CN1262649C

CN1262649C - 重组生产人甲状旁腺激素衍生物的方法及所用表达载体

Info

Publication number: CN1262649C
Application number: CN 02151706
Authority: CN
Inventors: 陈松森; 狄旭; 刘长征; 张艳丽; 邓艳春
Original assignee: Institute of Basic Medical Sciences of CAMS
Current assignee: Institute of Basic Medical Sciences of CAMS
Priority date: 2002-12-31
Filing date: 2002-12-31
Publication date: 2006-07-05
Anticipated expiration: 2022-12-31
Also published as: CN1511949A

Abstract

本发明涉及一种高效重组生产甲状旁腺激素衍生物的方法及所用表达载体。更具体地，本发明涉及通过将人甲状旁腺激素(PTH)(1-34)与缩短型配体蛋白的融合基因进行表达而高效生产人PTH(1-34)的方法及所得产物，本发明还涉及所述融合基因及包含该融合基因的表达载体。

Description

重组生产人甲状旁腺激素衍生物的方法及所用表达载体

技术领域

背景技术

甲状旁腺激素(PTH)是含有84个氨基酸的哺乳动物甲状旁腺的分泌产物，它的主要生理功能是通过调节骨细胞和肾细胞维持血钙平衡。PTH是调节钙磷代谢的重要肽类激素，它既可刺激破骨细胞的增殖及其对老化骨质的分解，又具有促成骨细胞合成新骨的作用。实验证明PTH可以激活成骨细胞的活性，分解吸收老化骨质，增加骨质量及骨质密度。同时PTH可以促进肾小管细胞对钙离子的再吸收，激活肾皮质细胞产生1α羟化酶，将25(OH)₂D₃羟化成1，25(OH)₂维生素D₃，从而促进小肠上皮细胞对钙离子的吸收，为骨细胞合成新骨提供物质基础。提示PTH很有希望开发为一种治疗骨质疏松症的理想药物。

天然牛、猪和人类的PTH含有84个氨基酸，简称PTH(1-84)，分子量9500道尔顿。PTH的氨基端是活性端，与靶组织受体结合后引起生物效应，羧基端不具有生物活性。现已证明，只要具有PTH氨基端的1-34个氨基酸片段即有完全的PTH生物学活性，甚至比PTH(1-84)活性更强。人工合成的PTH(1-34)的动物和临床实验结果也表明其生物活性强于天然PTH(1-84)。但人工合成PTH(1-34)成本高、价格昂贵且对环境会造成有害影响。应用基因工程方法在大肠杆菌细胞中表达生产人PTH(1-84)及其衍生物PTH(1-34)是解决这个问题的有效途径。现有研究结果表明因衍生物PTH(1-34)分子量小，在CHO细胞、大肠杆菌和酵母体系中均未获高效表达。PTH(1-34)目前均以融合蛋白形式表达，例如与β-半乳糖苷酶、谷胱甘肽转移酶(GST)或硫氧还原蛋白(TRX)融合，然后融合蛋白用酶或溴化氰切割。使用酶解法成本高，不利于大规模生产。溴化氰裂解法对环境有污染。另外，目前融合蛋白法生产PTH(1-34)的产量也不高。因此，现有技术中仍迫切需要高效生产PTH(1-34)的新方法。

发明内容

本发明提供了一种高效生产PTH(1-34)衍生物的新方法，所述方法是将编码人类PTH(1-34)的DNA与缩短型的谷胱甘肽S转移酶(GST)基因融合形成融合基因，该融合基因从5′至3′方向依次含有缩短型的谷胱甘肽S转移酶基因、编码羟胺裂解位点Asn-Gly的接头序列以及编码人类PTH(1-34)的DNA，将该融合基因在大肠杆菌中表达，用羟胺切割所表达的融合蛋白，分离纯化切割得到的人类PTH(1-34)衍生物。本发明的人类PTH(1-34)衍生物与天然人类PTH(1-34)相比在N末端添加了一个甘氨酸残基(Gly)，简称为Gly-hPTH(1-34)。

根据本发明，所用的缩短型GST基因(本文中称作GST69Δ基因)仅保留了编码正常天然GST的69个氨基酸(位于N端1-69位氨基酸)的核酸片段。另外，为进行羟胺切割，在人类PTH(1-34)的N端之前引入了两个氨基酸残基Asn Gly，以构成羟胺切割位点(Asn-Gly)，切割后得到人PTH(1-34)的衍生物Gly-hPTH(1-34)，该衍生物也是本发明的一部分，其编码核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。为了提高表达量，本发明还采用了大肠杆菌偏爱密码修改合成编码人PTH(1-34)的DNA片段。

