CN1287796C - 表没食子儿茶素没食子酸酯和叶酸的组合物及其在制备药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)与叶酸(FA)的组合物及其在抗消化道肿瘤中的应用，其中，EGCG和FA最佳效果的质量配比范围为100∶1～1∶4之间，优选50∶1～1∶3。所述组合物在该含量范围内对胃癌细胞的杀伤作用较单独用EGCG和FA的效果有明显提高，表明EGCG和FA二者存在协同作用。

Description

表没食子儿茶素没食子酸酯和叶酸的组合物 及其在制备药物中的应用

技术领域

本发明涉及含有表没食子儿茶素没食子酸酯的组合物及其用于抗消化道肿瘤，尤其是指表没食子儿茶素没食子酸酯与叶酸的组合物及其在抗消化道肿瘤中的应用。

背景技术

茶是世界上饮用最广泛的三大饮料之一，茶叶的主要成份-茶多酚(teapolyphenols)具有抗肿瘤作用，其由几种结构相似的多酚类化合物组成，包括：表没食子儿茶素没食子酸酯[(-)-epigallocatechin-3-gallate，EGCG]、表没食子儿茶素[(-)-epigallocatechin，EGC]、表儿茶素没食子酸酯[(-)-epicatechin-3-gallate，ECG]和表儿茶素[(-)-epicatechin，EC]等。在这几种单体中，EGCG的含量最丰富，应用价值最大，几种成分肿瘤抑制效应的强弱依次为：EGCG＝EGC＞ECG＞EC。作为其中活性最强者，EGCG的分子量为458.4，其对皮肤癌、肺癌、胃癌、结肠癌的发生均有抑制作用，还有研究证明其对人前列腺癌、乳腺癌细胞的生长也有抑制作用。

目前普遍认为茶多酚的药理作用主要表现为：1.茶多酚是一种抗氧化剂，可以结合金属离子、捕获活性氧产物，降低它们对于细胞脂膜、蛋白质和核酸的损害作用，从而表现出多种生物活性；2.茶多酚可以通过多种机制抑制肿瘤细胞生长，其中：a.EGCG可诱导PC-9、H661、KATO III、DU 145、A431、HaCat和Molt-43等细胞株产生细胞凋亡或充当一种前氧化物，通过产生H₂O₂来引起凋亡；b.EGCG还可以通过其他途径例如诱导细胞周期停滞、抑制导致重要转录因子激活物蛋白1(AP-1)和核转录因子_κB(NF-_κB)激活的信号传导通路来抑制肿瘤细胞生长；c.茶多酚还可以抑制肿瘤启动相关酶类，如TPA-相关表皮源性鸟氨酸脱羧酶、蛋白激酶C、脂氧化酶和环氧化酶等。大量实验也证实EGCG可引起多种肿瘤细胞生长抑制、S期减少、G₀-G₁期阻滞，但是这种生长抑制作用是否是通过凋亡途径实现的，还需要进一步研究证明。3.茶多酚有灭活致癌物、抗病毒以及提高免疫系统功能等作用；4.茶多酚类物质在许多研究中被证实可抑制生长相关信号传导通路；5.茶多酚(尤其是EGCG)能通过抑制内皮细胞的生长来阻止新生血管形成。

茶多酚中的EGCG对细胞周期分布的影响在不同的肿瘤细胞株中有所不同，研究表明在大多数肿瘤细胞株中，包括：HepG2、LNCaP、DU145、LoVo、A431和MCF-7等，EGCG可通过诱导细胞周期阻滞在G1期而发挥其抑制肿瘤细胞生长的作用；在LNCaP和DU145细胞中，其机制可能与使p21、p27、p16和p18表达上调以及使细胞周期蛋白(cyclin)D1、cyclinE、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)2、CDK4和CDK6表达下调相关；在少数细胞株，如T47D(人乳腺癌细胞株)和PC-9(人肺癌细胞株)细胞中，EGCG可诱导细胞阻滞在G2期，且该阻滞作用与剂量相关。

最近有文献报道，EGCG对HL-60和MKN45细胞的细胞周期分布无明显影响，但能够下调胃癌细胞株MKN45端粒酶的活性。所述的端粒酶是一种能够催化延长端粒末端的核糖核蛋白(RNP)，由RNA和相关蛋白组成，它能够以自身携带的RNA为模板，逆转录合成端粒DNA并添加于染色体末端，从而维持了端粒长度的稳定。端粒酶逆转录酶(hTERT)是合成端粒重复序列的主要成分，hTERT的活性决定了端粒酶的活性。已知85％的人肿瘤组织有端粒酶活性表达，而与肿瘤相邻的正常组织或良性病变的端粒酶的活性表达率仅为4％左右，因此，抑制端粒酶活性对肿瘤的治疗而言是一个很有意义的方法。

