CN1259875A - 含有与前体药物结合的抗体－酶偶联物的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

能通过酶活化的前体药物与酶偶联物一起配制用于顺序给药。两种成分之一或每种成分包含使其优先导向靶组织的多聚物载体。新的多聚物—前体药物偶联物可通过组织蛋白酶B或其它硫醇依赖的蛋白酶切割。本发明具有导向实体瘤的特别应用。

Description

含有与前体药物结合的抗体-酶
偶联物的药物组合物
发明领域：
本发明涉及用于酶-前体药物治疗的组合物和试剂盒，其中酶与载体偶联。
发明背景：
肿瘤疾病的化学疗法常常由于限制给药剂量的不利系统毒性而受到破坏或者由于多药抗性的出现而受到限制。已采取几种策略以改善药物导向并使肿瘤中的药物浓度提高到克服临床上相关的几种药物抗性的水平。
前体药物已在医药领域使用多年用于治疗各种失调。它们能提供改善的可溶性、改善的药物动力学和组织分布、不利代谢的避免、选择性器官效应和特异性肿瘤毒性。为使前体药物用作抗癌剂，肿瘤必须有高水平的能活化前体药物的酶或必须向其中传递外源酶，并且在正常组织中必须没有活性酶的存在。前体药物必须是无害及药物动力学惰性的，并且是具有有利Km和Vmax值的酶底物。
已经很好地建立了使用抗体偶联物(conjugate)或逆转录病毒载体将酶传递给肿瘤的抗体定向酶前体药物疗法(ADEPT)(参考文献1、2)和基因/病毒定向酶前体药物疗法(G/VDEPT)(参考文献3)的思想。在ADEPT中，将代谢正常不被哺乳动物细胞代谢的底物的外源酶与肿瘤特异的或肿瘤相关的抗体化学连接；静脉注射抗体偶联物并且通过识别肿瘤相关抗原强烈结合到肿瘤上。在VDEPT中，逆转录病毒设计为带有表达可以选择性地传递给肿瘤的预选酶基因或在肿瘤特异性启动子控制之下的预选酶基因。然后外源酶用于活化精心设计的低分子量前体药物。动物模型和人体试验研究已证明可以选择性地向实体瘤传递活性酶如羧肽酶G2、青霉素酰胺酶、β-内酰胺酶、β-葡糖醛酸酶、胞嘧啶脱氨酶、硝基还原酶或碱性磷酸酶(参考文献4、5)。
两种方法都有许多内在限制。以ADEPT为例，这些限制包括抗体-酶偶联物的免疫原性、需要修饰每一偶联物以靶向肿瘤上存在的抗原，优化给药时间表的困难以及在ADEPT中使用清除抗体的需要(参考文献6)。以VDEPT为例，有与病毒载体相关的内在危险，由于特异性地向癌细胞传递基因的问题而导致的肿瘤中酶表达特异性的潜在缺乏以及在病人基础上评估酶表达持续时间和可重复性的困难导致优化后续前体药物时间表时的困难。
近年来，对作为抗癌药物载体的多聚物(polymer)进行了大量研究(在参考文献7中综述)。大量此项工作的基础是有毒药物与高分子量载体的结合导致系统毒性的降低、体内滞留时间的延长、生物分布的改变、治疗功效的改善以及通过增强的渗透性和保持(EPT)效应而引起的点特异性被动捕捉。EPR效应是由于肿瘤新维管结构不连续内皮的渗漏，由其中增强的大分子或小颗粒渗透性引起。除了肿瘤血管发生(多维管结构症)以及血管网的不规则和不完整，伴随的淋巴引流缺乏也促进外渗大分子的积累。对于大分子试剂和脂类，可在许多实体瘤中观察到此效应。增强的血管渗透性将支持肿瘤快速生长对营养和氧的大量需求。除非特别指出肿瘤细胞通过受体介导的胞吞作用进行吸收，进入肿瘤内环境的多聚物通过液相胞饮作用相对缓慢地得到吸收。
