CN1271082C - 一种磺化甾醇、其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于化学领域，具体的说，本发明提供了一种新的磺化甾醇及其制备方法。更具体的说，本发明提供了磺化甾醇Arenicolsterol A，并通过质谱、核磁共振谱和红外波谱等多种波谱的测定确定了它的结构。本发明还提供了Arenicolsterol A的一种制备方法。细胞毒模型的药理学研究结果表明，Arenicolsterol A具有很好的抗肿瘤生物活性，将其制成药物，将为癌症的预防和治疗提供一种新的途径。
Description
发明领域
本发明属于化学领域，具体的说，本发明提供了一种新的磺化甾醇、其制备方法的应用。
背景技术
甾醇是天然产物中普遍存在的一类化合物，但其中的磺化甾醇相对较少存在(Tetrahedron 2001，57，4091-4094；.J.Med.Chem.1994，37，793-797；.J.Org.Chem.1987，52(18)，3947-3951.；C.J.Org.Chem.1998，63，7382-7388.)。从海绵和海星中提纯得到的几种磺化甾醇类化合物Toxiusol具有抗HIV-1和HIV-2活性(J Med Chem，1994，37(6)，793-7)，该文中所有提及甾醇类化合物均显示对HIV-1的逆转录酶(RT)活性具有抑制作用，文献还提到Toxiusol可发展成为潜在高特异性抗RT化合物，因为它强烈抑制逆转录酶活性，而不抑制DNA聚合酶活性。
然而，到目前为止，还没有报导公开过本发明的磺化甾醇。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种新的磺化甾醇。
本发明的另一个目的是提供一种该磺化甾醇的制备方法。
本发明的再一个目的是提供一种上述磺化甾醇的应用。
本发明提供了一种新的磺化甾醇，它被命名为Arenicolsterol A(海蚯蚓磺化甾醇A)，其分子式为C28H45O5SNa，熔点为169～171℃，分子量为517。其结构如图1所示。
本发明Arenicolsterol A的结构是通过核磁共振和高分辨电喷雾质谱(HRESIMS)数据测定的。
HRESIMS给出的分子离子峰为m/z 539.7043([M+Na]，Δ-1.8mmu)。核磁共振具体数据见表1。
表1.Arenicolsterol A的核磁共振数据
| C# | δC | δH | HMBC | mult，J(Hz) |
| 1α1β2α2β34α4β56α6β7891011α11β12α12β131415α15β16α16β17 | 21.031.875.739.331.829.2121.4141.140.342.237.137.336.549.935.424.435.4 | 0.981.501.401.883.822.342.121.921.501.815.182.340.871.501.01.800.991.641.301.590.991.59 | C2，C10C3，C1C3，C5C8，C9，C14C7，C8，C12C9C18C8，C18C17C17C16，C21，C22 | mmmmmmmmdd，3，5mdd，4，6mmmmmmmmm |
| 1819202122232425262728 | 12.419.339.919.0121.5175.356.344.819.419.320.1 | 0.730.932.120.985.271.01.150.840.820.84 | C12，C13，C14，C17C1，C5，C9，C10C17，C20C20，C23，C24C28C24C24，C25C24，C25C24 | s，3Hs，3Hmd，3H，8d，5mmd，3H，7d，3H，7d，3H，7 |
本发明还使用电喷雾质谱(EIMS)和一维及二维核磁共振谱进一步确定了其结构。
ESIMS/MS给出m/z 142.9([NaHSO4+Na]+)的碎片离子，以及EIMS给出m/z396的碎片离子(正好对应样品分子失去NaHSO4后的部分)都进一步证实了本发明Arenicolsterol A分子式的正确性。此分子式含有六个不饱和度，包括四个环和两个双键。红外波谱存在1246cm-1的强吸收带，对应于磺酸基团的特征吸收峰。
Arenicolsterol A的平面结构通过解析同核和异核二维核磁共振谱得以确立。一维氢核磁共振谱1HNMR含有两个甲基单峰信号(δ0.73，0.93ppm)，四个甲基双峰信号(δ0.98，0.84，0.82，0.84ppm)，一个氧次甲基信号(δ3.82ppm)和两个三取代烯质子信号(δ5.18，5.27ppm)。碳核磁共振谱(CNMR)中烯碳信号(δ175.3)的存在表明了磺酸钠基团OSO3Na是同烯碳相连的，这也解释了没有氧次甲基同磺酸钠基团OSO3Na相连，同时也解释了三取代质子(δ5.18ppm)具有的双峰信号和三取代质子(δ5.27ppm)具有的多重峰信号。具体结果可见图2。
