CN1279110A - 胸腺肽结肠控释胶囊制剂及胸腺肽的提取分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种胸腺肽结肠控释胶囊制剂,胶囊内容物以胸腺肽蛋白∶微晶纤维素∶干淀粉∶糊精∶羧甲基淀粉钠按重量1∶5~6.5∶17~18.5∶2~3∶1.5~2.5配制,并粘结成微粒,粘合剂是以乙醇液为溶剂的添加有Tween80的聚丙烯酸树脂。本制剂能在pH≥7.6的回盲及结肠部位释药而确保胸腺肽蛋白分子被最有效吸收。本发明还提供了用丙酮分级沉淀的优化组合提取分离胸腺肽的方法,制得的胸腺肽分子量在1000—12500Da,生物活性及收率高。
Description
本发明涉及胸腺肽结肠控释胶囊制剂,它是一种从哺乳动物胸腺组织中提取的多肽蛋白质类激素——胸腺肽的口服制剂,特别是能控制在结肠部位崩解与释药的口服胶囊制剂,属免疫(增强)类药物,本发明还涉及作为原料用于该制剂的胸腺肽的提取及分离方法。
胸腺肽是从哺乳类动物的胸腺组织中提取的一种多肽类免疫激素,故又名胸腺素,其可诱导与促进骨髓、胸腺内T细胞系统分化、发育及至成熟过程。临床上主要适用于原发及各种继发性免疫缺陷、自身免疫病、抗肿瘤、抗各种感染性疾病(如病毒性肝炎)的免疫治疗,以及其它免疫低下症。还可延缓和预防中老年人胸腺生理性退变,有抗衰、防衰的功效。1965年Goldstein从小牛胸腺的无细胞滤出液经过初步纯化,得到一个制剂,并第一次命名为胸腺素(Thymosin)。1975年Goldstein又提出了进一步的纯化方法,制备了胸腺素组分5(Thymosin F5),其分子量在1000—15000 dolton(Da)范围内分布。据认为,Goldstein的F5包括了可连续诱导、促进T细胞分化与发育的胸腺前的骨髓、胸腺内及胸腺后的周围T细胞系统的三个不同发育阶段及其不同发育环节所需的不可或缺的多肽组分。此后,许多国家开展的关于胸腺激素的研究大多集中于对F5的基础及临床应用研究。国内外众多实验室实际上已将F5视为胸腺制剂研究业已公认的“参照品”。我国八十年代初正式生产的猪胸腺素注射剂也是参照了F5方法提取。但F5方法工艺复杂,步骤繁多,蛋白收率低,最后采用以10KDa分子量的超滤膜的常规超滤工艺,由于受目前超滤技术的局限,使10KDa以下的许多组分被丢失,不仅使收率更低,而且还大大影响生物活性。又由于胸腺肽制剂是作用于T细胞系统的免疫调节药物,疗程在4—6周或更长,如此较长时期的注射治疗给病人带来不便和痛苦,使临床应用大为受限。因其系为有一定分子量的异性蛋白,长期注射使用,日后可能引起目前免疫学上尚难预知的免疫继发副反应。制剂经普通口服途径,蛋白质多肽往往在抵达回一盲部及结肠之前,就被胃酸及小肠的蛋白酶类水解。目前国内外胸腺肽口服制剂系为在小肠崩解的普通肠溶片剂或普通肠溶胶囊制剂,大部分胸腺肽在小肠段即已降解、失活,因此临床服用剂量需加大(往往加大三倍),不仅不经济,而且疗效也不佳。因而,适于多肽类肠吸收的口服制剂是人们欲努力寻求的新剂型。
本发明的目的是提供一种适于蛋白多肽类吸收的结肠靶向给药的口服新剂型——胸腺肽结肠控释胶囊制剂,以避免胸腺肽被上消化道蛋白酶类所酶解,而可控制制剂在预定的结肠或至少在回盲部位释药,使蛋白多肽在此处大部分能以整个分子形式被吸收,确保疗效。本发明的另一个目的是提供胸腺肽的提取、分离方法,它可进行组分与分子量控制、“捕捉”到与胸腺素F5组分及分子量分布范围相似的多组分肽,既有高活性,又有高收。
本发明胸腺肽结肠控释胶囊制剂采用结肠溶胶囊壳,内装有由粘合剂粘结成微粒的下列组合物:胸腺肽原粉、微晶纤维素(MCC)、干淀粉(Dry starch)、糊精和羧甲基淀粉钠,其中,胸腺肽蛋白质∶微晶纤维素∶干淀粉∶糊精∶羧甲基淀粉钠各组分的重量比为1∶5~6.5∶17~18.5∶2~3∶1.5~2.5,胸腺肽蛋白的分子量在1000~12500dolton范围内;所说的粘合剂是以浓度为90%(重量)的乙醇溶液为溶剂的聚丙烯酸树脂(即Ⅲ树脂),其中添加有Tween80,添加量为7~8ml Tween80/100g聚丙烯酸树脂。
