CN1289780A - 编码新的融合蛋白的dna和通过该dna的表达来制备有用的多肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种包含编码融合蛋白的核苷酸序列的DNA、包含所述DNA的载体、包含所述载体的属于芽孢杆菌属的细菌和通过培养所述的细菌来制备有用的多肽的方法,其中所述的融合蛋白包括:由芽孢杆菌的细胞壁蛋白的信号肽序列、用于分离及纯化所述融合蛋白的标记序列、接头序列、由用于化学或酶促裂解的序列、和外源多肽序列;所述的这些序列彼此按序线性连接,所述的信号肽序列、标记和接头是任选的序列,并且其中所述的核苷酸序列与包含芽孢杆菌启动子区的核酸序列的3’－末端相连。
Description
本发明涉及编码新的融合蛋白的DNA和这些DNA用于生产可在制药、科研和其他产业中利用的生物活性多肽的用途。
多肽物质例如用作药物的激素和生物活性物质和用于诊断、工业应用和科研的酶经常是通过提取法从生物体获取的。然而，靠提取法以低的花费获取大量的纯的物质却是困难的。最近，由于基因重组技术的进步，已经可以通过使用来自生物体如微生物、动物和植物的各种细胞而更加经济地、大量地制备高纯度的重组蛋白。
但是，直到目前还尚未完全实现有用蛋白(或多肽)的经济的大量生产，因此对新技术的开发也一直在连续不断地进行着。另外，目前所开发出的大量生产体系不能通过基因重组技术来制备所有种类的蛋白质，因此实际上它们是根据蛋白质的种类而分别开发的。
在采用短芽孢杆菌的重组蛋白表达体系中，当外源蛋白被连接在微生物的细胞壁蛋白(下文简称为“CWP”)信号肽的下游并将所得的融合蛋白表达时，具有天然结构的外源蛋白从欲被分泌到培养基中的CWP信号肽上切下(日本专利No．2082727；JP-A-62-201583；YamagataH．等人，细菌学杂志，169：1239-1245( )1987)；Udaka J日本生物科学、生物技术和农业化学协会杂志，61：669-676(1987)；Takano M．等人，微生物学生物技术应用，30：75-80(1989)；和YamagataH．等人，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86：3589-3593(1989))。当将人表皮生长因子(下文简称为“EGF”)在上述表达系统中表达时，EGF的表达量比EGF在其他表达系统中表达的量高10-100倍；所表达的蛋白保持其原本的活性并被分泌到培养基中；因此，容易对所表达的蛋白进行分离和纯化；并与一些大肠杆菌表达系统不同，该体系不需要将失活蛋白转变成活性蛋白的复杂程序。鉴于这些原因，上述表达体系作为重组蛋白的大量生产体系已引起人们的注意。
但是，并不是所有的与CWP信号肽相连的蛋白均可以与表达EGF相当的量进行表达，并且它们并不总是能从欲被分泌到培养基中的信号肽上裂解下来。
Miyauchi等人在《日本生物科学、生物技术和农业化学协会的年会论谈摘要》67：372(1993)中建议了解决上述问题的办法。即，他们制备了一种MWP蛋白N末端的17个氨基酸(具有9个或12个氨基酸的没有成功)被插在MWP信号肽和比目鱼生长激素蛋白之间的融合蛋白的编码基因，并将该基因在芽孢杆菌中表达以获得融合蛋白。然而，所产生的蛋白不是天然型的蛋白质，在其N末端多了一些氨基酸。Miyauchi等人指出该表达受来自MWP的N末端的氨基酸数目的影响。
Miyauchi等人既没有明示也没有暗示可以通过向序列中引入化学或酶促裂解位点来生产与相应的天然型蛋白具有相同氨基酸组成的多肽。事实上，这样的裂解是困难的，因为比目鱼生长激素包括一些易被化学或酶促裂解的序列。
在这种情况下，对于工业目的而言，开发出一种可使外源多肽在芽孢杆菌表达系统中容易地表达和分泌的技术是极其有用的，即，开发出一种重组蛋白的高表达系统是极其有用的，其中多肽具有与天然类型的多肽同样的序列。
本发明的目的在于提供一种包含融合蛋白的编码DNA的芽孢杆菌表达体系，所述的融合蛋白含有有用的多肽序列，该体系具有能大量表达和分泌融合蛋白的能力，可以选择性地裂解所述的融合蛋白以得到具有天然型结构的多肽。
本发明提供一种包含编码融合蛋白的核苷酸序列的DNA，其中所述的融合蛋白包括：由芽孢杆菌的细胞壁蛋白(CWP)N末端的一个或多个氨基酸残基组成的序列、由一个或多个氨基酸残基组成的用于化学或酶促裂解的序列、和外源多肽序列；所述的这些序列彼此按序线性连接，并且其中所述的核苷酸序列与包含芽孢杆菌启动子区的核酸序列的3’-末端相连。
本文所用的术语“(细胞壁蛋白的)N末端的一个或多个氨基酸残基”是指由自N末端第1个氨基酸开始数的一个或多个氨基酸组成的序列。例如，由3个氨基酸组成的序列是指由细胞壁蛋白的第1至第3个氨基酸组成的氨基酸序列。
融合蛋白还可包含位于N末端的芽孢杆菌CWP信号肽序列。
融合蛋白还可包含用作分离及纯化标记的氨基酸组成的序列和／或用作接头的氨基酸序列。
在本发明的一个实施方案中，芽孢杆菌属细菌是短芽孢杆菌。
作为用于化学裂解的氨基酸残基，举例说是甲硫氨酸。在这种情况下，融合蛋白不应再含有另外的甲硫氨酸残基，以便在化学裂解反应(例如用溴化氰进行的化学裂解反应)中获得最高的特异性。
用于酶促裂解的氨基酸残基可包含能被蛋白酶促裂解的序列。所述蛋白酶的例子是TEV蛋白酶、V8蛋白酶等等。
在本发明的第一个优选实施方案中，融合蛋白包含：由源自MWP蛋白N末端的一个或多个氨基酸残基组成的序列、由6个组氨酸残基组成的用作分离及纯化的标记的序列、作为接头的氨基酸序列Gly SerPro Val Pro Ser Gly、用于将目的多肽化学裂解出来所需的甲硫氨酸残基、和在其氨基酸序列中不含甲硫氨酸的多肽序列，其中所述的MWP蛋白是细胞壁蛋白的一种；所述的这些序列彼此按序线性连接。
在该情况下，融合蛋白可包含在N末端的MWP信号肽序列。所述多肽的一个例子是人胰岛素原。由MWP蛋白N末端的一个或多个氨基酸残基组成的序列优选包含6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、17、20或50个氨基酸。
在本发明的第二个优选的实施方案中，融合蛋白包含：由源自MWP蛋白N末端的10个或20个氨基酸残基组成的序列、由6个组氨酸残基组成的用作分离及纯化的标记的序列、作为接头的人表皮生长因子序列、用TEV蛋白酶将目的多肽裂解出来所需的氨基酸序列Asp Tyr Asp Ile Pro Thr Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln(SEQ ID NO：2)、和在其氨基酸序列中不含TEV蛋白酶识别序列但在其N末端具有甘氨酸或丝氨酸的的多肽序列，其中所述的MWP蛋白是细胞壁蛋白的一种；所述的这些序列彼此按序线性连接。
在此情况下，融合蛋白还可包含位于N末端的MWP信号肽序列。至于多肽，可以举例的是人促生长素抑制素。
在本发明的第三个优选的实施方案中，融合蛋白包含：由源自MWP蛋白N末端的20个氨基酸残基组成的序列、由6个组氨酸残基组成的用作分离及纯化的标记的序列、作为接头的氨基酸序列Gly SerPro Val Pro Ser Gly、用V8蛋白酶将目的多肽裂解出来所需的氨基酸序列Phe Leu Glu、和在其氨基酸序列中不含谷氨酸的多肽序列，其中所述的MWP蛋白是细胞壁蛋白的一种；所述的这些序列彼此按序线性连接。
在该情况下，融合蛋白类似地还可包含位于N末端的MWP信号肽序列。人胰高血糖素是一种有用的所述多肽。
本发明还涉及一种包含编码融合蛋白的核苷酸序列的DNA，其中所述的融合蛋白包括：芽孢杆菌的CWP信号肽序列、由氨基酸残基组成的用于酶促裂解的序列、和外源多肽序列；所述的这些序列彼此按序线性连接，并且其中所述的核苷酸序列与包含芽孢杆菌启动子区的核酸序列的3’-末端相连。
在该发明中，所述信号肽可直接与位于其下游的来自CWP蛋白N末端的一个或多个氨基酸组成的序列相连。
所述的芽孢杆菌属细菌优选为短芽孢杆菌。
在本发明的一个实施方案中，由用于酶促裂解的氨基酸残基组成的序列包含能被蛋白酶促裂解的序列。
在本发明的另一个实施方案中，融合蛋白包含：MWP的信号肽序列、用TEV蛋白酶将目的多肽裂解出来所需的氨基酸序列Asp TyrAsp Ile Pro Thr Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln、和在其氨基酸序列中不含TEV蛋白酶识别序列的多肽序列，其中所述的MWP蛋白是细胞壁蛋白的一种；所述的这些序列彼此按序线性连接。
在此情况下，所述信号肽可直接与位于其下游的由来自CWP蛋白N末端的一个或多个氨基酸组成的序列相连。作为所述的多肽，可以举出在其N末端具有甘氨酸或丝氨酸的突变的人生长激素。
本发明还提供包含上述一种DNA的载体。
本发明还进一步提供被上述载体转化的属于芽孢杆菌属的细菌。优选的细菌为短芽孢杆菌。
本发明还提供了一种制备重组多肽的方法，该方法包括：在培养基中培养如上文定义的细菌，以在该细菌细胞外使包含外源多肽的融合蛋白积聚；从培养基中分离出融合蛋白；从所分离出的融合蛋白中将所述外源多肽裂解出来；和收集所述的多肽。
本发明包括在作为本申请的优先权文件的日本专利申请No．10-87339的说明书和／或附图中所公开的所有或部分内容。
附图的简要说明
图1显示融合蛋白产物MWPsp-MWPmp10-(His)6-接头-Met-胰岛素原的氨基酸序列和编码该产物的核苷酸序列。
图2显示融合蛋白产物MWPsp-MWPmp10-Met-胰岛素原的氨基酸序列和编码该产物的核苷酸序列。
图3显示融合蛋白产物MWPsp-MWPmp20-(His)6-EGF-TEV-促生长素抑制素的氨基酸序列和编码该产物的核苷酸序列。
图4显示融合蛋白产物MWPsp-MWPmp20-(His)6-接头-V8-胰高血糖素的氨基酸序列和编码该产物的核苷酸序列。
图5是显示将各融合DNA引入短芽孢杆菌表达载体(pNU211R2L5)的方式的示意图。
图6是显示含有通过培养转化子而产生的与His-标记相连的胰岛素原的培养基的电泳结果的照片，其中，各样品为：标记蛋白(泳道1)、阴性对照(用不含外源蛋白编码基因的质粒pNU211R2L5转化的，泳道2)、转化子MWPsp-MWPmp6-(His)6-接头-Met-胰岛素原(泳道3)、转化子MWPsp-MWPmp8-(His)6-接头-Met-胰岛素原(泳道4)、转化子MWPsp-MWPmp9-(His)6-接头-Met-胰岛素原(泳道5)、转化子MWPsp-MWPmp10-(His)6-接头-Met-胰岛素原(泳道6)、转化子MWPsp-MWPmp11-(His)6-接头-Met-胰岛素原(泳道7)、转化子MWPsp-MWPmp12-(His)6-接头-Met-胰岛素原(泳道8)、转化子MWPsp-MWPmp15-(His)6-接头-Met-胰岛素原(泳道9)、转化子MWPsp-MWPmp40-(His)6-接头-Met-胰岛素原(泳道10)、转化子MWPsp-MWPmp50-(His)6-接头-Met-胰岛素原(泳道11)、转化子MWPsp-MWPmp100-(His)6-接头-Met-胰岛素原(泳道12)。
图7是显示含有通过培养转化子而产生的不含His-标记的胰岛素原的培养基的蛋白质印迹结果的照片，其中，各样品为：标记肽(泳道1)、阴性对照(仅用质粒pNU211R2L5转化的，泳道2)、转化子MWPsp-胰岛素原(泳道3)、转化子MWPsp-MWPmp1-Met-胰岛素原(泳道4)、转化子MWPsp-MWPmp2-Met-胰岛素原(泳道5)、转化子MWPsp-MWPmp3-Met-胰岛素原(泳道6)、转化子MWPsp-MWPmp4-Met-胰岛素原(泳道7)、转化子MWPsp-MWPmp5-Met-胰岛素原(泳道8)、转化子MWPsp-MWPmp6-Met-胰岛素原(泳道9)、转化子MWPsp-MWPmp7-Met-胰岛素原(泳道10)、转化子MWPsp-MWPmp8-Met-胰岛素原(泳道11)、转化子MWPsp-MWPmp9-Met-胰岛素原(泳道12)、转化子MWPsp-MWPmp10-Met-胰岛素原(泳道13)、转化子MWPsp-MWPmp11-Met-胰岛素原(泳道14)、转化子MWPsp-MWPmp12-Met-胰岛素原(泳道15)、转化子MWPsp-MWPmp13-Met-胰岛素原(泳道16)、转化子MWPsp-MWPmp14-Met-胰岛素原(泳道17)、转化子MWPsp-MWPmp15-Met-胰岛素原(泳道18)、转化子MWPsp-MWPmp17-Met-胰岛素原(泳道19)、转化子MWPsp-MWPmp20-Met-胰岛素原(泳道20)、转化子MWPsp-MWPmp50-Met-胰岛素原(泳道21)。
图8是显示含有通过培养转化子而产生的促生长素抑制素的培养基的电泳结果的照片，其中，各样品为：标记肽(泳道1)、转化子MWPsp-促生长素抑制素28(泳道2)、转化子MWPsp-MWPmp10-(His)6-EGF-TEV-促生长素抑制素28胰岛素原(泳道3)、转化子MWPsp-MWPmp10-(His)6-TEV-促生长素抑制素28(泳道4)、和转化子MWPsp-MWPmp20-(His)6-EGF-TEV-促生长素抑制素28(泳道5)。
图9是显示含有通过培养转化子而产生的胰高血糖素的培养基的电泳结果的照片，其中，各样品为：标记肽(泳道1)、转化子MWPsp-胰高血糖素(泳道2)、转化子MWPsp-MWPmp10-(His)6-接头-V8-胰高血糖素(泳道3)、转化子MWPsp-MWPmp20-(His)6-接头-V8-胰高血糖素(泳道4)、和转化子MWPsp-MWPmp30-(His)6-接头-V8-胰高血糖素(泳道5)。
图10是显示含有通过培养转化子而产生的与His-标记相连的胰岛素原的培养基的电泳／蛋白质印迹结果的照片，其中，各样品为：阴性对照(仅用质粒pNU211R2L5转化的，泳道1)、转化子MWPsp-MWPmp6-(His)6-接头-Met-胰岛素原(泳道2)、转化子MWPsp-MWPmp8-(His)6-接头-Met-胰岛素原(泳道3)、转化子MWPsp-MWPmp9-(His)6-接头-Met-胰岛素原(泳道4)、转化子MWPsp-MWPmp10-(His)6-接头-Met-胰岛素原(泳道5)、转化子MWPsp-MWPmp11-(His)6-接头-Met-胰岛素原(泳道6)、转化子MWPsp-MWPmp12-(His)6-接头-Met-胰岛素原(泳道7)、转化子MWPsp-MWPmp15-(His)6-接头-Met-胰岛素原(泳道8)、转化子MWPsp-MWPmp40-(His)6-接头-Met-胰岛素原(泳道9)、转化子MWPsp-MWPmp50-(His)6-接头-Met-胰岛素原(泳道10)、转化子MWPsp-MWPmp100-(His)6-接头-Met-胰岛素原(泳道11)。
