CN1283794C - 节旋藻藻蓝蛋白基因的启动子及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种节旋藻的藻蓝蛋白β和α亚基基因的启动子，该DNA片段长度为：426bp，其序列描述为：藻蓝蛋白β和α亚基基因共用的一个启动子。该序列包含有如下功能因子-10区和-35区主要功能区及DOFCOREZM、EBOXBNNAPA、GT1CONSENSUS、GTGANTG10、IBOXCORE等功能因子。本启动子具有完整的-35区和-10区，两功能区的间隔长度显示它是高效启动子，这就可以实现以高效的强启动子来完成藻类基因工程的转录阶段任务，使外源基因的表达提高了效率，进而得到更多的改良和利用节旋藻所需的基因产物。本启动子应用在启动子探测载体——绿色荧光蛋白中实现了高效表达，证明了其可开发性。

Description

节旋藻藻蓝蛋白基因的启动子及其制备方法

技术领域：

本发明涉及藻类基因工程技术的改进，具体讲是一种节旋藻的藻蓝蛋白基因的启动子及其制备方法。即节旋藻Arthrospiraplatensis FACHB341藻蓝蛋白β和α亚基基因的启动子序列及其获得方法。其属于分子生物学和生物技术领域。

背景技术：

现有技术中，有一种节旋藻Arthrospiraplatensis，其属于蓝藻类。该节旋藻Arthrospiraplatensis的来源是：编号为FACHB341的节旋藻，其购自于武汉中国科学院水生生物研究所藻种中心。该藻种公开在美国得克萨斯大学UTEX藻种中心，保藏编号为：1926PCC 7345。其中藻蓝蛋白是由β和α亚基及发色团构成。两该亚基的基因序列是由De Rossi于1985年克隆获得的(De Rossi E，Riccardi G，Sanangelantoni AM and Ciferri O.Construction of cosmidlibrary of Spirulina platensis as an approach to DNA physical mapping.FEMS Microbiol.Letters，1985，30：239.)，但是迄今为止，两该亚基的基因序列的上游序列却没有被揭示，其影响了节旋藻基因工程的发展。因此，充分开发和合理利用节旋藻是现代藻类基因工程面临的问题，如何得到高效的藻类基因启动子一直是阻碍藻类转基因获得成功的关键因素。同时，外源基因在转基因植物中的表达效率低是一个普遍存在而又亟待解决的问题。细菌及真核生物基因工程的启动子在藻类基因工程中效率更低，有时甚至不起作用。这就延误了藻类基因工程的发展。

当前，藻蓝蛋白β和α亚基蓝藻分子生物学的发展为蓝藻基因工程研究奠定了基础，有引入外源基因在蓝藻中克隆或表达，以改进蓝藻遗传品质的研究；还有将蓝藻基因在其他的表达体系中进行表达的研究。

本发明是在上述已经报道的节旋藻藻蓝蛋白β和α亚基的基因序列的基础上，设计了简并引物Y1(ttgatgcctt cactaaggtg g，21bp)和Y2(gtagtagcc(t/g)at(g/a)tcacgagc，21bp)，并进行聚合酶链式反应，经过48℃-58℃范围内的的复性温度的测试，在最佳复性温度下扩增得到长900bp的DNA片段。经测序结果分析显示：此基因片段的结构如下：1-494bp为cpcB基因；495-605bp为亚基间隔区序列(IGSB-A)；606-857bp为cpcA基因，该基因序列已提交美国GenBank网站核酸序列数据库登记，其序列登记号为：AY244668。核苷酸序列测定结果如下：

