CN1282374A - 葡萄树的抗细菌性 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用vir基因或其抗病原体片段转化过的转基因葡萄树或转基因葡萄树部分,其中,所述vir基因或其抗病原体片段在转基因葡萄树或转基因葡萄树部分中的表达,可以产生对植物细菌病原体(例如,葡萄农杆菌)的抗性。

Description

葡萄树的抗细菌性

本发明背景

本发明涉及植物的抗病性。

葡萄是世界上广泛种植的果树作物，并且，用传统方法育种很困难(Mullins等，生物技术8：1041-1045，1990)。为了生产转基因葡萄栽培种，业已做出了相当大的努力。最近，用胚胎发生愈伤组织或悬浮培养物进行转化，业已在葡萄栽培种转化方面取得成功。业已获得了下列植物的转基因植物：根茎栽培种Rupestris St．George(沙地葡萄(Vitis rupestris)，Mullins等，生物技术8：1041-1045，1990)，Richter110(沙地葡萄×冬葡萄(Vitis herlandieri)，LeGall等，植物科学102：161-170，1994；Krastanova等，植物细胞报导14：550-554，1995)，41B(冬葡萄×沙地葡萄，Mauro等，植物科学112：97-106，1995)，以及接穗栽培种Chancellor(葡萄，Kikkert等，植物细胞报导15：311-316，1996)，Thompson Seedless(欧洲葡萄，Scorza等，美国园艺科学协会杂志，121：616-619，1996)，和Superior Seedless(欧洲葡萄，Perl等，植物科学104：193-200，1996)。导入所述葡萄栽培种的很多基因业已包被了葡萄病毒的蛋白基因，包括葡萄树扇叶病毒(Mauro等，1995；Krastanova等，植物细胞报导14：550-554，1995)，葡萄树色素花叶病毒(LeGall等，植物科学102：161-170，1994)，和番茄环斑病毒(Scorza等，美国园艺科学协会杂志121：616-619，1995)。另外，已报道了用编码裂解肽，Shiva-1的基因进行转化(Scorza等，美国园艺科学协会杂志，121：616-619，1995)。所述技术以及其它技术的应用提供了在葡萄上通过工程方法产生抗病性的基础；例如，培育能够抵抗害虫(例如，昆虫和线虫)侵害和病原性微生物(例如，真菌，细菌和病毒)侵害的转基因葡萄植物。

在葡萄上发现的一种微生物诱导的病害是冠瘿病。它是由农杆菌(一种土壤寄居性格兰氏阴性细菌)引起的病害。该细菌能长时间存在于土壤中的植物碎片上，该细菌具有最广泛的宿主范围，可以是任何植物的病原体。这种细菌能在植物的根、冠、干、和茎上诱导冠瘿或植物肿瘤。

农杆菌属是通过拷贝并转移肿瘤诱导(Ti)质粒的一个片段(被称为转移DNA(T-DNA))到植物细胞中，并整合到植物细胞基因组上而导致冠瘿。T-DNA向植物细胞核中的转移取决于各种毒力(vir)基因的表达，这些基因同样位于Ti质粒上。一种毒力蛋白VirD2是位点专一性内切酶，它在与VirD1蛋白结合之后，能识别左侧和右侧T-DNA臂序列的‘底链’并形成缺口(Stachel等，EMBO杂志，6：857-863，1987)。VirD2蛋白被共价结合在所述缺口链的5’末端(Ward和Warnes，科学242：927-930，1988)。然后，该单链T-DNA(ss T-DNA)被排出植物细胞(Tinland等，Proc．Natl．Acad．Sci．91：8000-8004，1994，Yusibov等，Proc．Natl．Acad．Sci．91：2994-2998，1994)。

目前，对将T-DNA转移到植物细胞核中的假设是，ss T-DNA是由VirE2蛋白的分子包被的，业已证实该蛋白能结合ss T-DNA。包被过的T-DNA被称为T-复合体，该复合体被认为通过由VirB蛋白形成的一个孔输送到植物细胞中。T-复合体可以利用植物蛋白途径进入细胞核；包括将具有细胞核定位信号的蛋白输送到细胞核。VirD2和VirE2都是将T-DNA适当转移到植物细胞核中所必需的。因此，T-复合体从农杆菌属转移到植物细胞中，在这里T-DNA整合到植物基因组上。

农杆菌属的T-DNA编码多种参与生长素和细胞分裂素生物合成途径的酶。受感染的细胞会过量产生植物激素--生长素和细胞分裂素，导致快速和失控的细胞分裂，并形成冠瘿或植物肿瘤。冠瘿的形成会妨碍水分和养分在植物中的流动。受感染的植物通常会变得不能结实，并且，更容易受不利环境条件的影响。这种病害对诸如葡萄的果树作物特别有危害。

葡萄的冠瘿病几乎都是由葡萄农杆菌(A．vitis)引起的，并在很小的程度上由根瘤农杆菌(A．tumefaciens)引起。所述细菌感染葡萄树的茎干上受伤的部位，并导致冠瘿的形成。细菌能在葡萄树的木质部中存活，并通过受感染的繁殖材料扩散。农杆菌属感染对葡萄园形成阶段幼小葡萄树的危害特别大；快速生长的冠瘿能够在一个季节将幼小的葡萄树环剥(Agrios，植物病理学，第3版，学术出版社，1998)。受感染的葡萄树会降低产量和生产能力。

本发明概述

一般来说，本发明的特征是一种在植物上(例如，诸如葡萄属的葡萄树)上产生对细菌病原体的抗性的方法。该方法一般包括以下步骤：(a)用一个毒力(vir)基因或其抗病原体片段转化植物细胞；(b)再生所述植物细胞，以便提供分化的植物；和(c)选择表达所述vir基因或其抗病原体片段的转化植物，其中，所述vir基因或其抗病原体片段的表达能产生对植物细菌病原体的抗性。一般来说，将T-DNA从细菌转移到植物中的方法是通过存在于农杆菌属的肿瘤诱导(Ti)或根瘤诱导(Ri)质粒上的vir片段编码的基因产物介导的。可用于本发明的代表性vir基因包括，但不限于virE2和virD2。

在本发明的优选实施方案中，将vir基因或其抗病原体片段整合到植物的基因组中。所述vir基因优选为virE2、virD2或这两者；或是突变体(例如，抗-病原体vir基因片段，如编码诸如virE2缺失B、virE2缺失C、或virE2缺失E的Vir蛋白的缺失的基因)。能介导增强对冠瘿病的抗性的vir序列被认为可用于本发明。在本文中，术语“片段”在用于表达核酸分子序列时表示至少5个连续的核苷酸，优选至少10个连续的核苷酸，更优选至少20-30个连续的核苷酸，最优选至少40-80或更多个连续的核苷酸。可以生产vir基因(例如，virE2或virD2)的天然片段或合成片段，随后按照本领域技术人员所公知的方法将其整合到任何标准植物表达载体(例如，本文所披露的载体)上。可以按照标准方法(例如，本文所披露的方法)测定所述vir基因片段(例如，编码virE2基因的缺失B、缺失C、缺失D或缺失E的vir基因)在植物中表达时产生对细菌性植物病原体的抗性的能力。能产生植物细菌病原体抗性的片段被称为“抗病原体片段”。