图11是显示含有通过培养转化子而产生的不含His-标记的胰岛素原的培养基的电泳／蛋白质印迹结果的照片，其中，各样品为：阴性对照(仅用质粒pNU211R2L5转化的，泳道1)、转化子MWPsp-胰岛素原(泳道2)、转化子MWPsp-MWPmp1-Met-胰岛素原(泳道3)、转化子MWPsp-MWPmp2-Met-胰岛素原(泳道4)、转化子MWPsp-MWPmp3-Met-胰岛素原(泳道5)、转化子MWPsp-MWPmp4-Met-胰岛素原(泳道6)、转化子MWPsp-MWPmp5-Met-胰岛素原(泳道7)、转化子MWPsp-MWPmp6-Met-胰岛素原(泳道8)、转化子MWPsp-MWPmp7-Met-胰岛素原(泳道9)、转化子MWPsp-MWPmp8-Met-胰岛素原(泳道10)、转化子MWPsp-MWPmp9-Met-胰岛素原(泳道11)、转化子MWPsp-MWPmp10-Met-胰岛素原(泳道12)、转化子MWPsp-MWPmp11-Met-胰岛素原(泳道13)、转化子MWPsp-MWPmp12-Met-胰岛素原(泳道14)、转化子MWPsp-MWPmp13-Met-胰岛素原(泳道15)、转化子MWPsp-MWPmp14-Met-胰岛素原(泳道14)、转化子MWPsp-MWPmp15-Met-胰岛素原(泳道17)、转化子MWPsp-MWPmp17-Met-胰岛素原(泳道18)、转化子MWPsp-MWPmp20-Met-胰岛素原(泳道19)、转化子MWPsp-MWPmp50-Met-胰岛素原(泳道20)。
图12是显示经分离并纯化的融合蛋白MWPmp10-(His)6-接头-Met-胰岛素原和通过溴化氰处理而从中裂解下来的胰岛素原的电泳结果的照片，其中，各样品为：标记肽(泳道1)、分离并纯化的融合蛋白MWPmp10-(His)6-接头-Met-胰岛素原(30微克，泳道2)、通过溴化氰处理而从所述融合蛋白中裂解下来的胰岛素原(30微克，泳道3)和胰岛素原(Sigma)(2微克，泳道4)。
图13是显示经分离并纯化的融合蛋白MWPmp10-(His)6-接头-Met-胰岛素原和通过溴化氰处理而从中裂解下来的胰岛素原的电泳／蛋白质印迹结果的照片，其中，各样品为：分离并纯化的融合蛋白MWPmp10-(His)6-接头-Met-胰岛素原(0．3微克，泳道1)、通过溴化氰处理而从所述融合蛋白中裂解下来的胰岛素原(0．3微克，泳道2)和胰岛素原(Sigma)(0．3微克，泳道3)。
图14是显示经分离并纯化的融合蛋白MWPmp20-(His)6-EGF-TEV-促生长素抑制素28和通过TEV蛋白酶处理而从中裂解下来的促生长素抑制素28的电泳／蛋白质印迹结果的照片，其中，各样品为：分离并纯化的融合蛋白MWPmp20-(His)6-EGF-TEV-促生长素抑制素28(104微克，泳道1；52微克，泳道3；26微克，泳道5)、通过TEV蛋白酶处理而从所述融合蛋白中裂解下来的促生长素抑制素28(104微克，泳道2；52微克，泳道4；26微克，泳道6)、和促生长素抑制素28(BACHEM)(4．5微克，泳道7；1．5微克，泳道8)。
图15是显示经分离并纯化的融合蛋白MWPmp20-(His)6-接头-V8-胰高血糖素和通过V8蛋白酶处理而从中裂解下来的胰高血糖素的电泳／蛋白质印迹结果的照片，其中，各样品为：分离并纯化的融合蛋白MWPmp20-(His)6-接头-V8-胰高血糖素(90微克，泳道1；45微克，泳道3；22．5微克，泳道5)、通过V8蛋白酶处理而从所述融合蛋白中裂解下来的胰高血糖素(90微克，泳道2；45微克，泳道4；22．5微克，泳道6)、和胰高血糖素(日本Shimizu制药株式会社)(1．5微克，泳道7)。
图16是显示用于估测所产生的融合蛋白MWPmp10-(His)6-接头-Met-胰岛素原的量的电泳／蛋白质印迹结果的照片，其中，各样品为：通过培养转化子MWPmp10-(His)6-接头-Met-胰岛素原而获得的培养基(1微升，泳道1；1／3微升，泳道2；1／32微升，泳道3；1／33微升，泳道4；1／34微升，泳道5)和胰岛素原(Sigma)(1微升，泳道6；0．3微升，泳道7；0．1微升，泳道8；0．03微升，泳道9；0．01微升，泳道10)。
图17显示融合蛋白产物MWPsp-MWPmp20-TEV-G-GH的氨基酸序列和编码该产物的核苷酸序列。
图18是显示将融合产物MWPsp-MWPmp20-TEV-G-GH引入短芽孢杆菌表达载体(pNU211R2L5)的方式的示意图。
图19是显示含有通过培养转化子而产生的人生长激素的培养基的电泳结果的照片，其中，各样品为：标记蛋白(泳道1)、阴性对照(仅用质粒pNU211R2L5转化的，泳道2)、转化子MWPsp-GH(泳道3)、转化子MWPsp-TEV-G-GH(泳道4)、转化子MWPsp-MWPmp1-TEV-G-GH(泳道5)、转化子MWPsp-MWPmp2-TEV-G-GH(泳道6)、转化子MWPsp-MWPmp3-TEV-G-GH(泳道7)、转化子MWPsp-MWPmp4-TEV-G-GH(泳道8)、转化子MWPsp-MWPmp5-TEV-G-GH(泳道9)、转化子MWPsp-MWPmp6-TEV-G-GH(泳道10)、转化子MWPsp-MWPmp7-TEV-G-GH(泳道11)、转化子MWPsp-MWPmp8-TEV-G-GH(泳道12)、转化子MWPsp-MWPmp9-TEV-G-GH(泳道13)、转化子MWPsp-MWPmp10-TEV-G-GH(泳道14)、转化子MWPsp-MWPmp11-TEV-G-GH(泳道15)、转化子MWPsp-MWPmp12-TEV-G-GH(泳道16)、转化子MWPsp-MWPmp14-TEV-G-GH(泳道17)、转化子MWPsp-MWPmp20-TEV-G-GH(泳道18)、转化子MWPsp-MWPmp30-TEV-G-GH(泳道19)。
图20是显示含有通过培养转化子而产生的人生长激素的培养基的蛋白质印迹结果的照片，其中，各样品为：阴性对照(仅用质粒pNU211R2L5转化的，泳道1)、转化子MWPsp-GH(泳道2)、转化子MWPsp-TEV-G-GH(泳道3)、转化子MWPsp-MWPmp1-TEV-G-GH(泳道4)、转化子MWPsp-MWPmp2-TEV-G-GH(泳道5)、转化子MWPsp-MWPmp3-TEV-G-GH(泳道6)、转化子MWPsp-MWPmp4-TEV-G-GH(泳道7)、转化子MWPsp-MWPmp5-TEV-G-GH(泳道8)、转化子MWPsp-MWPmp6-TEV-G-GH(泳道9)、转化子MWPsp-MWPmp7-TEV-G-GH(泳道10)、转化子MWPsp-MWPmp8-TEV-G-GH(泳道11)、转化子MWPsp-MWPmp9-TEV-G-GH(泳道12)、转化子MWPsp-MWPmp10-TEV-G-GH(泳道13)、转化子MWPsp-MWPmp11-TEV-G-GH(泳道14)、转化子MWPsp-MWPmp12-TEV-G-GH(泳道15)、转化子MWPsp-MWPmp14-TEV-G-GH(泳道16)、转化子MWPsp-MWPmp20-TEV-G-GH(泳道17)、转化子MWPsp-MWPmp30-TEV-G-GH(泳道18)。
图21是显示经分离并纯化的融合蛋白MWPmp20-TEV-G-GH和通过TEV蛋白酶处理而从中裂解下来的突变的人生长激素G-GH的蛋白质印迹结果的照片，其中，各样品为：标记蛋白(泳道1)、分离并纯化的融合蛋白MWPmp20-TEV-G-GH(5微克，泳道2)、通过TEV蛋白酶处理而从所述融合蛋白中裂解下来的突变的人生长激素G-GH(5微克，泳道3)、和人生长激素(Biogenesis)(5微克，泳道4)。
图22是显示经分离并纯化的融合蛋白MWPmp20-TEV-G-GH和通过TEV蛋白酶处理而从中裂解下来的突变的人生长激素G-GH的电泳结果的照片，其中，各样品为：分离并纯化的融合蛋白MWPmp20-TEV-G-GH(0．1微克，泳道1)、通过TEV蛋白酶处理而从所述融合蛋白中裂解下来的突变的人生长激素G-GH(0．1微克，泳道2)、和人生长激素(Biogenesis)(0．1微克，泳道3)。
本发明的详细说明
按照本发明，具有所需的天然型一级结构的多肽可通过对在芽孢杆菌中表达上述的DNA而产生的融合蛋白进行化学或酶学处理而得到。
来自芽孢杆菌的CWP蛋白N末端的一个或多个氨基酸残基的例子是来自(但不限于)短芽孢杆菌菌株47-5Q(保藏编号为FERMBP-1664：JP-A-60-58074；JP-A-62-201589)和短芽孢杆菌菌株HPD31(保藏编号为FERM BP-1087；JP-A-04-0278091)的那些残基。例如，可以使用下列序列：
MWPmp10：Ala Glu Glu Ala Ala Thr Thr Thr Ala Pro (SEQ IDNO：3；细菌学杂志169：1239-1245，1989)；
OWPmp10：Ala Pro Lys Asp Gly Ile Tyr Ile Gly Gly (SEQ ID NO：4；细菌学杂志170：176-186，1988)；
HWPmp10：Ala Glu Asp Thr Thr Thr Ala Pro Lys Met (SEQ IDNO：5；细菌学杂志172：1312-1320，1990)。
来自所述N末端的氨基酸残基的数目通常为一个或更多，优选为6个或更多，更优选为6、7、8、10、11、12、13、14、15、17、20或50个。
关于氨基酸残基的化学或酶促裂解，化学裂解的例子包括位于甲硫氨酸C-末端侧的选择性裂解(生物化学杂志，237：1856-1860，1962)和位于色氨酸C-末端侧的选择性裂解(酶学方法，91：318-324，1983)；而酶促裂解的例子是通过因子Xa、凝血酶、肠激酶、V8蛋白酶、TEV蛋白酶或类似的酶等对融合位点的选择性裂解。因为对氨基酸残基的化学或酶促裂解位于目的多肽的N末端侧，随后的化学或酶促裂解可导致具有所需一级结构的多肽的产生。
在本发明中，外源多肽可是来源于任何生物体的多肽，只要它不影响上述的化学或酶促裂解程序即可。具体地讲，当采用化学裂解特别是通过溴化氰进行的化学裂解时，在目的外源多肽的一级结构(或氨基酸序列)中不应含有甲硫氨酸残基。所述多肽的例子是(不限于)人胰岛素原、人血小板衍生的生长因子A链(PDGF-A)、人肠促胰液素和类似物等。在特别采用TEV蛋白酶进行酶促裂解时，为了得到与天然类型相同的多肽，所述外源多肽在N末端侧必须具有甘氨酸或丝氨酸残基。这些外源多肽的例子是人促生长素抑制素28、人血小板衍生的生长因子A链(PDGF-A)、人神经生长因子(NGF)等，然而，所述多肽不限于上面举出的具体例子，只要在N末端添加甘氨酸或丝氨酸不影响外源多肽的功能就行。当使用V8蛋白酶进行酶促裂解时，外源多肽应绝不含谷氨酸残基。这种多肽的例子是人胰高血糖素、人心房钠尿肽、人降钙素等等。
根据本发明，DNA可优选含有编码在融合蛋白N末端的芽孢杆菌CWP信号肽的核苷酸序列，特别是MWP信号肽的核苷酸序列。
本发明的DNA还可含有编码用作分离及纯化的标记的氨基酸的核苷酸序列和／或编码被称作接头的氨基酸的核苷酸序列。
本文所用的术语“分离及纯化的标记”是指助于将通过基因重组技术表达而制备的融合蛋白分离出来的肽。
优选标记序列和能与之结合的物质间的结合是可逆的。所述的标记序列包括(例如)与谷光甘肽有亲和性的谷光甘肽S-转移酶、与直链淀粉有亲和性的麦芽糖结合蛋白、其中的组氨酸与金属有亲和性的组氨酸残基组成的肽序列、抗原及其抗体，等等。在本发明一个优选的实施方案中，所述的标记序列是His His His His His His(SEQ IDNO：61)(即，(His)6)。
接头通常存在于蛋白质内的功能性结构域之间，并具有连接所述的结构域但不影响所述结构域的功能的作用。在本发明中，接头位于用于分离及纯化的标记序列和外源多肽之间，并起使带有所插入的标记序列的融合蛋白表达／分泌的作用。所用接头的例子是选自Ala、Gly、Pro、Ser和Val的氨基酸残基不同数目的组合。在本发明优选的实施方案中，所述的接头是Gly Ser Pro Val Pro Ser Gly。然而，如果没有插入用于分离及纯化的标记序列，可以将接头掺入融合蛋白中，也可以不将之掺入。在融合蛋白包含促生长素抑制素28作为外源多肽的情况下，一个特别的接头如EGF是保证外源多肽的表达／分泌所必须的。
在本发明的一个实施方案中，本发明提供一种包含编码融合蛋白的核苷酸序列的DNA，所述的融合蛋白包含：由源自MWP蛋白N末端的1个或多个、优选6-50(不包括9)个、特别是6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、17、20或50个氨基酸残基组成的序列(下文简称为MWPmp6、MWPmp7、MWPmp8、MWPmp10，等等)，由6个组氨酸残基组成的用作分离及纯化的标记的序列(在本文中以(His)6表示)，作为接头的氨基酸序列Gly Ser Pro Val Pro Ser Gly，用于将目的多肽裂解出来所需的甲硫氨酸残基，和在其氨基酸序列中不含甲硫氨酸的多肽序列，其中所述的MWP蛋白是CWP的一种；所述的这些序列彼此按序线性连接，并且其中所述的核苷酸序列与包含芽孢杆菌启动子区的核酸序列的3’-末端相连。这种多肽的例子是人胰岛素原。所述的标记序列或接头是任选的元件。所述融合蛋白还可进一步包含位于N末端的MWP信号肽序列。
在另一实施方案中，本发明提供一种包含编码融合蛋白的核苷酸序列的DNA，所述的融合蛋白包含：由源自MWP蛋白N末端的1个或多个、优选6-50(不包括9)个、特别是10或20个氨基酸残基组成的序列，由6个组氨酸残基组成的用作分离及纯化的标记的序列，作为接头的人表皮生长因子序列、用TEV蛋白酶将目的多肽裂解出来所需的氨基酸序列Asp Tyr Asp Ile Pro Thr Thr Glu Asn Leu Tyr PheGln，和在其氨基酸序列中不含TEV蛋白酶识别序列但在其N末端具有甘氨酸或丝氨酸的的多肽序列，其中所述的MWP蛋白是细胞壁蛋白的一种；所述的这些序列彼此按序线性连接，并且其中所述的核苷酸序列与包含芽孢杆菌启动子区的核酸序列的3’-末端相连。所述多肽的例子是促生长素抑制素28。所述融合蛋白还可进一步包含位于N末端的MWP信号肽序列。