本发明提取、分离胸腺肽的方法,以哺乳类动物的胸腺组织为原料,按下列步骤制备:
(1)原料预处理:将哺乳类动物胸腺组织剔除筋膜,漂洗后加1~2倍双蒸水,高速捣碎制成匀浆;—20℃下贮存48小时以上,反复冻融2~3次。
(2)蛋白质抽提:匀浆中加入3~5N(当量浓度)的HCl,调pH至1.5~3.5,抽提4小时,离心,取上清液。此步骤使大部分核酸沉淀除去,所得上清液为蛋白质粗提液。本步骤也可在加入HCl之前,先在匀浆中按0.30~0.65%浓度(重量)加入NaCl,搅拌溶解。此低浓度离子强度的单价钠盐有保护蛋白质及助沉剂的作用。(3)调胸腺肽等电点:在上述蛋白质提取粗提液后的滤渣中,加入0.5倍的的双蒸水,2小时后离心,在上清液中加入3~5N的NaOH,调pH值至胸腺肽的等电点5.03~5.48,静置1~3小时,离心,将沉淀物倾入蛋白质粗提液中,搅拌,用3~5N的NaOH调pH 6.0~6.5。(4)热变性除杂蛋白:上述上清液在70~85℃下保持10~15分钟,其中部分非胸腺肽杂蛋白及对热不稳定的蛋白胸腺肽沉淀,离心除去沉淀物,得上清液。此步骤使胸腺肽进一步提纯,并提高胸腺肽制剂的稳定性,延长保存期限;(5)丙酮分级沉淀胸腺肽:①上述上清液中加HCl,调pH至5.0~5.5,冷却至4~0℃,加入—10~—20℃的0.5~2.0倍(体积)冷丙酮,—10~—20℃的低温环境中0.5~1小时,迅速离心弃去沉淀物,收集上清液;②以上所得的上清液中加入—10~—20℃的2~6倍(体积)冷丙酮,置—10~—20℃的低温环境中3~4小时,入8000转/分的离心机,离心30分钟,所得沉淀物经丙酮—乙醚、乙醚分次脱水、脱脂,真空干燥后得黄色颗粒状胸腺肽原粉。
经崩解时限及释放/溶出试验证实,将本发明胸腺肽胶囊制剂分别置于pH1.2的人工胃液中2小时、pH6.8的人工小肠液中3小时后,以上两种介质中均未有蛋白检出;而在pH7.8的介质中30分钟也未能检出蛋白,但在pH7.8介质中达45分钟时,检出平行四个试验溶出杯中,平均溶出率为78.5%。表明本制剂在胃和小肠生理条件下均不会崩解,而当进入定位的结肠处即可崩解,制剂的内容物在pH<7.6介质中均不会有蛋白释出。可见,本制剂在胃和小肠的生理条件下,乃至在回盲部之前的任何肠段,其内部的药剂均不会释出,只有在进入定位的释药部位结肠处后,才可完成崩解与释药过程,蛋白才溶出并可被吸收,因此达到了结肠靶向给药的目的。本制剂中还含有肠吸收促进剂Tween80,可促进多肽蛋白被肠壁吸收。经先进的流式细胞光度术测定,日服本制剂有效剂量为15mg,此即为注射剂的剂量范围,说明本品与注射剂的临床效果相当;而目前市售的胸腺肽肠溶片临床日服量至少为本制剂的3倍以上。欧洲专利局1988年公布的TLT片剂临床日服量为本发明剂量的10倍,Tymus Mulli片剂日服量为本发明制剂的10~15倍。可见本发明胸腺肽胶囊制剂不仅服用方便,而且肠道使用药效高。
本发明提取、分离胸腺肽的方法中,采用了丙酮分级沉淀的优化组合方案,因而可有效地“捕捉”到与胸腺素F5组分及分子量分布范围均为相似的多肽组分,这是常规的超滤—冻干法所无法达到的。本发明提取的胸腺肽具有较高的生物学活性,根据体外测定活性的体外玫瑰花结试验(E—RFC%)显示,能表现活性的最低蛋白含量(浓度)愈低,表示其活力愈高,本发明制剂的该最低蛋白含量为0.01μg/ml,比胸腺肽注射剂的”质标”中规定所需蛋白含量2.5μg/ml低得多,二者相差250倍,可见本发明方法制得的胸腺肽具有的高活性。另外从3H—TdR掺入的淋巴细胞转化试验表明,本发明制备的胸腺肽仅0.039~0.312μg/ml的低浓度下即有促进ConA诱导BALB/c小鼠脾(T)淋巴细胞增殖反应的作用,也可见其生物活性之高。