CN1287492A - 给予AspB28－人胰岛素的方法 - Google Patents

Abstract

要求保护的本发明涉及吸入给予Asp^B28－人胰岛素的方法;吸入给予Asp^B28－人胰岛素治疗糖尿病的方法;和吸入给予Asp^B28－人胰岛素治疗高血糖症的方法。

Description

给予AspB28-人胰岛素的方法

本发明一般涉及治疗糖尿病患者的方法。更具体地说，本发明涉及单体胰岛素类似物的肺传递以通过肺而系统吸收，从而显著降低或消除通过注射给予单体胰岛素类似物的需要。

自从在二十世纪二十年代引入胰岛素以来，对改善糖尿病的治疗已取得了不断进步。已经在胰岛素纯度和可用性方面取得重要进展，也已经研制了具有不同作用时间的各种制剂。需要非注射型胰岛素以增加患者对强胰岛素治疗的顺从性以及降低其并发症风险。

糖尿病是影响约6％世界人口的疾病。此外，大多数国家的人口老化，而糖尿病在老年人口中特别常见。通常就是这个人群经历难以或不愿意自我注射给予胰岛素。在美国约有5％的人患有糖尿病，而这些糖尿病患者的约三分之一通过皮下注射每天自我给予一剂或多剂胰岛素。这种类型的强治疗是降低血糖水平所必需的。高水平的血糖是由于低水平或缺乏内源性胰岛素引起的，它改变正常的人体化学，并可能导致许多器官的微血管系统衰竭。未治疗的糖尿病患者常常经受切断术和遭受失明以及肾衰竭。据估计仅在美国糖尿病副作用的医学治疗和由于糖尿病的不当治疗引起的生产力丧失的年费用约400亿美元。

涉及1，441例Ⅰ型糖尿病患者的九年糖尿病控制和并发症实验(DCCT)证实，血糖水平维持在高精度范围内可降低糖尿病并发症的频率和严重程度。常规的胰岛素治疗涉及每天仅注射两次。在所述DCCT研究中的强胰岛素治疗涉及每天注射胰岛素三次或三次以上。在该研究中，糖尿病副作用的发生率显著降低。例如在用强疗法的患者中，视网膜病变降低50-76％，肾脏病变降低35-56％以及神经病变降低60％。

遗憾的是，由于与维持葡萄糖水平的精确控制需要的多次注射有关的不舒服，许多糖尿病患者不愿意接受强治疗。该类型治疗可能在心理和生理上均是痛苦的。口服后，胰岛素迅速在胃肠道降解而不能吸收入血流。因此，许多研究者已经研究了给予胰岛素的替代途径，例如口服、直肠、经皮和鼻途径。然而迄今这些给药途径仍未产生有效的胰岛素吸收。

多年来，已知某些蛋白可以由肺吸收。实际上，胰岛素以吸入气溶胶给到肺在1925年由Gaensslen首次报道。尽管事实是许多人类和动物研究已表明某些胰岛素制剂可以通过肺吸收，但是肺传递作为有效治疗糖尿病的手段仍未获得广泛接受。部分原因是相对于传递量而言吸收的胰岛素量小。另外，在肺传递不同胰岛素制剂甚至多剂相同制剂在不同时间传递后，研究人员已经观察到吸收的胰岛素量变异幅度大。

因此，需要提供通过肺途径传递胰岛素的有效可靠的方法。这种需要对于用速效人单体胰岛素类似物进行攻击性治疗(aggressivetreatment)方案的患者特别明显。如果需要快速降低血糖浓度，例如餐后或不用胰岛素疗法较长时间后，速效人单体胰岛素类似物的有效肺传递将具有该效应。

显然，不是所有蛋白均可以在肺中有效吸收。有很多因素影响蛋白是否可以通过肺有效传递。经肺吸收在较大程度上取决于待传递的特定治疗蛋白的物理特性。所以，尽管已经观察了正规人胰岛素的肺传递，但是正规人胰岛素和速效单体胰岛素类似物之间的物理差异，使得不清楚这些类似物是否可以经肺途径有效传递。

蛋白的有效肺传递取决于将所述蛋白传递到深部肺泡上皮的能力。沉积在上呼吸道上皮的蛋白很大程度上不被吸收。这是因为上面覆盖的粘液约30-40μm厚并是吸收障壁。另外，沉积在该上皮的蛋白由粘液纤毛沿所述呼吸道向上运输而被清除，然后经胃肠道清除。该机制也大致上造成某些蛋白颗粒的吸收低。蛋白不被吸收而经这些途径消除的程度取决于其可溶性、大小和其它缺少了解的特性。

难以预测的是，治疗蛋白即使成功传递至深部肺泡上皮，是否可以由肺快速运送到血液。已经计算了经肺传递的某些蛋白的吸收值，其范围从甲状旁腺素(片段1-34)的15分钟至糖基化α1-抗胰蛋白酶的48小时。因为在肺中存在范围广泛的肽酶，较长的吸收时间增加所述蛋白吸收前显著降解或经粘液纤毛转运清除的可能性。