许多以多聚物为基础的抗癌剂，现在已进入临床或正在通过临床试验；每一种抗癌剂与传统药物相比已证实了此观念。例如，N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)共聚物-阿霉素偶联物已在早期临床试验中表现出前景(参考文献9、10)。并且，未渗透入肿瘤但保留在循环中的残留HPMA共聚物偶联物快速分泌出来，给出较高的肿瘤：血比(参考文献11)。
在大多数情况中，多聚物载体上活性抗癌药物的释放由简单水解作用或由蛋白水解或酯酶介导(参考文献12、13)。因为这些反应的条件不必然限定于肿瘤组织，所以一些非特异性药物释放是不可避免的。
水溶性多聚物与药理学活性蛋白如酶、毒素、免疫球蛋白、细胞因子或过敏原的偶联可用于减少这些蛋白蛋白水解上的降解、改善它们的生物学效力并延长血浆清除作用，同时减弱蛋白的免疫原性。例如，HPMA共聚物-天冬酰胺酶偶联物已用于治疗白血病。酶与多聚物的偶联已表现增强酶的循环时间，其中酶的活性在去除白血病细胞的天冬酰胺方面是有用的。
发明概述：
根据本发明，产品或试剂盒包含两种成分，即安排或适于对人或动物顺序给药的两种药物组合物。第一种成分是酶偶联物，例如包含药学上可接受的赋形剂和酶偶联物的组合物。酶偶联物可由与多聚物或其它载体共价结合的酶组成，便得酶偶联物可保持其酶活性。第二种成分是前体药物，例如包含药学上可接受的赋形剂和前体药物的组合物。前体药物一般基本上无活性(在药物活性方面)但能通过酶活化。
应当指出除非本文特别指出产品给药的顺序，此处提及的“第一种”和“第二种”组合物不表示任何具体给药顺序。
试剂盒的两种成分用于类似于ADEPT的治疗方案，除了施用酶偶联物而不是抗体-酶偶联物。一个显著差异是在采用本发明时两种成分可以任一顺序给药。例如，含前体药物的组合物可首先给药。本发明能避免由抗体-酶偶联物的免疫原性引起的ADEPT的问题。而且，尽管多聚物载体不是特异性地靶向肿瘤细胞表面的抗原位点，但仍可预期它能通过EPR效应优先在实体瘤中积累。已观察到ADEPT在体内是惊人地非特异性的，并且可以相信多聚物-酶偶联物可能表现出与ADEPT中表现的同样显著的优先积累。
附图描述：
图1表示通过β-内酰胺酶从头孢菌素连接的前体药物中释放药物的反应机制；
图2表示实施例1和2的反应；
图3是表示HPMA-Gly-Gly-ONp和β-内酰胺酶混合反应后的光谱的图；
图4是表示通过β-内酰胺酶和通过HPMA-β-内酰胺酶偶联物降解苄青霉素的图；
图5是表示患B16F10黑色素瘤的C57小鼠血液中游离和偶联的放射性标记β-内酰胺酶的柱形图；
图6是表示患B16F10黑色素瘤的C57小鼠中游离和偶联的放射性标记β-内酰胺酶的肿瘤积累的柱形图；
图7表示可通过组织蛋白酶B切割的前体药物PR1的结构；
图8是表示通过游离和偶联的组织蛋白酶B以及没有组织蛋白酶B时从HPMA-Gly-Phe-Leu-Gly-dox释放阿霉素的图；
图9是表示通过游离和偶联的组织蛋白酶B从患B16F10黑色素瘤的C57小鼠中的PK1释放阿霉素的柱形图；并且
图10是表示对患B16F10鼠黑色素瘤的C57黑色雄性小鼠进行4次HPMA共聚物-组织蛋白酶B给药之后阿霉素从PK1释放的图。
发明描述：
优选的是酶偶联物的分子量应得到修饰以优化肿瘤中偶联物的积累。因此分子量应足够高以使偶联物不通过正常内皮但通过渗漏的新维管结构进入肿瘤并通过阻止从其中清除而得以积累。但是，分子量还应足够低以从肾清除残余的非肿瘤积累的偶联物。偶联物的总分子量优选地应小于1000kD，更优选地是小于100kD，并且优选地至少20kD。
