CN1245164A - 菊欧氏杆菌小分子细菌素及其发酵提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明菊欧氏杆菌小分子细菌素Echcin及其发酵提取方法,属于微生物发酵工艺和化学领域。菊欧氏杆菌B3菌株能产生生物碱类小分子细菌素,其化学结构为0≤n≤3,含有5个氨基和1个羟基,氨基可位于R1,R2,R3,R4,R5,R6六个位置中任意5个位置。采用深层发酵。提取方法为萃取、反萃取、逆流分泳和琼脂糖电泳等方法。Echcin在农业和医学上具有广泛的应用价值。
Description
本发明菊欧氏杆菌小分子细菌素及其发酵提取方法，属于微生物发酵工艺和化学领域，专用于菊欧氏杆菌小分子细菌素的发酵提取。
菊欧氏杆菌(Erwinia chrysanthemi)是一种重要的植物病原细菌，能引起马铃薯、大白菜软腐和水稻基腐等重要植物病害。产细菌素是细菌中存在的普遍现象。绝大多数的细菌素研究仅限于一般的性状描述，对其理化性质、遗传背景等问题均未加以阐明，鉴定了细菌素分子结构的例子就更少，这在一定程度上限制了细菌素的开发利用。菊欧氏杆菌的细菌素最早于1961年由Y.Homan发现和研究。1979年，E.Echandi对菊欧氏杆菌的细菌素的形态和性状进行了详细研究，认为菊欧氏杆菌的细菌素是一种热不稳定、抗蛋白酶，形态上与噬菌体尾部相似的高分子蛋白。1985年，E.Dominique等对9株菊欧氏杆菌产生的细菌素进行了研究，认为菊欧氏杆菌的细菌素为低分子蛋白，对热不敏感，与大肠杆菌素相似。1987年，发明人在以B3菌株为材料研究菊欧氏杆菌细菌素时发现菊欧氏杆菌产生能通过透析膜的小分子细菌素，命名为Echcin。
Echcin对多种动植物病原菌，甚至癌细胞具有很强的抑制作用。然而，菊欧氏杆菌B3菌株在多种液体培养基中培养都不分泌Echcin，这给提取分离工作带来了困难。
本发明的目的在于提供细菌素Echcin发酵提取工艺，提高发酵产量，将Echcin提取纯化，鉴定Echcin分子结构，为Echcin的开发利用奠定基础。
本发明所提供的菊欧氏杆菌小分子细菌素Echcin为一类生物碱。分子量为：600-900，其化学结构基本骨架为：
0≤n≤3，含有5个氨基和1个羟基，氨基可位于R1，R2，R3，R4，R5，R6六个位置中任意5个位置。
其中四种细菌素的结构分别为①1，11，19，27，35-五氨基-3-羟基四十烷，分子量为653；②4，14，22，30，38-五氨基-6-羟基四十三烷，分子量为695。③6，7，17，24，32，40-五氨基-9-羟基四十三烷，分子量为739；④7，18，26，34，42-五氨基-10-羟基四十九烷，分子量为793。
Echcin可以与盐酸形成盐酸盐，其盐酸盐极易溶于水，但在水中加入氯化纳时可使细菌素的溶解度大幅度降低。
本发明所述Echcin的发酵方法为：
(1)种子培养：菊欧氏杆菌B3菌株活化后挑取单菌落，NB培养基28℃-30℃下培养15-28hr。
(2)发酵罐培养：采用10升的发酵罐在26-28℃，pH为5-8，每小时通气500-800升，搅拌器转速500-600转/分\罐压0.4-0.6磅/立方厘米的条件下进行发酵，发酵时间为28-30hr。接种量为1-10％。发酵期间用溴麝香草酚蓝对发酵质量进行快速检测。
发酵培养基(1L)配方为糖5-20克，氨基酸1-3克，盐0.5-3克，氨水调pH至7。
本发明所述Echcin的提取方法为：
1.发酵液离心后取上清液，用NaOH调pH8-12，离心后得上清液A和沉淀物B。
2.取上述沉淀物B加无水乙醇溶解后得乙醇液C和不溶物D。