胰岛素是分子量约5，800道尔顿的肽激素。在存在锌的情况下，人胰岛素自缔合为稳定的六聚体型。据信所述稳定六聚体的离解是胰岛素由皮下注射部位吸收入血流的限速步骤。但是速效胰岛素类似物不易形成稳定的六聚体。因为这些类似物不易自缔合成稳定的高级复合物，所以称为单体胰岛素类似物。这种自缔合的缺乏是由于人胰岛素的氨基酸序列中的修饰引起的，所述修饰通过破坏二聚体形成而减少缔合。遗憾的是，对胰岛素的修饰使得这些类似物成单体，还导致单体非特异性凝集。这种非特异性凝集可使所述类似物不溶和不稳定。

因此，由于单体胰岛素类似物的固有不稳定性、形成不溶性胰岛素类似物沉淀的可能性、胰岛素和单体胰岛素类似物之间的物理差异以及在经肺传递的正规人胰岛素吸收方面的高度变异性，令人惊奇的是，气溶胶化单体胰岛素类似物制剂可以重复而有效地经肺传递。最为有益而意外的发现是，与用正规人胰岛素获得的数据相比，吸入体积的改变不会导致在所述单体胰岛素类似物的药代动力学或药效学上产生可检测的差异，特别是Lys^B28Pro^B29-人胰岛素。此外，令人吃惊的是，Lys^B28Pro^B29-人胰岛素传递后由肺的吸收至少与皮下给予后一样迅速。

本发明涉及给予单体胰岛素类似物的方法，包括通过肺途径对需要其的患者给予有效量的所述单体胰岛素类似物。本发明还涉及治疗糖尿病的方法，包括通过肺途径对需要其的患者给予有效量的单体胰岛素类似物。本发明的另一方面涉及治疗高血糖症的方法，包括通过肺途径对需要其的患者给予有效量的单体胰岛素类似物。最好是，所述单体胰岛素类似物通过吸入传递到所述患者的下呼吸道。

可以采用适合吸入给予的各种装置中的任何一种，将所述单体胰岛素类似物在载体中作为溶液或悬浮液、或作为干粉传递。最好是，所述单体胰岛素类似物以有效到达肺的下呼吸道的颗粒大小传递。优选的单体胰岛素类似物的颗粒大小小于10微米。甚至更优选的单体胰岛素类似物的颗粒大小为1-5微米。

图1图示Lys^B28Pro^B29-人胰岛素的气溶胶传递后，在小猎犬中的平均葡萄糖反应与时间的关系曲线。

本文使用的术语“胰岛素”是指哺乳动物胰岛素，例如牛、猪或人胰岛素，所述胰岛素的序列和结构是本领域已知的。人胰岛素的氨基酸序列和空间结构是众所周知的。人胰岛素由通过二硫键交联的21个氨基酸的A链和30个氨基酸的B链组成。正常交联的人胰岛素含有3个二硫桥：一个在A链7位和B链7位之间、第二个在A链20位和B链19位之间、第三个在A链6位和11位之间。

术语“胰岛素类似物”是指具有A链和B链、其氨基酸序列分别与人胰岛素的A链和B链大致相同的蛋白，但是所述序列因具有不破坏所述胰岛素类似物的胰岛素活性的一个或多个氨基酸缺失、一个或多个氨基酸取代和/或一个或多个氨基酸插入，而不同于人胰岛素的A链和B链。

一种类型的胰岛素类似物“单体胰岛素类似物”是本领域众所周知的。这些是人胰岛素的速效类似物，包括例如这样的单体胰岛素类似物，其中：a)用Asp、Lys、Leu、Val或Ala取代B28位的氨酰基残基，而B29位的氨酰基残基是Lys或Pro；b)B28、B29和B30位的氨酰基残基缺失；或c)B27位的氨酰基残基缺失。优选的单体胰岛素类似物是Asp^B28。甚至更优选的单体胰岛素类似物是Lys^B28Pro^B29。

单体胰岛素类似物公开于Chance等，美国专利第5，514，646号；Chance等，美国专利申请系列第08/255，297号；Brems等，ProteinEngineering，5：527-533(1992)；Brange等，EPO公布号第214，826号(于1987年3月18日公布)；和Brange等，Current Opinion inStructural Biology，1：934-940(1991)。为了描述单体胰岛素类似物，这些说明书特别通过引用结合到本文中。

胰岛素类似物也可以具有以酸型氨基酸取代酰胺化氨基酸的取代。例如，Asn可以用Asp或Glu取代。同样，Gln可以用Asp或Glu取代。具体来说，Asn(A18)、Asn(A21)或Asp(B3)或这些残基的任意组合可以由Asp或Glu取代。此外，Gln(A15)或Gln(B14)或这二者可以由或Asp或Glu取代。