酶偶联物的载体优选地是多聚物，如酶可与之形成共价键的水溶性多聚物。多聚物和酶之间的键应允许保持偶联物的酶活性。因此多聚物可通过间隔基团与酶结合使得多聚物主链和酶之间有一段距离，避免酶活性位点的空间阻碍。为避免降解，使用分子量至少30kD的多聚物可能是优选的。
在酶偶联物中，每一个酶分子可通过一个或多个连接与多聚物分子结合，优选地通过单独的共价键连接。并且，平均每一个多聚物分子可以有少于一个酶分子与之结合。然而优选地，与多聚物分子结合的酶分子的平均数是至少1个，更优选地1到5个。优选的比例取决于酶的分子量、多聚物的分子量和通过EPR效应在肿瘤中积累的偶联物的最佳总分子量。
已用作载体并且其偶联物看来通过EPR效应积累的适当多聚物包括聚乙二醇、乙烯乙二醇共聚物、糊精、羟烷基(甲基)丙烯酰胺多聚物和共聚物如羟丙基甲基丙烯酰胺以及苯乙烯与顺丁烯二酸酐的共聚物。可以使用的其它多聚物包括多聚半乳糖醛酸、羟烷基(甲基)丙烯酸盐的共聚物如N-苯基吡咯烷酮、多聚(L-谷氨酸羟乙基-L-谷氨酰胺)、多聚(α-顺丁烯二酸)、多聚天冬氨酸-PEG共聚物、多聚-L-赖氨酸以及聚乙烯亚胺的共聚物。
尽管酶-多聚物偶联物在实体瘤中的定位首先依靠EPR，但结合确保活跃导向的配体是有利的。例如，结合半乳糖配体以将偶联物导向肝是有利的。选择性地，可将黑色素细胞刺激素与多聚物结合作为黑色素瘤的配体。如果需要，可将抗体作为配体连接到多聚物上，使抗体导向目的靶组织的特异性抗原位点。尽管这样的抗体-多聚物-酶偶联物的使用在减弱免疫原性方面有一些超过在正常ADEPT系统中使用的抗体-酶偶联物的优点，本发明优选地避免使用酶偶联物的活跃导向配体。
酶偶联物包括功能性酶。偶联物优选地保持高水平酶活性。只要保留了高水平的有用活性，与天然酶相比其活性水平可以降低。
用于本发明的前体药物可以是相对低分子量的化合物。酶对前体药物的作用可能并不显著改变化合物的分子量。适当前体药物和活化前体药物的酶的有用总结在参考文献5的表1中给出，参考文献5是引用了很多参考文献的综述文章，其中描述了前体药物及其使用的完整细节。因此酶可选自DT-心肌黄酶、纤溶酶、羧肽酶G2、胸腺嘧啶激酶(病毒的)、胞嘧啶脱氨酶、葡萄糖氧化酶、黄嘌呤氧化酶、羧肽酶A、α-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、偶氮还原酶、γ-谷氨酰转移酶、β-葡糖醛酸酶、β-内酰胺酶、碱性磷酸酶、氨肽酶、青霉素酰胺酶和硝基还原酶。
一个优选的酶是β-内酰胺酶。β-内酰胺酶是一组具有不同特异性的酶，但所有酶都能使β-内酰胺水解成取代的β-氨基酸。一些酶更易作用于青霉素，而其它酶则对头孢菌素有更强的活性。β-内酰胺酶活性对于哺乳动物系统不是内源性的并且因此易受到来自抑制剂、酶底物或内源酶系统的最低限度干扰。
一系列不同芥子(mustard)的头孢菌素衍生物(参考文献14)和阿霉素(参考文献15)的合成已得到描述并且这些物质是酶的相对好的底物。多聚物和抗癌药物之间的间隔将含有以青霉素或头孢菌素形式的β-内酰胺环。β-内酰胺酶切割内酰胺环并在化学重排后(如图1表示)产生药物。可结合许多细胞毒性试剂，只要它们具有可替换的NH2或OH基团并因此可作用为前体药物。水解率通过吸光度变化进行体外测量。
另一类优选的酶是蛋白酶/肽酶。硫醇依赖的蛋白酶如组织蛋白酶B是特别优选的。
前体药物在药物活性上应是基本上无活性的。因此活化的药物应优选地具有前体药物活性至少100倍的活性，最优选地具有前体药物至少1000倍的活性。