本发明还涉及包含上述融合基因的表达载体，在本发明的一个实施方案中，所述表达载体为pGEX-GST69Δ-NG-hPTH，如图1所示。

与现有技术相比，本发明具备如下优点：本发明选择缩短型GST69Δ为配体蛋白，使PTH(1-34)在融合蛋白中的比例从原来的14％提高到34％(质量比)，大幅度提高了PTH(1-34)的相对产量。另外，本发明采用羟胺裂解融合蛋白，该法经济、切割效率高，不会造成环境污染，从而适于产业化生产。

附图说明

图1为本发明的表达载体pGEX-GST69Δ-NG-hPTH的构建示意图。

图2示出了本发明的人甲状旁腺激素衍生物Gly-hPTH(1-34)的核苷酸序列和氨基酸序列。箭头示出羟胺切割位点，·示出与天然hPTH(1-34)不同的核苷酸。

图3示出SDS-PAGE鉴定的Gly-hPTH(1-34)衍生物的纯化。其中泳道1为包含体盐酸羟胺裂解产物，2为分子量标记，3为Sephadex-G-50分离的P3峰，4为Sephadex-G-50分离的P4峰，5为Sephadex-G-50分离的P1峰，6-7为P3峰反向高效液相层析分离收集的目的蛋白峰。

具体实施方式

以下将结合附图和实施例进一步描述本发明。

实施例1编码人PTH(1-34)的DNA片段的合成

根据天然人PTH(1-34)序列(Geoffrey N.Hendy etal.Nucleotidesequence of cloned cDNAs encoding human preproparathyroid hormone.PNAS，USA，78(12)，7365-7369，1981)和大肠杆菌偏爱密码合成二对引物，分别为P1和P2以及P3和P4。其中正向引物P1的3’端与反向引物P2的3’端有13个核苷酸相配对，正向引物P3的5′端与P2的5’端有18个核苷酸相配对，反向引物P4的3’端与P3的3’端有16个核苷酸相配对。P45’端加一个终止密码TTA和一个BamHI酶切位点GGATCC，并加两个保护碱基CG。P15’端加一序列CTAACGGT，其中AACGGT编码Asn-Gly，为羟胺切割位点，前两个碱基CT与所用载体pGEX-2T/Ba1平端直接相连，与载体的G组合成GCT(编码Ala)，确保目的基因阅读框架正确。上述4个引物的核苷酸序列如下：

P1：5′CT AAC GGT TCT GTT AGC GAA ATC CAG CTG 3′(SEQ ID NO：3)

P2：5′AAC ACG TTC CAT GGA GTT CAG GTG TTT ACC CAG

GTT GTG CAT CAG CTG GAT TTC G 3′(SEQ ID NO：4)

P3：5′AAC TCC ATG GAA CGT GTT GAA TGG CTG CGT AAA

AAA CTG CAG GAT GTT CAC A 3′(SEQ ID NO：5)

P4：5′CG GGATCC TTA AAA ATT GTG AAC ATC CTG CAG 3′(SEQ ID NO：6)

将上述4条引物等量混合(P1和P4适量加量)，加热和退火后加dNTP，用pfu-Taq DNA聚合酶进行PCR扩增，其扩增产物即为编码人PTH(1-34)的DNA片段，命名为片段F。

实施例2表达载体pGEX-GST69Δ-NG-hPTH的构建及工程菌的表达

将实施例1获得的DNA片段F用限制性内切酶BamH I酶切，同时用BamH I和Bal I双酶切载体pGEX-2T(购自PharmaciaBiotech)，切除该载体上含有的GST基因3’端465bp，留207bp，编码69个氨基酸配体蛋白(GST69Δ)。用琼脂糖凝胶电泳法分别分离纯化和回收目的DNA片段F和缩短型载体pGEX-GST69Δ。用T4DNA连接酶将目的DNA片段F(5’端为平头，3’为粘性末端)和载体pGEX-GST69Δ连接，得到表达载体pGEX-GST69A-NG-hPTH(图1)。连接物转入大肠杆菌JM109感受态菌中，涂布LB培养基-琼脂平板(含氨苄青霉素100μg/ml)，37℃培养12-16小时，长出菌落。