术语“防腐剂”是指加入药用制剂中以抗微生物剂发挥作用的化合物。胃肠外制剂必须符合对工业上可行的多用途产品的防腐效果准则。作为胃肠外制剂中有效并可接受、本领域已知的防腐剂有苯扎氯铵、苯索氯铵、氯己定、苯酚、间甲苯酚、苄醇、羟苯甲酸甲酯、氯丁醇、邻甲苯酚、对甲苯酚、氯甲苯酚、硝酸苯汞、乙基汞硫代水杨酸钠、苯甲酸和其各种混合物。参见例如Wallh_usser，K.-H.，Develop.Biol.Standard，24：9-28(Basel，S.Krager，1974)。已知某些酚类防腐剂(例如苯酚和间甲苯酚)结合胰岛素样分子，由此诱导提高物理或化学或物理化学稳定性的构象变化[Birnbaum等，Pharmac.Rrs.14：25-36(1997)；Rahuel-Clermont等，Biochemistry 36：5837-5845(1997)]。间甲苯酚和苯酚是在用于本发明的所述单体胰岛素类似物制剂中的优选防腐剂。

术语“缓冲剂”或“药学上可接受的缓冲剂”是指已知用于胰岛素制剂是安全的、并具有控制所述制剂的pH于所述制剂需要的pH的作用的化合物。用于控制pH于中度酸性pH至中度碱性pH的药学上可接受的缓冲剂包括，例如，诸如磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、TRIS、精氨酸或组氨酸的化合物。

术语“等渗剂”是指生理上可耐受并赋予制剂合适张力以防止水净流过所述细胞膜的化合物。为此普遍使用已知浓度的诸如甘油的化合物。其它可接受的等渗剂包括盐类(例如NaCl)、葡萄糖、甘露醇和乳糖。优选浓度为12-25mg/mL的甘油作为等渗剂。单体胰岛素类似物的给予

单体胰岛素类似物以剂量有效方式吸入给予，以提高循环的胰岛素蛋白水平和/或降低循环的葡萄糖水平。这种给予对治疗诸如糖尿病或高血糖症的疾病可能是有效的。达到有效剂量的单体胰岛素类似物需要给予的吸入剂量为高于约0.5μg/kg-约50μg/kg单体胰岛素类似物蛋白，优选约3μg/kg-约20μg/kg，最优选约7μg/kg-约14μg/kg。治疗有效量可由有经验的从业医师确定，所述从业医师将考虑的因素包括胰岛素蛋白水平、血糖水平、所述患者的身体状况、所述患者的肺状况等。

按照本发明，单体胰岛素类似物经吸入传递以达到快速吸收这些类似物。吸入给予可以产生与皮下给予胰岛素相当的药代动力学。吸入单体胰岛素类似物导致循环的胰岛素水平快速升高，接着血糖水平快速下降。当比较相似的颗粒大小和相似的肺沉积水平时，不同吸入装置通常提供相似的药代动力学。

按照本发明，单体胰岛素类似物可以用本领域已知的、用于吸入给予治疗剂的各种吸入装置中的任何一种传递。这些装置包括计量剂量吸入器、雾化器、干粉生成器、喷雾器等。单体胰岛素类似物优选经干粉吸入器或喷雾器传递。用于给予单体胰岛素类似物的吸入装置具有几种需要的特性。例如，经吸入装置传递的优势是可靠、可重复和准确。所述吸入装置应该传递小颗粒以利于良好呼吸，例如小于约10μm，优选约1-5μm。适合实施本发明的市售吸入装置的某些具体实例有Turbohaler^TM(Astra)、Rotahaler^_(Glaxo)、Diskus^_(Glaxo)、Spiros^TM吸入器(Dura)、Inhale Therapeutics销售的装置、AERx^TM(Aradigm)、Ultravent^_雾化器(Mallinckrodt)、AcornⅡ^_雾化器(Marquest Medical Products)、Ventolin^_计量剂量吸入器(Glaxo)、Spinhaler^_粉剂吸入器(Fisons)等。

本领域技术人员会认识到，单体胰岛素类似物蛋白的制剂、所传递制剂的量和单剂量的给药时间取决于所用吸入装置的类型。对于某些气溶胶传递系统，例如雾化器，给药频率和所述系统活化时间长短主要取决于气溶胶中的单体胰岛素类似物蛋白的浓度。例如，较短的给药时间可用于雾化器溶液中较高浓度的单体胰岛素类似物蛋白。诸如计量剂量吸入器的装置可以产生较高的气溶胶浓度，并可操作用于较短时间传递需要量的单体胰岛素类似物蛋白。诸如干粉吸入器的装置传递活性药物直到给定的治疗剂装料由所述装置喷出。在该类型吸入器中，一定量的所述粉剂中的单体胰岛素类似物蛋白的量决定了单次给药所传递的剂量。