环A/B系统的排列由HMBC(异核多键相关谱)相关和COSY(同核位移相关谱)相关得以确立。HMBC相关为Me-19到C-1，C-5，C-9和C-10的相关以及H-7到C-8，C-9和C-14的相关；COSY相关为从H1α和H1β经过H2α和H2β，H-3，H4α和H4β，H-5，H6α和H6β到H-7的依次两两相关。环C/D系统的排列也由HMBC相关和COSY相关确立。HMBC相关为Me-18到C-12，C-13，C-14和C-17，以及C-9到H-11和H-12；COSY相关为从H-14经过H15α和H15β，H16α和H16β，H-17的依次两两相关。Δ7(8)双键的位置由从H-7到C-8，C-9和C-14的HMBC相关得以证实。侧链的结构仍由HMBC相关和COSY相关推得。COSY相关为H-20到H-17，H-21，H-22，和从H-25到H-24，Me-26与Me-27，以及Me-28到H-24的两两相关；HMBC相关为从C-23到H-22和H-24的相关。
Arenicolsterol A的相对立体化学通过NOESY(二维偶极偶合相关谱)相关数据得以确立，如图3所示。通过从Me-19到H-4β和H-6β的NOE相关可以确立环A/B的反式连接排列；而从Me-18到H-11β和H-15β且不到H-12的NOE相关可知C/D环系统也是反式连接。羟基的相对立体化学被确定为3β位是由于H-4α和H-3之间存在NOE相关。侧链的相对立体化学根据NOESY数据被推得为20R和24S构型，这同stellasterol的情况也是一致的(J.Med.Chem.1994，37，793-797)。Stellasterol的结构见图4。
本发明还提供了Arenicolsterol A的一种制备方法，该方法包括：
(1)将沙蠋属无脊椎动物组织干燥后用极性有机溶剂浸泡提取；
(2)将(1)得到的提取物真空干燥后分散在水中；
(3)将(2)的产物先后用C3-C6的酯和C3-C7的醇萃取；
(4)将上述C3-C7的醇溶解部分进行液相色谱分离；
(5)将(4)的产物重结晶，得到权利要求1所述的磺化甾醇。
本发明中使用的沙蠋属无脊椎动物是可以是海蚯蚓。在本发明的一个实施例中，采用了采集自中国大陆东海岸的海蚯蚓(Arenicola cristata)。
本发明中用于浸泡沙蠋属无脊椎动物组织的有机溶剂是沸点为40-80℃的极性有机溶剂，可在室温下挥发且不影响Arenicolsterol A分子结构。可采用的有机溶剂如乙醇及其水溶液等。有机溶剂/水溶液的浓度视具体实验条件而定。以乙醇水溶液为例，浓度较适宜采用60％-95％，更好的采用75-85％。本发明中通过制备方法步骤(1)得到的提取物是无色玻璃态固体。
本发明中制备方法步骤(2)中用于分散提取物的水可以采用蒸馏水、双蒸水、三蒸水等。使用的水越不纯，对后续的纯化步骤要求越高。本发明专利的一个实施例中采用去离子水。
本发明中使用的本发明中使用的C3-C6的酯和C3-C7的醇用于初步分离Arenicolsterol A与动物组织提取物中的其他成分，以去除动物组织提取物中的大部分杂质。C3-C6的酯可采用甲酸乙酯、乙酸乙酯或丙酸丁酯等，C3-C7的醇可采用丙醇、丁醇或戊醇等。
本发明中使用的液相色谱可采用硅胶色谱、凝胶色谱和高效液相色谱等。
本发明中硅胶色谱的使用是为了将提取物中各组分按极性进行分离。可使用内径为4厘米-8厘米的硅胶柱，并用体积比为20∶1的氯代甲烷/甲醇逐级添加甲醇到100％甲醇进行连续梯度洗脱。
本发明中凝胶色谱是为了进一步纯化样品，可以采用葡萄糖凝胶色谱，以体积比为7∶6-7∶1的氯代甲烷/甲醇作为流动相。
本发明采用高效液相色谱作最后的纯化处理，以体积比为5∶4-10∶3的甲醇水溶液作为高效液相色谱流动相。通过多次反复分离后得到纯的Arenicolsterol A。
本发明还提供了一种磺化甾醇Arenicolsterol A的应用，即将该磺化甾醇用于制备抑制肿瘤的药物。
细胞毒模型的药理学研究结果表明，本发明的Arenicolsterol A具有很好的抗肿瘤生物活性，将其制成药物，将为癌症的预防和治疗提供一种新的途径。
附图说明
图1是Arenicolsterol A的分子结构式。
