CN1273588C - 提取猕猴桃蛋白酶的方法 - Google Patents

Abstract

一种提取猕猴桃蛋白酶的方法，本发明采用含有0.1-0.5%的茶多酚水溶液为沉淀剂，其与果汁混合的体积比为0.8-1.1∶1。与已有技术相比，本发明具有收率高、生产工艺简便、周期短、成本低、无毒害且安全的优点，适合于猕猴桃蛋白酶的工业化生产。

Description

提取猕猴桃蛋白酶的方法

技术领域

本发明属于从猕猴桃果实中分离提取猕猴桃蛋白酶方法的改进。

背景技术

猕猴桃是一种营养价值很高的果品，被称为“V_c之王”、保健果品和太空食品。猕猴桃果实中除含有大量的Vc和多种矿物元素外，还含有大量的猕猴桃蛋白酶。猕猴桃蛋白酶是一种其活性中心含有巯基的植物蛋白酶，在医药、食品、啤酒生产、化妆美容、生化试剂等领域有广泛的用途。

中国是猕猴桃生产大国，已有两千年的栽培历史。近20年来，猕猴桃的人工栽植面积迅速扩大，目前全国总面积为87万亩，年产鲜果33万吨，猕猴桃资源十分丰富。猕猴桃果实属于呼吸跃变型的浆果，不耐贮藏，鲜果如若销售不畅，造成积压，将会造成资源上的浪费和经济上的损失。同时猕猴桃生产中每年约有20％的残次果也有待于加工利用。为了充分利用这些猕猴桃资源，可采用生物化学的方法，分离提取出其中的猕猴桃蛋白酶。通过深加工的方式，不仅可以有效地解决猕猴桃残次果的出路问题，为果农增加收入，延伸猕猴桃生产的产业链，同时也可以为市场上提供较为紧缺的猕猴桃蛋白酶的产品。

有关猕猴桃蛋白酶的分离提取技术，目前公开的报道还比较少。1986年厦门大学林沁瑛等人用硫酸铵沉淀法分离提纯猕猴桃蛋白酶(林沁瑛等，中华猕猴桃蛋白酶分离提纯及性质研究，《厦门大学学报(自然版)》，1986，25(3)：347～353)，该方法属于实验室的制备方法，所用仪器设备昂贵，制备的酶样量较少，仅供科研分析之用，无法进行工业化生产。同时提取所用的硫酸铵残留在酶品中，也限制了其酶在医药、食品中的应用。本发明人于日前提交了用氯化钠食盐沉淀法分离提取猕猴桃蛋白酶的专利申请(申请号：CN 20041002 5932.8)，该方法虽克服了已有技术的缺陷，降低了提取成本，可以进行工业化生产，酶制品也符合食品医药等用途的要求，但作为工业化的生产工艺技术，仍存在有食盐用量较大、工艺周期较长、需冰箱冷库等设备进行低温沉淀等生产性问题。

在常见的分离提取植物蛋白酶的方法中，主要是采用沉淀法，而沉淀法中最关键的技术是沉淀剂的选择。在经典的生物化学方法中，常用的沉淀剂是中性盐，如上所述的硫酸铵和氯化钠等，这些方法一直沿用了近200年。在近代对植物天然活性成分进行深入研究的过程中，人们发现茶叶中的主要活性成分茶多酚也是一种良好蛋白质沉淀剂，可用于沉淀分离蛋白质或酶。

茶多酚(简称TP，tea polypHenol)是茶叶中多酚类物质的总称，是一类分子结构中含有多个游离酚羟基的复合体。茶多酚在茶叶中的含量为18％～36％。由于茶多酚在医药、食品等领域有许多重要的用途，近年来对茶多酚化学性质的研究也逐渐深入。最初人们已经认识到茶多酚具有鞣质和单宁所特有的收剑性，即茶多酚中游离的酚羟基可以与病毒、细菌上的蛋白质结合，使细菌蛋白质发生沉淀，因而具有抗病毒杀菌作用(杨贤强等，《茶多酚化学》上海科学技术出版社，2003，44-46)。随着研究的深入，进而发现茶多酚具有多酚类化合物一个共同的化学性质：即茶多酚中大量的游离酚羟基，可以与蛋白质发生络合作用，在等电点时，就可以将蛋白质或酶从溶液中沉淀分离。

对于茶多酚络合沉淀蛋白质的化学性质的研究，Haslam E.等人(Haslam E.Plat Polyenols Vegetable Tannis Revisited，Cambridge Universitypress，1989，10，170)提出了茶多酚与蛋白质结合的理论模型及作用条件，杨贤强等人系统描述了茶多酚沉淀蛋白质的作用模式。在这些理论的指导下，近几年人们已经开始将茶多酚用于分离提取蛋白质实际工作中。但由于茶多酚在这一方面的应用研究仍处于起步阶段，可参考的实例较少，应用范围也仅局限在少数几种蛋白质中。而对于利用茶多酚分离提取猕猴桃蛋白酶，经资料检索，尚未发现有关这方面的研究报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够用于工业生产的猕猴桃蛋白酶的提取方法，使其进一步降低提取成本，并使操作更为简化，工艺周期缩短，提高酶的收率，使整个工艺过程更加适合工业化生产。

