS-BJ-01病毒。设置无细胞对照，细胞对照和病毒对照。37℃，5％CO2培养96小时。期间，显微镜下观察细胞病变，96小时后以MTS法检测(方法见Promega公司的操作指南)细胞存活状况。
结果
石蒜提取物对SARS病毒的作用
我们以VERO细胞作为宿主检测了药物对SARS病毒的作用。
1.细胞形态观察
采用光学显微镜观察细胞形态，见图1。
观察细胞形态可以看出，病毒对照B在感染病毒48小时即可出现明显CPE，即细胞圆缩、裂解。而石蒜提取物0.003～0.3mg/ml浓度下，对SARS病毒对VERO细胞的攻击有显著的抑制作用。0.00001～0.003mg/ml浓度范围则抑制作用降低。细胞对照生长良好。
2.MTS检测
表1石蒜提取物药物浓度药效实验(OD＝492nm)
  药名   剂量(mg/ml)   OD(X±SD)
石蒜提取物浓度病毒对照细胞对照空白对照   0.300000.030000.020000.010000.003000.001000.00001   2.0350±0.01062.2060±0.01062.2370±0.04672.2850±0.09121.7250±0.01061.6340±0.00491.6780±0.04101.4550±0.18002.4110±0.04240.4820±0.0092
X为平均值；SD表示标准偏差。
图2显示了石蒜提取物对SARS病毒细胞病变作用的抑制作用剂量曲线。由图可见，石蒜提取物抗病毒活性随浓度增加而增强，在0.01mg/ml浓度有最强抑制效果，当浓度达到一定高度(0.02mg/ml)后，达到平台期，无毒范围内的有效浓度范围广。EC50为0.003571mg/ml，半数有效浓度相对较低。
3.石蒜提取物对VERO细胞的毒性检测结果
表2石蒜提取物在VERO细胞上的毒性作用
  药名   剂量(mg/ml)   OD(X±SD)
石蒜提取物浓度细胞对照空白对照   2.00001.00000.30000.10000.03000.01000.00300.00100.0003   1.2450±0.00801.3125±0.06651.7590±0.05101.8240±0.01701.8455±0.03052.0730±0.04902.2135±0.02252.2850±0.00002.2430±0.00802.1998±0.05620.1352±0.0070
图3显示了石蒜提取物药物浓度毒性曲线。半数致死浓度(CC50)：1.109mg/ml。从图3中可见，石蒜提取物浓度在≤0.3mg/ml时，对VERO细胞无毒性。CC50为1.109mg/ml。
结论：
如上所述，石蒜提取物在体外具有较强的抗SARS病毒作用，且其毒性较小，CC50：1.109mg/ml，抑制病毒活性高，EC50为0.003571mg/ml，有效浓度范围广，可作为抗SARS药物进一步开发。
实施例3石蒜总碱提取物的提取和检测
实验步骤：
取一定量的实施例1得到的石蒜提取物溶解在0.1mol/LHCl溶液中，震荡使其充分溶解。
真空泵抽滤上含酸溶液，去掉残渣。
滤液用NaHCO3调节上酸性溶液，使PH＝9-10。并用CHCL3提取三次。得到含CHCL3的溶液。
回收CHCL3并旋干得到总碱粉末，不经纯化用于下一步的有效部位测定。
实施例4石蒜总碱提取物抗SARS有效部位的鉴定
1.实验仪器及试剂：
岛津半制备液相色谱仪、YWG250x10，10um的色谱柱、LC-MMS(Agilient)、
甲醇(4L，Fisher)，纯水(millipore)天平(beckman，精度0.1mg)，药匙，
移液枪(pipet.lite U.S.A 10ul、20ul、100ul、1ml)
滤器(millipore，PTFE膜，0.22um)国产震荡器
石蒜碱：株洲大有生物科技有限公司。
一.实验环境：
室温干净的操作实验台 通风橱
二.实验步骤：
1.称取一定量的石蒜碱粉末溶解在甲醇的溶液里，震荡，并过0.22um的滤膜，滤液转到进样瓶中。
2.HPLC处理样品的基本条件：
仪器：class-vp系列岛津(shimadzu)半制备液相色谱仪
基本的配置：自动进样器、6A泵二个、LCD、自动收集器，DAD检测仪
色谱柱：YWG C18 250×10 10um   (Beijing Shuntu Technology Co.Ltd.)