tttctcaagc tgatactcgc ggcgaaatgc tgagtacagc tcaaatcgat gctctgagcc60

aaatggttgc tgaaagcaac aaacgtttgg gttctgttaa ccgcattacc agcaacgctt120

ccaccattgt ttccaacgct gctcgttctt tgttcgcaga gcaaccccaa ctgattgctc180

ccggtggaaa cgcctacacc agccgtcgta tggctgcttg cttgcgtgac atggaaatca240

tcctgcgcta tgtaacctac gctgtgtttg ctggcgatgc aagtgttctc gaagatcgtt300

gcttgaacgg tttgcgtgaa acttacctgg ctttgggaac tcccggttct tccgttgctg360

tcggtgttgg caaaatgaaa gaagctgctc tggcgatcgt taacgatccc gcaggtatca420

ctcctggtga ttgtagcgct ttggcttcag aaatcgctgg ttactttgac cgtgctgctg480

cagcagtttc ctaatcaagc agatccatag catataacaa ttgaaacagt ttagctgaag540

tctaagtgac tggacttctg tttgttacct aattttttgt aaaccaatcg ggagataact600

cgagaatgaa aaccccccta accgaagcag tttctatcgc tgattcccaa ggtcgtttcc660

taagcagcac cgaaatccaa gtagcttttg gccgttttcg tcaagccaaa gctggtctgg720

aagctgctaa agctctgacc tctaaagctg atagtctgat cagtggtgct gcccaagcag780

tgtacaacaa gttcccctac accacccaaa tgcagggacc taactacgcg gcagaccaac840

gcggtaagga caaatgt857

本发明人在以上工作的基础上，为研制开发高效的藻类基因启动子而设计了如下技术方案。

发明内容：

本发明是来自藻类基因工程，在上述工作的基础上，要想得到藻类基因工程的表达产物，就必须使该基因能够表达，而表达的前提，首先要转录，该转录又取决于高效的启动子。因此，本发明的目的是根据基因的基本功能结构，选择和设计一个高效的藻类基因工程急需的启动子，来完成藻类基因工程的转录阶段任务，使外源基因的表达能够提高效率，进而得到更多的藻类基因工程所需基因产物。本发明要选择和设计得到的节旋藻(Arthrospira platensisFACHB341)藻蓝蛋白β和α亚基基因的启动子及其制备方法，要为改良和利用节旋藻奠定一个良好的基础。

本发明的目的是由以下技术方案实现的，研制了节旋藻的藻蓝蛋白β和α亚基基因的启动子，其是长度为1545bp的藻蓝蛋白基因的操纵子序列中的DNA片段。该DNA片段长度为：426bp，其序列描述为：藻蓝蛋白β和α亚基基因共用的一个启动子，该启动子的序列表征为：

tcaatatttt aatgcttgta ttgacccacg gattcgctat taattccctg tcagaaaata 60

tacttagtta ttaatactta gttatttttc ttaataaatt ttaacaaacc aaagggcgtt 120

ggctgtgtat aaaggatatt cgaagaggtg agaaggaagg cgaatgttga tttatgaagt 180

ttgattaaca tttgtatcaa aatataaaat tcttctcata aaccctgtag aatcttttaa 240

gatttcggaa agtgttctag gatactgaag aaatgaacca cggggcaatt gttaaaagcc 300

tttgtcgatg gttcgccccg gaaggggtct taggaggtga caccgatgga ttgattgtcg 360

tgatcattca tggtgtgtcc aatcccaact caactctaag caagtcaaca agtaggagat 420

aaatcc 426

该序列包含有如下功能因子：DOFCOREZM、EBOXBNNAPA、GT1CONSENSUS、GTGANTG10、IBOXCORE、MYBGAHV、MYBST1、POLASIG1、POLLEN1LELAT52、RAV1AAT、REALPHALGLHCB21、ROOTMOTIFTAPOX1、TAAAGSTKST1、WBOXATNPR1、-10区和-35区。

所述的-10区中具有转录调控功能的因子有：TATAAA，GATACTG，GATCATT和TCCAAT；其中CAAT因子位于第2，287，381位位点；TATA因子位于第39，70和83位位点；GATA因子为核锌指结构DNA，其分别位于第136，262，419和464位位点。

所述的-35区中具有转录调控功能的因子有：TTGATT，TTAAGA，GTGACA和TTGTCG为-35区序列。

所述的藻蓝蛋白操纵子序列，其包括三个开放阅读框：

1)、串联在启动子后面的、长度为519bp的β亚基基因——cpcB，该基因是结构基因，其编码173个氨基酸残基的多肽(β亚基)；

2)、串联在β亚基基因——cpcB后面的、长度为110bp的间隔区序列——IGSB-A；

3)、串联在间隔区序列——IGSB-A后面的、长度为489bp的α亚基基因——cpcA，该基因是结构基因，其编码163个氨基酸残基的多肽(α亚基)。

本发明所述的节旋藻藻蓝蛋白β和α亚基基因的启动子的制备方法，该方法是以节旋藻(Arthrospira platensis FACHB341)基因组为模板，采用染色体步移的方法，即：用适当的限制性内切酶将基因组DNA完全消化(本实验采用Sau3AI内切酶)，用具有相应酶切位点的接头(由试剂盒提供)进行连接反应，用接头引物和根据已知区域设计的引物进行第一次PCR反应；再用上一步扩增的一部分PCR产物及内侧引物(接头内侧引物由试剂盒提供)进行第二次特异的扩增DNA。本发明实验中采用的试剂盒是大连宝生物公司出品的：TaKaRa LAPCRTM in vitro Cloning Kit试剂盒。