药物可选自抗肿瘤剂、抗生素、抗代谢剂、烷化剂、生物碱类和微管抑制剂和信号转导调节物。优选地，它是细胞毒素试剂，因为本发明主要用于癌症的治疗。因此药物可以是任何已知的、酶活化的、能以前体药物形式提供的细胞毒素试剂。
药物及其预期的前体药物以及相应活化酶的适当目录在参考文献5的表1中给出。因此药物可选自：
5-(Azurubub-1-基)-4-二羟基氨基-2-硝基苯甲酰胺
苯二胺芥子
苯甲酸芥子(各种)
Gangcyclouir三磷酸
腺嘌呤阿拉伯核苷三磷酸(araATP)
5-氟尿嘧啶
过氧化氢
超氧化物，过氧化氢
氨甲蝶呤
氰化物
苯二胺芥子类(各种)
苯二胺芥子
苯酚芥子
Anthracyclines如表阿霉素、阿霉素和道诺红菌素
4-脱乙酰长春碱-3-carboxhydrazide
氮芥子(各种)
丝裂霉素醇
表鬼臼毒素吡喃葡糖苷
岩沙海葵毒素
苯丙氨酸氮芥
5-(氮丙啶-1-基)-4-羟胺-2-硝基苯酰胺
放射菌素D，丝裂霉素C
Taxanes，如紫杉醇和taxotere
拓扑异构酶抑制剂如喜树碱和topotecan
优选地，前体药物包含与药物偶联的载体。在一些情况下，前体药物的酶活化不伴随活化药物从多聚物偶联物的释放这一点可能是有利的。因此，活化的药物-多聚物偶联物可以带有通过不被酶切割的连接部分与药物部分结合的多聚物，而药物活性仍得以保留。选择性地，通过酶反应对前体药物的活化可独立于药物部分从多聚物偶联物的切割发生，例如通过连接药物部分与多聚物的衔接物上的分开的酶活性。
然而对于前体药物-多聚物偶联物的活化，优选的是通过易于被酶切割的衔接物的断裂发生活化。
因此衔接物可以是头孢菌素衔接物，可按参考文献15中所述的通过β-内酰胺酶进行切割。然而优选地，衔接物是肽部分并且酶是以肽衔接物作为底物的肽酶。
在本发明的另一实施方案中，前体药物包含通过肽基衔接物连接在一起的多聚物与药物部分的偶联物并且酶偶联物包含与载体部分结合的酶。偶联物和前体药物是安排用于顺序给药的包含两种组合物的新试剂盒的成分，每种组合物含有前述偶联物之一。
多聚物和药物部分的偶联物优选地具有5kD到1000kD范围内、更优选地20kD到100kD范围内的分子量。
在本发明的这一方面，酶偶联物可以是如用于本发明第一方面的多聚物-酶偶联物。它也可以是例如ADEPT中所用的抗体-酶偶联物。选择性地，载体可以是能被活跃地导向所希望的靶细胞或可特异性结合其它蛋白或成分的另一类型分子。例如，载体可包含能与环境中存在的载体或细胞表面的受体特异性结合的激素或其它特异性部分。
用于本发明这一方面的酶是能切割前体药物偶联物肽基衔接物的肽酶。衔接物的切割优选地导致活性药物的释放。选择性地，酶反应产物可进一步通过后续步骤反应以在原位产生活性药物。优选地，肽酶是仅切割特异性肽序列的特异性酶，并且不是非特异性的肽酶。
肽基衔接物包含足够的氨基酸单位以保证特异性结合和通过肽酶进行的切割。优选地，衔接物至少2个氨基酸长，更优选地至少3个氨基酸长，例如4个或更多氨基酸长。
同样在本发明的这一方面，药物优选地是细胞毒性药物。肽基衔接物通过在肿瘤中存在的与组织相比相对高水平的酶来切割是方便的。适当的酶是硫醇依赖的蛋白酶，例如组织蛋白酶B。组织蛋白酶B的特异性底物是Gly-Phe-Leu-Gly衔接物。
多聚物、衔接物与药物的偶联可使用传统化学和生化技术进行。例如，多聚物上的基团可与使用的肽化合物反应并且具有肽侧链的多聚物随后可与药物分子反应。选择性地，可多聚化的肽化合物易于获得并且与其它单体共聚化以形成带有肽基团的多聚物，药物化合物可与之反应。Gly-Phe-Leu-Gly-阿霉素-HPMA偶联物的合成在参考文献16中描述。参考文献17中偶联物表现与游离的阿霉素相比减弱的毒性和改善的抗肿瘤活性。