在由所述吸入装置传递的制剂中，所述单体胰岛素类似物蛋白的颗粒大小对于使所述蛋白进入肺以及优选进入下呼吸道或肺泡的能力是重要的。优选配制所述单体胰岛素类似物使得至少约10％所传递的单体胰岛素类似物蛋白沉积在肺中，优选约10％-约20％或更高。已知对于口呼吸的人，用颗粒大小约2μm-约3μm获得最大效率的肺沉积。当颗粒大小大于约5μm时，肺沉积明显减少。小于约1μm的颗粒大小导致肺沉积减少，并使得难以传递具有治疗上有效的足够质量的颗粒。因此，吸入传递的单体胰岛素类似物蛋白颗粒的颗粒大小优选小于约10μm，更优选范围约1μm-约5μm，最优选范围约2μm-约3μm。选择单体胰岛素类似物蛋白制剂以在选定的吸入装置中产生所需要的颗粒大小。用干粉吸入器给予单体胰岛素类似物

为了有利于以干粉给予，单体胰岛素类似物蛋白以颗粒大小小于约10μm、优选约1μm-约5μm、最优选约2μm-约3μm的颗粒型制备。优选的颗粒大小为有效传递到所述患者肺泡的大小。最好是，所述干粉主要由所产生的颗粒组成，从而使得大多数颗粒的大小在所需要的范围内。最好是至少约50％的所述干粉是直径小于约10μm的颗粒。这类制剂可以通过含单体胰岛素类似物蛋白和其它需要成分的溶液的喷雾干燥、制粉或临界点凝结获得。也适合产生可用于本发明的颗粒的其它方法是本领域已知的。

所述颗粒通常与容器中的干粉制剂分开，然后通过载气流运送入患者肺中。通常，在目前的干粉吸入器中，仅由患者的吸入提供破碎所述固体的力。一种合适的干粉吸入器是Astra(S_dertalje，瑞典)生产的Turbohaler^TM。在另一种类型吸入器中，由患者吸入产生的气流驱动使所述单体胰岛素类似物颗粒解凝集的叶轮马达。DuraSpiros^TM吸入器就是这样一种装置。

用于由干粉吸入器给予的单体胰岛素类似物制剂通常包括含单体胰岛素类似物蛋白的细碎干粉剂，但是所述粉剂也可以含有增量剂、载体、赋形剂、另一添加剂等。添加剂可以包含于单体胰岛素类似物蛋白的干粉制剂中，例如以便根据需要稀释干粉以由所述特定粉剂吸入器传递、以有助于所述制剂的加工、以便为所述制剂提供有利的粉剂特性、以有利于由所述吸入装置分散所述粉剂、以稳定所述制剂(例如，抗氧化剂或缓冲剂)、以赋予所述制剂味道等。有益的是，所述添加剂不会负面影响患者的气道。所述单体胰岛素类似物蛋白可以在分子水平与添加剂混合，或所述固体制剂可以包括与所述添加剂颗粒混合的单体胰岛素类似物蛋白颗粒或所述单体胰岛素类似物蛋白包衣于所述添加剂颗粒上的颗粒。典型的添加剂包括单糖、双糖和多糖；糖醇类和其它多元醇类，诸如例如，乳糖、葡萄糖、棉籽糖、松三糖、乳糖醇、麦芽糖醇、海藻糖、蔗糖、甘露醇、淀粉或它们的组合物；表面活性剂，例如山梨醇、二磷脂酰胆碱或卵磷脂等。通常添加剂(例如增量剂)以上述目的的有效量存在，常常为所述制剂重量的约50％-约90％。本领域已知的用于诸如胰岛素类似物蛋白的蛋白制剂的其它添加剂也可以包含于所述制剂中。

Lys^B28Pro^B29-人胰岛素的Humalog^_干粉制剂经吸入给予是治疗糖尿病的优选方法。以喷雾剂给予单体胰岛素类似物

含单体胰岛素类似物蛋白的喷雾剂可以通过迫使单体胰岛素类似物蛋白悬浮液或溶液加压下通过喷嘴而产生。可以选择所述喷嘴的大小和构型、所用的压力和所述液体的进料速率以获得所需要的输出量和颗粒大小。例如通过与毛细管或喷嘴进料装置(nozzle feed)连接的电场可以产生电子喷雾。有利的是，经喷雾器传递的单体胰岛素类似物蛋白颗粒的颗粒大小小于约10μm，优选范围约1μm-约5μm、最优选约2μm-约3μm。