有研究证明EGCG能够下调胃癌细胞株MKN45端粒酶的活性可能是通过以下途径实现的：首先，EGCG可以抑制AP-1和NF-_κB转录因子依赖性信号传导通路，在端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子上游序列中，存在AP-1和NF-_κB的结合位点，hTERT的转录需要AP-1和NF-_κB转录因子依赖性信号传导通路来实现；其次，茶多酚对肿瘤启动相关酶类的抑制也可以间接抑制端粒酶活性，可见EGCG下调端粒酶逆转录酶活性是其抗肿瘤作用的重要机制。

叶酸(也称蝶酰谷氨酸)是一种水溶性维生素，可由微生物和植物合成，广泛分布于食物中。有研究发现，叶酸缺乏可影响DNA修复，增强尿嘧啶错误插入水平，导致特定基因的甲基化程度降低，影响细胞的凋亡等，改善叶酸缺乏状况可以通过抑制粘膜增生而起到预防肿瘤作用，叶酸浓度与细胞凋亡的关系目前尚不甚明确；研究还发现，HepG2细胞株(人肝脏细胞瘤)在叶酸缺乏的实验组中出现细胞生长抑制、细胞死亡率增加和凋亡等现象，同时，细胞周期被阻逆于S，G2/M期，平衡蛋白含量增加，此过程不依赖于P53的表达。与此相似，中国仓鼠卵巢和脊髓细胞生活于缺乏叶酸的培养液中改变了核苷酸池，出现生长停滞、凋亡和突变；对于低分化胃癌细胞株MKN-45和高分化胃癌细胞株MKN-28，未加叶酸干预者两种细胞系的凋亡指数均低于5％；低浓度叶酸可诱导MKN-45细胞凋亡，高浓度者使MKN-28凋亡率增加。可以看出，叶酸干预可影响胃癌细胞凋亡的发生。从流行病学、动物和人体实验研究的证据来看，叶酸缺乏增加肿瘤的发生率，大剂量的叶酸能降低胃癌发生的危险性。

前期研究证实：EGCG对于不同的胃肠道肿瘤细胞株具有不同程度的、呈剂量依赖的杀伤作用，而且端粒酶是其作用的重要靶位点，研究又显示叶酸缺乏可增加肿瘤的发生率，影响肿瘤的凋亡。EGCG可引起多种肿瘤细胞生长抑制是公知的，该抑制作用与剂量成正比，其单独施用时只有依赖大幅度增加剂量才能对某些肿瘤细胞达到预期的抑制和杀伤效果，这无疑给施用者带来极大的困扰和不便，因此，研究EGCG与其他具有抑瘤作用的成分，例如叶酸，在杀伤胃癌细胞方面是否具有协同作用，可以为凭借其协同作用而联合用药应用于胃癌的预防和治疗奠定理论基础。

发明内容

本发明人经过大量的筛选和实验，通过将EGCG与叶酸以一定的配比组成组合物，联合应用于抑制肿瘤细胞的生长中，实验证明EGCG与叶酸联用所产生协同作用的效果优于单独使用EGCG。

本发明提供了一种含有EGCG和叶酸的组合物，该组合物在抑制肿瘤细胞，尤其是抑制消化道肿瘤细胞方面，显示优于单独应用EGCG的效果。

本发明还提供了一种含有EGCG和叶酸的组合物在抑制肿瘤细胞，尤其是杀伤消化道肿瘤细胞方面的药物的应用。

本发明提供了一种药物组合物，该组合物含有EGCG和叶酸，所述EGCG和FA的质量配比范围为100∶1～1∶4，优选比例为50∶1～1∶3，更优选10∶1～1∶3。

根据药效学研究的结果，该组合物通过EGCG与FA的特定组合，对肿瘤细胞株的协同杀伤作用远远优于单独使用EGCG所达到的的效果。

上述组合物中EGCG所占的比例较大时，即只有少量FA存在于组合物中，例如EGCG与FA的含量比例约为100∶1～10∶1，该组合物主要的临床表现为用于预防肿瘤的发生，在此基础上增加FA的含量，利用叶酸干预来影响胃癌细胞凋亡的发生的机制，增加癌症细胞的凋亡率，可以达到抑制(预防和治疗)肿瘤的效果，例如，EGCG和FA的配比为10∶1～1∶3，该组合物临床表现为杀伤肿瘤细胞株，以此来治疗肿瘤，所述的肿瘤细胞尤其是指胃癌细胞，例如SGC7901、MKN45和MKN28细胞。