在另一实施方案中，本发明提供一种包含编码融合蛋白的核苷酸序列的DNA，所述的融合蛋白包含：由源自MWP蛋白N末端的1个或多个、优选6-50(不包括9)个、特别是20个氨基酸残基组成的序列，由6个组氨酸残基组成的用作分离及纯化的标记的序列，作为接头的氨基酸序列Gly Ser Pro Val Pro Ser Gly，用V8蛋白酶将目的多肽裂解出来所需的氨基酸序列Phe Leu Glu，和在其氨基酸序列中不含谷氨酸的多肽序列，其中所述的MWP蛋白是细胞壁蛋白的一种；所述的这些序列彼此按序线性连接，并且其中所述的核苷酸序列与包含芽孢杆菌启动子区的核酸序列的3’-末端相连。所述多肽的例子是人胰高血糖素。所述融合蛋白还可进一步包含位于N末端的MWP信号肽序列。
根据本发明的另一方面，本发明还涉及一种包含编码融合蛋白的核苷酸序列的DNA，所述的融合蛋白包含：芽孢杆菌的CWP信号肽序列、由用于酶促裂解的氨基酸残基组成的序列、和外源多肽序列；所述的这些序列彼此按序线性连接，并且其中所述的核苷酸序列与包含芽孢杆菌启动子区的核酸序列的3’-末端相连。
由来自CWP蛋白N末端的一个或多个氨基酸残基组成的序列可以直接跟着所述的信号肽序列。用于酶促裂解的序列可以是易被蛋白酶如因子Xa、凝血酶、肠激酶、V8蛋白酶或TEV蛋白酶等裂解的序列。
在本发明的另一实施方案中，融合蛋白包括：MWP的信号肽序列、用TEV蛋白酶将目的多肽裂解出来所需的氨基酸序列Asp Tyr AspIle Pro Thr Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln、和在其氨基酸序列中不含TEV蛋白酶识别序列的多肽序列，其中所述的MWP蛋白是细胞壁蛋白的一种；所述的这些序列彼此按序线性连接。
在这种情况下，由来自MWP蛋白N末端的一个或多个氨基酸残基组成的序列可以直接跟着所述的信号肽序列。如果融合蛋白中包含来自MWP蛋白N末端的序列，优选该序列包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、20或30个氨基酸。所述多肽的例子是在N末端为甘氨酸的突变的人生长激素。
在本发明中，编码上述融合蛋白的核苷酸序列与包含芽孢杆菌启动子区的核酸序列的3’-末端相连。适宜的启动子是(但不限于)来源于短芽孢杆菌菌株47-5Q(JP-B-01-58950；JP-B-07-108224)的MWP启动子和来源于短芽孢杆菌菌株HPD31(JP-A-06-278091；JP-A-06-133782)的HWP启动子，等等。
本发明的DNA可以通过现有技术中的已知技术的组合来制备。例如，各元件的DNA序列可通过化学合成或克隆来分别制备；结合PCR扩增(即，聚合酶链式反应)，将所获得的NDA序列用连接酶按序连接起来，以得到目的DNA。参考下文所描述的实施例，其细节可更加明晰。关于可用于本发明的各种常用技术，请参见：Maniatis，T．等人编辑，分子克隆第二版，实验室手册，冷泉港实验室(1989)；Innis，NA．等人，PCR Protocols，方法和应用指南，Academic出版社(1990)。
编码外源多肽的DNA可利用常规的克隆技术而得到。例如，将外源多肽纯化并测定其部分氨基酸序列；在所测出的序列的基础上，合成探针或制备抗体；并用探针或抗体来筛选含有目的cDNA的cDNA文库，由此得到编码目的多肽的DNA。对于较短的DNA，可利用亚氨膦酸酯化学在市售的DNA合成仪上合成。如果必要，可对DNA进行PCR扩增，其中将DNA变性、与引物的退火和延伸循环重复20次或以上。
本发明还提供包含上文定义的DNA的载体。可用于本发明的载体必须具有适当的插入位点或能引入DNA的限制位点，允许DNA在芽孢杆菌宿主细胞中表达，并可在该宿主细胞中自主复制。在载体可包含复制起点、终止子序列、核糖体结合位点或可选择的标记如抗药基因和营养缺陷型特征的互补基因。本发明的载体优选为质粒。载体的例子包括pUN200、pHY500(Proc．Natl．Acad．Sci．USA86：3589-3593)、pHY4831(细菌学杂志169：1239-1245，1987)、pUN100(应用微生物学生物技术30：75-80，1989)、pNU211(生化杂志112：488-491，1992)、pNU211R2L5(JP-A-07-170984)、pHY700(JP-A-04-278091)、pHT210(JP-A-06-133782)和pHT110R2L5(应用微生物学生物技术42：358-363，1994)。在下面所述的例子中，可通过如图5和18所示的构建方法制备表达载体，即，pNU-PINS-1、pNU-PINS-2、pNU-STN、pNU-GCN和pNU-G-GH。
本发明还提供了用上文定义的载体转化的属于芽孢杆菌属的细菌。可用于本发明的芽孢杆菌是(但不限于)短芽孢杆菌菌株47-5Q(保藏编号为FERM BP-1664；JP-A-60-58074；JP-A-62-201589)、短芽孢杆菌菌株47K(JP-A-02-257876)、短芽孢杆菌菌株31OK(JP-A-06-296485)、短芽孢杆菌菌株HPD31(保藏编号为FERM BP-1087；JP-A-04-0278091)，等等。被转入短芽孢杆菌菌株47-5Q的表达载体pNU-PINS-1、pNU-PINS-2、pNU-STN和pNU-GCN已分别按照布达佩斯条约保藏于日本通产商业省工业技术院生命工学工业技术研究所(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)；其保藏编号为FERM BP-6311、FERM BP-6312、FERM BP-6313和FERM BP-6314。
将如上获得的载体引入处于感受态的芽孢杆菌细胞中，然后在适当的培养基中将芽孢杆菌细胞在能使载体表达的条件下培养，由此在细胞内或细胞外、优选在细胞外产生重组融合多肽；并通过常规技术收集和纯化所产生的多肽。所述引入载体的例子是电穿孔(酶学方法217：23-33，1993)。可采用适当的混合凝胶过滤、离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用层析、电泳等等来对所获得的融合蛋白进行纯化。
可随后对融合蛋白进行化学或酶促裂解，以得到具有天然一级结构的目的多肽。关于裂解处理，可采用甲硫氨酸或色氨酸C-末端侧的化学裂解以及通过因子Xa、凝血酶、肠激酶、V8蛋白酶或TEV蛋白酶进行的酶促裂解。
本发明还提供了一种制备重组多肽的方法，该方法包括：在培养基中培养如上被转化的属于芽孢杆菌属的细菌，以在该细菌的细胞外使包含外源多肽的融合蛋白积聚；从培养基中分离出融合蛋白；从所分离出的融合蛋白中将所述外源多肽裂解出来；和收集所述的多肽。
按本发明的该方法制备出的重组多肽可用于制药、诊断、科研等等。
实施例
下文将结合附图通过实施例对本发明进行更详细的描述。
在实施例中，融合蛋白通过如下步骤制备：将化学合成的正链和负链寡核苷酸退火；采用寡核苷酸通过PCR反应(聚合酶链式反应)扩增DNA片段；采用DNA连接酶通过连接反应将扩增出的DNA片段连接起来。在本文中，“MWPsp”是指MWP蛋白的信号肽，跟在MWPmp后面的数字(如，MWPmp1、2、3…)是指来自MWP成熟蛋白N-末端的氨基酸的数目(如，1个、2个、3个…氨基酸)。
实施例1
构建掺入融合DNA MWPsp-MWPmp10-(His)6-
接头-Met-胰岛素原的载体pPINS-1
(1)制备DNA片段MWPsp-MWPmp10
将下列(ⅰ)至(ⅳ)加至0．5ml试管中，得到100μl反应溶液，按照已知方法(Innis，M．A．等，PCR总论，方法和应用指南，Academic Press，1990)进行PCR反应，重复30个循环：94℃变性1分钟；55℃退火1分钟；72℃延长DNA链1分钟。
(ⅰ)模板DNA
840 ng基因组DNA，是按照已知方法(分子克隆第二版，实验室手册，冷泉港实验室(1989))从短芽孢杆菌(菌株47-5Q)中提取的。
(ⅱ)引物
正向引物5’-GTCGTTAACAGTGTATTGCT-3’(SEQ ID NO：6)和反向引物5’-TGGAGCTGTAGTAGTTGCTGCTTCTTCTGC-3’(SEQ IDNO：7)，是以Yamagata，H．等(细菌学杂志169，1239-1245，1987)和Tsuboi．A．等(细菌学杂志170，935-945，1988)确定的MWP蛋白质的核苷酸序列为基础，用有机合成法制备的，将这些引物加至0．1μM的终浓度。
(ⅲ)Taq DNA合成酶
5U市售Taq DNA合成酶(GIBCO BRL)。
(ⅳ)其它
Tris-HCl(终浓度为20mM，pH8)，MgCl2(终浓度为2．5 mM)和dNTPs(dATP，dGTP，dCTP和dTTP，终浓度各50μM)。
在PCR反应结束时，用苯酚浓缩反应混合物，然后加至0．8％琼脂糖凝胶中，在正常条件下，进行电泳。用Ultrafree C3H(MolliporeCorp．)从琼脂糖凝胶中回收PCR产物，即DNA片段MWPsp-MWPmp10。将回收的PCR产物用苯酚处理，经乙醇沉淀，真空干燥，然后溶解于适量的蒸馏水中。此后，按制造商的说明，将所得PCR产物用DNA Blunting试剂盒(Takara Shuzo，CoLtd)制成平整末端。
(2)制备DNA片段(His)6
根据遗传密码表(分子克隆第二版，实验室手册，冷泉港实验室(1989))，化学合成编码(His)6的正向寡核苷酸5’-CATCATCATCATCATCAC-3’(SEQ ID NO：8)和反向寡核苷酸5’-GTGATGATGATGATGATG-3’(SEQ ID NO：9)。按制造商的说明，用T4多核苷酸激酶(Nippon Gene)将所述寡核苷酸磷酸化，于95℃，在10mM Tris-HCl(pH8)和5mM MgCl2溶液中处理5分钟，并在37℃退火15分钟。将退火的双链DNA片段(His)6用苯酚处理，经乙醇沉淀，真空干燥，然后溶解于适量的蒸馏水中。
(3)制备DNA片段接头
根据遗传密码表(同上文)，化学合成编码接头Gly Ser Pro Val Pro SerGly(SEQ ID NO：1)的正向寡核苷酸5′-GGTTCTCCAGTACCTTCTGGA-3’(SEQ ID NO：53)和反向寡核苷酸5′-TCCAGAAGGTACTGGAGAACC-3’(SEQ ID NO：10)，然后按照本实施例(2)中所述进行退火以得到双链DNA片段接头。
(4)制备DNA片段胰岛素原
按照与本实施例(1)中所述相同的方法，制备平整末端DNA的片段胰岛素原，不同的是：
(a)用掺入人胰岛素原DNA的质粒载体10ng作模板DNA，该载体通过下列方法制备：按照制造商的说明，用第一链cDNA合成试剂盒(Pharmacia)，从市售人胰腺mRNA(Clontech)合成人胰腺cDNA；以Bell，G．I．等(Nature，282，525-527，1979)确定的人胰岛素原基因的核苷酸序列为基础，合成正向引物5’-ATGGCCCTGTGGATGCGCC-3’(SEQID NO：11)和反向引物5’-CTAGTTGCAGTAGTTCTCC-3’(SEQ IDNO：12)；用上述得到的作为模板的cDNA和合成的寡核苷酸进行PCR反应，重复35个循环：在94℃处理1分钟，60℃处理1分钟，72℃处理1分钟；将由此得到的PCR产物，即人胰岛素原DNA克隆到pGEM-T载体(Promega)中；
(b)使用正向引物5’-TTTGTGAACCAACACCTG-3’(SEQ IDNO：13)和反向引物5’-CTAGTTGCAGTAGTTCTCC-3’(SEQ IDNO：12)；和
(c)通过重复25个循环：94℃变性1分钟，53℃退火1分钟，72℃延长DNA链30秒钟；完成PCR反应。
(5)制备DNA片段Met-胰岛素原
按照本实施例(4)中所述相同的方法，制备平整末端DNA片段Met-胰岛素原，不同之处是：(a)用本实施例(4)中得到的10ng PCR产物胰岛素原作模板DNA；和(b)使用正向引物5’-ATGTTTGTGAACCAACACCTG-3’(SEQ ID NO：54)。
按照制造商的说明，用T4多核苷酸激酶(Nippon Gene)，使平整末端DNA片段Met-胰岛素原再经磷酸化反应，由此得到磷酸化DNA片段Met-胰岛素原。
(6)制备融合DNA MWPsp-MWPmp10-(His)6
按照本实施例(1)中所述相同的方法，制备平整末端融合DNAMWPsp-MWPmp10-(His)6，不同的是：(a)用DNA连接试剂盒(TakaraShuzo，CoLtd．)，通过将本实施例(1)中得到的适量DNA片段MWPsp-MWPmp10与本实施例(2)中所得的适量DNA片段(His)6在16℃反应30分钟来制备模板DNA；(b)使用反向引物5’-GTGATGATGATGATGATG-3’(SEQ ID NO：9)；和(c)重复25个循环：在94℃变性1分钟，45℃退火1分钟，72℃将DNA链延长30秒；完成PCR反应。
此后，按照制造商的说明，用T4多核苷酸激酶(Nippon Gene)，将所得的PCR产物磷酸化。用DNA连接试剂盒(Takara Shuzo，CoLtd．)将磷酸化的PCR产物导入HincⅡ切割的载体(BlueScript SK-，Stratagene)中，以便用已知方法(分子克隆第二版，实验室手册，冷泉港实验室(1989))转化大肠杆菌DH5α。从转化体中纯化质粒载体DNA。为了确定是否得到了融合DNA MWPsp-MWPmp10-(His)6，用测序载体的正向或反向引物(即M13正向或反向引物)，确定载体的核苷酸序列。按照与上述相同的方法，完成第二PCR反应，用掺入MWPsp-MWPmp10-(His)6的载体作模板DNA，并使用正向引物5’-GTCGTTAACAGTGTATTGCT-3’(SEQ ID NO：6)和反向引物5’-GTGATGATGATGATGATG-3’(SEQ ID NO：9)，由此，制备平整末端的融合DNA MWPsp-MWPmp10-(His)6。
(7)制备融合DNA MWPsp-MWPmp10-(His)6-接头