在优选实施方案中，所述植物是葡萄树或葡萄树的部分(例如，体细胞胚、接穗、或根茎)；所述细菌病原体是葡萄农杆菌或根瘤农杆菌；而对葡萄农杆菌或根瘤农杆菌的抗性能减弱冠瘿的形成或所述细菌在受感染的植物上的生长。在另一种优选实施方案中，所述vir基因(或其抗病原体片段)源于农杆菌属(例如，葡萄农杆菌、根瘤农杆菌、毛根农杆菌)的肿瘤诱导(Ti)或根诱导(Ri)质粒。所述Ti质粒的例子包括，但不限于胭脂氨酸、vitopine、章鱼氨酸、章鱼氨酸／南瓜氨酸、leucinopine／农杆氨酸、succinamopine、或农杆氨酸型Ti质粒。所述vir基因序列或抗病原体片段是按照本领域的标准方法获得的。

本文所披露的方法可用于在多种葡萄树(例如，葡萄、杂交葡萄、和Euvitis和Muscadinia亚属的所有成员)上产生对细菌病原体(例如，葡萄农杆菌或根瘤农杆菌)的抗性或耐性或这两者，所述葡萄树包括接穗和根茎栽培种。典型的接穗栽培种包括，但不限于被称为鲜食葡萄或葡萄干的品种以及用于生产葡萄汁和葡萄酒的品种，如Cabernet Franc，Cabernet Sauvignon，Chardonnay(例如，CH01，CH02，CH Dijon)，Merlot，Pinot Noir(PN，PN Dijon)，Semillon，White Riesling，Lambrusco，Thompson Seedless，AutumnSeedless，Niagrara Seedless，和Seval Blanc。可用于本发明的根茎栽培种包括，但不限于沙地葡萄Constantia，沙地葡萄St．George，加州葡萄(Vitis caiifornia)，谷地葡萄(Vitisgirdiana)，圆叶葡萄(Vitis rotundifolia)，圆叶葡萄Carlos，Richter 110(冬葡萄×沙地葡萄；“11OR”)，101-14 Millarderet de Grasset(河岸葡萄(Vitis riparia)×沙地葡萄；“101-14Mgt”)，Teleki 5C(冬葡萄×河岸葡萄)，Courderc 3309(河岸葡萄×沙地葡萄；“C3309”)，Riparia Gloire de Montpellier(河岸葡萄)，5BB Teleki(选择性Kober，冬葡萄×河岸葡萄)，S04(冬葡萄×沙地葡萄)，41B Millardet(欧洲葡萄×冬葡萄)，Ramsey(Vitis champinii)，K5140(Vitis．Champinii×河岸葡萄)，和039-16(欧洲葡萄×圆叶葡萄)。

本发明的特征还在于由本文所披露的任何转基因葡萄树或葡萄树部分产生的接穗、根茎、体细胞或合子胚胎、细胞、或种子，例如，本发明的特征是用编码Vir蛋白或其抗病原体片段的核酸分子转化过的转基因植物，其中，所述核酸分子的表达能产生对细菌病原体(例如葡萄农杆菌或根瘤农杆菌)的抗性。本发明还包括用能产生对细菌病原体的抗性的核酸分子(例如，virE2缺失B转基因构建体，通过将该转基因与植物表达控制片段可操作地连接进行定位表达)转化过的葡萄细胞。然后用本领域技术人员公知的方法(例如本文所披露的方法)用所述葡萄细胞再生根茎、接穗、体细胞胚胎、或种子。

“定位表达”表示将所述DNA分子定位于靠近指导该序列转录的DNA序列处。

“表达控制区域”是指足以指导转录的任何序列。在本发明中包括启动子和增强子元件，所述元件足以使得启动子依赖型基因表达可以控制细胞、组织、或器官特异性基因表达，或者能够用外部信号或制剂(例如，光线、病原体、创伤、应激或激素诱导型元件或组成型元件)诱导的元件；所述元件可以位于天然基因的5’或3’区域或加工进转基因构建体。

“可操作地连接”是指一个基因和一个调控序列的连接使得当合适的分子(例如，转录激活蛋白)结合于该调控序列上时基因能够表达。

“植物细胞”是指由半透性膜包围并含有质体的任何自身繁殖的细胞。在本文中，植物细胞是从(但不限于)种子、悬浮培养物、胚胎、分生组织部位、愈伤组织、原生质体、叶片、根、芽、体细胞和合子胚胎、以及生殖或营养组织或器官的任何部分获得的细胞。

“植物部分”是指从完整的植物或植物细胞获得的一部分、片段、或器官。典型的植物部分包括，但不限于体细胞胚胎、叶片、果实、接穗、和根茎。

“转基因的”是指包括一个DNA序列的任何细胞，该DNA序列通过人工方法插入一种细胞，并成为由该细胞形成的生物(整合的或染色体外的)的基因组的部分。在本文中，转基因生物通常是指转基因葡萄树或葡萄树部分，而所述DNA(例如转基因)是通过人工方法插入所述植物细胞的细胞核或细胞质区室中。所述转转基因葡萄树或葡萄树部分优选能表达至少一个vir核酸序列(例如，vir基因或其抗病原体片段，如源于葡萄农杆菌菌株CG450的virE2缺失B)。在另一种优选实施方案中，转基因植物可以表达一种以上的vir序列或vir序列的组合(例如，源于不同Ti质粒的vir核酸序列，如胭脂氨酸、vitopine、章鱼氨酸、章鱼氨酸／南瓜氨酸、leucinopine／农杆氨酸、succinamopine、或农杆氨酸型Ti或Ri质粒)。

“转基因”是指通过人工方法插入一种细胞，并成为由该细胞形成的生物的一部分(整合到其基因组上或者保持在染色体外)的任何DNA片段。所述转基因可以包括对转基因生物来说为部分或完全异源(即外源)的基因，或者可以是与该生物的内源基因同源的基因。

“对植物细菌病原体的抗性”是指在转基因葡萄(或葡萄部分或细胞、种子或其体细胞胚胎)上对病原体(例如，葡萄农杆菌或根瘤农杆菌)的抗性水平高于相对于对照葡萄(例如非转基因葡萄树)的抗性。在优选实施方案中，在转基因葡萄树上对病原体的抗性水平至少比对照葡萄树的抗性水平高5-10％(优选20％、30％、或40％)。在其它优选实施方案中，对所述病原体的抗性比对照葡萄树高50％、60％、更优选75％或90％；最优选比对照葡萄树高100％的抗性。所述抗性水平是用常规方法测定的。例如，对农杆菌属的抗性水平可以通过比较转基因葡萄树的物理特征(例如，植物高度和重量，或通过比较病害症状，例如，推迟的冠瘿形成，变小的冠瘿，或茎干减弱的畸形)或通过比较在所述植物上存活的病原体群体(例如，通过测定转基因植物和对照植物上农杆菌属的系统性群体)。