在本发明的优选实施方式中，该组合物还可含有任何药学可接受的辅料，并且采用药学常规工艺，制成药剂学可接受的任何剂型，包括口服剂型和注射剂型，例如口服液、片剂、胶囊剂、注射液或冻干粉针等。

利用本发明所述的组合物，制成任何剂型的药物，均可用于预防肿瘤的发生，或抑制消化道肿瘤细胞，尤其是对胃癌细胞有较强的杀伤作用。

实验显示，将上述组合物用于杀伤胃癌细胞，如SGC7901、MKN45和MKN28细胞株，其效果优于单用EGCG，对上述3株细胞的半数抑制浓度(IC₅₀)较EGCG相比分别降低约51.9％、28.4％和40％(见表1)。

EGCG浓度为：0、20、40、60、80、100、120、140和160μmol/L，共9种浓度；FA浓度为：0、5、20和40μg/ml，共4种浓度。二者合用(4种浓度的FA和9种浓度的EGCG搭配)，得到剂量-效应曲线，求出其半数抑制浓度(IC50)。

如表1所示，对照组EGCG对三种细胞SGC7901、MKN45、MKN28的IC50(μmol/l)分别为：79.1、55.9、119.8；当以20μg/ml的FA与EGCG(9种浓度的)合用时三种细胞的IC50(μmol/l)分别下降为：38.05、40.02、71.88，此时换算为FA与EGCG浓度比分别约为：1∶1(SGC7901)、1∶1(MKN45)、3∶2(MKN28)。

表1.EGCG联合FA和对照组EGCG对3株胃癌细胞的杀伤作用的IC₅₀

	SGC7901	MKN45	MKN28
				EGCG联合FA的IC50(μmol/l)	38.05	40.02	71.88
对照组EGCG的IC50(μmol/l)	79.1	55.9	119.8

附图说明

图1：EGCG对hTERT及其上游基因表达的影响；其中M：标记DNA；

1：对照组；

2、3、4：EGCG 20μmol/L组24h、48h、72h；

5、6、7：EGCG 40μmol/L组24h、48h、72h；

8、9、10：EGCG 60μmol/L组24h、48h、72h；

图2：EGCG联合FA对MKN45细胞株的剂量-效应曲线；

图3：EGCG联合FA对SGC7901细胞株的剂量-效应曲线；

图4：EGCG联合FA对MKN28细胞株的剂量-效应曲线；

图5：FA对MKN45细胞株的剂量-效应曲线；

图6：实施例1的不同质量比的EGCG和FA对胃癌细胞的杀伤作用；其中横坐标1-8点分别代表EGCG和FA的比为0、1∶1、1∶3、1∶4、5∶1、10∶1、50∶1、100∶1。

具体实施方式

实施例1：不同质量比的EGCG和FA对胃癌细胞的杀伤作用

所选EGCG和FA的质量比为(即图6中横坐标1-8点所代表的EGCG和FA的比值)：0、1∶1、1∶3、1∶4、5∶1、10∶1、50∶1、100∶1。

具体的EGCG和FA的浓度如下：

0；5mg/L和5mg/L；5mg/L和15mg/L；5mg/L和20mg/L；25mg/L和5mg/L；50mg/L和5mg/L；250mg/L和5mg/L；500mg/L和5mg/L。

对胃癌细胞的杀伤作用的实验结果见图6。

实施例2：EGCG联合FA杀伤胃癌细胞的实验研究

一、材料及细胞培养

人胃癌细胞株SGC7901购自中科院上海细胞生物学研究所，MKN45细胞、MKN28细胞为上海消化疾病研究所细胞室保存。EGCG单体购自中国农科院茶叶研究所，纯度99％。FA购自华美生物工程公司。肿瘤细胞培养的培养基为含10％胎牛血清的RPMI-1640(Gibco BRL)完全培养液，细胞置于含5％CO₂、95％空气的CO₂孵箱中，37℃、95％湿度条件下培养。

分别配制含有不同浓度的EGCG和FA的培养液备用，EGCG浓度为20μmol/L、40μmol/L和60μmol/L，FA浓度为5μg/ml、20μg/ml和40μg/ml。