随机挑取上述培养板上10-20个转化菌落分别接种于含有3mlLB液体培养基中，37℃发酵培养过夜，次日，按总体积3-5％比例取培养过夜菌液接种于另一新鲜LB培养液管中，37℃培养3小时，待菌体密度生长到达0.4-0.6(A_600nm)时，加诱导剂IPTG诱导表达4-5小时，收集菌体，按常规方法进行SDS-PAGE电泳进行检测，考马斯亮蓝染色，在分子量12000道尔顿处有明显新的蛋白区带者疑为阳性克隆工程菌株，并显示以包含体形式表达融合蛋白，表达量为20％以上。

选上述疑为阳性克隆工程菌株提取质粒DNA，用DNA序列自动测序仪进行目的基因核苷酸序列测定，确证了目的基因结构及阅读框架正确。图2示出了本发明的人甲状旁腺激素衍生物Gly-hPTH(1-34)的核苷酸序列和氨基酸序列。所述序列也分别如SEQ IDNO：1和2所示。

实施例3人甲状旁腺激素衍生物Gly-hPTH(1-34)的生产

取实施例2获得的经确证结构正确的工程菌株经较大量体积(2升)发酵培养，加IPTG诱导表达，收集菌体，超声波破菌体，高速离心，弃上清，收集沉淀。用常规方法纯化包含体，尽可能除去菌体蛋白及核苷酸等杂质。用含有8mol/L尿素的甘氨酸缓冲液(pH8.0-9.0)裂解包含体(IB)，然后加盐酸羟胺至终浓度为2mol/L，pH8-9，37℃反应12-14小时。融合蛋白裂解物经Sephadex G-25柱除盐、甘氨酸和羟胺，然后用Sephadex G-50分离，共有4个峰(P1-P4)。收集目的蛋白峰P3，经浓缩后再经反向高效液相层析分离，收集目的蛋白峰，冷冻干燥去除乙氰，取样分析，确证得到Gly-PTH(1-34)衍生物。经SDS-PAGE检测，其纯度达95％(图3)。经质谱分析其分子量为4177道尔顿，经毛细管电泳分析其等电点(pI)为8.40。氨基酸自动分析仪测定其N-末端15个氨基酸序列为GSVSEIQLMHNLGKH，其N-端第1个氨基酸为G。

实施例4生物学活性测定

用大鼠成骨细胞株HOSTE85(中国医学科学院基础医学研究所医学细胞中心提供)进行实施例3获得的人PTH(1-34)衍生物的活性测定。

(1)用³H-胸腺嘧啶掺入法测定Gly-hPTH(1-34)对成骨细胞增殖的影响

将细胞接种于48孔板，密度5×10⁴/ml，细胞培养液为McCoy 5A+10％去固醇血清。以不同浓度的实施例3获得的人PTH(1-34)衍生物作用于细胞。细胞收获前6小时，加入³H-胸腺嘧啶(18.5kBq)继续培养。培养结束后弃上清，以PBS洗细胞5次，以0.1N NaOH溶解细胞，取1毫升所述细胞溶液加甲苯闪烁液，置于液闪计数仪中测定样品放射活性。结果如下表1所示。

表1³H-胸腺嘧啶掺入试验结果(Bq)

剂量	作用6小时组	作用12小时组
剂量	作用6小时组	作用12小时组	对照组阳性对照10-9组剂量10-8组剂量10-9组剂量10-10组	199.00±25.41359.50±38.80^364.68±24.21^326.67±18.04^294.73±18.07^	213.31±20.91377.84±25.22^377.85±34.30^333.65±14.82^*320.02±11.67

^*p＜0.05(相对于对照组)，样品剂量10^-9组与阳性对照10^-9组相比无统计学显著差异

(2)用³H-脯氨酸掺入法测定Gly-hPTH(1-34)对成骨细胞胶原合成的影响

将细胞接种于24孔板，密度5×10⁴/ml，细胞培养液为McCoy 5A+10％去固醇血清。以不同浓度的实施例3获得的人PTH(1-34)衍生物作用于细胞。细胞收获前8小时，加入³H-脯氨酸(74kBq)继续培养。培养结束后弃上清，以PBS洗细胞5次，以0.1N NaOH溶解细胞，取1毫升所述细胞溶液加甲苯闪烁液，置于液闪计数仪中测定样品放射活性。结果如下表2所示。

表2 ³H-脯氨酸掺入试验结果(Bq)

剂量	作用6小时组	作用12小时组
剂量	作用6小时组	作用12小时组	对照组阳性对照10^-9组剂量10^-8组剂量10^-9组剂量10^-10组	22.37±3.4035.03±6.13^35.36±6.23^29.58±2.64^*23.40±1.82	24.15±5.3925.82±3.1529.62±0.8325.93±2.2325.16±5.75