如上文所述，业已发现vir核酸序列virE2缺失B的表达使转基因葡萄树产生对由农杆菌属细菌导致的冠瘿病的抗性。因此，由于没有其它能有效控制葡萄上的农杆菌的方法，本发明为葡萄种植者提供了多种重要的改进和优点。例如，通过证实所述序列能有效抗冠瘿病的形成，本发明提供了一种预防所述病害的有效并且经济的方法。所述预防能减弱或降低对传统措施的需要，例如，化学处理，葡萄种植者通常用这种方法来控制农杆菌属的蔓延，并在葡萄园中提供对导致这种病害的病原体的抗性的预防作用。另外，由于表达vir核酸序列或抗病原体片的葡萄植物不太容易受农杆菌属(例如，葡萄农杆菌和根瘤农杆菌)的影响，并因此不太容易受冠瘿病的影响，本发明还提供了较高的产量效率，以及改善的品质、颜色、香味、和葡萄产量。另外，由于本发明降低了对化学预防葡萄树病原体的必要性，它有利于保护葡萄园种植的环境。

通过阅读下面的说明书及其优选实施方案和权利要求书可以了解本发明的其它特征和优点。

详细说明

首先说明附图。

附图

图1是表示T-DNA片段的部分图谱的示意图，该片段含有受串接的CaMV35S启动子控制的virE2缺失B转基因。

图2用源于根瘤农杆菌菌株A6的virE2缺失B基因转化101-Mgt的柱形图，所得到的若干转基因品系与对照植物相比具有抗性。

概述

用根瘤农杆菌和葡萄农杆菌进行遗传学研究，以便鉴定可用于增强葡萄植物对病原体感染的抗性的Vir蛋白产物(例如，virE2基因的缺失突变体)。用根瘤农杆菌菌株C58(该菌株携带胭脂氨酸型Ti质粒)、根瘤农杆菌菌株A6(该菌株携带章鱼氨酸型Ti质粒)、和葡萄农杆菌菌株CG450(该菌株携带vitopineTi质粒)制备突变型virE2缺失B转基因构建体(Citovsky等，科学256：1802-1806，1992)。virE2缺失B基因编码缺少215个羧基末端氨基酸的VirE2蛋白。这种截短缺少了VirE2蛋白的单链T-DNA(ssT-DNA)结合域。然后用一个转基因转化葡萄根茎(例如Courderc3309(河岸葡萄×沙地葡萄；“C3309”)，101-14Millarder et DE Grasset(河岸葡萄×沙地葡萄；“101-14Mgt”，和Richter110(冬葡萄×沙地葡萄；“110R”)，以及烟草(例如，Nicotiana benthamiana)，该转化体能表达virE2基因的缺失B(图1)。制备表达所述转基因构建体的转基因植物，随后评价对冠瘿病的抗病性。

下面的实施例只是用于说明本发明的目的的，并不构成对本发明的限定。

virE2缺失B转基因构建体和农杆菌属菌株

按如下方法制备virE2缺失B基因构建体。virE2缺失B基因是突变型virE2基因，缺少编码ssDNA结合基序的片段(Citovsky等，科学256：1802-1805，1992)。所述基因是从根瘤农杆菌菌株C58和根瘤农杆菌菌株A6获得的，所述菌株分别具有胭脂氨酸和章鱼氨酸型Ti质粒。virE2缺失B基因还可以从携带vitopine型Ti质粒的葡萄农杆菌菌株CG450制备。由根瘤农杆菌菌株C58和葡萄农杆菌菌株CG450DNA扩增virE2缺失B基因，使用引物5'nop(5’-TACTTACCATGGATCCGAAGGCCAAGGC；序列1)，该引物与胭脂氨酸virE2基因的5’编码区相同， 和3’nop(5’-TCTTGACCATGGCTATCGATTCTCGCCGGCGGAACTC；序列2)，与相同基因的1000-1020号核苷酸位置杂交。由根瘤农杆菌菌株A6扩增章鱼氨酸型virE2缺失B突变型，使用寡聚体引物5’oct(与章鱼氨酸型virE2基因的5’区相同)和3’oct(互补于从翻译起始密码子开始的927-951号核苷酸位置)。

按如下方法进行源于不同Ti质粒的virE2缺失B基因的聚合酶链式反应(PCR)扩增。用每一种寡聚体引物各0．5微克按照生产商的说明(Perkin-Eller Cetus)扩增virE2缺失B基因。PCR循环为在92℃下1分钟(变性)，在50℃下1分钟(退火)，和在72℃下2分钟(聚合)。直接加样，并在1．2％的琼脂糖凝胶上分离。从凝胶中提取分离的virE2缺失B片段，乙醇沉淀，并溶解在20微升蒸馏水中。然后用限制性酶NcoI消化凝胶分离的突变型基因片段，并直接克隆到NcoI消化过的植物表达载体pEPT8上。因此，rirE2编码序列的表达是由融合在表达载体pEPT8的苜蓿花叶病毒(AIMV)的5’非翻译前导序列上的双CaMV35S启动子控制的。用HindIII从所述构建体上切除所述表达框，并连接到用相同的酶裂解过的植物转化载体pBIN19上。按照标准方法通过电穿孔将所得到的转化载体pBIN19-EPT8-virE2-C58(图1)、pBIN19-EPT8-virE2-A6、和pBIN19-EPT8-virE2-CG450转入根瘤农杆菌菌株C58sZ707中。

用virE2缺失B转基因构建体转化葡萄和烟草

用下面的农杆菌属共培养方法，用virE2缺失B转基因构建体转化C3309、101-14Mgt、和110R的胚胎发生愈伤组织。

能够产生体细胞胚胎的胚胎发生愈伤组织是按照标准方法用培养的花药培育的。简单地讲，通过Rajasekaran和Mullins的方法用根茎克隆C3309、101-14Mgt、和110R的花药开始愈伤组织培养(实验植物学杂志30：399-407，1979)。在春天和夏初从大田生长的植物上在开花之前采集芽，从团块中取出，并在70％乙醇中进行表面消毒1-2分钟。将所述芽转移到1％次氯酸钠中浸泡15分钟，然后在消毒双蒸馏水中漂洗3次。在无菌条件下将半透明的黄色花药从花芽中切除。在无菌条件下剥离花药并以每个培养皿40或50个花药的密度铺平板在起始培养基上。在28℃下在黑暗中培养花药。在30天内形成胚胎发生愈伤组织。

在28℃下在震荡培养器上LB培养基中生长用于转化的含有virE2缺失B转基因构建体的根瘤农杆菌的过夜培养物。以3000rpm的速度离心细菌5分钟，并重新悬浮在MS液体培养基(A600nm下OD0．4-0．5)，将具有球形或心形胚胎的愈伤组织浸泡在细菌悬浮液中15分钟，吸水干燥，并转移到含有乙酰丁香酮(100μM)的HMG培养基上。在28℃下在黑暗中培养胚胎发生愈伤组织和所述细菌48小时。然后在添加了头孢噻腭(300微克／毫升)和羧卞青霉素(400微克／毫升)的MS液体中洗涤所述植物材料2-3次。将所述材料转移到含有相同抗生素的HMG培养基中1-2次。2周之后，将胚胎发生愈伤组织从含有20或40毫克／升卡那霉素和300毫克／升头孢噻腭，加200毫克／升羧卞青霉素的HMG培养基上，以便选择转基因胚胎。在选择培养基上生长3-4个月，然后将胚胎转移到不含卡那霉素的HMG、MGC、或MSE上。在大约4个月之后，将所有材料转移到不含抗生素的培养基上。在下胚轴形成之后将胚胎转移到不含抗生素的发根培养基上。