图2是Arenicolsterol A分子结构中的重要HMBC相关图。一维氢核磁共振谱1HNMR含有两个甲基单峰信号(δ0.73，0.93ppm)，四个甲基双峰信号(δ0.98，0.84，0.82，0.84ppm)，一个氧次甲基信号(δ3.82ppm)和两个三取代烯质子信号(δ5.18，5.27ppm)。碳核磁共振谱13CNMR中烯碳信号(δ175.3)的存在表明了磺酸钠基团OSO3Na是同烯碳相连的，这也解释了没有氧次甲基同磺酸钠基团OSO3Na相连，同时也解释了三取代质子(δ5.18ppm)具有的双峰信号和三取代质子(δ5.27ppm)具有的多重峰信号。
环A/B系统的排列由HMBC相关和COSY相关得以确立。HMBC相关为Me-19到C-1，C-5，C-9和C-10的相关以及H-7到C-8，C-9和C-14的相关；COSY相关为从H1α和H1β经过H2α和H2β，H-3，H4α和H4β，H-5，H6α和H6β到H-7的依次两两相关。环C/D系统的排列也由HMBC相关和COSY相关确立。HMBC相关为Me-18到C-12，C-13，C-14和C-17，以及C-9到H-11和H-12；COSY相关为从H-14经过H15α和H15β，H16α和H16β，H-17的依次两两相关。Δ7(8)双键的位置由从H-7到C-8，C-9和C-14的HMBC相关得以证实。侧链的结构仍由HMBC相关和COSY相关推得。COSY相关为H-20到H-17，H-21，H-22，和从H-25到H-24，Me-26与Me-27，以及Me-28到H-24的两两相关；HMBC相关为从C-23到H-22和H-24的相关。
图3是Arenicolsterol A的分子结构中的NOESY相关图。通过从Me-19到H-4β和H-6β的NOE相关可以确立环A/B的反式连接排列；而从Me-18到H-11β和H-15β且不到H-12的NOE相关可知C/D环系统也是反式连接。羟基的相对立体化学被确定为3β位是由于H-4α和H-3之间存在NOE相关。侧链的相对立体化学根据NOESY数据被推得为20R和24S构型，这同stellasterol的情况也是一致的。
图4是Stellasterol的分子结构式。
图5Arenicolsterol A对子宫颈癌细胞(Hela)和非小细胞肺癌细胞(NCI-h6)的生长抑制作用图。人肺成纤维细胞(929)为对照。MTT方法检测表明，不同浓度的Arenicolsterol A对癌细胞均有一定的抑制作用。浓度达8μg/ml时，对Hela细胞的抑制率为98.44％，对NCI-h6细胞的抑制率为51.8％，对929细胞的抑制率为66.4％(图5)。
下面用实施例进一步说明本发明。文中所用比例均为体积比。
具体实施方式
实施例一 磺化甾醇的制备
(1)原材料
以海蚯蚓Arenicola cristata为原料，于2002年冬季在位于中国浙江省东海岸的舟山岛沙滩上采集而得。样品采集后立即冷冻保存。
(2)样品的分离和纯化
在化合物的分离和纯化过程中使用的所有溶剂在用前均已重蒸。所有核磁共振实验均在Varian-Inova-400MHz核磁共振仪上进行，应用DEPT实验测定碳的多重性。电喷雾质谱(ESIMS)数据在Q-TOF micro YA019质谱仪上获得。EI数据在Agilent 5973N MSD型质谱仪上获得。旋光度数据在波长为589nm下在Rudulph Autopol III型的旋光仪上测的。红外波谱记录在Nicolet Impact 420型傅利叶变换红外波谱仪上。
烘干的海蚯蚓样品(干重5000g)切碎后用85％的乙醇水溶液提取，得到500g的有机提取物的乙醇浓缩液，然后分散在1升水中，先后用乙酸乙脂和正丁醇萃取。正丁醇层溶液用旋转蒸发仪在真空下抽干后加样到内径为8cm的硅胶柱上进行色谱分离，采用从9∶1CH3Cl/MeOH到MeOH的连续梯度洗脱。其中的6∶4CH3Cl/MeOH洗脱液在真空下浓缩后加样到Sephadex LH20凝胶柱((Pharmacia，2.5cm×200cm，流速5mL/min)上，以6∶4CH3Cl/MeOH为流动相进行凝胶色谱分离，获得13个分离片断。我们对最后一个分离片断进行高效液相色谱分离，色谱柱采用Supelco C-18HPLC柱(4.5mm×250mm)，流动相为7∶3MeOH/H2O体系。经过多次反复分离后得到纯的Arenicolsterol A(16mg)。
所得Arenicolsterol A的特征为：无色玻璃态固体；[α]D＝+7.8°(c 0.28，MeOH)；熔点：169~171℃。UV(MeOH)250nm；IR(KBr)3488，2952，2871，1643，1246cm-1；1HNMR(400MHz，DMSO-d6)参见表1；13CNMR(100MHz，DMSO-d6)参见表1；HRESIMS m/z 539.7043[M+Na].