按照与本实施例(6)所述相同的方法制备平整末端融合DNAMWPsp-MWPmp10-(His)6-接头，不同的是：(a)用DNA连接试剂盒(Takara Shuzo，CoLtd．)通过将上述(6)中所得的适量融合DNAMWPsp-MWPmp10-(His)6与上述(3)中得到的适量DNA片段接头在16℃反应30分钟来制备用于第一PCR反应的模板DNA；和(b)将反向引物5-TCCAGAAGGTACTGGAGAACC-3’(SEQ ID NO：10)用于第一PCR反应。
(8)制备掺入有融合DNA MWPsp-MWPmp10-(His)6-接头-Met-胰岛素原的载体
按照与本实施例(6)中所述相同的方法制备掺入融合产物MWPsp-MWPmp10-(His)6-接头-Met-胰岛素原的载体pPINS-1，不同的是(a)用DNA连接试剂盒(Takara Shuzo，CoLtd．)，通过将适量本实施例(7)中所得融合DNA MWPsp-MWPmp10-(His)6-接头与适量本实施例(5)所得DNA片段Met-胰岛素原在16℃反应30分钟来制备用于第一PCR反应的模板DNA；和(b)将反向引物5’-CTAGTTGCAGTAGTTCTCC-3’(SEQID NO：12)用于第一PCR反应。
实施例2分别构建掺入有融合DNA MWPsp-MWPmp6-、8-、9-、11-、12-、15-、
40-、50-、100-(His)6-接头-Met-胰岛素原的载体
(1)制备DNA片段MWPsp-MWPmp6、8、9、11、12、15、40、50、100
按照与实施例1(1)所述相同的方法，制备DNA片段MWPsp-MWPmp6、8、9、11、12、15、40、50、100，不同的是：
(a)用下列引物作为反向引物：MWPmp6： 5′-AGTTGCTGCTTCTTCTGC-3′ (SEQ ID NO：14)MWPmp8： 5′-TGTAGTAGTTGCTGCTTC-3′ (SEQ ID NO：15)MWPmp9： 5′-AGCTGTAGTAGTTGCTGC-3′ (SEQ ID NO：16)MWPmp11：5′-TTTTGGAGCTGTAGTAGT-3′ (SEQ ID NO：17)MWPmp12：5′-CATTTTTGGAGCTGTAGT-3′ (SEQ ID NO：18)MWPmp15：5′-ATCAGCGTCCATTTTTGG-3′ (SEQ ID NO：19)MWPmp40：5′-GTCTACACCGTATTCGCCGT-3′(SEQ ID NO：20)MWPmp50：5′-AGTAGCGAACTCTGCACGAG-3′(SEQ ID NO：21)MWPmp100：5′-AGATTTGTCCGGGAAACCTT-3′(SEQ ID NO：22)；
(b)通过重复30个循环：94℃变性1分钟，45℃退火1分钟，72℃延长DNA链1分钟；以完成PCR反应。
(2)制备DNA片段(His)6-接头-Met-胰岛素原
按照与实施例1(1)中所述相同的方法，制备平整末端DNA片段(His)6-接头-Met-胰岛素原，不同的是(a)用10ng实施例1(8)中所得的掺入有融合DNA MWPsp-MWPmp10-(His)6-接头的载体pPINS-1作为模板DNA；(b)使用正向引物5’-CATCATCATCATCATCAC-3’(SEQ IDNO：8)和反向引物5’-CTAGTTGCAGTAGTTCTC-3’(SEQ ID NO：23)；和(c)重复25个循环：94℃变性1分钟，47℃退火1分钟，72℃延长DNA链30秒；以完成PCR反应。
按照制造商的说明，用T4多核苷酸激酶(Nippon Gene)，将平整末端DNA片段(His)6-接头-Met-胰岛素原进行磷酸化反应，由此得到磷酸化的DNA片段(His)6-接头-Met-胰岛素原。
(3)分别制备掺入有融合DNA MWPsp-MWPmp6-、8-、9-、11-、12-、15-、40-、50-、100-(His)6-接头-Met-胰岛素原的载体
按照实施例1(8)中所述，制备分别掺入有融合DNA MWPsp-MWPmp6-、8-、9-、11-、12-、15-、40-、50-、100-(His)6-接头-Met-胰岛素原的载体，不同的是，用DNA连接试剂盒(Takara Shuzo，CoLtd．)通过分别将本实施例(1)中制备的适量DNA片段MWPsp-MWPmp6-、8-、9-、11-、12-、15-、40-、50-、100与本实施例(2)中所得的适量DNA片段(His)6-接头-Met-胰岛素原在16℃反应30分钟，来制备用于第一PCR反应的模板DNA。
实施例3
构建掺入有融合DNA MWPsp-MWPmp10-Met-胰岛素原的载体
按照与实施例1(8)所述相同的方法制备掺入有融合DNAMWPsp-MWPmp10-Met-胰岛素原的载体pPINS-2，不同的是，用DNA连接试剂盒(Takara Shuzo，CoLtd．)，通过将实施例1(1)中得到的适量DNA片段MWPsp-MWPmp10与实施例1(5)得到的适量DNA片段Met-胰岛素原在16℃反应30分钟，来制备用于第一PCR反应的模板DNA。
实施例4构建分别掺入有融合DNA MWPsp-MWPmp1-、2-、3-、4-、5-、6-、7-、8-、9-、11-、12-、13-、14-、15-、17-、20-、50-Met-胰岛素原的载体
(1)制备DNA片段MWPsp-MWPmp1、2、3、4、5、7、13、14、17、20
按照与实施例1所述相同的方法制备平整末端DNA片段MWPsp-MWPmp1、2、3、4、5、7、13、14、17、20，不同的是：
(a)用下列引物作为反向引物：MWPmp1： 5′-TGCTGCGAAAGCCATTGG-3′ (SEQ ID NO：24)MWPmp2： 5′-TTCTGCTGCGAAAGCCAT-3′ (SEQ ID NO：25)MWPmp3： 5′-TTCTTCTGCTGCGAAAGC-3′ (SEQ ID NO：26)MWPmp4： 5′-TGCTTCTTCTGCTGCGAA-3′ (SEQ ID NO：27)MWPmp5： 5′-TGCTGCTTCTTCTGCTGC-3′ (SEQ ID NO：28)MWPmp7： 5′-AGTAGTTGCTGCTTCTTC-3′ (SEQ ID NO：29)MWPmp13：5′-GTCCATTTTTGGAGCTGT-3′ (SEQ ID NO：30)MWPmp14：5′-AGCGTCCATTTTTGGAGC-3′ (SEQ ID NO：31)MWPmp17：5′-TTCCATATCAGCGTCCAT-3′ (SEQ ID NO：32)MWPmp20：5′-TACGGTTTTTTCCATATCAGC-3′(SEQ ID NO：33)；
(b)重复30个循环：94℃变性1分钟，45℃退火1分钟，72℃延长DNA链1分钟；完成PCR反应。
(2)制备分别掺入有融合DNA MWPsp-MWPmp1-、2-、3-、4-、5-、6-、7-、8-、9-、11-、12-、13-、14-、15-、17-、20-、50-Met-胰岛素原的载体
按照与实施例1(8)所述相同的方法，制备分别掺入有融合DNAMWPsp-MWPmp1-、2-、3-、4-、5-、6-、7-、8-、9-、11-、12-、13-、14-、15-、17-、20-、50-Met-胰岛素原的载体，不同的是：(a)用DNA连接试剂盒(Takara Shuzo，CoLtd．)，通过分别将适量实施例2(1)和本实施例(1)中所得的DNA片段MWPsp-MWPmp1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、17、20、50与实施例1(5)中所得的适量DNA片段Met-胰岛素原在16℃反应30分钟，来制备用于第一PCR反应的模板DNA。
实施例5
构建掺入有融合DNA MWPsp-胰岛素原的载体
(1)制备DNA片段MWPsp
按照与实施例1(1)所述相同的方法，制备平整末端DNA片段MWPsp，不同的是，将反向引物5’-TGCGAAAGCCATTGGAGCAAC-3’(SEQ ID NO：34)用于PCR反应。
(2)制备掺入有融合DNA MWPsp-胰岛素原的载体
按照与实施例1(8)所述相同的方法，制备掺入有融合DNAMWPsp-胰岛素原的载体，不同的是，用DNA连接试剂盒(Takara Shuzo，CoLtd．)，通过将本实施例(1)中所得的适量DNA片段MWPsp与实施例1(4)中所得的平整末端DNA片段胰岛素原在16℃反应30分钟，来制备用于第一PCR反应的模板DNA。
实施例6构建分别掺入有融合DNA MWPsp-促长素抑制素28、MWPsp-MWP10-(His)6-EGF-TEV-促生长素抑制素28、MWPsp-MWP10-(His)6-TEV-促生长素抑制素28和MWPsp-MWP20-(His)6-EGF-TEV-促生长素
抑制素28的载体
(1)制备DNA片段促生长素抑制素28
按照与实施例1(1)所述相同的方法，制备平整末端的DNA片段促生长素抑制素28，不同的是：
(a)以Shen，L．-P等(Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A，79，4575-4579，1982)确定的核苷酸序列为基础，用有机合成法制备作为模板DNA的10ng人促生长素抑制素28单链DNA(5′-TCTGCTAACTCAAACCCGGCTATGGCACCCCGAGAACGCAAAGCTGGCTGCAAGAATTTCTTCTGGAAGACTTTCACATCCTGTTAG-3′(SEQID NO：55))；
(b)使用正向引物5’-TCTGCTAACTCAAACCCG-3’(SEQ IDNO：35)和反向引物5’-CTAACAGGATGTGAAAGTCTT-3’(SEQ IDNO：36)；和
(c)重复25个循环：94℃变性1分钟，50℃退火1分钟，72℃延长DNA链10秒；完成PCR反应。
按制造商的说明，用T4多核苷酸激酶(Nippon Gene)将平整末端DNA片段促生长素抑制素28进行磷酸化反应，由此得到磷酸化的DNA片段促生长素抑制素28。
(2)制备DNA片段EGF
按照与实施例1(1)所述相同的方法，制备平整末端DNA片段EGF，不同的是：
(a)用10ng人表皮生长因子(EGF)单链DNA(5′-AACTCTGACTCCGAATGCCCGCTGTCTCACGACGGTTATTGCCTGCATGATGGTGTTTGTATGTATATCGAAGCTCTGGACAAATATGCTTGCAACTGTGTTGTTGGTTACATCGGTGAGCGTTGCCAGTATCGCGACCTGAAATGGTGGGAACTGCGT-3′)(SEQ ID NO：56))作为模板DNA，该单链DNA是以Bell，G．I．等(核酸研究，14，8427-8446，1986)确定的人表皮生长因子的核苷酸序列为基础，通过有机合成法制备的；
(b)使用正向引物5’-AACTCTGACTCCGAATGC-3’(SEQ IDNO：37)和反向引物5’-ACGCAGTTCCCACCATTT-3’(SEQ ID NO：38)；和
(c)重复25个循环：94℃变性1分钟，50℃退火1分钟，72℃延长DNA链15秒；完成PCR反应。
按制造商的说明，用T4多核苷酸激酶(Nippon Gene)将平整末端DNA片段EGF进行磷酸化反应，由此得到磷酸化的DNA片段EGF。
(3)制备DNA片段TEV
根据遗传密码表(同上文)，化学合成编码由TEV蛋白酶识别的氨基酸序列的正向寡核苷酸5′-GACTATGATATCCCGACCACTGAAAACCTGTACTTCCAA-3′(SEQ ID NO：57)和反向寡核苷酸5′-TTGGAAGTACAGGTTTTCAGTGGTCGGGATATCATAGTC-3′(SEQ IDNO：58)，并按照实施例1(2)所述进行退火，由此得到双链DNA片段TEV。
(4)制备融合DNA MWPsp-MWPmp10-(His)6-EGF
按照实施例1(6)所述，制备平整末端的融合DNA MWPsp-MWPmp10-(His)6-EGF，不同的是：(a)用DNA连接试剂盒(Takara Shuzo，CoLtd．)，将实施例1(6)中所得的适量融合DNA MWPsp-MWPmp10-(His)6与本实施例(2)中所得的适量DNA片段EGF在16℃反应30分钟，来制备用于第一PCR反应的模板DNA；和(b)将反向引物5’-ACGCAGTTCCCACCATTT-3’(SEQ ID NO：38)用于第一PCR反应。
(5)制备融合DNA MWPsp-MWPmp10-(His)6-TEV
按照实施例1(6)所述，制备平整末端的融合DNA MWPsp-MWPmp10-(His)6-TEV，不同的是：(a)用DNA连接试剂盒(TakaraShuzo，CoLtd．)，在16℃，通过将实施例1(6)中所得的适量融合DNAMWPsp-MWPmp10-(His)6与本实施例(3)中所得的适量DNA片段TEV反应30分钟，制备用于第一PCR反应的模板DNA；和(b)将反向引物5’-TTGGAAGTACAGGTTTTC-3’(SEQ ID NO：39)用于第一PCR反应。
(6)制备融合DNA MWPsp-MWPmp10-(His)6-EGF-TEV
按照与实施例1(6)所述相同的方法，制备平整末端的融合DNAMWPsp-MWPmp10-(His)6-EGF-TEV，不同的是：(a)用DNA连接试剂盒(Takara Shuzo，CoLtd．)，在16℃，通过将本实施例(4)中所得的适量融合DNA MWPsp-MWPmp10-(His)6-EGF与本实施例(3)中所得的适量DNA片段TEV反应30分钟，来制备第一PCR反应的模板DNA；和(b)将反向引物5’-TTGGAAGTACAGGTTTTC-3’(SEQ ID NO：39)用于第一PCR反应。
(7)制备融合DNA MWPsp-MWPmp20-(His)6
按照与实施例1(6)中所述相同的方法，制备平整末端的融合DNAMWPsp-MWPmp20-(His)6，不同的是：(a)用DNA连接试剂盒(TakaraShuzo，CoLtd．)，在16℃，通过将实施例4(1)中所得的适量融合DNAMWPsp-MWPmp20与实施例1(2)中所得的适量DNA片段(His)6反应30分钟，来制备用于第一PCR反应的模板DNA。