3.取上清液A调pH4-5后，加NaCl至0.5-1.5M，再加10-30％正丁醇(V∶V)，取正丁醇相加90-100％乙酸乙酯(V∶V)后得沉淀物E和液相F。
4.沉淀物E和不溶物D合并，加5-20％盐酸水(pH4.0，V∶V)，取水溶液调pH8-12，离心后得沉淀物，即为Echcin I粗品，定为组分I。
5.液相F加40％-60％水(V∶V)，取下相与乙醇液C合并后，调pH8-12，加90-100％乙酸乙酯(V∶V)，取酯相加40-60％盐酸水(pH4.0，V∶V)，取水相加NaCl至1-3M，加5-15％正丁醇(V∶V)，取正丁醇相加2-8倍体积乙酸乙酯，析出Echcin I、II、III、IV和IV混合粗品，定为组分II。
6.组分I主要含Echcin I型细菌素，采用琼脂糖凝胶电泳方法获得Echcin I纯品。
7.组分II中含有Echcin II-V型四种细菌素，分离方法是：
7.1)将组分II的样品溶解在0.5M NaCl水溶液中做为第一管的下相，加入等体积的正丁醇∶乙酸乙酯＝1∶1的混合液(上相)振摇，待两相分层后，吸上相到已装有0.5M NaCl(等体积)的第2号分溶管中，第一号分溶管补加新鲜的上相溶液，两管子同时振摇，待静置分层后，2号管的上相再移入3号管，1号管的上相再移入2号管，新鲜上相再补充1号管。如此反复操作，使分配系数不同的样品在各分溶管的不断分配中被分离。逆流分溶20管，回收2-6管的细菌素定为组分III，11-18管的细菌素定为组分IV。
7.2)组分III中含有Echcin II、III两种细菌素，采用琼脂糖凝胶电泳方法将Echcin II和III分开，电洗脱回收获得Echcin II、Echcin III纯品。
7.3)组分IV中含有Echcin IV、V两种细菌素，采用氯仿∶正丁醇∶甲醇＝5∶5∶3为逆流分溶下相，以0.5M NaCl溶液为流动上相，逆流分溶60管，将EchcinIV和V分开。在3-9管中含EchcinV，在11-17管中含EchcinIV，回收后获得Echcin IV、V纯品。
与现有技术相比，本发明所提供的细菌素为一类新的化合物(江苏省科技情报所查新中心查新结果)，分子量小。本发明所提供的细菌素具广谱抗菌活性，对多种动植物病原细菌、病原真菌和癌细胞具有很强的抑杀活性，最低抑菌浓度分别为0.05-10μg/mL、5-50μg/mL和1-10μg/mL。对耐药性金黄色球菌的最低抑菌浓度为0.075-1.25μg/mL。采用本发明所提供的细菌素发酵方法，细菌素的发酵效价为512。对工厂化生产具有重要参考意义。本发明还将细菌素进行分离提纯，提取方法得率为61％，并分析其理化性质，鉴定其分子结构，为生产开发研究新药打下了基础。
图1为Echcin I纯品和Echcin II、III、IV、V粗品提取流程图。
图2为Echcin II、III、IV、V粗品进一步提纯流程图
实施例：
本发明所述Echcin的发酵方法为：
(1)种子培养：菊欧氏杆菌B3菌株活化后挑取单菌落，NB培养基28℃下培养28hr。
(2)发酵罐培养：采用10升的发酵罐在28℃，pH为6.8，每小时通气600升，搅拌器转速550转/分\罐压0.5磅/立方厘米的条件下进行发酵，发酵时间为30hr。接种量为2％。发酵期间用溴麝香草酚蓝对发酵质量进行快速检测。
发酵培养基(1L)配方为蔗糖10克，谷氨酸1克，(NH4)2SO4 1克，氨水调pH至7。
该方法发酵效价为512。
上述Echcin的提取方法为：
1.发酵液离心后取上清液，用2N NaOH调pH11，3000rpm离心20′后得上清液A和沉淀物B。
2.取上述沉淀物B加无水乙醇溶解后得乙醇液C和不溶物D。
