CN1239894A - 肌醇多磷酸酯衍生物及其使用方法 - Google Patents

肌醇多磷酸酯衍生物及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了作为肌醇多磷酸酯的细胞渗透性拮抗剂的组合物。另外，本发明提供了通过将细胞与肌醇多磷酸酯的细胞渗透性拮抗剂接触来增加氯离子分泌的方法。本发明还提供了通过给个体施用肌醇多磷酸酯的细胞渗透性拮抗剂来增加个体的氯离子分泌的方法。本发明来提供了通过给所述个体施用肌醇多磷酸酯的细胞渗透性拮抗剂缓解个体中与囊性纤维性变有关的体征或症状的方法。本发明还提供了作为肌醇多磷酸酯的细胞渗透性激动剂的组合物。另外，本发明还提供了通过将细胞与肌醇多磷酸酯的细胞渗透性激动剂接触来减小氯离子分泌的方法。本发明还提供了通过给个体施用肌醇多磷酯酸酯的细胞渗透性激动剂来减少氯离子分泌的方法。此外，本发明还提供了通过给所述个体施用肌醇多磷酸酯的细胞渗透性激动剂缓解个体中与分泌性腹泻有关的体征或症状的方法。

Description

肌醇多磷酸酯衍生物及其使用方法
本发明是在由国家健康研究院(NIH)资助的编号为R01 DK47240—01A1的政府资助下完成的。政府对本发明享有特定的权利。
                    发明背景
                    发明领域
本发明主要涉及调节氯离子运输的化合物和方法，更具体地讲，涉及肌醇多磷酸酯的拮抗剂和激动剂。
                    背景资料
所有的活生物体均是由细胞组成的。细胞的界限是由将其内外物质隔开的质膜确定的。细胞膜对物质如营养物质进出细胞的通行进行调节。在细胞中离子跨细胞膜运输起多方面的重要作用，包括调节细胞的肿胀压。离子运输的调节可以使细胞具有适宜的离子浓度以保持其完整性和功能。在不适宜的条件下，例如，如果细胞内的离子浓度太高，水就会进入细胞并导致细胞肿胀或破裂。如果细胞内的离子浓度太低，细胞就会收缩。
生物体利用细胞膜的离子运输性能来调节在特定组织中的流体。例如，肠细胞层利用离子运输调节水的吸收。细胞运输的一种特别重要的离子是氯离子。在各种细胞功能如渗透调节、细胞内pH调节以及盐和体液分泌中，氯离子运输都起着重要作用。
在肠中，高水平的氯离子分泌与疾病例如分泌性腹泻有关。分泌性腹泻有许多原因，包括由微生物如沙门氏菌(Salmonella)、志贺氏菌(Shigella)和特定的大肠杆菌(Echerichia coli.)菌株引起的感染。与组织中体液水平和氯离子分泌之调节有关的其他条件包括与炎症、感染或创伤有关的组织肿胀。因此，用于抑制有害水平之氯离子分泌的方法也可用于缓解这些疾病的症状。
囊性纤维性变(Cystic fibrosis)高加索人种(Caucasians)中的最常见的遗传性疾病，在欧洲裔美洲人中的发病率为约1/2000。其特征是有异常的粘性粘液分泌，从而导致慢性肺病、胰腺功能不全和肠梗阻。在美国，约30,000人患有囊性纤维性变，而且每年有约1,000例被首次诊断出患有该疾病。在过去，患病儿童常常在婴儿时期就死亡了，但现在个体可存活至二十几和三十几岁。然而，现在没有能够治愈囊性纤维性变的方法，而且目前的治疗方法不能更正本质性的细胞缺陷，而只能控制疾病的症状。
目前囊性纤维性变的治疗方法大部分局限于症状的控制或机遇性感染的控制。例如，利用针对病毒性病原体的免疫接种和针对细菌感染的培养特异性抗生素可以预防感染。皮质类固醇药物有时用于治疗因感染引起的炎症反应，但这类药物有各种不利的长期副作用。其他治疗方法主要是针对与肺异常粘性粘膜分泌有关之慢性肺病的症状。例如，物理性辅助疗法如胸叩击和姿势导液法有助于从肺中清除分泌物。支气管扩张药对某些患者有用，但在另一些患者中可能会导致气体交换减少。与异常粘性粘膜分泌有关的其他症状包括肠梗阻和胰腺功能不全。肠梗阻发生于20％的成年人中，可用灌肠法治疗，或者灌肠法无效时，用外科手术治疗。
胰腺功能不全发生于80％至90％的患者中，并且是因碳酸氢根离子和体液分泌减少而导致的，所述分泌减少是由细胞外氯离子再循环损伤引起的。相应的胰液中，蛋白被超浓缩，而且胰液也变得很浓，引起胰管阻塞，从而导致胰腺泡萎缩。通过补充酶来治疗胰腺功能不全，这样通常可恢复足够的消化和吸收功能，由此改变营养不良的症状。但是，产生所述症状的疾病仍然存在，常常会引起胰腺炎复发，这样会导致胰腺萎缩。
可恢复正常肺功能、正常结肠分泌功能或正常胰腺功能的治疗比现有方法有更大的优越性。已经将基因治疗用于囊性纤维性变患者。但是，由于多种原因，在基因治疗方面进行的努力并未取得成功，这些原因包括基因的大小超常，对用于转移所述基因之腺病毒载体产生免疫反应以及上皮组织的迅速更新。