(8)制备融合DNA MWPsp-MWPmp20-(His)6-EGF
按照与实施例1(6)中所述相同的方法，制备平整末端的融合DNAMWPsp-MWPmp20-(His)6-EGF，不同的是：(a)用DNA连接试剂盒(Takara Shuzo，CoLtd．)，在16C，通过将本实施例(7)中所得适量融合DNA MWPsp-MWPmp20-(His)6与(2)所得的适量DNA片段EGF反应30分钟，来制备用于第一PCR反应的模板DNA；和(b)将反向引物5’-ACGCAGTTCCCACCATTT-3’(SEQ ID NO：38)用于第一PCR反应。
(9)制备融合DNA MWPsp-MWPmp20-(His)6-EGF-TEV
按照与实施例1(6)中所述相同的方法，制备平整末端的融合DNAMWPsp-MWPmp20-(His)6-EGF-TEV，不同的是：(a)用DNA连接试剂盒(Takara Shuzo，CoLtd．)，在16℃，通过将本实施例(8)中所得适量融合DNA MWPsp-MWPmp20-(His)6-EGF与本实施例(3)所得的适量DNA片段TEV反应30分钟，来制备用于第一PCR反应的模板DNA；和(b)将反向引物5’-TTGGAAGTACAGGTTTTC-3’(SEQ ID NO：39)用于第一PCR反应。
(10)制备分别掺入有融合DNA MWPsp-促生长素抑制素28、MWPsp-MWPmp10-(His)6-EGF-TEV-促生长素抑制素28、MWPsp-MWPmp10-(His)6-TEV-促生长素抑制素28和MWPsp-MWPmp20-(His)6-EGF-TEV-促生长素抑制素28的载体
按照与实施例1(8)所述相同的方法，制备分别掺入有融合DNAMWPsp-促生长素抑制素28、MWPsp-MWPmp10-(His)6-EGF-TEV-促生长素抑制素28、MWPsp-MWPmp10-(His)6-TEV-促生长素抑制素28和MWPsp-MWPmp20-(His)6-EGF-TEV-促生长素抑制素28的载体，不同的是：(a)用DNA连接试剂盒(Takara Shuzo，CoLtd．)，在16℃，通过将实施例5(1)中所得的DNA片段MWPsp与本实施例(1)中所得的DNA片段促生长素抑制素28反应30分钟，来制备用于MWPsp-促生长素抑制素28的第一PCR反应的模板DNA；并用DNA连接试剂盒(Takara Shuzo，CoLtd．)，在16℃，通过将适量DNA片段促生长素抑制素28分别与本实施例(5)、(6)和(9)中所得的适量融合DNAMWPsp-MWPmp10-(His)6-TEV、MWPsp-MWPmp10-(His)6-EGF-TEV和MWPsp-MWPmp20-(His)6-EGF-TEV反应30分钟，制备用于MWPsp-MWPmp10-(His)6-EGF-TEV-促生长素抑制素28、MWPsp-MWPmp10-(His)6-TEV-促生长素抑制素28和MWPsp-MWPmp20-(His)6-EGF-TEV-促生长素抑制素28的第一PCR反应的模板DNA；将反向引物5’-CTAACAGGATGTGAAAGTCTT-3’(SEQ ID NO：36)用于第一PCR反应。
实施例7构建分别掺入有融合DNA MWPsp-胰高血糖素、MWPsp-MWPmp10-(His)6-接头-V8-胰高血糖素、MWPsp-MWPmp20-(His)6-接头-V8-胰高血糖素(pGCN)和MWPsp-MWPmp30-(His)6-接头-V8-胰高血糖素的载体
(1)制备DNA片段胰高血糖素
按照与实施例1(1)所述相同的方法，制备平整末端的DNA片段胰高血糖素，不同的是：
(a)用10ng人胰高血糖素单链DNA(5′-CACAGCCAAGGTACTTTCACATCCGACTACTCTAAATATCTGGATTCCCGTCGCGCTCAAGATTTCGTTCAATGGCTGATGAACACT-3′(SEQ ID NO：59))作为模板DNA，该单链DNA是以Drucher，D．J等(生物化学杂志，263，13475-13478，1988)确定的人胰高血糖素核苷酸序列为基础，通过有机合成法制备的；
(b)使用正向引物5’-CACAGCCAAGGTACTTTC-3’(SEQ IDNO：40)和反向引物5’-TTAAGTGTTCATCAGCCATTG-3’(SEQ IDNO：41)；和
(c)重复25个循环：94℃变性1分钟，50℃退火1分钟，72℃延长DNA链10秒；完成PCR反应。
按制造商的说明，用T4多核苷酸激酶(Nippon Gene)将平整末端DNA片段胰高血糖素进行磷酸化反应，由此得到磷酸化的DNA片段胰高血糖素。
(2)制备DNA片段V8-胰高血糖素
按照与实施例1(1)所述相同的方法，制备平整末端DNA片段V8-胰高血糖素，不同的是：
(a)用10ng本实施例(1)中得到的人胰高血糖素DNA为模板DNA；
(b)使用正向引物5’-TTCCTGGAACACAGCCAA-3’(SEQ IDNO：42)和反向引物5’-TTAAGTGTTCATCAGCCATTG-3’(SEQ IDNO：41)；和
(c)重复25个循环：94℃变性1分钟，50℃退火1分钟，72℃延长DNA链10秒；完成PCR反应。
按制造商的说明，用T4多核苷酸激酶(Nippon Gene)将平整末端DNA片段V8-胰高血糖素进行磷酸化反应，由此得到磷酸化的DNA片段V8-胰高血糖素。
(3)制备DNA片段MWPsp-MWPmp30
按照与实施例1(6)所述相同的方法，制备平整末端的融合DNA片段MWPsp-MWPmp30，不同的是，使用反向引物5’-TGCTACCAGGCCAAGAGCTT-3’(SEQ ID NO：43)。
(4)制备融合DNA MWPsp-MWPmp30-(His)6
按照与实施例1(6)所述相同的方法，制备平整末端的融合DNA片段MWPsp-MWPmp30-(His)6，不同的是，用DNA连接试剂盒(TakaraShuzo，CoLtd．)，在16℃，通过将本实施例(3)中所得的适量DNA片段MWPsp-MWPmp30与实施例1(2)中所得的适量DNA片段(His)6反应30分钟，制备用于第一PCR反应的模板DNA。
(5)制备融合DNA MWPsp-MWPmp20-、30-(His)6-接头
按照与实施例1(6)所述相同的方法，制备平整末端的融合DNAMWPsp-MWPmp20-、30-(His)6-接头，不同的是：(a)用DNA连接试剂盒(Takara Shuzo，CoLtd．)，在16℃，通过将实施例1(3)中所得的适量DNA片段接头分别与实施例6(7)和本实施例(4)中所得的适量融合DNA MWPsp-MWPmp20-(His)6和MWPsp-MWPmp30-(His)6反应30分钟，制备用于第一PCR反应的模板DNA；和(b)在第一PCR反应中使用反向引物5′-TCCAGAAGGTACTGGAGAACC-3′(SEQ IDNO：10)。
(6)制备分别掺入有融合DNA MWPsp-胰高血糖素和MWPsp-MWPmp10-、20-、30-(His)6-接头-V8-胰高血糖素的载体
按照与实施例1(8)所述相同的方法，制备分别掺入有融合DNAMWPsp-胰高血糖素和MWPsp-MWPmp10-、20-、30-(His)6-接头-V8-胰高血糖素的载体，不同的是：(a)用DNA连接试剂盒(Takara Shuzo，Co．，Ltd．)，在16℃，通过将实施例5(1)中所得的适量DNA片段MWPsp与本实施例(1)中所得的适量DNA片段胰高血糖素反应30分钟，制备用于MWPsp-胰高血糖素的第一PCR反应的模板DNA；并用DNA连接试剂盒(Takara Shuzo，CoLtd．)，在16℃，通过将本实施例(2)中所得的适量DNA片段V8-胰高血糖素分别与实施例1(7)和本实施例(5)中所得的适量融合DNA MWPsp-MWPmp10-(His)6-接头和MWPsp-MWPmp20-、30-(His)6-接头反应30分钟，制备用于MWPsp-MWPmp10-、20-、30-(His)6-接头-V8-胰高血糖素的第一PCR反应的模板DNA；和(b)将反向引物5’-TTAAGTGTTCATCAGCCATTG-3’(SEQID NO：41)用于第一PCR反应。
实施例8
融合DNA的表达／分泌和产物的选择性裂解
(1)融合产物的氨基酸序列和编码所述氨基酸序列的核苷酸序列
在实施例1-7中所得的融合产物中，在SEQ ID NOS：48-51、62-65和图1-4中分别列出了下列产物的核苷酸序列和氨基酸序列。
MWPsp-MWPmp10-(His)6-接头-Met-胰岛素原
(SEQ ID NO：48，62)
MWPsp-MWPmp10-Met-胰岛素原
(SEQ ID NO：49，63)
MWPsp-MWPmp20-(His)6-EGF-TEV-促生长素抑制素28
(SEQ ID NO：50，64)
MWPsp-MWPmp20-(His)6-接头-V8-胰高血糖素
(SEQ ID NO：51，65)
(2)融合产物的表达／分泌
表达由实施例1-7中所得的融合DNA编码的融合蛋白质。图5是一个代表性实例，是分别将上述4个融合DNA导入表达载体的方法。
具体地讲，用限制酶ApaLⅠ和HindⅢ(当相对于M13引物的方向，以正向插入融合DNA时)或ApaLⅠ和KpnⅠ(当相对于M13引物的方向，以反向插入融合DNA时)处理掺入了上述融合DNA的载体(pPINS-1、pPINS-2、pSTN、pGCN)。然后，将限制片段经0．8％琼脂糖凝胶电泳以分离出具有融合DNA的DNA片段。用DNA连接试剂盒(TakaraShuzo，CoLtd．)，在16℃，将由此所得的适量的各融合DNA与适量已用ApaLⅠ和HindⅢ(当相对于M13引物的方向，以正向插入融合DNA时)裂解的短芽孢杆菌表达载体pNU211R2L5(JP-A-5-304962和JP-A-7-170984)反应30分钟，由此，将各融合DNA导入表达载体。因此，得到分别掺入了各融合DNA的表达载体pNU-PINS-1、pNU-PINS-2、pNU-STN和pNU-GCN。按照已知方法(Methods in Enzymol217：23-33，1993)，用这些表达载体转化短芽孢杆菌菌株47-5Q(FERM BP-1664)，此后，使所得转化体在T2琼脂培养基[polypeptone(1％)，肉提取物(0．5％)，酵母提取物(0．2％)，尿嘧啶(0．1mg／ml)，葡萄糖(1％)，红霉素(10μg／ml)，琼脂(1．5％)，pH7]中生长。
在37℃，将各转化体在T2培养基(从T2培养基中除去琼脂)中培养1天。然后，按照已知方法(分子克隆第二版，实验室手册，冷泉港实验室(1989))，从各培养基中纯化质粒DNA，并用ApaLⅠ和HindⅢ(或KpnⅠ)处理，以确定融合DNA是否被导入了转化体。对于掺入了融合DNA的转化体，检测由掺入的融合DNA编码的融合蛋白质的表达／分泌。具体地讲，以1∶1000的体积比，将从T2培养基中得到的细胞悬浮液分别加至5YC培养基[polypeptone(3％)，酵母提取物(0．2％)，葡萄糖(3％)，CaCl2·2H2O(0．01％)，MgSO4·7H2O(0．01％)，FeSO4·7H2O(0．001％)，MnSO4·4H2O(0．001％)，ZnSO4·7H2O(0．0001％)，对羟苯基甘氨酸(0．3％)，红霉素(10μg／ml)，pH7]中，在30℃振荡培养4天。
在培养结束时，以15000rpm，将培养基离心2分钟以得到上清液，用于按已知方法(Laemmli，U．KNature，227，680-685，1970)电泳分析蛋白质。具体地讲，将18μl各上清液加至2μl缓冲液1[125 mM Tris-HCl(pH6．8)，20％甘油，4％SDS，10％2-巯基乙醇]中，煮沸5分钟，然后加至4μl缓冲液2[250mM Tris-HCl(pH6．5)，50％甘油，0．5％BPB]中。用市售15／25％SDS聚丙烯酰胺凝胶(Daiichi Chemicals，Co．LtdJapan)电泳所得的上清液(电泳缓冲液为：100mM Tris，100mM麦黄酮(Tricine)，0．1％SDS)，以便用考马斯蓝染色确定是否存在融合蛋白质的表达／分泌。
MWPsp-MWPmp6-、8-、9-、10-、11-、12-、15-、40-、50-、100-(His)6-接头-Met-胰岛素原的表达／分泌结果列于图6，作为外源多肽胰岛素原的代表。除MWPsp-MWPmp9-(His)6-接头-Met-胰岛素原(泳道5)外，所有融合产物均有表达／分泌。MWPsp-胰岛素原、MWPsp-MWPmp1-、2-、3-、4-、5-、6-、7-、8-、9-、10-、11-、12-、13-、14-、15-、17-、20-、50-Met-胰岛素原的表达／分泌结果列于图7。除MWPsp-胰岛素原(泳道3)和MWPsp-MWPmp9-Met-胰岛素原(泳道12)外，所有融合产物均有表达／分泌。对于MWPsp-MWPmp6-、8-、9-、10-、11-、12-、15-、17-、20-、50-Met-胰岛素原还观察到较高的表达／分泌水平。MWPsp-促生长素抑制素28、MWPsp-MWPmp10-(His)6-EGF-TEV-促生长素抑制素28、MWPsp-MWPmp10-(His)6-TEV-促生长素抑制素28和MWPsp-MWPmp20-(His)6-EGF-TEV-促生长素抑制素28的表达／分泌结果列于图8，作为外源多肽促生长素抑制素28的代表。未观察到MWPsp-促生长素抑制素28和MWPsp-MWPmp10-(His)6-TEV-促生长素抑制素28有表达／分泌，但是观察到MWPsp-MWPmp10-(His)6-EGF-TEV-促生长素抑制素28和MWPsp-MWPmp20-(His)6-EGF-TEV-促生长素抑制素28有表达／分泌。而且MWPsp-MWPmp20-(His)6-EGF-TEV-促生长素抑制素28的表达／分泌水平较高。MWPsp-胰高血糖素和MWPsp-MWPmp10-、20-、30-(His)6-接头-V8-胰高血糖素的表达／分泌结果列于图9，作为外源多肽胰高血糖素的代表。只观察到MWPsp-MWPmp20-(His)6-接头-V8-胰高血糖素有表达／分泌。
(3)鉴定胰岛素原