(3)用对硝基苯酚法测定Gly-hPTH(1-34)对成骨细胞碱性磷酸酶(AKP)活性的影响

将细胞接种于6孔板，密度5×10⁴/ml，以不同浓度的实施例3获得的人PTH(1-34)衍生物作用于细胞。收获时弃上清，用超声细胞粉碎机破坏细胞，采用对硝基苯酚法以紫外分光光度计测定样品的吸光度。结果以IU/mg表示，如表3所示。

表3 AKP活性测定结果(×10³U/mg蛋白质)

剂量	作用6小时组	作用12小时组
剂量	作用6小时组	作用12小时组	对照组阳性对照10^-9组剂量10^-8组剂量10^-9组剂量10^-10组	1.97±0.173.15±0.28^2.95±0.25^2.71±0.24^2.66±0.10^	2.38±0.123.57±0.24^3.34±0.44^2.90±0.27^#2.76±0.12^

^*p＜0.05(相对于对照组)，^#p＜0.05(相对于阳性对照组)

(4)用cAMP检测试剂盒测定Gly-hPTH(1-34)对成骨细胞腺苷酸环化酶活性的影响，以cAMP生成量表示活性高低。

将细胞接种于6孔板，细胞培养液为McCoy 5A+10％胎牛血清。待细胞铺满后(48小时)以不同浓度的实施例3获得的人PTH(1-34)衍生物作用于细胞10分钟。弃培养液，以TE缓冲液洗细胞，以细胞刮擦器取细胞，104℃煮沸1分钟，离心取上清，以放射免疫法测定样品cAMP含量，以考马斯亮蓝法测样品蛋白含量，结果以pmol/1.μg蛋白表示。

表4cAMP活性测定结果

剂量	cAMP含量(pmol/1.μg蛋白)
剂量	cAMP含量(pmol/1.μg蛋白)	对照组阳性对照10^-9组剂量10^-8组剂量10^-9组剂量10^-10组	1.54±0.036.65±0.10^11.92±0.65^6.65±0.24^3.94±0.28^

从表1、表2、表3和表4中结果显示本发明所得的PTH(1-34)衍生物能刺激大鼠成骨细胞增殖、增加成骨细胞胶原合成、AKP活性增高以及cAMP生成量增加，并呈量效关系，与PTH(1-34)阳性对照相当。

序列表

<110>中国医学科学院基础医学研究所

<120>重组生产甲状旁腺激素衍生物的方法及所用表达载体

<130>I20021166CB

<160>6

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>108

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(108)

<223>

<400>1

ggt tct gtt agc gaa atc cag ctg atg cac aac ctg ggt aaa cac ctg 48

Gly Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu

1 5 10 15

aac tcc atg gaa cgt gtt gaa tgg ctg cgt aaa aaa ctg cag gat gtt 96

Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val

20 25 30

cac aat ttt taa 108

His Asn Phe

35

<210>2

<211>35

<212>PRT

<213>人工序列

<400>2

Gly Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu

1 5 10 15

Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val

20 25 30

His Asn Phe

35

<210>3

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

ctaacggttc tgttagcgaa atccagctg 29

<210>4

<211>58

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

aacacgttcc atggagttca ggtgtttacc caggttgttg tgcatcagct ggatttcg 58

<210>5

<211>52

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

aactccatgg aacgtgttga atggctgcgt aaaaaactgc aggatgttca ca 52

<210>6

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

cgggatcctt aaaaattgtg aacatcctgc ag 32

Claims

1、一种融合基因，该融合基因从5′至3′方向依次含有缩短型的谷胱甘肽S转移酶基因、编码羟胺裂解位点Asn-Gly的接头序列以及编码人类PTH(1-34)的DNA，所述的缩短型谷胱甘肽S转移酶基因编码谷胱甘肽S转移酶N端69个氨基酸。

2、如权利要求1所述的融合基因，其中所述编码人类PTH(1-34)的DNA的核苷酸序列为SEQ ID NO：1。

3、包含权利要求1或2的融合基因的表达载体。

4、如权利要求3的表达载体，其为图1所示的表达载体pGEX-GST69Δ-NG-hPTH(1-34)。

5、一种生产人类PTH(1-34)衍生物的方法，包括将权利要求3或4的表达载体导入大肠杆菌进行表达，用羟胺切割所表达的融合蛋白，以及纯化经切割后得到的所述人类PTH(1-34)衍生物。