将未转化过的愈伤组织生长在含或不含卡那霉素的相同培养基上作为对照，以便证实抗生素选择的效率，和所述材料的再生能力。烟草的转化

用叶片转化方法转化烟草植物N．tabacum和N．benthamiana(Horsch等，科学227：1229，1985)。二元载体pBINl9-EPT8-virE2-C58和pBINl9-EPT8-virE2-A6与葡萄转化中所使用的相同(图1)。从所述叶片再生芽，从原始的外殖体上切除，并让其在含有卡那霉素的MS培养基上长根。让烟草植物自交，并将R1代用于抗性分析。

转基因植物的鉴定

回收转基因植物，并通过常规NPTII-ELISA鉴定。回收转基因烟草的转基因C3309、101-14Mgt、和110R植物和品系。按下述方法从选择的植物的幼小叶片中提取总DNA，并通过常规聚合酶链式反应(PCR)检测所述转基因的存在。在大多数转基因植物中观察到相当于virE2缺失B转基因的1．020kb PCR产物。

通过Southern印迹杂交进一步分析选择的转基因C3309植物的基因拷贝数，使用1．0kbvirE2缺失B基因作为探针。易感的和抗性植物具有较少的转基因拷贝(1-4)。通过下面所述的Northern印迹分析检测virE2缺失B基因mRNA的含量。发现转基因抗性植物所表达的virE2缺失B mRNA的含量高于易感植物的。

对于上述分析来说，按照Krastanova等所述方法从植物中分离总DNA(植物细胞报导14：550-554，1995)。按上述方法对总的植物基因组DNA进行PCR反应，使用45℃的退火温度而不是50℃。对于Southern印迹杂交来说，用HandIII、PstI、和KpnI消化20微克的DNA，在1％的琼脂糖TBE凝胶上对总的基因组DNA进行电泳，并吸印到Nytran滤膜上(Schleicher和Schuell，Keene，NH)，按照生产商的说明。在80℃的烘箱中干燥所述印迹1小时，然后按照Sambrook等所述方法进行预杂交和杂交(分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室出版社，N．Y．1989)。用购自Gibco BRL(Gaithersburg，MD)的RadPrime DNA标记系统构建32PdCTP-标记的探针。用与提取DNA相同的方法从转基因植物中提取RNA，在-20℃下用2M氯化锂沉淀总核酸过夜，以便选择总的RNA。按照Sambrook等披露的方法在变性甲醛凝胶上对RNA(20微克)进行电泳(同上)，并吸印到Nytran-N上，并用与Southern印迹相同的探针进行预杂交和杂交。

抗病性

按以下方法测定葡萄植物的转基因品系对冠瘿病的抗性。按照Pu和Goodman披露的方法接种葡萄茎节间(生理学和分子植物病理学41：241-254，1992)，用于该实验的接种物是根瘤农杆菌菌株C58或根瘤农杆菌菌株A6。在28℃下在PDA培养基上生长细菌48小时，如果合适的话可以含有抗生素．对于接种来说，将细菌重新悬浮在无菌双蒸馏水(A_600nm=0．1)，对于C58来说大约为1×10⁸cfu／ml。将5微升接种物或其稀释液涂在切割的葡萄节间上，并在接种后(dpi)7天、14天、和21天观察所述植物上肿瘤的形成。

用根瘤农杆菌菌株C58或A6接种的非转基因对照一致地表现出肿瘤形成。在易感植物上，偶尔会在7dpi观察到冠瘿形成，不过，通常在大约10dpi出现，并且在14dpi容易观察到。分析一级转化体，并发现某些一级转化体能抑制冠瘿形成。接种过的某些芽能够形成肿瘤。如果与未转化的芽相比冠瘿受到50％或50％以上的抑制即可将该植物统计为抗性的。

业已制备了对冠瘿具有抗性的品系C3309、101-14Mgt、和110R。在图2中示出了在用根瘤农杆菌菌株A6接种转基因101-14Mgt(表达virE2缺失B转基因，该转基因是由根瘤农杆菌菌株A6制备的)之后对冠瘿形成的抗性的典型结果。

另外，能表达源于根瘤农杆菌菌株C58的virE2缺失B转基因的葡萄根茎C3309由大约45％的植物表现出对冠瘿病的显著抗性(表1，见下文)。

表1

通过接种根瘤农杆菌菌株C58评价表达virE2缺失B转基因的葡萄根茎C3309转基因品系对冠瘿的抗性

品系号	植物号	对冠瘿病的抗性
			1	223，224，225，228，243	易感
2	240	抗性
			3	218，227	易感
3	169，222	抗性
			4	239	易感
5	245	抗性
			6	234，241	易感
11	235	易感
			15	226	抗性
16	171，220	抗性

在体外用根瘤农杆菌菌株C58的细菌悬浮液(大约10⁷cfu／ml)接种每一个植物的15-20个芽的切片。如果在接种之后6天所述芽接种物形成冠瘿的比率低于40％就认为该植物是抗性的。来自非转基因对照植物的芽100％的形成冠瘿。

按如下方法分析烟草对冠瘿病的抗性。让转基因烟草植物生长到6厘米大小，然后用10微升农杆菌属菌株CG49或K306的过夜培养悬浮液接种所述植物。在2-3周之后检查植物的肿瘤形成。

还评价了由农杆菌菌株C58(携带胭脂氨酸型Ti质粒)和根瘤农杆菌菌株A6(携带章鱼氨酸型Ti质粒)制备的表达virE2缺失B基因的烟草品系对冠瘿病的抗性。用葡萄农杆菌菌株CG49(携带胭脂氨酸型Ti质粒)或葡萄农杆菌菌株K306(携带章鱼氨酸型Ti质粒)接种所述植物。该实验的典型结果在下面的表2中示出。

表2

用葡萄农杆菌菌株CG49(携带胭脂氨酸型Ti质粒)和葡萄农杆菌菌株K306(携带章鱼氨酸型Ti质粒)接种能表达来自根瘤农杆菌菌株C58(携带胭脂氨酸型Ti质粒)和根瘤农杆菌菌株A6(携带章鱼氨酸型Ti质粒)的virE2缺失B转基因的转基因N．benthamiana的典型抗性资料。

植物t	virE2表达n	CG49	CG49-1	K306	K306-1	易感性
							1	Oct，++++	1．0	0	0．25	0．25	抗性
2	Oct，++	0．25	0	0．25	0．25	抗性
							3	Oct，+	2．5	2．5	1．0	1．0	易感
6	Oct，++++	1．0	0．5	0．5	0．5	抗性
							10	Oct，+++	2．0	2．0	2．0	0．75	易感
10	Oct，+++	2．0	0．5	0．75	0．25	对章鱼氨酸型质粒抗性
							30	Nop，+	0．75	．75	1．0	0．5	抗性
31	Nop，+++	2．5	2．5	3．0	3．0	易感
							32	Nop，++++	2．5	2．0	3．0	3．0	易感
34	Nop，+	0	0．5	0．5	0．25	抗性