所述的PCR反应，其实验体系如下：

DNA                                 1——5μl；

10×PCR缓冲液(PCR buffer)           5μl；

Mg²⁺(25mmol/L)                     5——8μl；

脱氧核苷三磷酸(dNTP10mmol/L)        2——5μl；

引物C1(50pmol/L)                    0.5——3μl；

或引物C2(50pmol/L)                  0.5——3μl；

引物S1(50pmol/L)                    0.5——3μl；

或引物S2(50pmol/L)                  0.5——3μl；

DNA聚合酶(TaqE)                     0.5——1μl；

用双蒸水补足反应体系至50μl；再配以相应的实验条件进行PCR扩增。

所述的引物C 1，其序列为：gtacatattg tcgttagaac gcgtaatacg actca；

所述的引物C2，其序列为：cgttagaacg cgtaatacga ctcactatag ggaga；

所述的引物S1，其序列为：tgcatcgcca gcaaacacag c；

所述的引物S2，其序列为：gagctgtact cagcatttcg cc。

本发明的积极效果在于：由于设计了一种节旋藻的藻蓝蛋白β和α亚基基因的启动子，其是长度为：426bp，其序列描述为：藻蓝蛋白β和α亚基基因共用的一个启动子，该启动子的序列表征得如此清楚、完整，使得在藻蓝蛋白β和α亚基基因转录起始时，与RNA聚合酶专一性接触的-10区和-35区功能因子能够迅速地形成复合物，并在转录起始位点处迅速进行转录。该转录的效率取决于本发明启动子中表征的碱基组成：如本发明的具有转录调控功能的因子：TATAAA，GATACTG，GATCATT和TCCAAT，其中CAAT因子位于第2，287，381位位点；TATA因子位于第39，70和83位位点；GATA因子为核锌指结构DNA，其分别位于第136，262，419和464位位点；和-35区的功能因子：TTGATT，TTAAGA，GTGACA和TTGTCG在很大程度上决定了本发明的启动子是高效的强启动子。经本发明人证明应用化学方法合成寡核甘酸引物诱导本发明的启动子39位-10区的TATA的第一位和第二位碱基发生突变，获得2个突变体(AATA，TGTA)，通过检测突变体结合蛋白的能力，近而间接检测启动子的活性。凝胶阻滞实验结果表明该启动子的活性有所改变。单碱基突变体结合蛋白的能力明显下降，说明单碱基突变体启动子活性下降。突变研究表明，启动子-10区和-35区的碱基突变，或是不同元件之间的距离改变都会使基因的转录活性受到影响。

本启动子具有完整的-35区和-10区，两功能区的间隔长度显示它是高效启动子，这就可以实现本发明的目的——以高效的强启动子来完成藻类基因工程的转录阶段任务，使外源基因的表达提高了效率，进而得到更多的改良和利用节旋藻所需的基因产物。

附图及其实施例：

本发明的保护范围不仅局限于本发明的实施例中。

图1.节旋藻的藻蓝蛋白基因的启动子体外克隆PCR原理示意图

图2.节旋藻的藻蓝蛋白基因的启动子及操纵子的结构示意图

参见图1——2，图1中Target DNA即为节旋藻(Arthrospira platensis FACHB341)基因组DNA，经Restriction Enzyme Digestion即限制性酶消化(我们实验中选择的是Sau3AI)后，与试剂盒带有的Sau3AI酶切位点的Cassette即接头进行Ligation也就是连接后，作为模板，用Primer C1和S1，即引物C1和S1，其中C1为试剂盒带有的，S1是我们根据基因组DNA序列设计的，进行1st PCR即第一次聚合酶链式反应，反应的一部分产物作为模板进行2nd PCR，也就是第二次聚合酶链式反应，使用的PrimerC2和S2，即引物C2和S2，其中C2为试剂盒带有的，S2是我们根据基因组DNA序列设计的，它位于S1的内侧，保证了特异性扩增。