与F5在此浓度范围内的浓度依赖性与量效关系曲线比较,二者有可比的“迭加”现象。本发明提取胸腺肽的方法简便,蛋白收率高。据报导,采用F5方法实验室制备,每公斤胸腺组织提取最后纯化所得仅为150mg蛋白含量;而目前生产使用的常规工艺,最后采取的超滤—冻干法,产率≯3000mg蛋白含量/kg胸腺组织;而本发明方法可达5500mg蛋白含量/kg胸腺组织,可见本发明收率之高。此外,本发明采用丙酮分级沉淀所制取的多肽物质吸湿性较小,结合本胶囊制剂的辅料配伍,能有效地克服多肽蛋白本身极易引湿的难题,使本口服制剂的贮存有效期限大大延长。
图1是用本发明方法提取的胸腺肽样品的紫外线吸收扫描曲线图。
图2是本发明方法提取的胸腺肽样品HPLC分子筛层析图谱。
图1中,横座标为对胸腺肽样品进行紫外光吸收扫描的波长(nm),纵座标为吸收光即光密度值(0D)。分别在215、260、280nm处及二波峰(212.8、275.0)和一波谷(253.9)处,测知其吸光度值。图示可见,在215nm处左右的212.8处有一最大吸收峰,在280nm处左右的275nm处也可见有一较为平缓的吸收波峰。212.8nm为胸腺肽的肽键的吸收峰,275nm为其蛋白质的吸收峰。从紫外吸收鉴别可确认,此图符合典型的多肽—蛋白质的紫外吸收特征。并可算出OD215/OD260、OD215/OD280之比值,表明本发明所提取、分离的胸腺肽样品中主要为多肽。
图2中,横座标为分子筛(凝胶)层析柱样品中肽组分的出峰时间(分,min),纵座标为柱的峰高(mAU)、出峰时间与分子量有关,峰高与组分浓度度有关。在作胸腺肽样品的HPLC(高效液相色谱分析)之同时,作标准蛋白胰岛素(分子量mw5700),细胞色素C(mw12300)及牛血清白蛋白(mw67000)的HPLC图谱,遂以其分子量对出峰时间作半对数图,得到标准曲线,可查知图2中样品的诸肽组分的分子量,图示7个峰廓表明主要为7个组分,在主成分前后的中心区域,分子量分布趋于连续出峰时间为17.597min的组分峰高3.01749,峰宽1.580,面积为367.0668,占样品的百分比为13.6%,该组分的分子量为12.2KDa(千道尔顿);分子量从1~12.2KDa的肽组分占66.9%;制品中其余小于1KDa的组分占19.5%。以上分析数据表明,本发明方法所得的胸腺肽组分及分子量分布与Goldstein的F5相似(F5的分子量分布1000~15000Da)。
下面提供本发明的实施例。
实施例一 胸腺肽的提取和分离
①制备匀浆:取小牛胸腺组织10kg,剔除筋膜漂洗后得7.5kg,加入11.5kg双蒸水,入高速捣碎机制得匀浆18500ml,—20℃保持48小时,快速反复冻—融三次。②蛋白质抽提:匀浆中加入NaCl 83.2g,配成0.45%(重量)浓度;加入5N(当量浓度)的HCl溶液320ml,调pH 2.78的酸性条件下抽提4小时,离心20分钟(3500转/分),得上清液即蛋白质粗提液13500ml。③调等电点:粗提后的滤渣4500ml中,加入2200ml双蒸水,调pH3.0,浸提2小时,4000转/分的离心机离心30分,在上清液中加入浓度为5N的NaOH150ml,调pH为5.2,静置1.5小时后离心30分钟(4000转/分),沉淀物倾入步骤②的蛋白质粗提液13000ml中,加入NaOH40ml,调pH至6.3。④热变性除杂蛋白:将上述蛋白质溶液水浴加温至76℃,保温13分钟,离心30分钟(4000转/分),除去沉淀的非胸腺肽杂蛋白和对热不稳定的胸腺肽蛋白,得胸腺肽溶液12000ml。⑤蛋白质分离:上述胸腺肽溶液中加入—20℃的丙酮6000ml,—20℃下保存1小时,大分子量的多肽蛋白首先沉淀析出,离心分离,除去沉淀,得胸腺肽丙酮溶液。在该溶液中加入—20℃丙酮36000ml,—20℃下保持4小时,其间不断搅拌,随后离心30分钟(8000转/分),收集沉淀物,依次经3倍分析纯—20℃冷丙酮—乙醚(各50%)1小时,3倍分析纯室温丙酮1小时,3倍分析纯室温乙醚1小时脱水、脱脂后,真空干燥得黄色胸腺肽蛋白质原粉119000mg,用Lowry法Folin酚试剂测得其蛋白质实际含量为42.86%。