流动相：甲醇(Fisher，HPLC级)   H2O(Millipore0.22um过滤)
检测器：DAD二极管阵列检测器
梯度：5％-----95％        甲醇：H2O    0----35min
      95％---5％          甲醇：H2O    35----42min
上样量：500ul
流速：4ml/min
收集方式：按时间收集并且每份按8ml一个收集单位
见图4，在HPLC中出现三个峰，分别为峰1、峰2和峰3。从图5A和5B看，峰2在288nm处有丰度接近100％的单峰。用MS分析峰2，其分子量和市售的石蒜碱的分子量相同。在相同条件下，HPLC分析石蒜碱其出峰时间大致和峰2吻合。见图5A和图5B。
因此可以认为，峰2是石蒜碱峰。280nm下，HPLC根据面积归一法得出石蒜碱占总碱含量的6.8％。
以下实验验证了石蒜碱的抗SARS活性。
实施例5石蒜碱抗SARS活性试验
材料和方法
a)受试药物：实施例4制得的峰2的石蒜碱。
细胞：非洲绿猴肾传代细胞(Vero)。
病毒：SARS病毒北京一号(BJ-01)。
试剂：DMEM培养基(GIBCO公司产品)，链霉素，L-谷氨酰胺(美国Invitrogen公司)，新生胎牛血清(美国Hyclone公司)，Hepes，MTS(美国Promega公司)，PMS，青霉素(Sigma公司)，碳酸氢钠(购自京科化学试剂公司进口分装)。
细胞培养液及试剂配制：DMEM培养液：含10％新生胎牛血清、3％L-谷氨酰胺、1％青霉素、链霉素、7.5％碳酸氢钠，10mM Hepes；
MTS/PMS染色液：按Promega公司的操作指南配制。
b)试验方法：
药物对SARS病毒感染VERO细胞病变的影响
按4,000细胞/孔密度接种96孔细胞培养板，每孔培养液100ul，37℃5％CO2孵育24小时，细胞融合成单层后加入受试药物，药物终浓度0.1×10-2、0.3×10-3、0.1×10-3、0.3×10-4、0.1×10-4、0.3×10-5、0.3×10-6mg/ml的浓度梯度加入，共10个浓度，每个浓度加2孔，随后每孔加入2ul SARS-BJ-01病毒。设置MTS对照，细胞对照和病毒对照。37℃5％CO2培养96小时。期间，显微镜下观察细胞病变，96小时后以MTS法检测(方法见Promega公司的操作指南)细胞存活状况。
药物对细胞毒性试验
按4,000细胞/孔密度接种96孔细胞培养板，每孔加入培养液100ul，37℃5％CO2孵育细胞24小时后加入受试药物。石蒜碱以细胞培养液稀释后最终浓度分别为0.3、0.2、0.1、0.03、0.01、0.003、0.001、0.0003、0.0001、0.00003、0.00001mg/ml，共11个浓度。每个浓度加2孔。设正常细胞对照，MTS对照。37℃5％CO2孵育细胞96小时后，显微镜下观察细胞病变，加MTS/PMS，每孔20ul，37℃下5％CO2孵育3小时，加50ul 10％SDS，紫外分光光度仪检测O.D(490nm)，以样品读数不小于细胞对照的90％作为无毒性指标。
结果
a)石蒜碱对SARS病毒的作用
以VERO细胞作为宿主检测了药物对SARS病毒的作用。
1.细胞形态观察
采用光学显微镜观察细胞形态，结果见图6A-6F。
观察细胞形态可以看出，病毒对照E在感染病毒48小时即可出现明显CPE，即细胞圆缩、裂解。而石蒜碱浓度在大于0.3×10-4mg/ml浓度下，对SARS病毒对VERO细胞的攻击有显著的抑制作用。细胞对照生长良好。
2.MTS检测
由图7可见，石蒜碱抗病毒活性随浓度增加而增强，在0.1×10-3mg/ml浓度有最强抑制效果，当浓度达到一定高度(0.3×10-3mg/ml)后，达到平台期，无毒范围内的有效浓度范围广。EC50为1.846×10-5mg/ml，半数有效浓度较低。