本发明的另一方面在于使用硫醇依赖的蛋白酶作为酶/前体药物疗法的酶成分。新的偶联物含有与载体共价结合的硫醇依赖的蛋白酶，所述偶联物保持硫醇依赖的蛋白酶活性。酶优选地是组织蛋白酶B。偶联物可作为药物组合物或试剂盒的一部分提供。
在此，发明的第三方面，载体与第二方面一样可以是抗体或其它活跃导向成分，但优选地是多聚物。尽管对于硫醇依赖的蛋白酶-多聚物偶联物优选的是不被活跃导向的，但是提供具有活性配体如抗体和其它特异性结合成分的多聚物是可能的。
产品或试剂盒包含新的偶联物和含有通过可被硫醇依赖的蛋白酶切割的衔接物与载体结合的药物的前体药物。
在本发明的每一方面，成分可用于治疗方法。治疗将是与药物相关联的治疗。每种成分应该给药的量取决于治疗条件的性质和所使用的特定药物，这对于本领域普通技术人员是显而易见的。典型的量和剂量方案可与相关方法相同或类似，并可在需要时加以调整。
在本发明的每一方面，成分可对病人以任一顺序给药。优选的是选择给予第一种组合物使得它通过EPR在肿瘤中积累。优选地，给予的第一种组合物中的成分能由肾在短于例如12小时、优选地短于6小时(循环半寿期)时期后从循环正常清除。首先给予前体药物偶联物是特别方便的，从而实现肿瘤中的快速积累以及随后潜在毒性前体药物通过经由肾的分泌有从循环的清除。这明显优于其中必须施用首先酶的ADEPT系统。
当首先给药的成分未从循环充分清除时，通过施用清除成分从循环清除该成分可能是适当的。第一种给药成分可与适于与抗配体结合的配体共同提供。此成分因此能通过包含抗配体和使清除成分适于从循环清除的部分的第二种清除成分从循环中清除。
优选地，新方法中首先给药的成分是前体药物。因此它应适于优化其EPR而由此优化肿瘤积累。尽管在这样的优选实施方案中，因为酶偶联物一般是基本上是无毒性的，第二位给药的酶偶联物利于优先导向肿瘤，但酶偶联物在适于优化EPR效应方面更不重要。酶偶联物的循环时间应足够长以在基本上所有前体药物的目的位点活化。两种组合物给药之间的时间差异可以是几小时或甚至几天。控制各个偶联物的分子量产生最佳给药方案的控制级别。
本发明第三方面的优点是前体药物在肿瘤中优先积累时将通过在肿瘤中细胞内以增高水平存在的内源硫醇依赖的蛋白酶在细胞内活化并且通过硫醇依赖的蛋白酶-载体偶联物在细胞外活化。这提供了可转运到不含活性药物的细胞中的细胞外活性药物。
发明参考附图的图2等在下列实施例中得到进一步说明。实施例1：HPMA-β-内酰胺酶偶联物
β-内酰胺酶(Sigma公司；～29kDa)于控制的pH通过ONp基团的非特异性氨解反应与多聚物载体N-(2-羟基丙基)甲基丙烯酰胺-甘氨酸-甘氨酸-P-硝基苯酚(HPMA-Gly-Gly-ONp；Polymer Laboratories；～30kDa)结合。反应在图2中表示。进行了下列步骤：
将侧链P-硝基苯酚(ONp)基团上带有的多聚物溶于双蒸水(4mg/ml)中并将此β-内酰胺酶溶于pH7.2的0.05M磷酸缓冲液中(2mg/ml)，并且将此溶液在搅拌下于4℃加入到多聚物溶液中。
反应混合物在黑暗中于pH7.2搅拌30分钟。通过加入饱合的四硼酸钠缓冲液在超过4小时时间内将pH小心升高到8.5(为防止酶变性)，并将反应混合物再搅拌4小时。通过加入1-氨基-2-丙醇(相对于原始ONp基团的1/2量)去除未反应的ONp基团来终止反应。溶液酸化到pH7.2。