图2中1为USSB藻蓝蛋白β亚基上游序列——启动子元件；2为cpcB藻蓝蛋白β亚基基因序列；3为IGSB-A蛋白β亚基和α亚基基因间隔区序列；4为cpcA藻蓝蛋白α亚基基因序列。

本发明的启动子的制备过程是：

根据扩增得到的藻蓝蛋白操纵子编码β亚基基因的部分序列设计引物，首先向β亚基的上游序列移动，其由两次PCR反应组成。第一次反应所采用的引物为S1，C1；第二反应所采用的引物为S2和C2。S1和S2根据上一步所克隆的cpcB基因所设计(见表1)。

                 表1.本发明的实验所用引物及Cassette序列

引物	序列
		Y1	ttgatgcctt cactaaggtg g
Y2	gtagtagcc(t/g)at(g/a)tcacgagc
		C1	gtacatattg tcgttagaac gcgtaatacg actca
C2	cgttagaacg cgtaatacga ctcactatag ggaga
		S1	tgcatcgcca gcaaacacag c
S2	gagctgtact cagcatttcg cc
		PS1	tccatcggtg tcacctccta ag
PS2	tgccccgtgg ttcatttctt cag
		Sau3AICassette	5′ho gtacatattg tcgttagaac gcgtaatacg actcactata ggga3′catgtataac agcaatcttg cgcattatgc tgagtgatat ccctctag oh 5′

        表2.本发明的启动子PCR反应设计的实验体系

两次PCR反应的反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性60s，50℃复性60s，72℃延伸80s，30个循环，循环结束后72℃延伸10min。最终得到高效特异性的藻蓝蛋白β和α亚基基因的启动子。

            表3.藻蓝蛋白操纵子cpcB基因的上游推断的启动子元件序列

起始端	末端	启动子序列
			175	220	atgaagt ttg attaacattt gtatcaaaa t ataaaattct tctcataaac
233	278	atctt ttaa gatttcggaa agtgttctag  gatactgaag aaatgaacca c
			334	379	ggag gtgaca ccgatggatt gattgtcgt g atcattcatg gtgtgtccaa
350	395	gattga ttgt cgtgatcatt catgggtgtg t ccaatcccaa ctcaactcta

注：转录起始位点在表中颜色加深斜体字。推断的-10区和-35区序列下面划线。

经启动子元件分析软件分析表明cpcB基因的上游序列含有启动子序列，其中的TATAAA，GATACTG，GATCATT和TCCAAT为-10序列，GATACTG和P_L序列(GT GATACTGAGCACA)完全相同；其中的TTGATT，TTAAGA，GTGACA和TTGTCG为-35序列(见表3的序列下面划线)。

在向α亚基下游序列扩增的反应中，所采用的引物为PS1，PS2，C1和C2(见表1)。PS1和PS2的序列根据上一次反应的克隆序列的测序结果得到，步移结果得到了cpcA基因的全序列。

将上述得到的序列全部拼接起来，得到长度为1545bp的藻蓝蛋白基因的启动子及操纵子序列(见图2)，其中包括四个开放阅读框：

519bp的cpcB基因，它编码173个氨基酸残基的多肽(β亚基)；

489bp的cpcA基因，编码163个氨基酸残基的多肽(α亚基)；

110bp的cpcB基因和cpcA基因的间隔区序列；

426bp的cpcB基因的上游序列——启动子元件。

如图1所示：1为USSB藻蓝蛋白β亚基上游序列——启动子元件；2为cpcB藻蓝蛋白β亚基基因序列；3为IGSB-A蛋白β亚基和α亚基基因间隔区序列；4为cpcA藻蓝蛋白α亚基基因序列。