因此，现在仍需要可改变氯离子分泌的方法，以便缓解与异常氯根运输有关之疾病如囊性纤维性变和分泌性腹泻的症状。本发明满足了这种需求并提供了相关的优点。
                      发明综述
本发明提供了肌醇多磷酸酯的细胞渗透性拮抗剂组合物。例如，本发明提供了myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸酯和磷脂酰肌醇三磷酸酯的拮抗剂。另外，本发明提供了通过将细胞与肌醇多磷酸酯的细胞渗透性拮抗剂接触来增加氯离子从该细胞中分泌的方法。本发明还提供了通过给个体施用肌醇多磷酸酯的细胞渗透性拮抗剂来增强个体的氯离子分泌的方法。此外，本发明还提供了通过给个体施用肌醇多磷酸酯的细胞渗透性拮抗剂来缓解所述个体中与囊性纤维性变有关的体征或症状的方法。
本发明还提供了肌醇多磷酸酯的细胞渗透性激动剂组合物。例如，本发明提供了nyo-肌醇3，4，5，6-四磷酸酯和磷脂酰肌醇三磷酸酯的激动剂。另外，本发明提供了通过将细胞与肌醇多磷酸酯的细胞渗透性激动剂接触来减少氯离子从该细胞中分泌的方法。本发明还提供了通过给个体施用肌醇多磷酸酯的细胞渗透性激动剂来降低个体的氯离子分泌的方法。此外，本发明还提供了通过给个体施用肌醇多磷酸酯的细胞渗透性激动剂来缓解所述个体中与分泌性腹泻有关的体征或症状的方法。
                附图的简要说明
图1表示myo-肌醇、scyllo-肌醇和代表性细胞渗透性肌醇多磷酸酯衍生物、2-Bt-1-Me-Ins(3，4，5，6)P4/AM的结构。
图2表示在兔结肠中氯离子分泌的Bt2-Ins(3，4，5，6)P4/AM抑制作用。
图3表示由于Bt2-Ins(3，4，5，6)P4/AM介导的对组胺刺激的氯离子分泌的抑制作用，用200μM2-Bt-1-Me-Ins(3，4，5，6)P4/AM处理的结肠上皮T84细胞的氯离子分泌增加。
图4表示Bt2-Ins(3，4，5，6)P4/AM没有增加细胞内钙，并且不影响对钙对毒胡萝卜素的反应。
图5表示在用D，L-1，2-亚环己基-Ins(3，4，5，6)P4/AM(图5A)；1-Bu-2-Bt-Ins(3，4，5，6)P4/AM(图5B)；Bu2-Ins(3，4，5，6)P4/AM(图5C)；3-Bt-2-Bu-Ins(1，4，5，6)P4/AM(图5D)；Bu2-Ins(1，4，5，6)P4/AM(图5E)；1-Bt-2-Bu-Ins(3，4，5，6)P4/AM(图5F)；以及3-Bu-2-Bt-Ins(1，4，5，6)P4/AM(图5G)处理的结肠上皮T84细胞中，氯离子分泌增加。
图6表示由于EGF-介导的氯离子分泌抑制作用的逆转，在用Bt2-Ins(1，4，5，6)P4/AM处理的结肠上皮T84细胞中氯离子分泌增加。
图7表示用EGF或用PtdInsP3的细胞渗透性衍生物处理的结肠上皮T84细胞中氯离子分泌减少。由于EGF-和PtdInsP3-介导的氯离子分泌抑制作用的逆转，Bt2-Ins(1，4，5，6)P4/AM增加了氯离子分泌。
图8表示在用浓度不断增加的PtdInsP3/AM处理的结肠上皮T84细胞中氯离子分泌减少。
图9表示细胞渗透性PtdInsP3和二C16-Bt-PtdInsP3/AM的结构。
图10表示细胞渗透性PtdInsP3/AM衍生物合成的流程图。
图11表示1，2-亚环己基-Ins(3，4，5，6)P4/AM合成的流程图。
图12表示myo-肌醇1，3，4-三磷酸酯和2，5，6-Bt3-Ins(1，3，4)P3/AM的结构。仅表示了所述化合物的D构型。
图13表示细胞渗透性肌醇多磷酸酯衍生物合成的流程图。
                      发明详述
本发明提供了通过将细胞与作为肌醇多磷酸酯拮抗剂或激动剂的细胞渗透性化合物接触，以改变氯离子分泌的组合物和方法。文中所用，术语“改变”指增加或减少氯离子分泌以便使进出细胞的氯离子运输水平不同于未用本发明激动剂或拮抗剂处理之细胞中的分泌水平。文中所用术语“拮抗剂”指具有降低另一种化合物的生理学活性之功能的化合物。例如抑制氯离子分泌的化合物的拮抗剂可逆转该抑制作用。同样，术语“激动剂”指具有模拟另一种化合物之生理学活性之功能的化合物。
本发明的拮抗剂可增加细胞的氯离子分泌作用。文中所用术语“增加”当用于增加氯离子的分泌作用时，指将氯离子运输出细胞的水平高于未用拮抗剂处理的相应细胞中的分泌水平。相反，术语“减少”当用于降低氯离子的分泌作用时，指将氯离子运输出细胞的水平低于未用激动剂处理的相应细胞的分泌水平。文中所用术语“接触”指将细胞保温或暴露于细胞渗透性化合物以便所述化合物可穿过该细胞的膜。