用胰岛素原C-肽的抗体免疫鉴定胰岛素原。以15000rpm将培养基离心2分钟以得到各培养基的上清液。然后，按上述将各1微升的上清液电泳，并按已知方法(Towbin，H．等，76，4350-4354，1979)电印迹到硝酸纤维素膜上。将该膜在溶于缓冲液3[20mM Tris-HCl(pH7．4)，150mM NaCl，0．1％Tween 20]的5％脱脂奶中浸1小时，然后，在振荡条件下，再浸在用缓冲液3以1∶2000稀释的兔抗-C-肽抗体(LINCORESEARCH)中，30分钟。在振荡条件下，用缓冲液3，将所述膜洗涤3次，每次10分钟，然后再在振荡条件下，浸在用缓冲液3以1∶2000稀释的以过氧化物酶标记的抗兔IgG抗体(E-Y实验室)中30分钟。浸渍完成后，将膜用缓冲液3振荡洗涤3次，每次10分钟，以便用ECL检测试剂盒(Amersham International plc)按照制造商的说明确定胰岛素原的存在与否。如图10和11所示，对于MWPsp-MWPmp6-、8-、10-、11-、12-、15-、40-、50-、100-(His)6-接头-Met-胰岛素原，检测到了表示胰岛素原存在的信号，但对于不含融合DNA的pNU211R2L5和MWPsp-MWPmp9-(His)6-接头-Met-胰岛素原，没有检测到信号。对于MWPsp-MWPmp1-、2-、3-、4-、5-、6-、7-、8-、10-、11-、12-、13-、14-、15-、17-、20-、50-Met-胰岛素原，检测到了表示胰岛素原存在的信号，但对于pNU211R2L5、MWPsp-胰岛素原和MWPsp-MWPmp9-胰岛素原，没有检测到信号。
(4)胰岛素原的裂解
在培养基中培养含有掺入了融合DNA MWPsp-MWPmp10-(His)6-接头-Met-胰岛素原的表达载体的转化体。将所得的培养基以20000rpm离心15分钟。向上清液中加入饱和度为30％的硫酸铵。将所得的上清液再以20000rpm离心20分钟以得到沉淀，将所得沉淀溶解于适量的2mM磷酸钠缓冲液(pH7)中，以相同的缓冲液进行透析。在透析结束时，将溶液的缓冲液用20mM磷酸钠(pH7)和150mM NaCl置换。将所得的溶液加到螯合柱(Pharmacia)上，并用含300mM咪唑的相同缓冲液洗脱以便将融合蛋白质与其它杂质蛋白质分离并得到纯化。将分离出的融合蛋白质用硫酸铵沉淀并按上述方法离心，收集沉淀。将颗粒沉淀溶解于2mM磷酸钠缓冲液(pH7)中以便用相同的缓冲液进行透析。
然后，将甲酸加到经透析的溶液中，达到70％的终浓度，向其中加入溴化氰，溴化氰的加入量与蛋白质的克数相等。将混合物在室温放置过夜，以便从融合蛋白质中化学裂解出胰岛素原。将所得溶液用2mM磷酸钠缓冲液(pH7)进行透析，然后加至螯合柱上，用含60mM咪唑的相同缓冲液洗脱胰岛素原。图12列出了将融合蛋白MWPmp10-(His)6-接头-Met-胰岛素原和胰岛素原在15／25％聚丙烯酰胺凝胶上电泳和考马斯蓝染色的结果，该融合蛋白已用螯合柱分离并纯化，但还未裂解，所述胰岛素原已用溴化氰裂解。图13表示用蛋白质电泳，然后用抗-C-肽抗体将电泳结果印迹在硝酸纤维素膜上来鉴定胰岛素原。对于融合蛋白证实了胰岛素原的存在。
(5)促生长素抑制素28的裂解
在培养基中培养含有掺入了融合DNA MWPsp-MWPmp20-(His)6-EGF-TEV-促生长素抑制素28的表达载体的转化体。将所得的培养基以20000rpm离心15分钟。向所得上清液中加入50％饱和度的硫酸铵。再将所得上清液以20000rpm离心20分钟，得到颗粒沉淀，将所述沉淀溶解于适量的2mM磷酸钠缓冲液(pH7)中，用相同的缓冲液进行透析。在透析结束时，用20mM磷酸钠缓冲液(pH7)和150mM NaCl置换溶液的缓冲液。将所得溶液加至螯合柱(Pharmacia)上，用含300mM咪唑的相同缓冲液洗脱，以便将融合蛋白质MWPmp20-(His)6-EGF-TEV-促生长素抑制素28与其它杂质蛋白分离并纯化。用TEV蛋白酶(GIBCO BRL，10U)按照制造商的说明，处理不同量的分离出的融合蛋白质(104，52和26微克)，以便从融合蛋白质中裂解出促生长素抑制素28。将用TEV蛋白酶处理的蛋白质以及未处理的蛋白质电泳，印迹在硝酸纤维素膜上，然后用兔抗促生长素抑制素抗体(MEDAC，稀释2000倍)和过氧化物酶标记的抗兔IgG抗体(E-Y实验室，稀释2000倍)检测。图14表示用TEV蛋白酶促裂解出促生长素抑制素28。
(6)胰高血糖素的裂解
在培养基中培养含有掺入了融合DNA MWPsp-MWPmp20-(His)6-接头-V8-胰高血糖素的表达载体的转化体。将所得的培养基以20000rpm离心15分钟。向所得上清液中加入50％饱和度的硫酸铵。再将所得上清液以20000rpm离心20分钟，得到颗粒沉淀，将所述沉淀溶解于适量的2mM磷酸钠缓冲液(pH7)中，用相同的缓冲液进行透析。在透析结束时，用20mM磷酸钠缓冲液(pH7)和150mM NaCl置换溶液的缓冲液。将所得溶液加至螯合柱(Pharmacia)上，用含300mM咪唑的相同缓冲液洗脱，以便将融合蛋白质MWPmp20-(His)6-接头-V8-胰高血糖素与其它杂质分离并纯化。用V8蛋白酶(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd2微克)的0．1M碳酸钠溶液处理不同量的分离出的融合蛋白质(90，45和22．5微克)，以便从融合蛋白质中裂解出胰高血糖素。将用V8蛋白酶处理的蛋白质以及未处理的蛋白质电泳，印迹在硝酸纤维素膜上，然后用兔抗胰高血糖素抗体(SANBIO，稀释2000倍)和过氧化物酶标记的抗兔IgG抗体(E-Y实验室，稀释2000倍)检测。图14表示用V8蛋白酶促裂解出了胰高血糖素。
(7)胰岛素原的氨基酸分析
通过氨基酸分析鉴定从融合蛋白质MWPmp10-(His)6-接头-Met-胰岛素原中裂解出的胰岛素原。具体地讲，分析按如下步骤完成：在在Hitachi氨基酸分析仪L-8500(Hitachi，Ltd．)上进行分析前，用溴化氰处理融合蛋白，然后用6N-HCl(含0．1％苯酚)于110℃水解已经用螯合柱分离纯化过的胰岛素原20小时。如下表所示，来自融合蛋白的胰岛素原的氨基酸组成与天然胰岛素原的理论氨基酸组成基本一致。
表1
氨基酸 理论值 测定值(nM) 氨基酸组成
A 4 3．374 4．80
R 4 2．977 4．24N+D 4 3．083 4．39
C 6 1．253 1．78Q+E 15 10．634 15．13
G 11 8．173 11．63
H 2 1．584 2．25
I 2 1．212 1．72
L 12 8．709 12．39
K 2 1．602 2．28
F 3 2．304 3．28
P 3 3．094 4．40
S 5 2．541 3．62
T 3 2．211 3．15
Y 4 2．805 3．99
V 5 4．178 5．95
85 59．734 85．00
(8)评估产量
以融合产物MWPsp-MWPmp10-(His)6-接头-Met-胰岛素原为例，用Western印迹评估其在培养基中分泌出的产量。将以15000rpm离心2分钟得到的1微升上清液和1微升胰岛素原(Sigma)分别进行3n-倍稀释，电泳，然后印迹到硝酸纤维素膜上以便比较用抗C肽抗体检测到的信号强度。如图16所示，3倍稀释的上清液的信号强度似乎与0．03微克至0．1微克的胰岛素原的相似。因此，推测出MWPmp10-(His)6-接头-Met-胰岛素原的产量为100至300mg／升。
实施例9构建掺入有融合DNA MWPsp-MWPmp20-TEV-G-GH的载体(pG-GH)
(1)制备DNA片段MWPsp-MWPmp20
按照与实施例4(1)所述相同的方法，制备平整末端的DNA片段MWPsp-MWPmp20，不同的是，重复30个循环：94℃变性1分钟，53℃退火1分钟，72℃延长DNA链1分钟；完成PCR反应。
(2)制备DNA片段TEV
根据遗传密码表(同上文)，化学合成编码氨基酸序列(AspTyrAspIleProThrThrGluAsnLeuTyrPheGln(SEQ ID NO：2)正向寡核苷酸5′-GACTATGATATCCCGACCACTGAAAACCTGTACTTCCAA-3′(SEQ ID NO：57)和反向寡核苷酸5′-TTGGAAGTACAGGTTTTCAGTGGTCGGGATATCATAGTC-3′(SEQ ID NO：58)，该氨基酸序列能够被TEV蛋白酶识别。然后，用T4多核苷酸激酶(Nippon Gene)，按照制造商的说明，将所述寡核苷酸磷酸化，在95℃，10mM Tris-HCl(pH8)和5mM MgCl2溶液中处理5分钟，然后在37℃退火15分钟。将退火的双链DNA片段TEV用苯酚处理，用乙醇沉淀，真空干燥，然后溶解于适量蒸馏水中。
(3)制备DNA片段人生长激素GH
按照与本实施例(1)所述相同的方法，制备平整末端的DNA片段GH，不同的是：
(a)用掺入有DNA片段GH的质粒载体作为模板DNA，用下列方法制备该载体：用第一链cDNA合成试剂盒(Pharmacia)，按照制造商的说明，从市售人垂体mRNA(Clonteeh)合成人垂体cDNA；以Roskam，W．G．等(核酸研究，7，305-320，1979)和Martial，J．A．等(科学，205，602-607，1979)确定的人生长激素基因的核苷酸序列为基础，合成正向引物5，-ATGGCTACAGGCTCCCGGAC-3’(SEQ ID NO：44)和反向引物5’-CTAGAAGCCACAGCTGCCCT-3’(SEQ ID NO：45)；用上述cDNA为模板并使用合成的寡核苷酸，重复35个循环：94℃处理1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟；完成PCR反应；然后将由此得到的PCR产物即人生长激素DNA克隆至pGEM-T载体(Promega)中；
(b)正向引物5’-TTCCCAACCATTCCCTTATC-3’(SEQ ID NO：46)和反向引物5’-CTAGAAGCCACAGCTGCCCT-3’(SEQ ID NO：45)；和
(c)重复25个循环：94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延长DNA链30秒；完成PCR反应。
(4)制备在N末端与Gly连接的突变体人生长激素(G-GH)的DNA片段
按照与本实施例(1)所述相同的方法，制备平整末端的DNA片段G-GH，不同的是：(a)用10ng本实施例(3)中所得的PCR产物GH为模板DNA；(b)使用正向引物5’-GGTTTCCCAACCATTCCCTTATC-3’(SEQ ID NO：47)和反向引物5’-CTAGAAGCCACAGCTGCCCT-3’(SEQ ID NO：45)；和(c)重复25个循环：94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延长DNA链30秒；完成PCR反应。
用T4多核苷酸激酶(Nippon Gene)，按制造商的说明，将平整末端的DNA片段G-GH进行磷酸化反应，由此得到磷酸化的DNA片段G-GH。
(5)制备融合DNA MWPsp-MWPmp20-TEV
按照与本实施例(1)所述相同的方法，制备平整末端的融合DNAMWPsp-MWPmp20-TEV，不同的是：(a)在16℃，用DNA连接试剂盒(Takara Shuzo，CoLtd．)，通过将本实施例(1)中得到的适量DNA片段MWPsp-MWPmp20与本实施例(2)中所得的适量DNA片段TEV反应30分钟，来制备用于第一PCR反应的模板DNA；(b)在第一PCR反应中使用反向引物5’-TTGGAAGTACAGGTTTTC-3’(SEQ ID NO：39)；和(c)重复25个循环：在94℃变性1分钟，45℃退火1分钟，72℃将DNA链延长30秒；完成PCR反应。
此后，用T4多核苷酸激酶(Nippon Gene)，按制造商的说明，将所得的PCR产物磷酸化。用DNA连接试剂盒(Takara Shuzo，CoLtd)，将磷酸化的PCR产物导入HincⅡ切割的载体(BlueScript SK-，Stratagene)中，以便按照已知方法(分子克隆第二版，实验室手册，冷泉港实验室(1989))转化大肠杆菌DH5α。从所述转化体中纯化质粒载体DNA。为了确认得到了融合DNA MWPsp-MWPmp20-TEV，用用于确定载体序列的正向或反向引物(即M13正向或反向引物)确定所述载体的核苷酸序列。按照与上述相同的方法，用掺入有MWPsp-MWPmp20-TEV的载体为模板DNA，使用正向引物5’-GTCGTTAACAGTGTATTGCT-3’(SEQ ID NO：6)和反向引物5’-TTGGAAGTACAGGTTTTC-3’(SEQ ID NO：39)完成第二PCR反应，由此制备平整末端的融合DNA MWPsp-MWPmp20-TEV。
(6)制备掺入有融合DNA MWPsp-MWPmp20-TEV-G-GH的载体
按照与本实施例(5)所述相同的方法，制备掺入有融合DNAMWPsp-MWPmp20-TEV-G-GH的载体，不同的是：(a)在16℃，用DNA连接试剂盒(Takara Shuzo，CoLtd．)，通过将本实施例(5)中得到的适量融合DNA片段MWPsp-MWPmp20-TEV与本实施例(4)中所得的适量DNA片段G-GH反应30分钟，来制备模板DNA；(b)用正向引物5’-GTCGTTAACAGTGTATTGCT-3’(SEQ ID NO：6)和反向引物5’-CTAGAAGCCACAGCTGCCCT-3’(SEQ ID NO：45)；和(c)重复25个循环：在94℃变性1分钟，53℃退火1分钟，72℃将DNA链延长1分钟；完成PCR反应。
实施例10
构建掺入有融合DNA MWPsp-GH的载体
(1)制备DNA片段MWPsp
按照与实施例1(1)所述相同的方法，制备平整末端的DNA片段MWPsp，不同的是：(a)使用反向引物5’-TGCGAAAGCCATTGGAGCAAC-3’(SEQ ID NO：34)；和(b)重复30个循环：在94℃变性1分钟，53℃退火1分钟，72℃将DNA链延长30秒；完成PCR反应。
(2)制备掺入有融合DNA MWPsp-GH的载体