适合用喷雾器使用的单体胰岛素类似物蛋白制剂通常包括浓度为每ml溶液含约1mg-约20mg单体胰岛素类似物蛋白的单体胰岛素类似物蛋白水溶液。所述制剂可以含有的药剂例如赋形剂、缓冲剂、等渗剂、防腐剂、表面活性剂并优选含有锌。所述制剂也可以含有稳定所述单体胰岛素类似物蛋白的赋形剂或药剂，例如缓冲剂、还原剂、填充蛋白或糖类。用于配制单体胰岛素类似物蛋白的填充蛋白包括白蛋白、鱼精蛋白等。通常用于配制单体胰岛素类似物蛋白的糖类包括蔗糖、甘露醇、乳糖、海藻糖、葡萄糖等。所述单体胰岛素类似物蛋白制剂也可以含有表面活性剂，它可以减少或防止在形成气溶胶时所述溶液雾化引起的所述单体胰岛素类似物蛋白的表面诱导的凝集。可以使用各种常规表面活性剂，例如聚氧乙烯脂肪酸酯和醇类以及聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯。用量范围一般为所述制剂重量的0.001-4％。用于本发明目的的特别优选的表面活性剂是聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯、多乙氧基醚80、多乙氧基醚20等。用于诸如胰岛素类似物蛋白的蛋白制剂的本领域已知的其它的药剂也可以包含于所述制剂中。用雾化器给予单体胰岛素类似物

单体胰岛素类似物蛋白可以经雾化器给予，例如喷射式雾化器或超声雾化器。通常在喷射式雾化器中，压缩空气源用来产生通过喷嘴的高速空气射流。随着所述气体膨胀到所述喷嘴以外，产生低压区，它通过连接至液体贮存器的毛细管抽吸单体胰岛素类似物蛋白液。来自所述毛细管的液体流当其离开所述毛细管时被剪切为不稳定丝和微滴，产生所述气溶胶。可以应用各种构型、流速和折流板类型以由给定的喷射式雾化器获得所需要的性能特性。在超声雾化器中，用高频电能来产生振动的机械能，通常应用压电变换器。该能量或者直接传递或经过偶合流体传递至单体胰岛素类似物蛋白制剂，从而产生含所述单体胰岛素类似物蛋白的气溶胶。有利的是，由雾化器传递的单体胰岛素类似物蛋白颗粒的颗粒大小小于约10μm，优选范围约1μm-约5μm、最优选约2μm-约3μm。

适合用雾化器(或者为喷气式雾化器或者为超声雾化器)使用的单体胰岛素类似物蛋白制剂通常包括浓度为每ml溶液含约1mg-约20mg单体胰岛素类似物蛋白的单体胰岛素类似物蛋白水溶液。所述制剂可以含有的药剂例如赋形剂、缓冲剂、等渗剂、防腐剂、表面活性剂并优选含有锌。所述制剂也可以含有稳定所述单体胰岛素类似物蛋白的赋形剂或药剂，例如缓冲剂、还原剂、填充蛋白或糖类。可用于配制单体胰岛素类似物蛋白的填充蛋白包括白蛋白、鱼精蛋白等。通常用于配制单体胰岛素类似物蛋白的糖类包括蔗糖、甘露醇、乳糖、海藻糖、葡萄糖等。所述单体胰岛素类似物蛋白制剂也可以含有表面活性剂，它可以减少或防止在形成气溶胶时所述溶液雾化引起的所述单体胰岛素类似物蛋白的表面诱导的凝集。可以使用各种常规表面活性剂，例如聚氧乙烯脂肪酸酯和醇类以及聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯。用量范围一般为所述制剂重量的0.001-4％。用于本发明目的的特别优选的表面活性剂是聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯、多乙氧基醚80、多乙氧基醚20等。用于诸如胰岛素类似物蛋白的蛋白制剂的本领域已知的其它药剂也可以包含于所述制剂中。用计量剂量吸入器给予单体胰岛素类似物

在计量剂量吸入器(MDI)中，抛射剂、单体胰岛素类似物蛋白和任何赋形剂或其它添加剂以包含液化压缩气的混合物盛于罐(canister)中。所述计量阀的开启释放作为气溶胶的混合物，所述混合物优选含有的颗粒大小小于约10μm，优选约1μm-约5μm、最优选约2μm-约3μm。通过采用本领域技术人员已知的各种方法生产的单体胰岛素类似物制剂，可以获得所需要的气溶胶颗粒大小，所述方法包括喷射研磨、喷雾干燥、临界点凝聚等。优选的计量剂量吸入器包括3M或Glaxo生产并用氟代烃(hydrofluorocarbon)抛射剂的吸入器。

用于用计量剂量吸入器装置使用的单体胰岛素类似物蛋白制剂一般包括含单体胰岛素类似物蛋白的细碎粉剂，所述粉剂为非水介质中的悬浮物，例如借助于表面活性剂悬浮于抛射剂中。所述抛射剂可以是用于该目的的任何常规物质，例如含氯氟烃(chlorofluorocarbon)、氯代氟代烃(hydrochlorofluorocarbon)、氟代烃、或烃，包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇和1，1，1，2-四氟乙烷、HFA-134a(氟代链烷-134a)、HFA-227(氟代链烷-227)等。所述抛射剂最好是氟代烃。可以选择所述表面活性剂以稳定作为所述抛射剂中的悬浮物的单体胰岛素类似物蛋白，以保护所述活性剂对抗化学降解等。合适的表面活性剂包括失水山梨醇三油酸酯、大豆卵磷脂、油酸等。在某些情况下，优选用诸如乙醇的溶剂的溶液气溶胶类。用于诸如胰岛素类似物蛋白的蛋白制剂的本领域已知的其它药剂，也可以包含于所述制剂中。