本发明提出的猕猴桃蛋白酶分离提取是采用络合沉淀法，方法步骤包括有：果汁与沉淀剂的混合，静置沉淀，固液分离，干燥粉碎；本发明的特点在于，所使用的沉淀剂为含有茶多酚的水溶液，其茶多酚含量的重量比为0.1％～0.5％，其与猕猴桃果汁混合的体积比为0.8～1.1∶1。所述含有茶多酚水溶液的配制可以采用粉未状商品茶多酚，用水配制成0.2％～0.5％(w/w)的水溶液，其与猕猴桃果汁混合的体积比为0.8～1∶1；含有茶多酚的水溶液也可以采用茶叶制成的茶叶水，其中茶多酚的含量(w/w)为0.1％～0.4％，其与猕猴桃果汁混合的体积比为0.9～1.1∶1。

本发明所述的络合沉淀是，在猕猴桃果汁中加入含有茶多酚的水溶液后，茶多酚便会与猕猴桃蛋白酶发生络合反应，形成茶多酚—蛋白质的复合物，进而凝集产生絮状沉淀，从而使猕猴桃蛋白酶从溶液中沉淀析出。

本发明所述的常温静置沉淀是，蛋白酶的沉淀析出过程是在室温条件下进行，即将含有茶多酚的水溶液与猕猴桃果汁混合后放在室温条件下，2～4小时后即可完成沉淀析出。一般情况下，若使用的沉淀剂是商品茶多酚，所需的沉淀时间较长，最低沉淀时间为4小时；若使用的沉淀剂是新鲜茶叶水，所需的沉淀时间较短，最低沉淀时间为2小时。

本发明所述的固液分离、干燥粉碎及乙醇提纯均采用已有技术。

本发明沉淀时对于混合液中的等电点并无严格要求。由于茶多酚络合沉淀蛋白质的能力较强，等电点对于协助沉淀蛋白质的作用微弱，所以要求的pH值范围较宽，一般情况下，调整混合液的pH值至3.0～5.5均可。为规范操作，可以调pH值至5.0为宜。

在实际生产操作中，为了更好地在室温条件下完成操作，当榨取的猕猴桃果汁不能及时进行处理且室温过高时(20℃以上)，可以向果汁中加入8％～12％(w/v)的食盐以利于果汁存放。加入氯化钠的目的一方面可以起防腐作用，同时氯化钠也可作为沉淀剂起到助沉作用，使形成的沉淀更彻底，以提高酶的收率。

本发明采用络合沉淀法所依据的原理是：茶多酚是近年发展起来的一种新型沉淀剂，对蛋白质的沉淀能力强，沉淀效率高。茶多酚是多酚类化合物，所含大量的游离酚羟基可以与蛋白质发生络合作用，将茶多酚与蛋白质所形成的复合物在等电点下沉淀析出，就可以达到分离提取蛋白质或酶的目的。关于茶多酚与蛋白质结合的理论模式，Haslam E.提出的模式是：多酚类与蛋白质结合的主要形式是氢键，即多酚中的酚羟基-OH与蛋白质肽链上的-NH-CO-以及与侧链上的-OH、-NH₂、-COOH等以氢键形式结合。杨贤强等人进一步解释了多酚类与蛋白质之间的结合模式可以是多点疏水键与氢键的结合，即多酚分子中的疏水基团进入蛋白质分子中的疏水部位，然后多酚上的酚羟基与蛋白质分子中的极性基团(如肽基-NH-CO、羟基-OH、羧基-COOH等)发生两点以上的多位点氢键结合，从而使多酚与蛋白质之间形成一种稳定结合。

本发明采用茶多酚作为蛋白质沉淀剂，具有以下明显优势：①茶多酚是茶树的次级代谢产物，在茶叶中的含量相当高(18％～36％)。属于植物天然活性成分，食品级原料，无毒无害，符合医药食品特殊的安全卫生要求，因此适合用作提取猕猴桃蛋白酶，本发明中的茶叶可以是低档茶、茶梗、茶末等。②茶多酚沉淀分离蛋白酶的效力高，且用量少，形成的沉淀物密集彻底，易于过滤，且形成沉淀所需的时间短，使整个工艺周期缩短。③茶多酚对于生物大分子具有抗氧化和保护作用，可以稳定酶活性；由于猕猴桃蛋白酶属于巯基植物蛋白酶，其巯基易被氧化而失活，本发明将茶多酚用于酶的分离提取，可以使酶活性中心的巯基得到保护，因而具有特殊的意义。④茶叶是广泛种植的饮用性植物，中国是茶叶生产大国，每年均有大量的中低档茶及茶梗、茶未，原料资源十分充足，将其作为沉淀剂使用，可提高茶叶产业的综合经济效益。