按照与实施例9(5)所述相同的方法，制备掺入有融合DNAMWPsp-GH的载体，不同的是：(a)在16℃，用DNA连接试剂盒(TakaraShuzo，CoLtd．)，通过将本实施例(1)中得到的适量DNA片段MWPsp与实施例9(3)中所得的适量DNA片段GH反应30分钟，来制备模板DNA；(b)用正向引物5’-GTCGTTAACAGTGTATTGCT-3’(SEQ IDNO：6)和反向引物5’-CTAGAAGCCACAGCTGCCCT-3’(SEQ IDNO：45)；和(c)重复25个循环：在94℃变性1分钟，53℃退火1分钟，72℃将DNA链延长1分钟；完成PCR反应。
实施例11构建分别掺入有MWPsp-MWPmp1-、2-、3-、4-、5-、6-、7-、8-、9-、
10-、11-、12-、14-、30-TEV-G-GH的载体
(1)制备DNA片段MWPsp-MWPmp1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、30
按照与实施例9(1)所述相同的方法，制备平整末端的DNA片段MWPsp-MWPmp1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、30，不同的是：
(a)用下列引物作为反向引物：MWPmp1： 5′-TGCTGCGAAAGCCATTGG-3′ (SEQ ID NO：24)MWPmp2： 5′-TTCTGCTGCGAAAGCCAT-3′ (SEQ ID NO：25)MWPmp3： 5′-TTCTTCTGCTGCGAAAGC-3′ (SEQ ID NO：26)MWPmp4： 5′-TGCTTCTTCTGCTGCGAA-3′ (SEQ ID NO：27)MWPmp5： 5′-TGCTGCTTCTTCTGCTGC-3′ (SEQ ID NO：28)MWPmp6： 5′-AGTTGCTGCTTCTTCTGC-3′ (SEQ ID NO：14)MWPmp7： 5′-AGTAGTTGCTGCTTCTTC-3′ (SEQ ID NO：29)MWPmp8： 5′-TGTAGTAGTTGCTGCTTC-3′ (SEQ ID NO：15)MWPmp9： 5′-AGCTGTAGTAGTTGCTGC-3′ (SEQ ID NO：16)MWPmp10：5′-TGGAGCTGTAGTAGTTGCTGCTTCTTCTGC-3′
(SEQ ID NO：7)MWPmp11：5′-TTTTGGAGCTGTAGTAGT-3′ (SEQ ID NO：17)MWPmp12：5′-CATTTTTGGAGCTGTAGT-3′ (SEQ ID NO：18)MWPmp14：5′-AGCGTCCATTTTTGGAGC-3′ (SEQ ID NO：31)MWPmp30：5′-TGCTACCAGGCCAAGAGCTT-3′(SEQ ID NO：43)；
(b)重复30个循环：在94℃变性1分钟，53℃退火1分钟，72℃将DNA链延长30秒；完成PCR反应。
(2)制备DNA片段TEV-G-GH
按照与实施例9(1)所述相同的方法，制备平整末端的DNA片段TEV-G-GH，不同的是：(a)用10ng实施例9(6)中得到的掺入了融合DNA MWPsp-MWPmp20-TEV-G-GH的载体pG-GH为模板DNA；(b)使用正向引物5’-GACTATGATATCCCGACCACT-3’(SEQ ID NO：60)和反向引物5’-CTAGAAGCCACAGCTGCCCT-3’(SEQ ID NO：45)；和(c)重复25个循环：94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延长DNA链30秒；完成PCR反应。
用T4多核苷酸激酶(Nippon Gene)，按制造商的说明，将所得的平整末端的DNA片段TEV-G-GH磷酸化，由此得到磷酸化的DNA片段TEV-G-GH。
(3)制备分别掺入有MWPsp-MWPmp1-、2-、3-、4-、5-、6-、7-、8-、9-、10-、11-、12-、14-、30-TEV-G-GH的载体
按照与实施例9(5)所述相同的方法，制备分别掺入有MWPsp-MWPmp1-、2-、3-、4-、5-、6-、7-、8-、9-、10-、11-、12-、14-、30-TEV-G-GH的载体，不同的是：(a)在16℃，用DNA连接试剂盒(Takara Shuzo，CoLtd．)，通过将本实施例(1)中得到的适量DNA片段MWPsp-MWPmp1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、30与本实施例(2)中所得的适量DNA片段TEV-G-GH反应30分钟，来制备模板DNA；(b)使用正向引物5’-GTCGTTAACAGTGTATTGCT-3’(SEQ ID NO：6)和反向引物5’-CTAGAAGCCACAGCTGCCCT-3’(SEQ ID NO：45)；和(c)重复25个循环：94℃变性1分钟，53℃退火1分钟，72℃延长DNA链1分钟：完成PCR反应。
实施例12
融合蛋白质的表达／分泌和所述产物的选择性裂解
(1)融合产物的氨基酸序列和编码所述产物的核苷酸序列
就实施例9-11得到的融合产物，下列产物的核苷酸序列和氨基酸序列分别列于SEQ ID NOS：52、66和图17中。
MWPsp-MWPmp20-TEV-G-GH(SEQ ID NOS：52、66)
(2)融合产物的表达／分泌
表达由实施例9-11所得的融合DNA编码的融合蛋白质。图18举例说明，将MWPsp-MWPmp20-TEV-G-GH导入表达载体的方法。
具体地讲，用限制酶ApaLⅠ和HindⅢ(当相对于用于测序的M13引物的方向，以正向插入融合DNA时)或ApaLⅠ和KpnⅠ(当相对于用于测序的M13引物的方向，以反向插入融合DNA时)处理在实施例9-11中制得的掺入了上述融合DNA的载体。然后，将限制片段经0．8％琼脂糖凝胶电泳以分离出具有融合DNA的DNA片段。用DNA连接试剂盒(Takara Shuzo，CoLtd．)，在16℃，将由此所得的适量的各融合DNA与适量的已用ApaLⅠ和HindⅢ(或当相对于M13引物的方向，以反向插入融合DNA时，用KpnⅠ)裂解的短芽孢杆菌表达载体pNU211R2L5(JP-A-5-304962和JP-A-7-170984)反应30分钟，由此，将各融合DNA导入各自的表达载体。按照已知方法(Methods in Enzymol217：23-33，1993)，用这些表达载体转化短芽孢杆菌菌株47-5Q(FERMBP-1664，JP-A-60-58074和JP-A-62-201589)，此后，使所得转化体在各自的T2琼脂培养基[polypeptone(1％)，肉提取物(0．5％)，酵母提取物(0．2％)，尿嘧啶(0．1mg／ml)，葡萄糖(1％)，红霉素(10μg／ml)，琼脂(1．5％)，pH7]中生长。
在37℃，分别将转化体在T2培养基(从T2培养基中除去琼脂)中培养1天。然后，按照已知方法(分子克隆第二版，实验室手册，冷泉港实验室(1989))，从各F培养基中纯化质粒DNA，并用ApaLⅠ和HindⅢ(或KpnⅠ)处理，以确定融合DNA是否被导入了转化体。对于掺入了融合DNA的转化体，检测由掺入的融合DNA编码的融合蛋白质的表达／分泌。具体地讲，以1∶1000的体积比，将从T2培养基中得到的细胞悬浮液分别加至培养基[polypeptone(3％)，酵母提取物(0．4％)，葡萄糖(3％)，MgSO4·7H2O(0．01％)，MnSO4·4H2O(0．001％)，红霉素(10μg／ml)，pH8]中，在30℃在试管(2ml／20ml试管)或Erlenmeyer烧瓶(50ml／500ml)中振荡培养4天。
在培养结束时，以15000rpm，将培养基离心2分钟以得到上清液，用于按已知方法(Laemmli，U．KNature，227，680-685，1970)电泳分析蛋白质。具体地讲，将18μl各上清液加至2μl缓冲液1[125 mMTris-HCl(pH6．8)，20％甘油，4％SDS，10％2-巯基乙醇]中，煮沸5分钟，然后加至4μl缓冲液2[250mM Tris-HCl(pH6．5)，50％甘油，0．5％BPB]中。用市售15／25％SDS聚丙烯酰胺凝胶(Daiichi Chemicals，Co．LtdJapan)电泳所得的上清液(电泳缓冲液为：100mM Tris，100mM麦黄酮(Tricine)，0．1％SDS)，以便用考马斯蓝染色确定是否存在融合蛋白质的表达／分泌。
图19显示了下列融合蛋白表达／分泌的结果：其中MWP信号肽正好在人生长激素前的MWPsp-GH；其中MWP信号肽正好在融合产物TEV-G-GH(即TEV蛋白酶的识别序列和突变体人生长激素G-GH的组合)前的MWPsp-TEV-G-GH；其中MWP信号肽通过来自MWP蛋白质N末端的至少一个氨基酸残基与融合产物TEV-G-GH相连的MWPsp-MWPmp1-、2-、3-、4-、5-、6-、7-、8-、9-、10-、11-、12-、14-、30-TEV-G-GH蛋白质。MWPsp-GH的电泳图与不含外源多肽基因的载体pNU211R2L5的表达产物的电泳图相似。因此，MWPsp-GH没有一个对应于生长激素的清晰的带。另一方面，对于MWPsp-TEV-G-GH和MWPsp-MWPmp1-、2-、3-、4-、5-、6-、7-、8-、9-、10-、11-、12-、14-、30-TEV-G-GH蛋白质来说，观察到了融合蛋白的表达／分泌(图19中箭头所指明的)。与MWPsp-MWPmp1-TEV-G-GH相比，MWPsp-MWPmp1-、2-、3-、4-、5-、6-、7-、8-、9-、10-、11-、12-、14-、20-、30-TEV-G-GH蛋白质的表达水平更高。
(3)鉴定人生长激素GH和突变体人生长激素G-GH
用人生长激素抗体免疫鉴定人生长激素和突变体人生长激素(Western印迹法)。将本实施例(2)中所得的各转化体的培养基以15000rpm离心2分钟，以得到各培养基的上清液。按本实施例(2)所述，将各1微升的上清液电泳，然后按照已知方法(Towbin，H．等76，4350-4354，1979)将其电印迹到硝酸纤维素膜上。将该膜在溶于缓冲液3[20mM Tris-HCl(pH7．4)，150mM NaCl，0．1％Tween 20]的5％脱脂奶中浸15分钟，然后，在振荡条件下，再浸在用缓冲液3以1∶2000稀释的兔抗人生长激素抗体(Biostride，Inc．)中30分钟。在振荡条件下，用缓冲液3，将所述膜洗涤3次，每次10分钟，然后浸在用缓冲液3以1∶2000稀释的以过氧化物酶标记的抗兔IgG抗体(E-Y实验室)中30分钟。浸渍完成后，将膜用缓冲液3洗涤3次，每次10分钟，同时振荡，以便用ECL检测试剂盒(Amersham International plc)按照制造商的说明确定GH的存在。如图20所示，所有融合蛋白即MWPsp-GH、MWPsp-TEV-G-GH、MWPsp-MWPmp1-、2-、3-、4-、5-、6-、7-、8-、9-、10-、11-、12-、14-、30-TEV-G-GH，均检测到了信号，但对于不含外源多肽基因的pNU211R2L5，没有检测到信号。对于信号肽正好位于人生长激素前的MWPsp-GH，用考马斯蓝染色和SDS-PAGE没有检测到对应于人生长激素的带，其中，在SDS-PAGE中用Western印迹法检测信号。考虑到Western印迹法比考马斯蓝染色敏感得多，当MWP信号肽位于人生长激素前时，MWPsp-GH能够表达／分泌，但其表达水平低。
(4)突变体人生长激素的裂解
在培养基中将含有掺入了融合DNA MWPsp-MWPmp20-TEV-G-GH的表达载体的转化体培养过夜。将培养基悬浮液(体积比为1∶1000)加至10个500毫升Erlenmeyer烧瓶中，每个烧瓶各含50毫升用于在实施例4(2)中表达的相同培养基，在30℃培养4天。在4℃，将所得的各培养基以10000rpm离心20分钟。加入EDTA，达到5mM的终浓度，加入硫酸铵达到60％的饱和度，以进行沉淀。再次以10000rpm离心20分钟后，将颗粒沉淀溶解于适量Tris-HCl缓冲液(20mMTris-HCl，1mM EDTA，pH8)中，然后加到Sephadex G-25(Pharmacia)柱上，进行缓冲液交换。将所得溶液加到并吸附到已用缓冲液A[20mMTris-HCl，1mM EDTA，1M脲，20％丙醇，pH8]平衡过的阴离子交换树脂(Pharmacia，QXL)柱上，再用缓冲液B(缓冲液A+1M NaCl)进行梯度洗脱。将以220-300mM NaCl洗脱下来的抗人生长激素抗体阳性级分用Ultrafree(Millipore CorpUFV2BCC40)浓缩，同时用缓冲液C(0．1％TFA，10％乙腈)替换，然后加到RPC柱(Pharmacia)上，进行反相色谱。随后用缓冲液D[0．1％TFA，60％乙腈]进行梯度洗脱的结果是，靶融合蛋白MWPmp20-TEV-G-GH被45-50％的乙腈洗脱了下来。将由此得到的融合蛋白用2mM Tris-HCl(pH8)透析，然后用TEV蛋白酶处理。按照制造商的说明，用TEV蛋白酶(GIBCO BRL，5U)处理5微克融合蛋白，以裂解出突变体人生长激素G-GH。图21和22是分别表示裂解结果的SDS-PAGE和Western印迹图。按照与本实施例(2)和(3)所述相同的方法完成SDS-PAGE和Western印迹。就图21和22而言，在与市售人生长激素(阳性对照)相同的位置(箭头标明的)上，裂解出了在N末端带有额外Gly的突变体人生长激素G-GH。
还可按照与本实施例相同的方法，表达其它多肽hNGF，mLIF，bSCF和hPDGF-B。当来自MWP N末端的氨基酸数目为10、40或100时，观察不到分泌作用。这表明通过与来自MWP N末端的至少一个氨基酸的融合而引起的分泌作用的机会依赖于所用外源多肽的类型。
通过与外源蛋白质的新融合，本发明能够进行高水平的表达／分泌，还可通过化学或酶促选择性裂解生产天然蛋白质。
本文所引用的所有文献包括专利申请均全文引入本文作为参考。