通过Northern印迹测定virE2表达，+号的个数表示所述信号的强度。用大约为10⁷cfu／ml和大约10⁶cfu／ml的病原体浓度接种植物。0=在接种位点无冠瘿或膨胀。0．5=在接种位点有有限的小的冠瘿；而3=在接种位点有很大的冠瘿。所有非转基因对照植物都能形成2-3级的冠瘿。

在接种葡萄农杆菌属菌株CG49或葡萄农杆菌菌株k306时，能表达源于根瘤农杆菌菌株A6的章鱼氨酸virE2缺失B转基因或源于根瘤农杆菌菌株C58的胭脂氨酸virE2缺失B转基因的烟草品系表现出在冠瘿病方面有大约50％的减弱(表2，出处同上)。分离vir基因或其抗病原体片段

任何Ri或Ti质粒(例如，胭脂氨酸、vitopine、章鱼氨酸、章鱼氨酸／南瓜氨酸、leucinopine／农杆氨酸、succinamopine、或农杆氨酸型Ti质粒)均可用作vir基因或其抗病原体片的分子克隆的核酸来源。例如，vir基因(例如，virE2或virD2)的分离包括分离编码具有vir-相关结构、特性、或活性的蛋白的DNA序列。根据所披露的有关virE2的(例如，参见GenBank保藏号2773266，138480，138481，95134，77949，737146，39124，154801和154727)和virD2核苷酸和氨基酸序列(例如，参见GenBank保藏号138464，138463，138465，95129，95128，77931，95077，737141，39000，154829和154796)，可以用本领域众所周知的标准方法和技术分离vir编码序列。

在一种具体实施例中，本文所披露的vir序列可以与常规核酸杂交筛选方法一起使用。所述杂交技术和筛选方法为本领域技术人员所熟知，例如，参见Benton和Davis，科学196：180，1977；Grunstein和Hogness，Proc．Natl．Acad．Sci．USA72：396l，1975；Ausubel等，当代分子生物学方法，Wiley Interscience，纽约；Berger和Kimmel，分子克隆技术指南，1987，学术出版社，纽约；和Sambrook等，分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室出版，纽约，1989。在一种具体实施例中，可将virE2或virD2核苷酸序列的全部或部分(由Citovsky披露，见下文)用作探针筛选重组Ti质粒DNA文库中具有与virE2或virD2基因相同的序列的基因。通过噬斑或菌落杂交用标准方法检测杂交序列，例如，下文所披露的方法。

另外，使用vir基因的氨基酸序列的全部或一部分及其遗传密码，人们可以方便地设计vir-专一性寡核苷酸探针，包括vir简并寡核苷酸探针(即，特定氨基酸序列的所有可能编码序列的混合物)。所述寡核苷酸可以基于DNA链的序列和vir序列的任何合适部分。提供了设计和制备所述探针的一般方法，例如，参见Ausubel等，1996，当代分子生物学方法，Wiley Interscience，纽约和Berger和Kimmel，分子克隆技术指南，1987，学术出版社，纽约。所述寡核苷酸可用于vir基因分离，将其用作探针能够与vir互补序列杂交，或者用作引物用于各种扩增技术，例如，聚合酶链式反应(PCR)克隆方法(例如，本文所披露的方法)，如果需要，可将不同寡核苷酸探针的组合用于筛选重组DNA文库。所述寡核苷酸可以用本领域已知的方法进行可检测的标记，并用于检测来自重组DNA文库的滤膜复制体。按照本领域已知方法制备重组DNA文库，例如，参见Ausubel等(同上)，或可以从商业渠道获得。一旦鉴定了vir核苷酸序列，就按照标准方法进行克隆和操作，并用于构建本文所披露的植物表达载体。

植物转基因的构建

除了用virE2缺失B基因转基因构建体转化葡萄植物之外，还可以通过用野生型virE2基因或其它virE2突变型基因，例如，缺失C(减弱多肽ssT-DNA和NSE1结合活性，例如，通过缺失virE2基因的228-244号氨基酸)或缺失D(减弱多肽ssT-DNA和NSE2结合活性)转化所述植物还可以获得对农杆菌属感染的抗性。VirE2缺失C突变的一个例子包括生产编码缺少228-244号氨基酸的VirE2蛋白的转基因(Citovsky等，科学256：1802-1806，1992)。VirE2缺失D突变的一个例子包括生产编码缺少296-3lO号氨基酸的VirE2蛋白的转基因(Citovsky等，同上)。还可以用virD2野生型或virD2突变型基因转化葡萄植物，以便产生对农杆菌属肿瘤形成能力的抗性。VirD2基因上的突变还能减弱农杆菌属ssT-DNA的细胞核转运(例如，能够抑制T-DNA链输入植物细胞核的突变，能够增强细胞核定位信号的活性的突变，或能防止VirD2蛋白与T-链结合的突变)。

当获得了编码所需要的野生型或突变型vir基因的DNA序列时，将所述序列插入合适的植物转化载体上，用于转化葡萄植物。公众可以获得多种适于稳定或染色体外感染植物细胞或建立转基因植物的载体；如披露于下列文献中的载体：Pouwels等(同上)，Weissbach和Weissbach(同上)和Gelvin等(同上)。用于构建所述细胞系的方法披露于诸如Weissbach和Weissbach(同上)和Gelvin等(同上)的文献中。可用于在葡萄树中表达转基因的载体的例子还披露于以下文献中：Scorza等(植物细胞报导14：589-592，1995)，Baribault等(实验植物学杂志41：1045-1049，1990)，Mullins等(生物技术8：1041-1045，1990)，Nakano等(实验植物学杂志45：649-656，1994)，Kikker等(植物细胞报导15：311-316，1995)，Krastanova等(植物细胞报导1：550-554，1995)，Scorza等(植物细胞报导14：589-592，1994)，Scorza等(美国园艺科学协会杂志121：616-619，1996)，Martinelli等(理论应用遗传学88：621-628，1994)和Legall等(植物科学102：161-170，1994)。

通常，植物表达载体包括(1)一个受5’和3’表达控制序列的转录控制的克隆基因(例如，野生型或突变型vir基因)和(2)一个显性选择标记。如果需要，所述植物表达载体还可以包括一个启动子调控序列(例如，能产生诱导型或组成型、病原体或创伤诱导、环境或发育调控、或细胞或组织专一性表达的序列)，一个转录起始位点，一个核糖体结合位点，一个RNA加工信号，一个转录终止位点，和／或一个聚腺苷酸化信号。

在其组成部分中，将编码野生型或突变型vir基因的DNA序列与具有能够在宿主葡萄树细胞中启动转录的转录起始控制片段的DNA构建体结合。一般来说，该构建体通常包括能够在植物中起作用的调控区，该调控区能够改变野生型或突变型Vir蛋白的产生，如本文所披露的。所述序列、突变序列、或其片段的5’末端可以与一个转录起始调控区接合，例如，天然存在于植物结构基因的5’上游区的序列。有多种转录起始区可供使用，这些转录起始区可以提供组成型或诱导型调控。