由以上可看出，本发明所提出猕猴桃蛋白酶的提取方法具有以下特点：

1)用茶多酚作为沉淀剂分离提取猕猴桃蛋白酶，既可以降低食盐用量或不用食盐，又可以省略脱盐步骤，减少工艺操作环节；

2)由于茶多酚对蛋白质的沉淀能力较强，所需的沉淀时间短，由盐析法的12小时减少为2～4小时；而且过滤速度加快，使整个工艺周期缩短；

3)本发明中的沉淀过程是在常温下进行(盐析法是在低温下进行)，因此，生产中不必投入冰箱、冷库等大型设备；

4)降低了提取成本，与食盐沉淀法相比，使用商品茶多酚可降低固定成本10％以上，使用茶叶水可降低固定成本20％以上；

5)提高了酶的收率，在以下几种提取方法中，猕猴桃蛋白酶的粗酶收率分别为：食盐沉淀法为1.22％，使用商品茶多酚为1.46％，使用茶叶水为1.52％，使用茶叶水并加入食盐为1.76％；

6)本发明直接用现场熬制的茶叶水分离沉淀猕猴桃蛋白酶，这样做不仅原料易得、价格便宜、且茶多酚未经分级纯化，分子量范围广，其沉淀蛋白质的效果更好；同时，直接使用茶叶水可以避免商品茶多酚所含分散剂对酶制品纯度的影响。

具体实施方式

实例1  取新鲜猕猴桃果汁1L，将配制的0.3％茶多酚水溶液800ml(无锡绿宝公司生产的粉未状茶多酚)与其混合，搅拌均匀，调整混合液的PH值至5.0，在室温下静置沉淀4小时以上，絮状凝聚物沉淀于容器底部。弃去上清液，将下层稀酶糊转入布氏漏斗中进行抽滤，收集漏斗中的沉淀物进行真空干燥，经球磨机粉碎并过筛，得到猕猴桃蛋白酶粗酶干制品14.6克，其粗酶收率为1.46％。

实例2  取新鲜猕猴桃果汁1L与自制茶叶水1L(用陕青茶22g，加入1500ml水，煮沸3分钟，保温浸泡20分钟后过滤，得到茶多酚含量约0.15％的茶叶水。通常茶多酚的溶出率为10％左右)混合，搅拌均匀，调整混合液的pH值至4.5，在室温下静置沉淀2小时以上，弃掉上清液，将下层稀酶糊进行抽滤，收集沉淀物进行真空干燥，经球磨机粉碎并过筛，得到猕猴桃蛋白酶粗酶干制品15.2g，粗酶收率为1.52％。

实例3  取新鲜猕猴桃果汁2L，加入食盐(NaCl)200g，搅拌溶解后，可在室温下保存1-3天。取实例2自制的茶叶水1.8L，与猕猴桃果汁混合均匀，调整pH值至4.0，室温下静置沉淀3小时，弃去上清液，将底部稀酶糊减压抽滤，得到猕猴桃蛋白酶粗酶湿品62.8g。取其中31.4g进行真空冷冻干燥，然后进行球磨粉碎并过筛，得到猕猴桃蛋白酶粗酶干制品17.6g，其粗酶收率为1.76％；将剩余的31.4g粗酶湿品，进行乙醇提纯，加入800ml的80％(V/V)的乙醇溶液使粗酶溶解，搅拌均匀，转入离心管在4000r/min速度下离心15分钟，移去上清液，收集底部的沉淀物，进行真空冷冻干燥，用研钵磨碎并过筛，得到猕猴桃蛋白酶纯酶干制品10.7g，其纯酶的收率为1.07％。

Claims (5)

1、一种提取猕猴桃蛋白酶的方法，是采用络合沉淀法，方法步骤包括有：果汁与沉淀剂的混合，静置沉淀，固液分离，干燥粉碎；其特征在于：所使用的沉淀剂为含有茶多酚的水溶液，其茶多酚含量的重量比为0.1～0.5％，其与果汁混合的体积比为0.8～1.1∶1。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的含有茶多酚的水溶液是采用商品茶多酚配制的0.2～0.5％的水溶液，其与果汁混合的体积比为0.8～1∶1；其静置沉淀是在室温条件下静置不低于4小时。

3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的含有茶多酚的水溶液是采用茶叶制成的茶多酚含量为0.1～0.4％的茶叶水，其与果汁混合的体积比为0.9～1.1∶1；其静置沉淀是在室温条件下静置不低于2小时。

4、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在静置沉淀前调整混合液的pH至3.0～5.5。

5、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在果汁与沉淀剂混合前允许果汁中含有8～12％重量体积比的食盐。