二、RT-PCR法检测基因的表达

1.细胞总RNA的抽提、质检

取处于对数生长期的MKN45细胞，分别以1×10⁴/ml的密度，每瓶5ml的量接种于25cm²培养瓶。24h后加入新鲜配制的EGCG，共分4组：对照组、EGCG 20μmol/L组、40μmol/L组和60μmol/L组。分别在培养的24h、48h、72h收取细胞，吸去上清液，PBS洗3次。细胞总RNA抽提采用Trizol试剂(Gibco BRL公司)根据说明书操作。每瓶细胞加入1ml Trizol，吸取细胞裂解液转入Eppendoff管，加200μl氯仿，混匀后置室温3min。4℃，12000×g离心15min。吸取上层水相至新管，加入0.5ml异丙醇，混匀，4℃，12000×g离心10min使RNA沉淀，倾去上清液，75％乙醇洗涤，真空干燥15min。加入50μl无RNA酶的去离子水，重溶RNA，紫外/可见分光光度计(Mltraspec 2000型，Pharmacia Biotech)测定RNA浓度。RNA产物置-70℃冰箱保存备用。提取的RNA经分光光度计检测的A260/A280值为1.8-2.0，从电泳结果来看，其18S和28S条带都很清晰，亮度比约为2∶1，说明总RNA纯度基本达到实验要求且无明显降解。

2.引物序列

根据Genbank中的基因序列，采用Prirmer3.0引物设计软件，由计算机辅助设计、并由上海Sangon公司分别合成针对c-myc、P53、mad1、hTERT、β-actin的PCR扩增引物(见表2)。

             表2  RT-PCR引物序列

基因	引物序列                                 PCR	扩增片段(bp)
			β-actinc-mycP53mad1hTERT	5′-GGA GTC CTG TGG CAT CCA CG-3′5′-CTA GAA GCA TTT GCG GTG GA-3′5′-CCA ACA GGA GCT ATG ACC TC-3′5′-CTC GGT CAC CAT CTC CAG CT-3′5′-CAG CCA AGT CTG TGA CTT GCA CGT AC-3′5′-CTA TGT CGA AAA GTG TTT CTG TCA TC-3′5′-AAG ACC TGG GGG AAA ACA CC-3′5′-ACA ATC GCT GCA TCC TGC-3′5′-CGG AAG AGT GTC TGG AGC AA-3′5′-GGA TGA AGC GGA GTC TGG A-3′	322290292719154

3.RT-PCR

按二步法分别进行RT-PCR反应，先将mRNA反转录为cDNA，然后再以cDNA为模板进行PCR扩增反应：首先取1μg总RNA样品+2μl10mmol/LdNTPMix(上海Sangon公司)+2μl Oligo(dT)18(500μg/ml)(上海Sangon公司)，加去离子双蒸DEPC(焦碳酸乙二脂)水至12μl，70℃水浴5min，迅速转移至冰浴2min，快速离心后加入首链cDNA合成缓冲液5μl+DEPC水6μl+1μlRNA抑制剂(40U/μl)(华美公司)混合后置42℃水浴2min，再加入M-MLV逆转录酶1μl(200U)，混匀，置42℃水浴50min，70℃水浴15min终止反应。产物置-20℃冰箱保存备用。

扩增反应条件为：(1)β-actin：94℃变性3min，经94℃30s，60℃1min，72℃1min，循环28次，72℃延伸5min；(2)c-myc：94℃变性3min，经94℃30s，58℃1min，72℃1min，循环35次，72℃延伸5min；(3)P53：94℃变性5min，经94℃30s，65℃1min，72℃1min，循环35次，72℃延伸5min；(4)mad1：94℃变性5min，经94℃30s，64℃1min，72℃1min，循环37次，72℃延伸5min；(5)hTERT：94℃变性5min，经94℃30s，54℃1min，72℃1min，循环37次，72℃延伸5min。取5μl PCR扩增产物加1μl 6×上样缓冲液(30％甘油，加溴酚蓝和二甲苯青染色)上样于含0.5μg/ml溴化乙锭的1.5％琼脂糖凝胶中电泳，紫外线下生物电泳图像分析系统(FR-200型，上海复日生物公司)观察结果并照相。RT-PCR结果重复2-3次。

三、四唑蓝(MTT)比色法分析EGCG联合FA对胃癌细胞株的杀伤作用

取对数生长期的3株不同细胞，按5×10⁴细胞/ml的单细胞悬液以100μl/孔分别接种铺96孔培养板。24h后加入新鲜配制的含不同EGCG和FA浓度的培养液(终浓度分别为20μmol/L+5μg/ml、40μmol/L+20μg/ml和60μmol/L+40μg/ml)三个浓度)，每孔100μl，每个浓度设6个复孔。正常对照组加入RPMI-1640培养液。EGCG对照组加入只含不同浓度EGCG的RPMI-1640培养液。FA组只加入含不同浓度FA的RPMI-1640培养液。作用48h后，每孔加入5mg/ml的噻唑蓝(MTT Sigma)溶液20μl，继续培养4h，吸去培养上清液，按100μl/孔加入二甲亚砜(DMSO)，避光室温下充分振荡20min。在酶联免疫检测仪(Microplate Reader，Model 550，Bio Rad)上测定各孔光吸收值(OD)，计算细胞存活率：存活率＝处理孔平均OD值/对照孔平均OD值×100％。对于不同肿瘤细胞株杀伤作用的强弱以半数抑制浓度(IC50)来表示。数据为三次实验数据的平均值。