下列是本文所述的SEQ ID NOS：48-52，62-66的序列资料：SEQ ID NO：48：gtcgttaaca gtgtattggc tagtgcactc gcacttactg ttgctccaat ggctttcgca 60gcagaagaag cagcaactac tacagctcca catcatcatc atcatcacgg ttctccagta 120ccttctggaa tgtttgtgaa ccaacacctg tgcggctcac acctggtgga agctctctac 180ctagtgtgcg gggaaagagg cttcttctac acacccaaga cccgccggga ggcagaggac 240ctgcaggtgg ggcaggtgga gctgggcggg ggccctggtg caggcagcct gcagcccttg 300gccctggagg ggtccctgca gaagcgtggc attgtggaac aatgctgtac cagcatctgc 360tccctctacc agctggagaa ctactgcaac 390SEQ ID NO：49：gtcgttaaca gtgtattggc tagtgcactc gcacttactg ttgctccaat ggctttcgca 60gcagaagaag cagcaactac tacagctcca atgtttgtga accaacacct gtgcggctca 120cacctggtgg aagctctcta cctagtgtgc ggggaaagag gcttcttcta cacacccaag 180acccgccggg aggcagagga cctgcaggtg gggcaggtgg agctgggcgg gggccctggt 240gcaggcagcc tgcagccctt ggccctggag gggtccctgc agaagcgtgg cattgtggaa 300caatgctgta ccagcatctg ctccctctac cagctggaga actactgcaa c 351SEQ ID NO：50：gtcgttaaca gtgtattggc tagtgcactc gcacttactg ttgctccaat ggctttcgca 60gcagaagaag cagcaactac tacagctcca aaaatggacg ctgatatgga aaaaaccgta 120catcatcatc atcatcacaa ctctgactcc gaatgcccgc tgtctcacga cggttattgc 180ctgcatgatg gtgtttgtat gtatatcgaa gctctggaca aatatgcttg caactgtgtt 240gttggttaca tcggtgagcg ttgccagtat cgcgacctga aatggtggga actgcgtgac 300tatgatatcc cgaccactga aaacctgtac ttccaatctg ctaactcaaa cccggctatg 360gcaccccgag aacgcaaagc tggctgcaag aatttcttct ggaagacttt cacatcctgt 420SEQ ID NO：51：gtcgttaaca gtgtattggc tagtgcactc gcacttactg ttgctccaat ggctttcgca 60gcagaagaag cagcaactac tacagctcca aaaatggacg ctgatatgga aaaaaccgta 120catcatcatc atcatcacgg ttctccagta ccttctggat tcctggaaca cagccaaggt 180actttcacat ccgactactc taaatatctg gattcccgtc gcgctcaaga tttcgttcaa 240tggctgatga acact 255SEQ ID NO：52：gtcgttaaca gtgtattggc tagtgcactc gcacttactg ttgctccaat ggctttcgca 60gcagaagaag cagcaactac tacagctcca aaaatggacg ctgatatgga aaaaaccgta 120gactatgata tcccgaccac tgaaaacctg tacttccaag gtttcccaac cattccctta 180tccaggcttt ttgacaacgc tatgctccgc gcccatcgtc tgcaccagct ggcctttgac 240acctaccagg agtttgaaga agcctatatc ccaaaggaac agaagtattc attcctgcag 300aacccccaga cctccctctg tttctcagag tctattccga caccctccaa cagggaggaa 360acacaacaga aatccaacct agagctgctc cgcatctccc tgctgctcat ccagtcgtgg 420ctggagcccg tgcagttcct caggagtgtc ttcgccaaca gcctggtgta cggcgcctct 480gacagcaacg tctatgacct cctaaaggac ctagaggaag gcatccaaac gctgatgggg 540aggctggaag atggcagccc ccggactggg cagatcttca agcagaccta cagcaagttc 600gacacaaact cacacaacga tgacgcacta ctcaagaact acgggctgct ctactgcttc 660aggaaggaca tggacaaggt cgagacattc ctgcgcatcg tgcagtgccg ctctgtggag 720ggcagctgtg gcttc 735SEQ NO ID：62：Val Val Asn Ser Val Leu Ala Ser Ala Leu Ala Leu Thr Val Ala Pro
1 5 10 15Met Ala Phe Ala Ala Glu Glu Ala Ala Thr Thr Thr Ala Pro His His
20 25 30His His His His Gly Ser Pro Val Pro Ser Gly Met Phe Val Asn Gln
35 40 45His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly
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115 120 125Cys Asn
130SEQ ID NO：63：Val Val Asn Ser Val Leu Ala Ser Ala Leu Ala Leu Thr Val Ala Pro1 5 10 15Met Ala Phe Ala Ala Glu Glu Ala Ala Thr Thr Thr Ala Pro Met Phe
20 25 30Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu
35 40 45Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu
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115SEQ ID NO：64：Val Val Asn Ser Val Leu Ala Ser Ala Leu Ala Leu Thr Val Ala Pro1 5 10 15Met Ala Phe Ala Ala Glu Glu Ala Ala Thr Thr Thr Ala Pro Lys Met
20 25 30Asp Ala Asp Met Glu Lys Thr Val His His His His His His Asn Ser
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130 135 140SEQ ID NO：65：Val Val Asn Ser Val Leu Ala Ser Ala Leu Ala Leu Thr Val Ala Pro1 5 10 15Met Ala Phe Ala Ala Glu Glu Ala Ala Thr Thr Thr Ala Pro Lys Met
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85SEQ ID NO：66：Val Val Asn Ser Val Leu Ala Ser Ala Leu Ala Leu Thr Val Ala Pro1 5 10 15Met Ala Phe Ala Ala Glu Glu Ala Ala Thr Thr Thr Ala Pro Lys Met
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210 215 220Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu225 230 235 240Gly Ser Cys Gly Phe
245
Claims (28)
1．一种包含编码融合蛋白的核苷酸序列的DNA，其中所述的融合蛋白包括：由芽孢杆菌的细胞壁蛋白N末端的一个或多个氨基酸残基组成的序列、由用于化学或酶促裂解的一个或多个氨基酸残基组成的序列、和外源多肽序列；所述的这些序列彼此按序线性连接，并且其中所述的核苷酸序列与包含芽孢杆菌启动子区的核酸序列的3’-末端相连。
2．权利要求1所述的DNA，其中所述的融合蛋白在其N末端还包含芽孢杆菌细胞壁蛋白的信号肽序列。
3．权利要求1或2所述的DNA，其中所述的融合蛋白还包含由被用作分离及纯化用的标记的氨基酸残基组成的序列。
4．权利要求1至3中任一项所述的DNA，其中所述的融合蛋白还包含由被用作接头的氨基酸残基组成的序列。
5．权利要求1至4中任一项所述的DNA，其中所述的芽孢杆菌是短芽孢杆菌。
6．权利要求1至5中任一项所述的DNA，其中所述的由用于化学裂解的氨基酸残基组成的序列是甲硫氨酸。
7．权利要求1至5中任一项所述的DNA，其中所述的由用于酶促裂解的氨基酸残基组成的序列包含能被蛋白酶促裂解的序列。
8．权利要求1所述的DNA，其中所述的融合蛋白包含：由源自MWP蛋白N末端的一个或多个氨基酸残基组成的序列、由6个组氨酸残基组成的用作分离及纯化用的标记的序列、作为接头的氨基酸序列Gly Ser Pro Val Pro Ser Gly、用于将目的多肽化学裂解出来所需的甲硫氨酸残基、和在其氨基酸序列中不含甲硫氨酸的多肽序列，其中所述的MWP蛋白是细胞壁蛋白的一种；所述的这些序列彼此按序线性连接。
9．权利要求8所述的DNA，其中所述的融合蛋白在其N末端还包含MWP信号肽序列。
10．权利要求8或9所述的DNA，其中所述的多肽是人胰岛素原。
11．权利要求8至10中任一项所述的DNA，其中所述由源自MWP蛋白N末端的一个或多个氨基酸残基组成的序列包含6、7、8、10、ll、12、13、14、15、17、20或50个氨基酸。
12．权利要求1所述的DNA，其中所述的融合蛋白包含：由源自MWP蛋白N末端的10个或20个氨基酸残基组成的序列、由6个组氨酸残基组成的用作分离及纯化用的标记的序列、作为接头的人表皮生长因子序列、用TEV蛋白酶将目的多肽裂解出来所需的氨基酸序列Asp Tyr Asp Ile Pro Thr Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln、和在其氨基酸序列中不含TEV蛋白酶识别序列但在其N末端具有甘氨酸或丝氨酸的多肽序列，其中所述的MWP蛋白是细胞壁蛋白的一种；所述的这些序列彼此按序线性连接。
13．权利要求12所述的DNA，其中所述的融合蛋白在其N末端还包含MWP信号肽序列。
14．权利要求12或13所述的DNA，其中所述的多肽是人促生长素抑制素28。
15．权利要求1的DNA，其中所述的融合蛋白包含：由源自MWP蛋白N末端的20个氨基酸残基组成的序列、由6个组氨酸残基组成的用作分离及纯化用的标记的序列、作为接头的氨基酸序列Gly Ser ProVal Pro Ser Gly、用V8蛋白酶将目的多肽裂解出来所需的氨基酸序列Phe Leu Glu、和在其氨基酸序列中不含谷氨酸的多肽序列，其中所述的MWP蛋白是细胞壁蛋白的一种；所述的这些序列彼此按序线性连接。
16．权利要求15所述的DNA，其中所述的融合蛋白在其N末端还包含MWP信号肽序列。
17．权利要求15或16所述的DNA，其中所述的多肽是人胰高血糖素。
18．一种包含编码融合蛋白的核苷酸序列的DNA，其中所述的融合蛋白包括：芽孢杆菌的细胞壁蛋白信号肽序列、由用于酶促裂解的氨基酸残基组成的序列、和外源多肽序列；所述的这些序列彼此按序线性连接，并且其中所述的核苷酸序列与包含芽孢杆菌启动子区的核酸序列的3’-末端相连。
19．权利要求18的DNA，其中紧跟所述信号肽序列的是由源自细胞壁蛋白N末端的一个或多个氨基酸残基组成的序列。
20．权利要求18或19所述的DNA，其中所述的芽孢杆菌是短芽孢杆菌。
21．权利要求18至20中任一项所述的DNA，其中所述的由用于酶促裂解的氨基酸残基组成的序列包含能被蛋白酶促裂解的序列。
22．权利要求18所述的DNA，其中所述的融合蛋白包含：MWP的信号肽序列、用TEV蛋白酶将目的多肽裂解出来所需的氨基酸序列Asp Tyr Asp Ile Pro Thr Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln、和在其氨基酸序列中不含TEV蛋白酶识别序列的多肽序列，其中所述的MWP蛋白是细胞壁蛋白的一种；所述的这些序列彼此按序线性连接。
23．权利要求22所述的DNA，其中紧跟所述信号肽序列的是由源自MWP蛋白N末端的一个或多个氨基酸残基组成的序列。
24．权利要求22或23所述的DNA，其中所述的多肽是在其N末端有甘氨酸或丝氨酸的突变体人生长激素。
25．包含根据权利要求1至24中任一项所述的DNA的载体。
26．由权利要求25所述的载体转化的属于芽孢杆菌属的细菌。
27．权利要求26所述的细菌，它是短芽孢杆菌。
28．一种制备重组多肽的方法，包括：在培养基中培养权利要求26所述的细菌，以在该细菌的细胞外使包含外源多肽的融合蛋白积聚；从培养基中分离出融合蛋白；从所分离出的融合蛋白中将所述外源多肽裂解出来；和收集所述的多肽。
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