异常的氯离子分泌作用与各种疾病有关。因此，本发明的化合物用于增加或降低氯离子分泌作用，由此缓解所述疾病的症状。在特定疾病如囊性纤维性变中，增加氯离子分泌作用对于缓解该疾病的症状有利，而在其他疾病如分泌性腹泻中，降低氯根分泌作用可缓解该症状。文中所用术语“缓解”指减轻疾病的症状。因此，根据氯离子分泌作用的异常性，本发明提供了组合物和方法以补偿与具体疾病有关的异常氯离子分泌作用。
本发明提供了作为肌醇多磷酸酯激动剂或拮抗剂的化合物。肌醇多磷酸酯衍生物可作为肌醇多磷酸酯激动剂和拮抗剂发挥功能。本发明化合物对Ins(3，4，5，6)P4-和PtdInsP3-介导的钙-介导之氯离子分泌的抑制作用在实施例中作了描述并总结于表I中。
本发明提供了细胞渗透性化合物，该化合物经钙依赖性钙离子通道，通过模拟或抵销钙-介导的氯离子分泌的内源抑制剂Ins(3，4，5，6)P4和PtdInsP3的活性来调节氯离子分泌。文中所述，增加Ins(3，4，5，6)P4或PtdInsP3的细胞内浓度的化合物用于抑制氯离子分泌。相反，拮抗Ins(3，4，5，6)P4或PtdInsP3的作用的化合物可用于增加氯离子分泌。表I肌醇多磷酸酯衍生物对氯离子分泌的作用表I
衍生物1 缩写2 氯离子分泌的抑制作用 阻断抑制作用的能力 影响的机理和肌醇多磷酸酯途径
1，2-二-O-丁酰-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯 Bt2-Ins(3，4，5，6)P4/AM + Ins(3，4，5，6)P4的激动剂
2-O-丁酰-1-O-甲基-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯 2-Bt-1-Me-Ins(3，4，5，6)P4/AM - + Ins(3，4，5，6)P4的拮抗剂
1，2-二-O-甲基-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯 Me2-Ins(3，4，5，6)P4/AM - + Ins(3，4，5，6)P4的拮抗剂
D，L-1，2-二-环亚己基-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯 D，L-1，2-环亚己基-Ins(3，4，5，6)P4/AM + Ins(3，4，5，6)P4的拮抗剂
1-O-丁基-2-O-丁酰-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯 1-Bu-2-Bt-Ins(3，4，5，6)P4/AM + Ins(3，4，5，6)P4的拮抗剂
1，2-二-O-丁基-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯 Bu2-Ins(3，4，5，6)P4/AM + Ins(3，4，5，6)P4的拮抗剂
1-O-丁酰-2-O-丁基-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯 1-Bt-2-Bu-Ins(3，4，5，6)P4/AM -
2，3-二-O-甲基-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯 Me2-Ins(1，4，5，6)P4/AM - -
2-O-丁酰-3-O-甲基-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯 2-Bt-3-Me-Ins(1，4，5，6)P4/AM - -
D，L-1，2-O-丁酰-scyllo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯 D，L-Bt2-scyllo-Ins(3，4，5，6)P4/AM + Ins(3，4，5，6)P4的激动剂
D，L-1-O-丁酰-2-O-甲基-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯 D，L-1-Bt-2-Me-Ins(3，4，5，6)P4/AM + Ins(3，4，5，6)P4的激动剂
D，L-1，2-二氯-1，2-二脱氧-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯 D，L-1，2Cl2-1.2-二脱氧-Ins(3，4，5，6)P4/AM -
3-O-丁酰-2-O-丁基-myo-肌醇1，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯 3-Bt-2-Bu-Ins(1，4，5，6)P4/AM -