本领域技术人员将认识到，可以通过经非本文所述装置肺部给予单体胰岛素类似物实施本发明的方法。单体胰岛素类似物蛋白的药用制剂

本发明还涉及含单体胰岛素类似物蛋白并适合经吸入给予的药用组合物或制剂。按照本发明，单体胰岛素类似物蛋白可以用于生产适合吸入给予的制剂或药物。本发明还涉及生产含单体胰岛素类似物蛋白、适合吸入给予的剂型制剂的方法。例如，用常规技术，可以以几种方式生产干粉制剂。大小范围适合在下呼吸道中最大沉积的颗粒可以通过微粉化、碾磨、喷雾干燥等制得。而液体制剂的制造可以将所述单体胰岛素类似物蛋白溶于合适pH的合适溶剂(诸如水)中，所述溶剂包括缓冲剂或其它赋形剂。

一种用于将通过所述肺途径给予的特定单体胰岛素类似物蛋白的特定药用组合物为Humalog^_。Humalog^_制剂描述于DeFelippis，美国专利第5，461，031号；Bakaysa等，美国专利第5，474，978号；和Baker等，美国专利第5，504，188号。为了描述各种单体胰岛素类似物制剂，这些说明书特别通过引用结合到本文。其它制剂包括单独的无菌水溶液和含低浓度表面活性剂、和/或防腐剂、和/或稳定剂、和/或缓冲剂的水溶液。其它合适的具锌单体胰岛素类似物制剂是本领域技术人员已知的。

参考以下实施例可以更好地理解本发明。这些实施例是本发明的典型的具体实施方案，而不是为了限制本发明的范围。实施例1：

在小猎犬中肺部给予单剂气溶胶剂量后Lys^B28Pro^B29-人胰岛素的血清药代动力学

Lys^B28Pro^B29-人胰岛素(Lys^B28Pro^B29-hI)的气溶胶由Lys^B28Pro^B29-hI的无菌水溶液产生，由超声雾化器经气管内插管通过肺途径给予麻醉的狗。用有效的放射免疫分析方法测定免疫反应性Lys^B28Pro^B29-hI的血清浓度。

6只小猎犬(3只雌性和3只雄性)用于本研究。所述动物或者每笼饲养2只或者单独饲养于具有悬起的网状底板的不锈钢笼中。开始，所有猎犬每天喂饲约450g Purina鉴定的犬粮(Certified Canine Diet)5007。给药前动物禁食约8小时。由麻醉状态恢复后，随意供给食物和水直到给药后48小时。初始的日饲养制度开始于给药后48小时。在研究开始，所述动物重量为12.5-17.6kg。

给药后在不同时间点收集血标本，以测定所述Lys^B28Pro^B29-hI的血浆浓度和测定所吸入物质的生物利用度。选择犬是因为它们是具有与人相似的呼吸道颗粒沉积的大动物。

如所有狗的血清中升高的免疫反应性Lys^B28Pro^B29-hI浓度所示，肺部给予Lys^B28Pro^B29-hI导致系统暴露。表1：肺传递后随时间而变的Lys^B28Pro^B29-hI血清浓度(ng/mL)示于表1：

^a所用的缩写：h，小时；M，雄性；F，雌性；N，计算用的动物数；SD，标准差；SEM，所述均值的标准误；BLQ，低于定量极限(＜0.25ng/mL)。为了计算，BLQ定为0值。^bN.S=无样品。给药前(0h)未从狗27258收集血清。肺部给予产生免疫反应性胰岛素迅速升高，大多数狗在暴露于所述气溶胶后约5-20分钟达到峰浓度(T_max)。

  表2：经肺传递的Lys^B28Pro^B29-hI的药代动力学参数

所用的缩写：kg，公斤；μg，微克；ng，纳克；mL，毫升；h，小时；C_max，最大血清浓度；T_max，达到最大血清浓度的时间； ${\mathrm{AUC}}_0^t$ ，从给药时间到回到基线的曲线下面积；t’“回到基线”；β，终末速率常数；t1/2，半衰期；M，雄性；F，雌性；SD，标准差；％CV，变异系数百分率；N，计算用的动物数。