四、流式细胞仪分析

取处于对数生长期的MKN45细胞，分别以1×10⁴/ml的密度，每瓶5ml的量接种于25cm²培养瓶。共分三大组：对照组、EGCG组、EGCG与FA混合组。24h后分别加入1640培养液、EGCG(终浓度分别为20μmol/L、40μmol/L和60μmol/L)和EGCG与FA的混合液(终浓度分别为20μmol/L+5μg/ml、40μmol/L+20μg/ml和60μmol/L+40μg/ml)。继续培养48h后0.25％胰蛋白酶消化收集各组细胞，PBS洗2次，每次1000r/min 4℃离心5min，去上清后，加入4℃PBS 0.5ml，充分混匀悬浮细胞，计数制成约10⁶个/ml×1ml单细胞悬液。在振荡器上，缓慢加入预冷的95％乙醇2ml，充分摇匀。固定细胞用PBS洗2次，加入RNA酶A(上海Sangon)100U/ml，37℃水浴摇床×30min，用10μg/ml含Triton X-100的碘化丙啶(PI Sigma)染色，4℃避光30min。尼龙网过滤，流式细胞仪(EPICS XL，COMLTER)上样检测。本实验重复三次。

五、统计学处理

各组间数据的显著性差异应用统计软件以配对计量资料t检验进行统计学处理，p＜0.05为差异有显著性。

                      结果

一、EGCG对于hTERT及其上游调控基因表达的影响

与对照组相比，hTERT基因在EGCG 20μmol/L组表达无明显变化。而在40μmol/L和60μmol/L组表达逐渐下降，尤其在60μmol/L组，基本检测不到其表达；c-myc基因在EGCG 60μmol/L组出现下降趋势；P53基因在三组中表达均无变化；madl基因在对照组和EGCG 20μmol/L组中仅有微弱表达，而在40μmol/L和60μmol/L组表达逐渐升高，说明EGCG在达到一定浓度下能影响hTERT及其上游调控基因的表达。

二、EGCG联合FA对3株胃癌细胞的杀伤作用

EGCG联合FA作用48小时较EGCG单独作用，光镜下胃癌细胞浮起、破碎、死亡等表现增多，存活细胞增殖呈明显停滞状态。MTT分析显示：联合作用较单独作用杀伤效能提高，3株癌细胞的EGCG半数抑制浓度(IC₅₀)均降低(见表1)，对SGC7901、MKN45和MKN28的IC₅₀分别降低约51.9％、28.4％和40％，其中以对SGC7901细胞的IC₅₀降低最为明显。而FA单独作用48小时对MKN45细胞的杀伤作用较弱，细胞在较高浓度(40μg/ml)也仅表现为增殖停滞；浮起、破碎、死亡等表现不明显。两者最佳效果的配比范围，EGCG在20μmol/L-40μmol/L之间；FA在5μg/ml-20μg/ml之间(见图2、3、4、5)。

EGCG联合FA干预胃癌细胞，较EGCG单独作用杀伤作用增强，证明两者存在协同作用。作用48小时对3株胃癌细胞的EGCG半数抑制浓度(IC50)均降低，其中最多者降低幅度达51.9％。从实验结果来看，两者最佳效果的配比范围，EGCG在20μmol/L-40μmol/L之间；FA在5μg/ml-20μg/ml之间。

本研究为EGCG联合FA应用于胃癌的治疗和饮食预防等方面作了有益的探讨。

以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。

Claims (6)

1、一种组合物，其特征在于含有表没食子儿茶素没食子酸酯和叶酸，其中表没食子儿茶素没食子酸酯与叶酸的质量比例为10∶1～1∶3。

2、权利要求1所述的组合物，其特征在于该组合物中还含有药学可接受的辅料。

3、权利要求2所述的组合物，其中该组合物为药剂学可接受的剂型，包括口服剂和注射剂。

4、权利要求1-3中任一项所述的组合物在制备抑制消化道肿瘤细胞药物中的用途。

5、权利要求4所述的用途，其中所述的消化道肿瘤细胞为胃癌细胞。

6、权利要求5所述的用途，其中所述的胃癌细胞为SGC7901、MKN45或MKN28细胞。

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