对于需要发育、细胞、组织、激素、或环境表达的应用来说，合适的5’上游非编码区是从其它基因获得的，例如，从在分生组织发育、种子发育、胚胎发育、叶片发育、茎发育、和蔓发育期间调节的基因获得。

还可以在本发明DNA构建体上提供转录终止调控区。转录终止区可以从常规的基因来源(例如，NOS或35S CaMV终止子)任何常见转录终止区提供。所述转录终止区优选还包括至少1-3kb的获得该终止区的结构基因的3’序列。具有野生型或突变型vir基因，如用于表达的感兴趣的DNA序列的植物表达构建体可用于多种葡萄树上。所述遗传工程植物可用于多种商业和农业目的。重要的是，本发明可应用于所有葡萄树或葡萄树部分，并可方便地应用于任何新的或改进的葡萄转化或再生方法。

所述表达结构至少包括一个可操作地连接于至少一个野生型或突变型vir基因序列上的启动子。根据本发明，一种有用的植物启动子的例子是花叶病毒启动子，例如，花椰菜花叶病毒(CaMV)启动子。所述启动子能够在大多数植物组织中进行高水平表达，并且所述启动子的活性不取决于由病毒编码的蛋白。CaMV是35S和19S启动子的来源。在转基因植物的大多数组织中，CaMV35S启动子是强启动子(例如，参见Odell等，自然313：810，1985)。CaMV启动子在单子叶植物中也具有高度活性(例如，参见Dekeyser等，植物细胞2：591，1990；Terada和Shimamoto，分子基因遗传学220：389，1990)。另外，通过CaMV35S启动子的重复还可以进一步加强该启动子的活性(即提高2-10倍)(例如，参见Kay等，科学236：1299，1987；Ow等，Proc．Natl．Acad．Sci．USA84：4870，1987；和Fang等，植物细胞1：141，1989，和McPherson和Kay，US5，378，142)。

其它有用的植物启动子包括，但不限于胭脂氨酸合成酶(NOS)启动子(An等，植物生理学88：547，1988)，章鱼氨酸合酶启动子(Fromm等，植物细胞1：977，1989)，水稻肌动蛋白启动子(Wu和McElroy，WO91／09948)，环化酶启动子(Chappell等，WO96／36697)和木薯脉花叶病毒启动子(Verdaguer等，植物分子生物学31：1129-1139，1996)。可用于本发明的进一步的代表性启动子包括，但不限于鸭柘草黄斑病毒(commelina yellow mettle virus7)启动子，甘蔗badna病毒启动子，稻tungro Bacilliform病毒启元件，玉米条纹病毒元件，和小麦矮化病毒启动子。

对某些用途来说，可能需要在合适的组织中，在合适的水平上或在合适的发育时间生产野生型或突变型vir序列。为此，有一类基因启动子各自具有其自身的体现在其调节序列上的独特特征，被证实能调节对诸如环境、激素和／或发育因素的诱导信号的反应。所述启动子包括，但不限于决定热调控基因表达的基因启动子(例如，参见Callis等，植物生理学88：965，1988；Takahashi和Komeda，分子基因遗传学219：365，1989；和Takahashi等，植物杂志2：751，1992，光调控的基因表达(例如，豌豆rbcS-3A，由Kuhlemeier等披露，植物细胞1：471，1989；玉米rbcS启动子，由Schaffner和Sheen披露，植物细胞3：997，1991；存在于豌豆中的叶绿素a／b-结合蛋白基因，由Simpson等披露，EMBO杂志4：2723，1985；Arabssu启动子；或稻rbs启动子)，激素调控的基因表达(例如，源于小麦Em基因的脱落酸(ABA)效应序列，由Marcotte等披露，植物细胞：969，1989；ABA诱导型HVA1和HVA22，和rd29A启动子，由Straub等在大麦和拟南芥属上披露，植物细胞6：617，1994和Shen等，植物细胞7：295，1995；和创伤诱导的基因表达(例如，由Siebertz等披露的wunI，植物细胞1：961，1989)，器官特异性基因表达(例如，块茎特异性储存蛋白基因，由Roshal等披露，EMBO杂志6：1155，1987；和源于玉米的23-kDa玉米醇溶蛋白基因，由Schernthaner等披露，EMBO杂志7：1249，1988；或法国菜豆β-菜豆蛋白基因，由Bustos等披露，植物细胞1：839，1989)，或病原体诱导型启动子(例如，PR-1，prp-1或β-1，3葡糖醛酸酶启动子，真菌诱导型小麦wirla启动子和线虫诱导型启动子，TobRB7-5A和Hmg-1，分别来源于烟草和欧芹)。

还可以选择性地包括RNA加工信号，例如，内含子，业已证实内含子对于有效的RNA合成和积累来说是重要的(Callis，基因和发育，1∶1183，1987)。RNA剪接序列的定位对植物中的转基因表达水平有很大影响。另一方面，一个内含子可以位于转基因上vir基因序列(或其片段)的上游或下游，以便调节基因表达水平。

除了上述5’调控序列之外，所述表达载体还可以包括一般位于植物基因的3’区域的调控区(Thornburg等，Proc．Natl．Acad．Sci．USA84：744，1987；An等，植物细胞1：115，1989)。例如，在所述表达载体上可以包括3’终止子区，以便增强mRNA的稳定性。所述终止子区之一可以源于马铃薯的PⅠ-Ⅱ终止子区。另外，其它常用的终止子源于章鱼氨酸或胭脂氨酸合酶信号。

所述植物表达载体通常还含有一个显性选择标记基因，用于识别被转化过的细胞。可用于植物系统的选择基因包括编码抗生素抗性基因的基因，例如，编码对潮霉素、卡那霉素、博莱霉素、G418、链霉素、壮观霉素的抗性的基因。还可将光合作用所需要的基因在光合缺陷型品系中用作筛选标记。最后，还可将编码除草剂抗性的基因用作选择标记；有用的除草剂抗性基因包括编码膦丝菌素乙酰转移酶的bar基因，该基因能产生对广谱性除草剂BASTA(Hoechst AG，法兰克福，德国)的抗性。

另外，如果需要所述植物表达构建体可以含有一种修饰过的或完全合成的可翻译的vir基因序列(或其片段)该基因序列已经被改变以便增强该基因在植物中的性能。

分子生物学领域，特别是植物分子生物学领域的技术人员可以理解的是，基因表达水平不仅取决于启动子、RNA加工信号、和终止子元件的组合，而且取决于这些元件是如何被用于提高选择标记基因表达水平的。