3.取上清液A加2N HCl调pH4后，加NaCl至1M，再加30％正丁醇(V∶V)，取正丁醇相加95％乙酸乙酯(V∶V)后得沉淀物E和液相F。
4.沉淀物E和不溶物D合并，加10％盐酸水(pH4.0，V∶V)，取水溶液加用2NNaOH调pH11，3000rpm离心20′后得沉淀物，即为Echcin I粗品，定为组分I。
5.液相F加50％水(V∶V)，取下相与乙醇液C合并后，用2N NaOH调pH11，加100％乙酸乙酯(V∶V)，取酯相加50％盐酸水(pH4.0，V∶V)，取水相加NaCl至3M，加15％正丁醇(V∶V)，取正丁醇相加3倍体积乙酸乙酯，析出Echcin I、II、III、IV和IV混合粗品，定为组分II。
6.组分I主要含Echcin I型细菌素，采用琼脂糖凝胶电泳方法获得Echcin I纯品。
7.组分II中含有Echcin II-V型四种细菌素，分离方法是：
7.1)将组分II的样品溶解在0.5M NaCl水溶液中做为第一管的下相，加入等体积的正丁醇∶乙酸乙酯＝1∶1的混合液(上相)振摇，待两相分层后，吸上相到已装有0.5M NaCl(等体积)的第2号分溶管中，第一号分溶管补加新鲜的上相溶液，两管子同时振摇，待静置分层后，2号管的上相再移入3号管，1号管的上相再移入2号管，新鲜上相再补充1号管。如此反复操作，使分配系数不同的样品在各分溶管的不断分配中被分离。逆流分溶20管，回收2-6管的细菌素定为组分III，11-18管的细菌素定为组分IV。
7.2)组分III中含有Echcin II、III两种细菌素，采用琼脂糖凝胶电泳方法将Echcin II和III分开，电洗脱回收获得Echcin II、Echcin III纯品。
7.3)组分IV中含有Echcin IV、V两种细菌素，采用氯仿∶正丁醇∶甲醇＝5∶5∶3为逆流分溶下相，以0.5M NaCl溶液为流动上相，逆流分溶60管，将EchcinIV和V分开。在3-9管中含Echcin V，在11-17管中含Echcin IV，回收后获得Echcin IV、V纯品。
该提取方法得率为61％。
Echcin I纯品是淡褐色粉末状固体，其盐酸盐易溶于水，不溶于醇、醚、酯等有机溶剂，游离型的Echcin I不溶于水和醇、醚、酯等有机溶剂。Echcin II、III、IV和V纯品是白色粉末状固体，其盐酸盐易溶于水、甲醇、乙醇和正丁醇，不溶于丙酮和乙酸乙酯，其游离型不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、正丁醇、丙酮，微溶于吡啶和乙酸乙酯，不溶于苯、石油醚和氯仿。Echcin II、III、IV和V盐酸盐在含氯化钠的水溶液中易形成簇晶，各类型细菌素晶形相似，Echcin I不能形成结晶，在盐水中只能析出絮状沉淀。
Echcin II、III、IV和V经红外、紫外、质谱和核磁共振光谱分析鉴定，EchcinII、III、IV和V的化学结构分别为1，11，19，27，35-五氨基-3-羟基四十烷，分子量为653；4，14，22，30，38-五氨基-6-羟基四十三烷，分子量为695；6，7，17，24，32，40-五氨基-9-羟基四十三烷，分子量为739；7，18，26，34，42-五氨基-10-羟基四十九烷，分子量为793。
Claims (5)
1.菊欧氏杆菌小分子细菌素，分子量为：600-900，其化学结构的基本骨架为：
0≤n≤3，含有5个氨基和1个羟基，氨基可位于R1，R2，R3，R4，R5，R6六个位置中任意5个位置。