为去除游离的多聚物和游离的酶，通过用于分离的Spectra/PORCE(Cellulose Ester)无菌50kDa分子量去除DispoDialyzer纯化偶联物。
偶联反应之后进行紫外分光光度法测定，表明P-硝基苯酚从HPMA-共聚物的释放。与HPMA结合的ONp在λmax 270nm吸收而游离的ONp在400nm吸收。光谱在图3中表示。
蛋白以浓度依赖方式将碱性Cu(II)还原成Cu(I)。辛可宁二酸(Bicinchoninic acid)是对Cu(I)高度特异的生色剂，形成在562nm有最大吸光度的紫色复合物。吸光度直接与蛋白浓度成比例。
辛可宁二酸分析的结果在下表中示：
  BSAμg/20μl    BSA平均吸光度  BSA±SD   β-内酰胺酶μg/20μl  β-内酰胺酶平均吸光度     β-内酰胺酶±SD  偶联物μg/20μl  偶联物平均吸光度   偶联物
   0     0   0     80   0.252   0.011   4.113  0.0293   0.0037
   2     0.05   0.003     40   0.146   0.004   43.774   0.1486   0.0049
   4     0.1   0.002     20   0.853   0.002
   8     0.17   0.018     10   0.045   0.001
   12     0.23   0.03     6.67   0.033   0.002
   16     0.31   0.032     5   0.026   0.003
   20     0.37   0.004
   24     0.45   0.042
-4.1μg β-内酰胺酶在分离＞50kDa后的20μl偶联物样品中(0.21mg/ml)。
-43.8μg β-内酰胺酶在分离前的20μl样品中(2.2mg/ml)。
产量为(205.7/1000)×100＝20.57％
进行SDS-PAGE以证明P-硝基苯酚基团的释放是由于氨解作用而不是由于磷酸缓冲液的水解作用。相对于分子量标记将游离的β-内酰胺酶与结合的β-内酰胺酶比较。如所预计的，来自多聚物的未反应的HPMA没有条带。由于存在两种类型的酶，游离的β-内酰胺酶给出两条与30kDa分子量标记相符的条带。HPMA共聚物-β-内酰胺酶偶联物给出对应于60kDa的条带；纯化之后未检测到游离酶。
在酶活性分析中，将磷酸缓冲液(0.1M，pH7.0)中的10单位/ml β-内酰胺酶(游离的或偶联的)加入苄青霉素溶液中(1mM)，240nm处的紫外吸光度随时间推移而下降。
活性分析使用与游离酶活性测试和偶联酶活性测试中相同的酶量即每ml 10单位来进行。在作为代表性底物的游离苄青霉素上测试活性。结果表明β-内酰胺酶在多聚物偶联之后保留了酶活性；尽管活性降低了，但足以切割PDEPT最终形式中的间隔。结果图4中表示。
以使用游离酶与偶联酶比较为基础，以恒定的酶浓度(10单位/ml)、在不同浓度的苄青霉素上(1.0mM、0.9mM、0.75mM、0.5mM、0.33mM)从上述分析计算Michaelis-Menten常数。吸光度的变化按时间计算直至达到平稳水平。对不同底物浓度降解的线性部分作图并从斜率计算Vo，并制作Lineweaver-Burk图。
对于游离的β-内酰胺酶，Vmax是0.77nM/S/单位，而Km是0.22。对于偶联物，Vmax是0.20nM/s/单位，而Km是0.07。