葡萄树转化和再生

在构建所述植物表达载体时，可以用若干标准方法将所述载体导入植物宿主，以便产生转基因植物。所述方法包括(1)农杆菌属介导的转化(根瘤农杆菌或毛根农杆菌)(例如，参见Lichtenstein和Fuller：遗传工程，第6卷，PWJRigby著，伦敦，学术出版社，1987；和Lichtenstein，C．P．，和Draper，J，参见：DNA克隆，第2卷，D．M．Glover著，牛津，IRI出版社，1985))，(2)粒子输送系统(例如，参见Gordon-Kamm等，植物细胞2：603(1990)；或Biorad技术公报1687，同上)，(3)显微注射方法(例如，参见Green等，同上)，(4)聚乙二醇(PEG)方法(例如，参见Draper等，植物细胞生理学，23；451，1982；或例如，Zhang和Wu，理论应用遗传学76：835，1988)，(5)脂质体介导的DNA摄入(例如，参(例如，参见Freeman等，植物细生理学，25：1353，1984)，(6)电穿孔方法(例如，参见Gelvin等，同上；Dekeyser等，同上；Fromm等，自然319：79l，1986；Sheen植物细胞2：1027，1990；或Jang和Sheen植物细胞6：1665，1994)，和(7)涡旋方法(例如，参见Kindle同上)。转化方法对本发明来说并不重要。能进行有效转化的任何方法都可以使用。用于转化葡萄的某些典型方法披露于以下文献中：Scorza等(植物细胞报导14：589-592，1995，Baribault等，(实验植物杂志41：1045-1049，1990)，Mullins等(生物技术8：1041-1045，1990)，Nakano等(实验植物杂志45：649-656，1994)，Kikkert等(植物细胞报导15：311-316，1996)，Krastanova等(植物细胞报导1：550-554，1995)，Scorza等(植物细胞报导14：589-592，1994)，Scorza等(美国园艺科学协会杂志121：616-619，1996)，Martinelli等(理论应用遗传学88：621-628，1994)，和Leqall等(植物科学102：161-170，1994)。如果有比较新的方法可用于转化葡萄的话，可以直接使用。

用于实施本发明的合适的植物包括，但不限于葡萄树(例如，葡萄，杂交葡萄，和Euvitis和Muscadinia亚属的所有成员)，包括接穗栽培种或根茎栽培种。接穗栽培种的例子包括，但不限于被称作鲜食葡萄或葡萄干的品种，以及用于酿酒的葡萄，如CabernetFranc，Cabernet Sauvignon，Chardonnay(例如，CH01，CH02，CHDijon)，Merlot，Pinot Noir(PN，PN Dijon)，Semillon，WhiteRiesling，Lambrusco，Thompson Seedless，Autumn Seedless，Niagrara Seedless，和Seval Blanc．可以使用的其它接穗栽培种包括通常被称作鲜食葡萄或葡萄干的栽培种，如Alden，Almeria，AnabE-Shahi，Autumn Black，Beauty Seedless，Black Corinth，Black Damascus，Black Malvoisie，Black Prince，Blackrose，Bronx Seedless，Burgrave，Calmeria，Campbell Early，Canner，Cardinal，Catawba，Christmas，Concord，Dattier，Delight，Diamond，Dizmar，Duchess，Early Muscat，Emerald Seedless，Emperor，Exotic，Ferdinand de Lesseps，Fiesta，Flame Seedless，Flame Tokay，Gasconade，Gold Himrod，Hunisa，Hussiene，Isabella，Italia，July Muscat，Khandahar，Katta，Kourgane，Kishmishi，Loose Perlette，Malaga，Monukka，Muscat ofAlexandria，Muscat Flame，Muscat Hamburg，New York Muscat，Niabell，Niagara，Olivette Blanche，Ontario，Pierce，Queen，Red Malaga，Ribier，Rish Baba，Romulus，Ruby Seedless，Schuyler，Seneca，Suavis(IP 365) ，Thompson Seedless， 和Thomuscat。它们还包括被用于葡萄酒生产的品种，如Aleatico，Alicante Bouschet，Aligote，Alvarelhao，Aramon，Baco blanc(22A)，Burger，Cabernet Franc，Cabernet，Sauvignon，Calzin，Carignane，Charbono，Chardonnay，Chasselas dore，Chenin blanc，Clairette blanche，Early Burgundy，Emerald Riesling，FeherSzagos，Fernao Pires，Flora，French Colombard，Fresia，Furmint，Gamay，Gewurztraminer，Grand noir，Gray Riesling，GreenHungarian，Green Veltliner，Grenache，Grillo，Helena，Inzolia，Lagrein，Lambrusco de Salamino，Malbec，Malvasia bianca，Mataro，Melon，Merlot，Meunier，Mission，Montua de Pilas，Muscadelle du Bordelais，Muscat blanc，Muscat Ottonel，MuscatSaint-Vallier，Nebbiolo，Nebbiolo fino，Nebbiolo Lampia，OrangeMuscat，Palomino，Pedro Ximenes，Petit Bouschet，Petite Sirah，Peverella，Pinot noir，Pinot Saint-George，Primitivo di Gioa，Red Veltliner，Refosco，Rkatsiteli，Royalty，Rubired，RubyCabernet，Saint-Emilion，Saint Macaire，Salvador，Sangiovese，Sauvignon blanc，Sauvignon gris，Sauvignon vert，Scarlet，Seibel 5279，Seibel 9110，Seibel 13053，Semillon，Servant，Shiraz，Souzao，Sultana Crimson，Sylvaner，Tannat，Teroldico，Tinta Madeira，Tinto cao，Tourega，Tramier，Trebbiano Toscano，Trousseau，Valdepenas，Viognier，Walschriesling，WhiteRiesling，和Zinfandel。

可用于本发明的根茎栽培种包括，但不限于，沙地葡萄Constantia，沙地葡萄St．George，加州葡萄，谷地葡萄，圆叶葡萄，圆叶葡萄Carlos，Richter 11O(冬葡萄×沙地葡萄)，101-14 Millarder et de Grasset(河岸葡萄×沙地葡萄)，Teleki 5C(冬葡萄×河岸葡萄)，3309 Courderc(河岸葡萄×沙地葡萄)，Riparia Gloire de Montpellier(河岸葡萄)，5BB Teleki(选择性Kober，冬葡萄×河岸葡萄)，SO₄(冬葡萄×沙地葡萄)，41BMillardet(欧洲葡萄×冬葡萄)，和039-16(欧洲葡萄×圆叶葡萄)。可以使用的其它根茎栽培种包括Couderc1202，Couderc 1613，Couderc 1616，Dog Ridge，Foex 33EM，Freedom，Ganzin 1(A x R#1)，Harmony，Kober 5BB，LN33，Millardet＆de Grasset 41B，Millardet& de Grasset 420A，Millardet & de Grasset 101-14，Oppenheim4(SO4)，Paulsen 775，Paulsen 1045，Pualsen 1103，Richter 99，Richter 110，Riparia Gloire，Ruggeri 225，Saint-George，SaltCreek，Teleki 5A，沙地葡萄Constantia，加州葡萄，和谷地葡萄。

一般来说，在植物细胞中转移和表达转基因的方法对本领域技术人员来说是常规方法，并且，业已成为在植物中进行基因表达研究和生产农业上或商业上感兴趣的改进的植物品种的主要工具。