2，3，-二-O-丁基-myo-肌醇1，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯 Bu2-Ins(1，4，5，6)P4/AM -
3-O-丁基-2-O-丁酰-myo-肌醇1，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯 3-Bu-2-Bt-Ins(1，4，5，6)P4/AM -
D，L-2，5，6-三-O-丁酰-myo-肌醇1，3，4-三磷酸六(乙酰氧甲基)酯 D，L-Bt3-Ins(1，3，4)P3/AM + Ins(3，4，5，6)P4的激动剂
2，3，-二-O-丁酰-myo-肌醇1，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯 Bt2-Ins(1，4，5，6)P4/AM + PtdInsP3的拮抗剂
sn-二-棕榈酰-D，L-6-O-丁酰-磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸七(乙酰氧基) 二C16-Bt-PtdInsP3/AM + PtdInsP3的激动剂
sn-二-辛酰-D，L-6-O-丁酰-磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸七(乙酰氧甲基)酯 二C8-Bt-PtdIns(3，4，5)P3/AM + PtdInsP3的激动剂
D，L-1-O-丁酰-2-O-脱氧-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯 D，L-1-Bt-2-脱氧-Ins(3，4，5，6)P4/AM Ins(3，4，5，6)P4的激动剂
1所列的衍生物使用下列缩写：TK，四磷酸酯；oct，十，hex，六。除非特别说明，所有化合物均是D型。2表和本申请中所用的缩写：Ins，肌醇；P，磷酸酯；Pn，n表示磷酸酯数；AM，乙酰氧基甲基酯；Bt，丁酰；Me，甲基；Bu，丁基；C16，棕榈酰；C8，辛酰；PtdIns，磷脂酰肌醇。除非特别说明，所有衍生物均是myo-肌醇衍生物。
本发明的细胞渗透性化合物可用于直接增加Ins(3，4，5，6)P4或PtdInsP3的细胞内浓度或由于结构相似性用于模拟Ins(3，4，5，6)P4或PtdInsP3的作用，所述化合物很容易通过细胞膜。或者，本发明的细胞渗透性化合物用于拮抗Ins(3，4，5，6)P4或PtdInsP3的作用。文中所述，肌醇多磷酸酯衍生物可作为Ins(3，4，5，6)P4或PtdInsP3的细胞渗透性激动剂或拮抗剂发挥功能。
按实施例XI中所述合成细胞渗透性肌醇多磷酸酯衍生物。这些化合物是细胞渗透性的，因为带电的磷酸基团被乙酰氧基甲基酯基团掩蔽，而羟基被疏水性化学基团(见图1)掩蔽。用于掩蔽亲水基团的疏水化学基团可以是例如，酰基、烷基、亚烷基基团，或可掩蔽肌醇多磷酸酯上之亲水基团的任何疏水化学基团。烷基基团包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、1-甲基丁基、2，2-二甲基丁基、2-甲基戊基、2，2-二甲基丙基、戊基和己基以及亚烷基基团，碳原子的环链如环己基和环戊基，以及直链或支链与碳原子环链的组合如甲基-环己基或环丙基-亚甲基。但是，就甲基衍生物而言，2-Bt-1-Me-Ins(3，4，5，6)P4/AM，Me2-Ins(3，4，5，6)P4/AM，Me2-Ins(1，4，5，6)P4/AM，2-Bt-3-Me-Ins(1，4，5，6)P4/AM和D，L-1-Bt-2-Me-Ins(3，4，5，6)P4/AM不在所要求的组合物范围内。另外，应认识到文中所定义的烷基可以被取代基所取得。亚烷基是乙缩醛，包括例如亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基、亚己基、环亚丁基、环亚戊基、环亚己基和环亚庚基(Kemp and Vellaccio，Organic Chemistry(有机化学)，Worth Publishers，New York(1980))，该文献引入本文作为参考。酰基包括例如乙酰基、丙酰基、丁酰基、己酰基和戊酰基。但是就酰基衍生物而言，Bt2-Ins(3，4，5，6)P4/AM，D，L-Bt2-scyllo-Ins(3，4，5，6)P4/AM和Bt2-Ins(1，4，5，6)P4/AM不在所要求的组合物范围内。一旦进入细胞，丁酰和乙酰氧甲基酯的基团就被细胞内的酯酶裂解。因此，用这些疏水功能基团修饰可以使化合物跨过细胞膜，在细胞膜内，所述化合物被水解，从而暴露了非衍生化合物的亲水基团。相反，烷基和亚烷基是不可水解的，因此，在其跨过细胞膜后，所述基团仍能被保留在所述衍生物上。