所述数据表明，肺部给予气溶胶化Lys^B28Pro^B29-hI在小猎犬血清中产生可检测浓度的免疫反应性Lys^B28pro^B29-hI。Lys^B28Pro^B29-hI快速吸收，在30分钟以内达到平均最大浓度。免疫反应性Lys^B28pro^B29-hI血清浓度下降的平均半衰期约40分钟。在Lys^B28pro^B29-hI的传递和沉积上未发现明显的性别差异。血糖值显示，吸入Lys^B28pro^B29-hI后，下降至其禁食狗的对照值的约55％(图1)。用γ摄像机检测锝⁹⁹测定，产生这些效应需要的平均肺剂量约7μg/kg，所述锝⁹⁹用作所述气溶胶微滴的放射性标记。与皮下注射后所观察到的相比，吸入Lys^B28pro^B29-hI的葡萄糖值下降所用的时间略少。

                  实施例2：

肺部给予后Asp^B28-人胰岛素在小猎犬中的吸收

Asp^B28-人胰岛素以气溶胶用头罩系统传递到清醒的小猎犬。收集血标本以测定暴露后的血清葡萄糖水平和血清Asp^B28-人胰岛素水平。选择犬用于本研究是因为它们是具有与人相似的呼吸道颗粒沉积的大动物。

6只雌性小猎犬用于本研究。所述动物或者每笼饲养2只或者单独饲养于具有悬起的网状底板的不锈钢笼中。所有动物每天喂饲约450g Hill’s Science Diet。给药前动物禁食约12小时。在研究开始，所述动物重量为10.8-14.1kg。

将所有狗暴露于Asp^B28-人胰岛素的气溶胶，同时用限制悬带固定保持。将一条0.03英寸胶乳片置于所述动物颈部周围以形成非限制性密封标志。将定制的11-L头罩置于所述狗头部并固定在所述限制装置上。通过所述头罩的总流速约11-15L/分钟。用输入速率约7.5L/分钟的雾化器产生气溶胶。所述发生器装有6mL含2.4mgAsp^B28-人胰岛素/mL的无菌水溶液和100-500μCi⁹⁹mTC。。所述发生器的输出物直接流入头罩。在每次以1L/分钟的流速暴露15分钟期间，收集一个重量分析标本。目标肺剂量为10mg/kg。实际沉积的肺剂量通过暴露后立即用γ照像机成像测定。

于0时(暴露前)、暴露后0.08、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3和4小时收集血标本以测定血清葡萄糖水平和血清Asp^B28-人胰岛素水平。每只狗暴露于Asp^B28-人胰岛素的平均暴露浓度范围为17.9-30.5μg/L。所有动物的平均(±标准差)浓度为22.4±4.3μg/L。计算沉积在6只狗的肺中的平均Asp^B28-人胰岛素剂量为10±5μg/kg(均值±标准差)。平均吸入剂量为287±107μg/kg(均值±标准差)。单个动物的数据示于以下的表3。表3：

动物　　　　目标　　　　吸入的　　　　估测的编号　　　　沉积　　　　剂量　　　　　沉积的肺　　　　(μg/kg)　　　　肺剂量剂量(μg/kg)　　　　　　　　(μg/kg)
27682　　　10　　　　　230　　　　　8.4827684　　　10　　　　　210　　　　　8.1527685　　　10　　　　　230　　　　　8.4727686　　　10　　　　　320　　　　　4.9427687　　　10　　　　　240　　　　 11.8827689　　　10　　　　　490　　　　 19.60

如所有狗的血清中升高的免疫反应性Asp^B28-人胰岛素浓度所示，肺部给予Asp^B28-人胰岛素引起系统暴露。用Coat-A-Count胰岛素RIA试剂盒(Diagnostic Products，Los Angeles，California)测定肺传递后随时间变化的Asp^B28-人胰岛素血清浓度。

表4：肺传递后随时间变化的Asp^B28-人胰岛素血清浓度(ng/mL)

肺部给予Asp^B28-人胰岛素后还检测血清葡萄糖的变化(表5)。用Hitachi Chemistry System(Boehringer Mannheim Corp.，Indpls，IN)测定血清葡萄糖。肺部给予后于暴露后1小时，观察到血清葡萄糖水平相对于对照的最大下降百分率。给予约10μg/kg沉积的肺剂量后观察到约40％和70％的下降。表5：

肺部给予Asp^B28-人胰岛素获得测试项目高于给药前水平的可检测水平。皮下和肺部给予后的药代动力学参数的比较示于表6。表6：

传递途径　　　　　　AUC　　　　　　Cmax　　　　　　Tmax(h)(ng·h/mL)　　　　(ng/mL)　　　　 (均值±SEM)(均值±SEM)　　 (均值±SEM)
皮下　　　　　　10.30±0.47　　　　5.57±0.35　　　　0.42±0.05肺　　　　　　　5.21±0.47　　　　 3.04±0.42　　　　0.21±0.07

肺部给予的AUC产生自-0.25-2小时(此时血糖水平大约回到基线)；皮下给予的AUC产生自0-4小时(此时血糖水平大约回到基线)。然后通过减去内源性犬胰岛素的基线水平，从而调整这些AUC值。减去所述内源性胰岛素基值后，估算所述肺途径相对于皮下注射的生物利用度约26％。为了比较，估算人胰岛素的所述肺途径相对于皮下注射给予的生物利用度约38％。