本实施例制得的胸腺肽原粉的高效液相色谱分析结果见图2。可见蛋白组分从1000~12200dolton(Da)范围内分布,其中12.2KDa组分占13.6%,1~12.2KDa组分占66.9%,其余小于1KDa的小肽组分为19.5%,显示多肽组分及分子量分布贴近国内外所公认的Goldstein的胸腺素F5。平均分子量低于10000,采用“双缩脲”反应确认样品由兰变为紫色,提示分子中有肽键;经紫外吸收鉴别确认,蛋白质的肽键在210~250nm范围内有强的紫外光吸收,紫外吸收扫描曲线(见图1)符合多肽—蛋白质的紫外吸收特征。并从OD215/OD260、OD215/OD280比值分别为8.25和6.18表明该品中主要为多肽,核酸及其降解物含量低。
实施例二 结肠控释胶囊制剂的制备
按每粒胶囊含5mg蛋白计,根据实施例一所得胸腺肽原粉的蛋白质实际含量为42.86%,则制备1000粒胶囊需取用实施例一的胸腺肽原粉12.8g,将其与微晶纤维素33.5g、干淀粉99.4g、糊精14.6g、羧甲基淀粉钠12.2g混匀,过80目筛待用;取聚丙烯酸树脂3.88g、Tween80 0.29ml,加入浓度为90%的乙醇溶液中,配制成粘合剂97ml,加入上述混合料中,粘结制成软材,过26目筛制粒,37℃真空干燥24小时,20目筛整粒后用2号结肠溶性胶囊壳灌装成1000粒胸腺肽结肠控释胶囊制剂。
Claims (3)
1.胸腺肽结肠控释胶囊制剂,其特征是结肠溶性胶囊壳内装有由粘合剂粘结成微粒的胸腺肽原粉、微晶纤维素、干淀粉、糊精和羧甲基淀粉钠组合物,其中,胸腺肽∶微晶纤维素∶干淀粉∶糊精∶羧甲基淀粉钠各组分的重量比为1∶5~6.5∶17~18.5∶2~3∶1.5~2.5,胸腺肽蛋白的分子量在1000~12500dolton范围内;所说的粘合剂是以浓度为90%(重量)的乙醇溶液为溶剂的聚丙烯酸树脂,其中添加有Tween80,添加量为7~8ml Tween80/100g聚丙烯酸树脂。
2.胸腺肽的提取分离方法,以哺乳动物的胸腺组织为原料,其特征是按下列步骤制备:
(1)原料预处理:将哺乳类动物胸腺组织剔除筋膜,漂洗后加1~2倍双蒸水,高速捣碎制成匀浆;—20℃下贮存48小时以上,反复冻融2~3次;
(2)蛋白质抽提:匀浆中加入3~5N的HCl,调pH至1.5~3.5,抽提4小时,离心,取得上清液为蛋白质粗提液;
(3)调胸腺肽等电点:在上述蛋白质提取粗提液后的滤渣中,加入0.5倍的双蒸水,2小时后离心,在上清液中加入3~5N的NaOH,调pH值至胸腺肽的等电点5.03~5.48,静置1~3小时,离心,将沉淀物倾入蛋白质粗提液中,搅拌,用3~5N的NaOH调pH6.0~6.5;
(4)热变性除杂蛋白:上述上清液在70~85℃下保持10~15分钟,离心除去沉淀物,得上清液;
(5)丙酮分级沉淀胸腺肽:①上述上清液中加HCl,调pH至5.0~5.5,冷却至4~0℃,加入—10~—20℃的0.5~2.0倍(体积)冷丙酮,置—10~—20℃的环境中0.5~1小时,离心弃去沉淀物,收集上清液;②以上所得的上清液中加入—10~—20℃的2~6倍(体积)冷丙酮,置—10~—20℃的低温环境中3~4小时,入8000转/分的离心机,离心30分钟,所得沉淀物经丙酮—乙醚、乙醚分次脱水、脱脂,真空干燥后得胸腺肽原粉。
3.根据权利要求2所述的胸腺肽的提取分离方法,其特征是步骤(2)中,在加入HCl之前,先在匀浆中按0.30~0.65%(重量)加入NaCl,搅拌溶解。
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