肌醇多磷酸酯的其他修饰可得到细胞渗透性衍生物。例如，Ins(3，4，5，6)P4衍生物，包括1，2-二脱氧-Ins(3，4，5，6)P4/AM，1-Bt-2-脱氧-Ins(3，4，5，6)P4/AM，2-Bt-1-脱氧-Ins(3，4，5，6)P4/AM和1，2-二氯-1，2-二脱氧-myo-Ins(3，4，5，6)P4/AM也是细胞渗透性衍生物(参见表I)。另外，细胞渗透性PtdInsP3衍生物包括，例如二C16-6-O-Bt-PtdIns(3，4，5)P3/AM和二C8-6-O-Bt-PtdIns(3，4，5)P3/AM以及二C16-2-O-Bt-PtdIns(3，4，5)P3/AM，二C8-2-O-Bt-PtdIns(3，4，5)P3/AM，二C16-2，6-O-Bt2-PtdIns(3，4，5)P3/AM和二C8-2，6-O-Bt2-PtdIns(3，4，5)P3/AM。Roemer等(J.Chem.Soc.，Chem.Commun.N4：411(fat 1995)；J.Chem.Soc.，Perkins Trans.1 N14：1683(fat 1996))描述了合成酰基化和乙酰氧甲基酯衍生物的方法，所述文献均引入本文作为参考。
本发明提供了作为肌醇多磷酸酯拮抗剂的细胞渗透性化合物。在一个实施方案中，该细胞渗透性化合物是Ins(3，4，5，6)P4拮抗剂。如本文所公开的，Ins(3，4，5，6)P4衍生物可起到Ins(3，4，5，6)P4拮抗剂的作用。例如，带有与位置1、位置2或这两个位置上的羟基相连的烷基的Ins(3，4，5，6)P4衍生物可起到Ins(3，4，5，6)P4拮抗剂的作用(参见表I和实施例III和IV)。特别有用的烷基衍生物是甲基(Me)和丁基(Bu)衍生物。例如2-Bt-1-Me-Ins(3，4，5，6)P4/AM，Me2-Ins-(3，4，5，6)P4/AM，1-Bu-2-Bt-Ins(3，4，5，6)P4/AM和Bu2-Ins(3，4，5，6)P4/AM均可逆转Ins(3，4，5，6)P4-介导的氯离子分泌抑制作用，因此，是Ins(3，4，5，6)P4拮抗剂。其他有用的Ins(3，4，5，6)P4衍生物是在位置1和位置2上含亚烷基的化合物。例如，D，L-1，2-环亚己基-Ins(3，4，5，6)P4/AM可逆转卡巴胆碱-介导的氯离子分泌抑制作用，因此，是Ins(3，4，5，6)P4拮抗剂。另外，在位置2和位置3上带有亚烷基的Ins(1，4，5，6)P4/AM衍生物也作为Ins(1，4，5，6)P4衍生物。
在另一实施方案中，细胞渗透性化合物是PtdInsP3拮抗剂。如本文所公开的，细胞渗透性Ins(1，4，5，6)P4衍生物是PtdInsP3拮抗剂。例如，在位置2和3上连有丁酰基的Ins(1，4，5，6)P4衍生物可逆转EGF-介导的和PtdInsP3-介导的对钙介导的氯离子分泌的抑制作用，因此是PtdInsP3拮抗剂(参见表I和实施例VII和VIII)。
本发明还提供了作为肌醇多磷酸酯激动剂的细胞渗透性化合物。在一个实施方案中，细胞渗透性化合物是Ins(3，4，5，6)P4激动剂。如本文所公开的，Ins(3，4，5，6)P4衍生物是Ins(3，4，5，6)P4激动剂。例如，Bt2-Ins(3，4，5，6)P4/AM，Bt2-scyllo-Ins(3，4，5，6)P4/AM和1-Bt-2-脱氧-Ins(3，4，5，6)P4/AM(36％的抑制作用)通过使氯离子分泌与细胞内钙浓度解偶联(uncoupling)来抑制钙介导的氯离子分泌，因此，是Ins(3，4，5，6)P4激动剂(参见表I和实施例I-III)。另外，Ins(1，3，4)P3衍生物是Ins(3，4，5，6)P4激动剂。例如Bt3-Ins(1，3，4)P3/AM通过提高Ins(3，4，5，6)P4的细胞内浓度来抑制钙介导的氯离子分泌，因此是Ins(3，4，5，6)P4激动剂(参见实施例V)。
在另一实施方案中，细胞渗透性化合物是PtdInsP3激动剂。如本文所公开的，PtdInsP3衍生物是PtdInsP3激动剂。例如，二C16-Bt-PtdInsP3/AM和二C8-Bt-PtdInsP3/AM抑制钙介导的氯离子分泌，因此是PtdInsP3激动剂(参见表I和实施例VIII)。
可以对肌醇多磷酸酯衍生物之结构的分子造型来设计具有模拟肌醇多磷酸酯衍生物所需活性的结构特征的合成化合物。或者，例如通过筛选组合化学库，鉴定可作为肌醇多磷酸酯激动剂或拮抗剂的细胞渗透性合成化合物。用本文描述的方法，可以筛选具有所需活性的合成化合物，所述活性指模拟或拮抗特定肌醇多磷酸酯对钙介导的氯离子分泌的影响。制备和筛选组合化学库的方法是本领域技术人员熟知的(组合肽和非肽库：手册(Combinatorial Peptide and NonpeptideLibraries：A Handbook)，Jung，ed.，VCH，New York(1996))，该文献引入本文作为参考。