实施例1的偶联物适合用于与适当前体药物结合。
HPMA共聚物-酶化合物的体内生物分布在根据UKCCCR(英国癌症研究协调委员会)准则进行的动物实验中测试。使用B16F10鼠黑色素瘤S.C.模型。
雄性C57BL/6J小鼠用105存活的B16F10细胞皮下(S.C.)接种。让肿瘤形成直至面积达到通过两正交径产物测量的约50-70mm2。将1×106计数细胞在0.9％NaCl中稀释成0.5ml。然后用饱合的NaOH中和pH并使终体积达到1.0ml。在此样品中，用1ml注射器和12规格针头取出100μl并计数作为注射剂量的测量值。
将100μl(5×105CPM)游离或偶联的β-内酰胺酶注射入C57BL/6J小鼠的尾静脉中(每个时间点重复三次)。然后将小鼠置于代谢笼中并在多至48小时的不同时间点将其处死。解剖下列组织样品：肿瘤、肝、肾、肺、心脏、脾并收集粪便、尿和血。样品经称重并在PBS中匀浆。然后将样品(1ml)在γ-计数器中计数，重复3次(每只小鼠每个器官3个样品)。然后结果表示为每个器官注射剂量的百分率或每个器官回收剂量的百分率。假定5.6ml血/100g小鼠计算小鼠的血量。结果在图5和6中表示。实施例2：HPMA-组织蛋白酶B偶联物
组织蛋白酶B(Sigma公司，～28kDa)于控制的pH通过ONp基团的非特异性氨解反应与多聚物载体(HPMA-Gly-Gly-ONp；～30kDa)结合。反应在图2中表示。除了将多聚物以1mg/ml溶于双蒸水中以及用组织蛋白酶B代替β-内酰胺酶之外，进行与实施例中相同的步骤。
偶联反应之后再次进行紫外分光光度法测定。
通过SDS-PAGE，相对于分子量标记将游离的组织蛋白酶B与结合的组织蛋白酶B比较。如所预计的，来自多聚物的未反应的HPMA没有条带。由于存在酶的不同链，游离的组织蛋白酶B给出与30kDa和90kDa分子量标记相符的条带。HPMA共聚物-组织蛋白酶B偶联物给出对应于60kDa和97kDa的条带(由于交叉连接)。纯化之后未检测到游离酶。
游离或偶联的组织蛋白酶B的活性通过在含有DETA(10mM)和还原谷胱甘肽(50mM)的柠檬酸缓冲液(0.2M，pH5.5)中、于37℃温育过程中测量410nm处P-硝基苯胺(NAp)从三肽Bz-Phe-Val-Arg-NAp的释放而进行分析。
实施例2的组织蛋白酶B偶联物适合用于与适当前体药物如HPMA-Gly-Phe-Leu-Gly-阿霉素(PK1；见图7)结合。
组织蛋白酶B(游离或偶联的)在高分子量底物PK1上的活性通过高压液相色谱评估。PK1与组织蛋白酶B的温育于37℃在含有400μl1mg/ml柠檬酸缓冲液(pH5.5，0.2M)中的PK1、100μl缓冲液(10mM)中的EDTA溶液、100μl还原谷胱甘肽(GSH 50mM)和400μl缓冲液中的HPMA-组织蛋白酶B或游离的组织蛋白酶B(与偶联物中存在的组织蛋白酶浓度相同-1mg/ml)的1ml终体积中进行。也准备了含有PK1但无酶的试管，评估水解作用水平作为对照。在不同时间取100μl样品，立即冻于液氮中并冻存在黑暗中直至通过高效液相色谱进行测定。然后样品与100ng作为内标准的道诺霉素(DNM)、甲酸铵缓冲液(pH8.5)和提取混合物(氯仿∶丙-2-醇)混合。离心试管，小心去除水层并使用在不高于13.8kPa(2lbf/in2)N2(g)的条件下操作的Techne氮系统蒸发有机部分至干燥。经蒸发的样品在分析前重新溶解于甲醇中。游离阿霉素体外从PK1的释放在图8中表示。