3.石蒜碱对VERO细胞的毒性检测结果
表3石蒜碱对VERO细胞的毒性检测结果
  药名   剂量(mg/ml)   OD(X±SD)
石蒜碱浓度细胞对照MTS对照   0.300000.200000.100000.030000.010000.003000.001000.000300.000100.000030.00001   0.5530±0.01270.5880±0.00570.6665±0.00490.7645±0.00921.0570±0.00141.6005±0.02191.9125±0.04451.9065±0.09551.7920±0.06651.8570±0.00992.0545±0.06722.1768±0.08730.5395±0.0475
图8显示了石蒜碱毒性测试的OD对浓度作图。可见石蒜碱浓度在低于0.3×10-2mg/ml时，对VERO细胞无毒性。IC50为7.644×10-3mg/ml。
结论：
1.如上所述，石蒜提取物在体外具有较强的抗SARS病毒作用，且其毒性较小，CC50：1.109mg/ml，抑制病毒活性高，EC50为0.003571mg/ml，有效浓度范围广，可作为抗SARS药物进一步开发。
2.如上所述，石蒜碱具有很强的抗SARS作用，其毒性较小，半抑制浓度仅为7.644×10-3mg/ml，而抗病毒活性的ED50达到1.846×10-5mg/ml。其有效浓度范围广。对于抗SARS药物的开发有重要意义。
如上描述了本发明所公开的石蒜提取物、石蒜总碱的制备方法，制得的产品及其用途。但需理解其中包含了本领域技术人员所理解的变化和改变。这些变化和改变也包含在权利要求所限定的本发明的范围内。

Claims (10)

1.石蒜碱的用途，其特征在于，该石蒜碱用于制备抗SARS病毒的药物。
2.一种制备石蒜总碱提取物的方法，其特征在于，该方法包括步骤：
(a)用50-90v％的氯仿水溶液或氯仿回流提取石蒜药材1-8个小时，获得提取液；
(b)过滤得到固体；
(c)用无水乙醇或50-90v％的乙醇溶液，回流提取1-8个小时，得到药液；
(d)水浴蒸干所述药液，然后在50-100℃烘干，获得固态的石蒜提取物；
(e)将石蒜提取物溶于酸溶液；
(f)中和溶液，至pH为8-11；
(g)用极性有机溶剂提取，得到溶解于有机相的石蒜总碱提取物。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，该方法还包括：
(h)干燥，得到粉末状总碱提取物。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(c)中用无水乙醇提取4小时。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述极性有机溶剂是氯仿。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述酸溶液是0.01N-0.1N的盐酸溶液。
7.用权利要求2所述的方法制备的石蒜总碱提取物，其特征在于，该提取物含有石蒜总碱50-99％重量。
8.如权利要求7所述的提取物，其特征在于，所述石蒜总碱含50-90％重量的石蒜碱。
9.权利要求7所述的石蒜总碱提取物的用途，其特征在于，该总碱提取物用于制备抗SARS病毒的药物。
10.一种抗SARS病毒的药物组合物，其特征在于，它含有1-99wt％权利要求2所述的石蒜总碱提取物和1-99wt％药学上可接受的载体。
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