本发明中的节旋藻藻蓝蛋白启动子元件及操纵子的基因序列如下：

本发明推断的核糖体结合位点(RBS)标于该序列中

tcaatatttt aatgcttgta ttgacccacg gattcgctat taattccctg tcagaaaata 60

tacttagtta ttaatactta gttatttttc ttaataaatt ttaacaaacc aaagggcgtt 120

ggctgtgtat aaaggatatt cgaagaggtg agaaggaagg cgaatgttga tttatgaagt 180

ttgattaaca tttgtatcaa aatataaaat tcttctcata aaccctgtag aatcttttaa 240

gatttcggaa agtgttctag gatactgaag aaatgaacca cggggcaatt gttaaaagcc 300

tttgtcgatg gttcgccccg gaaggggtct taggaggtga caccgatgga ttgattgtcg 360

tgatcattca tggtgtgtcc aatcccaact caactctaag caagtcaaca agta ggagat 420

aaatcc 426                                               RBS

→CPCB

atgtttgatg ccttcaccaa ggtggtttct caagctgata ctcgcggcga aatgctgagt 486

acagctcaaa tcgatgctct gagccaaatg gttgctgaaa gcaacaaac  gtttggattc 546

tgttaaccgc attaccagca acgcttccac cattgtttcc aacgctgctc gttctttgtt 606

cgcagagcaa ccccaactga ttgctcccgg tggaaacgcc tacaccagcc gtcgtatggc 666

tgcttgcttg cgtgacatgg aaatcatcct gcgctatgta acctacgctg tgtttgctgg 726

cgatgcaagt gttctcgaag atcgttgctt gaacggtttg cgtgaaactt acctggcttt 786

gggaactccc ggttcttccg ttgctgtcgg tgttggcaaa atgaaagaag ctgctctggc 846

gatcgttaac gatcccgcag gtatcactcc tggtgattgt agcgctttgg cttcagaaat 906

cgctggttac tttgaccgtg ctgctgcagc agtttcctaa tcaagcagat ccatagcata 966

taacaattga aacagtttag ctgaagtcta agtgactgga cttctgtttg ttacctaatt 1026

ttttgtaaac caatcg ggag ataactcgag a 1057

RBS

→CPCA

atgaaaaccc ccctaaccga agcagtttct atcgctgatt cccaaggtcg tttcctaagc 1117

agcaccgaaa tccaagtagc ttttggccgt tttcgtcaag ccaaagctgg tctggaagct 1177

gctaaagctt tgacctctaa agctgatagt ctgatcagtg gtgctgccca agcagtgtac 1237

aacaagttcc cctacaccac ccaaatgcag ggacctaact acgcggcaga ccaacgcggt 1297

aaggacaaat gtgctcgtga cataggctac tacctgcgga tggtaactta ttgcctgatt 1357

gctggtggaa ctggccccat ggatgagtac ctgattgccg gtattgatga aatcaaccgg 1417

actttcgagc tttctccaag ctggtacatt gaagccctga aatacatcaa agctaaccac 1477

ggtttgtctg gtgacgctgc tgttgaagct aactcctacc tcgactacgc gatcaacgcc 1537

ctgagctag 1546

在该序列中，β亚基基因与α亚基基因共用一个启动子元件。该启动子元件中的某些序列，如-10区序列(TATAAA，GATACTG，GATCATT和TCCAAT)和-35区序列(TTGATT，TTAAGA，GTGACA和TTGTCG)具有转录调控因子的功能，是基因表达调控必须的，如若缺失导致启动子失活。其中上游的第2，287，381位是CAAT位点，TATA因子位于第39，70和83位。GATA因子被认为是核锌指结构DNA结合蛋白家族，能够调节特异性靶基因的表达，它们分别位于第136，262，419和464位。

本发明获得的节旋藻Arthrospira platensis FACHB341藻蓝蛋白β和α亚基基因启动子，促使节旋藻基因在其他受体中高效表达成为可能。

本发明的启动子应用实施例4：

将本发明的启动子连接到启动子探测载体——绿色荧光蛋白质粒，用常规超声转化法转到节旋藻中，24小时后观察荧光情况。具体实验设计如下：

根据cpcB基因的上游序列，再设计引物PS2和PS3，常规PCR方法扩增cpcB基因的起始密码子上游，这对引物扩增时去除了藻蓝蛋白操纵子的编码区，从而保证了启动子探测载体上多克隆位点下游的gfp基因的读码框不被破坏。启动子探测载体绿色荧光蛋白报告基因用限制性内切酶SmaI进行切割产生平末端后，自制T载体，连接采用连接试剂盒进行。反应体系在16℃温育3hrs。连接产物转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞。用PCR反应筛选阳性重组子(PT)。将阳性克隆菌落培养后，通过序列测定确定插入为正向。提取质粒用常规超声转化法转到节旋藻中，24小时后用德国产的荧光显微镜(AxiophotPhotomicroscope From Carl Zeiss HB050)进行荧光检测，选定激发波长为488nm，发射波长为507nm。经与对照组比较，实验样品组细胞发出很强的绿色荧光。经流式细胞仪测量其荧光强度，与对照组相比萤光极大增强，对照组平均荧光强度为14.8，而实验样品组平均荧光强度为30.5。