本发明还提供了通过将细胞与作为肌醇多磷酸酯拮抗剂或激动剂的细胞渗透性化合物接触来改变氯离子分泌作用的方法。细胞利用氯离子的运动来调节生物体内的水流。细胞具有特异性的氯离子通道，该通道在开放时，仅允许氯离子通过膜。这些通道对在粘膜中的细胞是特别重要的，它们分泌粘蛋白并调节水流。当流入和流出细胞的水不足时，粘蛋白分泌会引起粘塞，这会阻塞肺中的导气管和如囊性纤维性变这类疾病的肠粘膜层。但是，不是所有的氯离子通道都相同，不同的通道以不同的方式受到调节。
一种具体的氯离子通道，钙-依赖性氯离子通道与钙离子流相联系。当细胞内的钙离子浓度增加时，氯离子分泌增加。文中所用术语“氯离子分泌”指氯离子跨细胞质膜的运输。用特定的化合物如组胺处理细胞会引起细胞内钙离子浓度的增加，从而导致氯离子分泌增加，所述化合物是对肌醇多磷酸酯代谢机理没有长期可检测的结果的一类生理学相关激动剂。
卡巴胆碱，一种毒蕈硷胆碱能化合物，短期给药也可以增加细胞内钙离子浓度并刺激氯离子分泌。但是，在用卡巴胆碱长期处理结肠上皮T84细胞后，细胞内钙离子浓度的增加不再刺激氯离子分泌(Kachintorn等，Am.J.Physiol.Cell 264：C671(1993))，该文献引入本文作为参考。用卡巴胆碱长期治疗会引起细胞内Ins(3，4，5，6)P4水平缓慢而持续地升高(Vajanaphanich，等，Nature，371：711(1994))，该文献引入本文作为参考。用Bt2-Ins(3，4，5，6)P4/AM和Bt2-Ins(1，4，5，6)P4/AM的混合物处理T84细胞会抑制氯离子分泌作用对因毒胡萝卜素诱导的细胞内钙浓度增加作出反应，而Bt2-Ins(1，4，5，6)P4/AM没有影响。如本文所举证的，旋光对应体纯的Bt2-Ins(3，4，5，6)P4/AM会抑制氯离子分泌作用对细胞内钙浓度的增加作出反应(参见实施例I)。因此，Ins(3，4，5，6)P4钙-介导的氯离子分泌作用的内源负调节剂，因为，它从钙离子浓度中解偶联氯离子分泌。
不同于Ins(3，4，5，6)P4介导的抑制钙介导的氯离子分泌的另一种机理是增加PtdInsP3水平。在T84细胞中，EGF抑制由卡巴胆碱和毒胡萝卜素诱导的钙介导的氯离子分泌(Uribe，等Am.J.Physiol.271：C914(1996a))。与卡巴胆碱相比，EGF使Ins(3，4，5，6)P4的水平增加1.7倍，而卡巴胆碱使Ins(3，4，5，6)P4的水平增加20倍。这些结果表明EGF通过一种不同于Ins(3，4，5，6)P4的机理来调节钙介导的氯离子分泌。
EGF激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI 3-激酶)，EGF对钙介导的氯离子分泌的抑制作用由PI 3-激酶介导(Uribe等，J.Biol.Chem.271：26588(1996b))。EGF刺激PI 3-激酶产物，磷脂酰肌醇3，4-二磷酸酯(PtdInsP2)和PtdInsP3水平的增加。在EGF抑制氯离子分泌的同时，这些PI 3-激酶产物会增加。渥曼青霉素是一种高特异性的PI 3-激酶抑制剂，它可以阻断PtdInsP3和PtdInsP2的形成并可逆转EGF诱导的氯离子分泌抑制作用。因此，涉及PtdInsP3的机理可以解释EGF诱导的钙介导的氯离子分泌的抑制作用。
由于本发明化合物是肌醇多磷酸酯的激动剂和拮抗剂，它们调节氯离子分泌，所以这些化合物对于改变细胞中的氯离子分泌是有用的。化合物的细胞渗透性使得通过将细胞与所述化合物接触，可将所述化合物传递至胞质中肌醇多磷酸酯的作用位点。
本发明提供了通过将细胞与肌醇多磷酸酯的细胞渗透性拮抗剂接触来增加跨细胞膜的氯离子分泌的方法。在一个实施方案中，用Ins(3，4，5，6)P4的拮抗剂增加氯离子分泌。如本文所公开的，可用Ins(3，4，5，6)P4衍生物作为Ins(3，4，5，6)P4拮抗剂。在另一实施方案中，用PtdInsP3拮抗剂增加氯离子分泌。如本文所公开的，可用Ins(3，4，5，6)P4衍生物作为PtdInsP3拮抗剂。
本发明还提供了通过将细胞与肌醇多磷酸酯的细胞渗透性激动剂接触来减少跨细胞膜的氯离子分泌的方法。在一个实施方案中，用Ins(3，4，5，6)P4激动剂减少氯离子分泌。如本文所公开的，可用Ins(3，4，5，6)P4衍生物作为Ins(3，4，5，6)P4激动剂。另外，可用Ins(1，3，4)P3衍生物作为Ins(3，4，5，6)P4激动剂。在另一实施方案中，用PtdInsP3激动剂减少氯离子分泌。如本文所公开的，可用PtdInsP3衍生物作为PtdInsP3激动剂。