体内评估通过使用B16F10鼠黑色素瘤模型进行。雄性C57BL/6J小鼠用105存活的B16F10细胞皮下(S.C.)接种。让肿瘤形成直至面积达到通过正交径产物测量的约50-70mm2。动物用PK1(相当于5mg/kg和10mg/kg阿霉素)静脉注射或者用PK1(相当于5mg/kg和10mg/kg阿霉素)接着5小时后用游离的组织蛋白酶B(3.63mg/kg)或HPMA共聚物-Gly-Gly-组织蛋白酶B(相当于3.63mg/kg组织蛋白霉B)静脉注射，并且在多至48小时的不同时间点处死动物。解剖下列组织样品：肿瘤、肝、肾、肺、心脏、脾并收集尿和血。样品称重，在PBS中搅匀，并与100ng作为内标准的道诺霉素(DNM)、甲酸铵缓冲液(pH8/5)和提取混合物(氯仿∶丙-2-醇)混合。离心试管，小心除去水层并使用在不高于13.8kPa(2lbf/in2)N2(g)的条件下操作的Techne氮系统蒸发有机部分至于燥。经蒸发的样品在进行高压液相色谱分析前重新溶解于甲醇中。比较阿霉素从含有和不含有酶的多聚物偶联物的释放，结果在图9和10中表示。
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Claims (19)

1.一种在药物治疗中作为结合制品用于顺序给药的产品，包含酶偶联物和前体药物，酶偶联物含有与多聚物载体共价结合的功能性酶，而前体药物是基本上无活性的(在药物活性方面)但通过酶活化。
2.根据权利要求1所述的产品，其中前体药物包含药物与之共价偶联的载体。
3.根据权利要求2所述的产品，其中前体药物的载体是多聚物。
4.根据权利要求3所述的产品，其中酶是蛋白酶并且药物通过可由蛋白酶切割的肽基衔接物与多聚物载体偶联。
5.一种在药物治疗中作为结合制品用于顺序给药的产品，包含酶偶联物和前体药物，前体药物包含通过由酶切割的肽基衔接物与多聚物载体连接的药物。
6.根据权利要求5所述的产品，其中酶偶联物包含与酶共价偶联的抗体。
7.根据前述权利要求中的任意一项所述的产品，其中酶是硫醇依赖的蛋白酶。
8.根据权利要求1-4中的任意一项所述的产品，其中酶是β-内酰胺酶。
9.一种在药物治疗中作为结合制品用于顺序给药的产品，包含酶偶联物和前体药物，酶偶联物包含与载体共价结合的功能性硫醇依赖的蛋白酶，而前体药物包含通过作为硫醇依赖的蛋白酶底物的肽基衔接物与载体结合的药物。
10.根据权利要求7或权利要求9所述的产品，其中硫醇依赖的蛋白酶是组织蛋白酶B。
11.根据权利要求9或权利要求10所述的产品，其中载体是多聚物。
12.根据权利要求1-8和11中的任意一项所述的产品，其中任何多聚物载体包括羟烷基(甲基)丙烯酰胺，优选地羟丙基甲基丙烯酰胺的多聚物或共聚物。
13.一种偶联物，含有与载体共价结合的、硫醇依赖的功能性蛋白酶。
14.根据权利要求13所述的偶联物，其中蛋白酶是组织蛋白酶B。
15.根据权利要求13或权利要求14所述的偶联物，其中载体是如权利要求12中所述的多聚物。
16.根据权利要求13到15中的任意一项所述的偶联物，用于治疗。
17.药物组合物，包含药学上可接受的赋形剂和根据权利要求13到15中的任意一项所述的偶联物。
18.如权利要求1-5和9-12中的任意一项所定义的前体药物的用途，用于制备与活性药物结合用于治疗的药物，治疗包括将使药物从前体药物释放的酶分开给药。
19.根据权利要求18所述的用途，其中前体药物在酶偶联物之前给药。
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