实施例二 Arenicolsterol A对癌细胞生长的抑制作用
非小细胞肺癌细胞(NCI-h6)、子宫颈癌细胞系(Hela)和正常的人肺成纤维细胞系(929)均购自中国科学院上海细胞生物学研究所。所有的细胞系均培养在Dulbecco修正的Eagle培养液(含有1％的非基本氨基酸和10％的小牛血清)中，培养环境是在37℃下潮湿的5％的二氧化碳气氛。
两千个NCI-h6细胞、Hela细胞或人肺成纤维细胞接种在96孔平底板中。第二天，在培养板中加入不同浓度的Arenicolsterol A，每一浓度下的平行样为三个，然后将培养板置入具有37℃下潮湿的5％的二氧化碳气氛的恒温培养箱中培养48个小时。此后，弃去残余培养液并加入100μL的MTT溶液(MTT购自Sigma公司，500μg溶解在1倍的Dulbecco修正的Eagle培养液中)，在恒温培养箱中培养四个小时。再弃去培养液并加入150μL DMSO的PBS溶液。在室温下温和振摇10min后由酶标仪(Bio-Rad)在波长570nm下记录吸光度。每一次做三个平行试验并重复三次。为了更好地分析样品的细胞毒活性，我们也利用显微成像系统拍摄了不同浓度下的细胞照片，显微成像系统由Sony电视监视器、CCD彩色数码照相机(Sony DXC-93OP)和Leica DMR显微镜。
MTT方法检测表明，不同浓度的Arenicolsterol A对癌细胞均有一定的抑制作用。浓度达8μg/mL时，对Hela细胞的抑制率为98.44％，对NCI-h6细胞的抑制率为51.8％，对929细胞的抑制率为66.4％(图5)。计算ArenicolsterolA对Hela、NCI-h6和929细胞的半数抑制率(IC50)分别为3.1±0.6μg/ml，7.6±0.8μg/ml和5.6±0.5μg/ml。相似结果由两次三组平行样的独立试验获得(结果见表2)。
表2Arenicolsterol A对Hela干细胞集落形成的影响(以929细胞系为对照细胞)
| 分组 | 浓度(μg/ml) | 集落数(个/皿) | 抑制率(×10-2) |
| 对照(Hela)a(Hela)b(Hela)c(Hela)对照(929)a(929)b(929)c(929) | -6μg/ml3μg/ml0.6μg/ml-6μg/ml3μg/ml0.6μg/ml | 224.50±9.52004.20±1.32112.60±11.46035.35±5.2392.30±8.32 | -10010098.13-10068.6118.03 |
Claims (12)
1.一种磺化甾醇，其特征在于，它的分子式为C28H45O5SNa，分子量为516.7145，结构为：
2.一种如权利要求1所述磺化甾醇的制备方法，其特征在于，该方法包括：
(1)将沙蝎属无脊椎动物组织干燥后用使用极性有机溶剂浸泡提取；
(2)将(1)得到的提取物真空干燥后分散在水中；
(3)将(2)的产物先后用C3-C6的酯和C3-C7的醇萃取；
(4)将上述C3-C7的醇溶解部分进行液相色谱分离；
(5)将(4)的产物重结晶，得到权利要求1所述的磺化甾醇。
3.如权利要求2所述方法，其特征在于，该方法中(1)中使用的沙蝎属无脊椎动物是海蚯蚓。
4.如权利要求2所述方法，其特征在于，该方法中(1)中使用的有机溶剂是沸点为40-80℃的极性有机溶剂。
5.如权利要求2所述方法，其特征在于，该方法中(2)中使用的水为去离子水。
6.如权利要求2所述方法，其特征在于，该方法中(3)中使用的C3-C6的酯是甲酸乙酯、乙酸乙酯或丙酸丁酯。
7.如权利要求2所述方法，其特征在于，该方法中(4)中使用的液相色谱包括硅胶色谱、凝胶色谱或高效液相色谱。
8.如权利要求2所述方法，其特征在于，该方法中(3)中使用的C3-C7的醇是丙醇、丁醇或戊醇。
9.如权利要求7所述方法，其特征在于，该方法中硅胶色谱使用内径为4厘米-8厘米的硅胶柱，并用体积比为20∶1的氯代甲烷/甲醇逐级添加甲醇到100％甲醇进行连续梯度洗脱。
10.如权利要求7所述方法，其特征在于，该方法中凝胶色谱为葡萄糖凝胶色谱，以体积比为7∶6-7∶1的氯代甲烷/甲醇作为流动相。
11.如权利要求7所述方法，其特征在于，该方法中以体积比为5∶4-10∶3的甲醇水溶液作为高效液相色谱流动相。
12.一种如权利要求1所述磺化甾醇的应用，其特征在于，将该碘化甾醇用于制备抑制肿瘤的药物。
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