本发明的节旋藻Arthrospiraplatensis FACHB341藻蓝蛋白β和α亚基启动子的获得，促进了藻类基因工程的发展，为藻类种质改良提供了前提，使外源基因在节旋藻中或节旋藻基因在其他受体——大肠杆菌DH5α中实现了高效表达。

Claims (5)

1、一种节旋藻(Arthrospira platensis FACHB341)的藻蓝蛋白β和α亚基基因的启动子，其是长度为1545bp的藻蓝蛋白基因的操纵子序列中的DNA片段，其特征在于：该DNA片段长度为：426bp，其序列描述为：藻蓝蛋白β和α亚基基因共用的一个启动子，该启动子的序列表征为：

tcaatatttt aatgcttgta ttgacccacg gattcgctat taattccctg tcagaaaata  60

tacttagtta ttaatactta gttatttttc ttaataaatt ttaacaaacc aaagggcgtt  120

ggctgtgtat aaaggatatt cgaagaggtg agaaggaagg cgaatgttga tttatgaagt  180

ttgattaaca tttgtatcaa aatataaaat tcttctcata aaccctgtag aatcttttaa  240

gatttcggaa agtgttctag gatactgaag aaatgaacca cggggcaatt gttaaaagcc  300

tttgtcgatg gttcgccccg gaaggggtct taggaggtga caccgatgga ttgattgtcg  360

tgatcattca tggtgtgtcc aatcccaact caactctaag caagtcaaca agtaggagat  420

aaatcc 426。

2、根据权利要求1所述节旋藻的藻蓝蛋白β和α亚基基因的启动子，其特征在于：所述的藻蓝蛋白操纵子序列，其包括三个开放阅读框：

1)、串联在启动子后面的、长度为519bp的β亚基基因——cpcB，该基因是结构基因，其编码173个氨基酸残基的多肽β亚基；

2)、串联在β亚基基因——cpcB后面的、长度为110bp的间隔区序列——IGSB-A；

3)、串联在间隔区序列——IGSB-A后面的、长度为489bp的α亚基基因——cpcA，该基因是结构基因，其编码163个氨基酸残基的多肽α亚基。

3、一种权利要求1所述节旋藻的藻蓝蛋白β和α亚基基因的启动子的制备方法，所述的方法是以节旋藻(Arthrospira platensis FACHB341)基因组为模板，采用染色体步移的方法，即：用适当的限制性内切酶将基因组DNA完全消化，用具有相应酶切位点的接头，进行连接反应，其特征在于：该反应是用接头引物C1和根据已知区域设计的引物S1而进行了第一次PCR反应；再用上一步扩增的一部分PCR产物及内侧引物C2、S2进行第二次特异的扩增DNA；所述的PCR反应，其实验体系如下：

    DNA                                     1--5μl；

    10×PCR缓冲液(PCR buffer)               5μl；

    Mg²⁺(25mmol/L)                         5--8μl；

    脱氧核苷三磷酸(dNTP10mmol/L)            2--5μl；

    引物C1(50pmol/L)                        0.5--3μl；

    或引物C2(50pmol/L)                      0.5--3μl；

    引物S1(50pmol/L)                        0.5--3μl；

    或引物S2(50pmol/L)                      0.5--3μl；

    DNA聚合酶(TaqE)                         0.5--1μl；

用双蒸水补足反应体系至50μl；再配以相应的实验条件进行PCR扩增。

4、根据权利要求3所述节旋藻的藻蓝蛋白β和α亚基基因的启动子的制备方法，其特征在于：所述的引物S1，其序列为：tgcatcgcca gcaaacacag c。

5、根据权利要求3所述节旋藻的藻蓝蛋白β和α亚基基因的启动子的制备方法，其特征在于：所述的引物S2，其序列为：gagctgtact cagcatttcg cc。

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