本发明提供了通过给个体施用Ins(3，4，5，6)P4或PtdInsP3拮抗剂来增加个体的氯离子分泌的方法。如文中所用，术语“个体”指用增加或减少氯离子分泌的本发明激动性或拮抗性化合物治疗的生物体，一般是哺乳动物，尤其是人。氯离子分泌增加或减少发生在个体中一个或多个组织器官的细胞中。文中所用术语“施用”指以一种方式和形式将拮抗剂或激动剂导入个体，一般将所述拮抗剂或激动剂传递至适宜的靶组织中，在所述组织中，与靶细胞接触，由此改变所述细胞的氯离子分泌。本发明还提供了缓解与囊性纤维性变有关之体征或症状的方法，该方法包括给表现出所述体征或症状的个体施用Ins(3，4，5，6)P4或PtdInsP3的拮抗剂或同时施用两种拮抗剂。
本发明还提供了通过给个体施用Ins(3，4，5，6)P4或PtdInsP3的激动剂来减少个体的氯离子分泌的方法。另外，本发明还提供了缓解与分泌性腹泻有关的体征或症状的方法，该方法包括给表现出所述体征或症状的个体施用Ins(3，4，5，6)P4或PtdInsP3的激动剂。
通常将拮抗剂或激动剂作为药物组合物施用给个体。所述药物组合物含有所述拮抗剂或激动剂和可药用载体。可药用载体是本领域熟知的，包括如作为生理缓冲盐的水溶液或其他溶剂或载体如乙二醇、甘油、油如橄榄油或可注射用有机酯。
可药用载体可含有生理学可接受的化合物，所述化合物可以例如稳定所述拮抗剂或激动剂或增加所述试剂的吸收。所述生理学可接受的化合物包括例如碳水化合物如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖，抗氧化剂如抗坏血酸或谷胱甘肽，螯合剂，低分子量蛋白质或其他稳定剂或赋形剂。本领域技术人员知道可药用载体，包括生理学可接受的化合物的选择取决于例如所述发明的拮抗剂或激动剂的给药途径和靶组织。
根据待治疗的个体和靶组织，可以利用不同的给药途径。可将药物组合物分别通过包括例如口、直肠或胃肠外，如静脉内、肌肉内、皮下、眼眶内、囊内、腹膜内、脑池内给药或通过消极或积极的经皮吸收，例如利用皮肤贴剂或跨皮离子电渗疗法给药。此外，可通过注射、插管或局部施用所述组合物，后者可以是消极的，例如通过直接施用软膏或粉剂，或积极的，例如用鼻喷雾剂或吸入剂。
作为单次剂量的总有效剂量或者作为药团(bolus)或在一个相对短的期间内通过输注施用给个体，或者可用分级治疗法(fractionatedtreatment protacol)施用，其中在一个更长的期间内施用多次剂量。本领域技术人员应知道，在一个个体中，得到有效剂量所需的试剂浓度取决于许多因素，包括年龄和个体的健康状况以及给药途径和待给药的次数。从这些因素看，本领域人员可调整具体剂量以便得到有效剂量。
具体化合物的剂量是由达到所需效果，例如增加或减少氯离子分泌所需的细胞内浓度所决定的。用本文公开的或本领域已知的方法确定有效细胞内浓度。例如用体外Ins(1，3，4)P3-5/6-激酶试验(Vajanaphanich等，同上文，1994)得出激动剂Bt2-Ins(3，4，5，6)P4/AM的有效细胞内浓度为约4μM。因此，对于Bt2-Ins(3，4，5，6)P4/AM，可选择剂量以便使细胞内衍生物浓度为约4-20μM，优选4μM。用一模型系统完成开始的研究以便确定具体化合物的效力。在个体中治疗疾病所需的有效浓度用I期和II期临床试验确定。
本发明化合物可单独使用，或彼此联用，或与其他治疗试剂联用以治疗与异常氯离子分泌有关的疾病。例如，治疗方法可从一种化合物开始，如果由于第一种化合物效力不足，可根据需要将其他化合物与第一种化合物一起施用。所述治疗也可与其他治疗方式结合，例如施用尿苷5’-三磷酸加阿米洛利(参见Bennett等，Am.J.Respir.Crit.Care Med.153：1796(1996))，该文献引入本文作为参考。
本发明组合物和方法用于治疗各种疾病，例如囊性纤维性变或分泌性腹泻，所述疾病的部分特征是氯离子分泌异常。在囊性纤维性变中发生缺陷型氯离子分泌是由于上皮细胞氯离子通道中囊性纤维性变跨膜调节因子(CFTR)的突变。与上皮细胞端面有关的氯离子通道是调节盐和液体分泌的主要控制点。大部分囊性纤维性变是因单个点突变(ΔF508突变)造成的，所述突变导致508位上苯丙氨酸的丢失。该突变干扰CFTR转移至细胞膜，由此减少细胞的氯离子分泌。