用植物表达载体转化的植物细胞可以按照标准植物组织培养技术从单细胞、愈伤组织、或叶片再生。本领域众所周知，几乎来自任何植物的各种细胞、组织、和器官均能成功地培养再生完整植株；所述技术披露于以下文献中：Vasil同上；Green等，同上；Weissbach和Weissbach，同上；和Gelvin等，同上。用于由转化的材料再生葡萄植物的典型方法披露于以下文献中。Scorza等(植物细胞报导14：589-592，1995，Baribault等，(实验植物杂志41：1045-1049，1990)，Mullins等(生物技术8：1041-1045，1990)，Nakano等(实验植物杂志45：649-656，1994)，Kikkert等(植物细胞报导15：311-316，1996)，Krastanova等(植物细胞报导1：550-554，1995)，Scorza等(植物细胞报导14：589-592，1994)，Scorza等(美国园艺科学协会杂志121：616-619，1996)，Martinelli等(理论应用遗传学88：621-628，1994)，和Leeall等(植物科学102：161-170，1994)。

在一种具体实施方案中，将受35S CaMV启动子和胭脂氨酸合酶终止子控制并携带选择标记(例如，卡那霉素抗性)的克隆的vir转基因构建体(例如，基于胭脂氨酸、vitopine、章鱼氨酸、章鱼氨酸／南瓜氨酸、leucinopine／农杆氨酸、succinamopine、或农杆氨酸型Ti质粒的virE2编码序列或基于存在于Ri质粒上的该编码序列的virE2、virD2、virE2缺失B、virE2缺失C、或virE2缺失E突变)转入农杆菌属。用含有载体的农杆菌属转化葡萄树是按照Scorza等所述方法进行的(美国园艺科学协会杂志121：616-619，1996)。在含有卡那霉素的植物组织培养基上培养数周之后选择推测的转化体。然后将卡那霉素抗性植物材料放置在不含激素的植物组织培养基上进行发根。

然后按照标准检测技术筛选表达所述选择标记的转基因植物对所述转基因DNA的遗传。与相同的转基因形成的其它转基因植物相比，每一个阳性转基因植物及其转基因后代是统一的。在大多数情况下，转基因DNA整合导植物基因组DNA中是偶然的。并且其整合位点能显著影响转基因表达的水平和组织和发育模式。因此，通常将多个转基因品系用于筛选每一个转基因，以便鉴定并选择具有最合适的表达形式的植物。

评价转基因品系的转基因表达水平。首先测定RNA水平上的表达，以便鉴定并定量阳性表达植株。使用RNA分析的标准技术，所述技术包括PCR扩增分析，使用为了仅仅扩增转基因RNA模板而设计的寡核苷酸引物，以及使用转基因专一性探针的溶液杂交分析(例如，参见Ausubel等，同上)。然后用上述方法分析阳性RNA植株对农杆菌感染和冠瘿形成的抗性。收集能表达virE2基因(或virD2基因)或其片段并相对于对照植物具有对冠瘿病抗性的转化的葡萄树，并将其用于本发明。

在本说明书中所提到的所有文献和专利申请都以相同的程度收作本文的参考文献，就如同每一件独立的文件或专利申请被专门和分别指明收作参考文献一样。

序列表

&#60110&#62康乃尔研究基金公司

&#60120&#62葡萄树的抗细菌性

&#60130&#6207678／030WO2

&#60150&#6260／062，246

&#60151&#621997-10-17

&#60160&#622

&#60170&#62FastSEQ for windows Version3．0

&#60210&#621

&#60211&#6229

&#60212&#62DNA

&#60213&#62人工序列

&#60220&#62

&#60223&#62合成引物

&#60400&#621

tacttaccat ggatccgaag gccgaaggc

&#60210&#622

&#60211&#6237

&#60212&#62DNA

&#60213&#62人工序列

&#60220&#62

&#60223&#62合成引物

&#60400&#622

tcttgaccat  ggctatcgat  tctcgccggc  ggaactc

Claims (24)

1．一种提供对能感染葡萄树或葡萄树部分的植物细菌病原体的抗性的方法，该方法包括以下步骤：

(a)用一个能在葡萄植物细胞中表达的vir基因或其抗病原体片段转化葡萄植物细胞；

(b)由所述葡萄植物细胞再生转基因葡萄树或转基因葡萄树部分；和

(c)选择表达所述vir基因或其抗病原体片段的转基因葡萄树或转基因葡萄树部分，其中，所述vir基因或其抗病原体片段的表达能产生对植物细菌病原体的抗性。

2．如权利要求1的方法，其中，所述vir基因或其抗病原体片段被整合到转基因葡萄树或转基因葡萄树部分的基因组中。

3．如权利要求1的方法，其中，所述vir基因是virE2。

4．如权利要求1的方法，其中，所述vir基因是virD2。

5．如权利要求1的方法，其中，所述抗病原体基因片段是virE2缺失B。

6．如权利要求1的方法，其中，所述转基因葡萄树或转基因葡萄树部分是葡萄属的一员。

7．如权利要求1的方法，其中，所述转基因葡萄树部分是体细胞胚胎，接穗、或根状茎。

8．如权利要求1的方法，其中，所述细菌病原体是农杆菌属。

9．如权利要求8的方法，其中，所述农杆菌属是葡萄农杆菌。

10．如权利要求8的方法，其中，所述农杆菌属是根瘤农杆菌。

11．如权利要求1的方法，其中，所述vir基因或其抗病原体片段的表达能减弱在所述转基因葡萄树或转基因葡萄树部分上形成冠瘿。

12．如权利要求1的方法，其中，所述vir基因或其抗病原体片段源于Ti质粒。

13．一种用vir基因或其抗病原体片段转化的转基因葡萄树或转基因葡萄树部分，其中，所述vir基因或其抗病原体片段在所述转基因葡萄树或转基因葡萄树部分中的表达提供了对植物细菌病原体的抗性。

14．如权利要求13的转基因葡萄树或转基因葡萄树部分，其中，所述vir基因或其抗病原体片段被整合到所述转基因葡萄树或转基因葡萄树部分的基因组中。

15．如权利要求13的转基因葡萄树或转基因葡萄树部分，其中，所述vir基因是virE2。

16．如权利要求13的转基因葡萄树或转基因葡萄树部分，其中，所述vir基因是virD2。

17．如权利要求13的转基因葡萄树或转基因葡萄树部分，其中，所述抗病原体基因片段是virE2缺失B。

18．如权利要求13的转基因葡萄树或转基因葡萄树部分，其中，所述葡萄树或葡萄树部分是葡萄属的一员。

19．如权利要求13的转基因葡萄树或转基因葡萄树部分，其中，所述葡萄树部分是体细胞胚胎、接穗、或根茎。

20．如权利要求13的转基因葡萄树或转基因葡萄树部分，其中，所述细菌病原体是农杆菌属。

21．如权利要求20的转基因葡萄树或转基因葡萄树部分，其中，所述农杆菌属是葡萄农杆菌。

22．如权利要求20的转基因葡萄树或转基因葡萄树部分，其中，所述农杆菌属是根瘤农杆菌。

23．如权利要求13的转基因葡萄树或转基因葡萄树部分，其中，所述vir基因或其抗病原体片段的表达能减弱冠瘿在所述转基因葡萄树或葡萄树部分上的形成。

24．如权利要求13的转基因葡萄树或转基因葡萄树部分，其中，所述vir基因或其抗病原体片段源于Ti质粒。

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