Claims (41)

1．一种给予AspB28-人胰岛素的方法，包括对需要其的患者经肺途径给予有效量的所述AspB28-人胰岛素。

2．权利要求1的方法，其中所述AspB28-人胰岛素传递到所述患者的下呼吸道。

3．权利要求2的方法，其中所述AspB28-人胰岛素沉积在肺泡中。

4．权利要求1的方法，其中所述AspB28-人胰岛素通过所述患者的口吸入。

5．权利要求1的方法，其中所述AspB28-人胰岛素以含在药学上可接受的载体中的Asp^B28-人胰岛素的药用制剂给予。

6．权利要求5的方法，其中所述制剂选自水性介质溶液剂和非水介质的悬浮剂。

7．权利要求6的方法，其中所述制剂以气溶胶给予。

8．权利要求5的方法，其中所述制剂为干粉剂型。

9．权利要求5的方法，其中所述AspB28-人胰岛素的颗粒大小小于约10微米。

10．权利要求9的方法，其中所述AspB28-人胰岛素的颗粒大小约1-约5微米。

11．权利要求10的方法，其中所述AspB28-人胰岛素的颗粒大小约2-约3微米。

12．权利要求1的方法，其中至少约10％所传递的AspB28-人胰岛素沉积在所述肺中。

13．权利要求1的方法，其中所述AspB28-人胰岛素由吸入装置传递，所述装置适合肺部给予并能够将所述胰岛素类似物沉积在所述患者的肺中。

14．权利要求13的方法，其中所述装置选自雾化器、计量剂量吸入器、干粉吸入器和喷雾器。

15．权利要求14的方法，其中所述装置是干粉吸入器。

16．权利要求14的方法，其中所述装置启动给予约3μg/kg-约20μg/kg的AspB28-人胰岛素。

17．权利要求16的方法，其中所述装置启动给予约7μg/kg-约14μg/kg的AspB28-人胰岛素。

18．一种治疗糖尿病的方法，包括对需要其的患者经肺途径给予有效剂量的AspB28-人胰岛素。

19．权利要求18的方法，其中所述AspB28-人胰岛素以含药学上可接受载体中的所述AspB28-人胰岛素的药用制剂给予。

20．权利要求18的方法，其中所述AspB28-人胰岛素由吸入装置传递，所述装置适合于肺部给予并能够将AspB28-人胰岛素沉积在所述患者的肺中。

21．权利要求20的方法，其中所述装置是喷雾器或干粉吸入器。

22．权利要求21的方法，其中所述装置启动给予约3μg/kg-约20μg/kg的AspB28-人胰岛素。

23．权利要求22的方法，其中所述装置启动给予约7μg/kg-约14μg/kg的AspB28-人胰岛素。

24．一种治疗高血糖症的方法，包括对需要其的患者经肺途径给予有效剂量的AspB28-人胰岛素。

25．权利要求24的方法，其中所述AspB28-人胰岛素以含药学上可接受载体中的所述胰岛素类似物的药用制剂给予。

26．权利要求24的方法，其中所述AspB28-人胰岛素由吸入装置传递，所述装置适合于肺部给予并能够将AspB28-人胰岛素沉积在所述患者的肺中。

27．权利要求26的方法，其中所述装置选自喷雾器和干粉吸入器。

28．权利要求27的方法，其中所述装置启动给予约3μg/kg-约20μg/kg的AspB28-人胰岛素。

29．权利要求28的方法，其中所述装置启动给予约7μg/kg-约14μg/kg的AspB28-人胰岛素。

30．一种含AspB28-人胰岛素蛋白并适合吸入给予的药用组合物或制剂。

31．一种适宜实施权利要求1-29中任一项要求保护的方法的药用组合物或制剂。

32．AspB28-人胰岛素蛋白用于生产适合吸入给予的药物的用途。

33．权利要求32中要求保护的用途，用于对权利要求1-29中任一项要求保护的方法起作用。

34．按照权利要求32的用途，其中所述药物是溶液型或水性介质型或悬浮液型或非水介质型。

35．按照权利要求32的用途，其中所述药物是气溶胶型。

36．按照权利要求32的用途，其中所述药物是干粉剂型。

37．按照权利要求32的用途，其中所述AspB28-人胰岛素的颗粒大小小于约10微米。

38．按照权利要求32的用途，其中所述AspB28-人胰岛素的颗粒大小约1-约5微米。

39．按照权利要求32的用途，其中所述AspB28-人胰岛素的颗粒大小约2-约3微米。

40．按照权利要求32-39中任一项的用途，其中所述AspB28-人胰岛素以约3μg/kg-约20μg/kg之间的剂量给予。

41．按照权利要求32-39中任一项的用途，其中所述AspB28-人胰岛素以约7μg/kg-约14μg/kg之间的剂量给予。