2.根据权利要求1所述的菊欧氏杆菌细菌素，其特征在于，上述细菌素指的是以下四种：①1，11，19，27，35-五氨基-3-羟基四十烷，分子量为653；②4，14，22，30，38-五氨基-6-羟基四十三烷，分子量为695；③6，7，17，24，32，40-五氨基-9-羟基四十三烷，分子量为739；④7，18，26，34，42-五氨基-10-羟基四十九烷，分子量为793。
3.根据权利要求1或2所述的菊欧氏杆菌细菌素，其特征在于，细菌素指的是：①1，11，19，27，35-五氨基-3-羟基四十烷，分子量为653；②4，14，22，30，38-五氨基-6-羟基四十三烷，分子量为695。
4.权利要求1或2所述的菊欧氏杆菌细菌素Echcin的发酵方法为：
4.1)种子培养：菊欧氏杆菌B3菌株在NB培养基28-30℃下培养15-28hr；
4.2)发酵罐培养：在26-28℃，pH为5-8，每小时通气500-800升，搅拌器转速500-600转/分、罐压0.4-0.6磅/立方厘米的条件下进行发酵，发酵时间为28-30hr，接种量为1-10％(V/V)，发酵培养基(1L)配方：糖5-20克，氨基酸1-3克，盐0.5-3克，氨水调pH至7。
5.权利要求1-3之一所述的菊欧氏杆菌细菌素Echcin的提取方法为：
5.1)发酵液离心后取上清液，用NaOH调pH8-12，离心后得上清液A和沉淀物B。
5.2)取上述沉淀物B加无水乙醇溶解后得乙醇液C和不溶物D。
5.3)取上清液A调pH3-5后，加NaCl至0.5-1.5M，再加10-30％正丁醇(V∶V)，取正丁醇相加90-100％(V∶V)乙酸乙酯后得沉淀物E和液相F。
5.4)沉淀物E和不溶物D合并，加5-20％盐酸水(pH4.0，V∶V)水，取水溶液调pH8-12，离心后得沉淀物，即为Echcin I粗品，定为组分I。
5.5)用液相F加40％-60％盐酸水(pH4.0，V∶V)，取下相与乙醇液C合并，调pH8-12h后，加90-100％乙酸乙酯(V∶V)，取酯相加40-60％盐酸水(pH4.0，V∶V)，取水相加NaCl至1-3M，加5-15％正丁醇(V∶V)，取正丁醇加2-8倍体积乙酸乙酯，析出析出Echcin I、II、III、IV和IV混合粗品，定为组分II。
5.6)组分I主要含Echcin I型细菌素，采用琼脂糖凝胶电泳方法纯化，电洗脱回收获得Echcin I纯品。
5.7)组分II中含有Echcin II-V型四种细菌素，分离方法是：
5.7.1)将组分II的样品溶解在0.5M NaCl水溶液中做为第一管的下相，加入等体积的正丁醇∶乙酸乙酯＝1∶1的混合液(上相)振摇，待两相分层后，吸上相到已装有0.5M NaCl(等体积)的第2号分溶管中，第一号分溶管补加新鲜的上相溶液，两管子同时振摇，待静置分层后，2号管的上相再移入3号管，1号管的上相再移入2号管，新鲜上相再补充1号管。如此反复操作，使分配系数不同的样品在各分溶管的不断分配中被分离。逆流分溶20管后，回收2-6管的细菌素定为组分III，11-18管的细菌素定为组分IV。
5.7.2)组分III中含有Echcin II、III两种细菌素，采用琼脂糖凝胶电泳方法将Echcin II和III分开，电洗脱回收获得Echcin II、Echcin III纯品。
5.7.3)组分IV中含有Echcin IV、V两种细菌素，采用氯仿∶正丁醇∶甲醇＝5∶5∶3为逆流分溶下相，以0.5M NaCl溶液为流动上相，逆流分溶60管，将EchcinIV和V分开。在3-9管中含Echcin V，在11-17管中含Echcin IV，回收后获得Echcin IV、V纯品。
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