治疗囊性纤维性变的一种方法是人工激活其他氯离子通道。例如，在上皮细胞中，外调整氯根通道(outwardly rectifying chloridechannel，ORCC)是由环AMP调节的一个氯离子通道。但是，认为ORCC也受CFTR的调节，因此，在囊性纤维性变中活性较低(Schwiebert等，Cell，81：1063(1995)；Egan等，Nature，358：581(1992)；和Gabriel等，Nature，363：263 1993)。相反，钙依赖性氯离子通道在囊性纤维性变的小鼠模型的细胞中更丰富(Grubb等，Am.J.Physiol.266：C1478(1994))。由于钙依赖性氯离子通道与CFTR不同并且可能在囊性纤维性变患者的细胞中更丰富，因此，可以增大通过这些通道的流量以补偿通过CFTR的流量短缺。如本文所公开的，可以用一种或多种Ins(3，4，5，6)P4或PtdInsP3的拮抗剂恢复受CFTR缺陷影响的上皮细胞中的氯离子分泌。
数个模型系统可用于评估本发明肌醇多磷酸酯衍生物增加氯离子分泌的能力。一个所述模型是人结肠上皮T84细胞系，作为一个分泌性上皮模型，该细胞系已经被进行了广泛的研究(Dharmsathaphom等，Am.J.Physiol.246：G204(1984))。当在可渗透支持物上生长至汇合时，T84细胞有相对分化的表型，形成有紧密连接和向量运输的多极化单层。T84单层保留了许多受体介导的氯离子分泌机理，包括与游离胞质钙和CFTR变化有关的机理(Cohn等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：2340(1992))。组胺、卡巴胆碱、钙离子载体和毒胡萝卜素等试剂可提高细胞内钙离子并在不同程度上刺激跨T84单层的氯离子分泌(Dharmsathaphom等，J.Clin.Invest.84：945(1989)；Kachintom等，同上文，1993)。在T84细胞中，环AMP也通过CFTR刺激氯离子分泌(Anderson and Welsh，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：6003(1991))。因此，T84细胞提供了在正常和与氯离子运输缺陷有关的疾病如囊性纤维性变中调节氯离子分泌的体外模型。另外，兔结肠的上皮细胞也提供了结肠上皮细胞模型。
囊性纤维性变的三个最使人衰弱的症状是慢性肺病、胰腺功能不全和肠梗阻。有数个模型系统可用于表征本发明肌醇多磷酸酯衍生物的治疗这些症状的效力，例如，剔除T84细胞中的CFTR基因(CFTR-T84细胞)提供了结肠上皮细胞模型，该模型的遗传背景与囊性纤维性变患者的结肠细胞相似(参见实施例X)。在不断增加氯离子分泌的条件下，CFTR-T84细胞系用于评估本发明化合物的效力，所述化合物是Ins(3，4，5，6)P4和PtdInsP3的拮抗剂。
初级人鼻上皮细胞是用于检测各种化合物对氯离子分泌之作用的呼吸上皮模型。初级人鼻上皮细胞用于检测本发明化合物对这些细胞中的氯离子分泌的功能，所述化合物是Ins(3，4，5，6)P4和PtdInsP3的拮抗剂(参见实施例IX)。
用于研究胰腺功能的适宜模型系统使用胰腺管上皮细胞CFTR-细胞系，CFPAC，该细胞系是衍生于纯合ΔF508突变之患者的胰腺腺癌的人细胞系。CFPAC细胞没有cAMP-刺激的通道功能，但显示钙激活的氯离子通道活性(Shoemacher等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：4012(1990))。狗胰腺管上皮细胞也用于检测本发明化合物对这些细胞中的氯离子分泌的功能，所述化合物是Ins(3，4，5，6)P4和PtdInsP3的拮抗剂(Nguyen等，Am.J.Physiol.272：G172(1997))，该文献引入本文作为参考。
还可用囊性纤维性变动物模型评估Ins(3，4，5，6)P4和PtdInsP3拮抗剂的活性。例如已经产生了CFTR剔除小鼠，提供了囊性纤维性变模型(Rozmahel等，Nature Gen.12：280(1996)；Snouwaert等，Science257：1083(1992)；Ratiff等，Nature Gen.4：35(1992)；O′Neal等，Hum.Molec.Genet.2：1561(1993)和Dorin等，Nature 359：211(1992))，所述文献均引入本文作为参考。钙依赖性氯离子通道表达水平的提高增加了CFTR剔除小鼠的生存力(Clarke等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：479(1994)；和Rozmahel等，同上文1996)。用动物模型检测本发明化合物对这些动物氯离子分泌的效力，所述化合物是Ins(3，4，5，6)P4和PtdInsP3的拮抗剂。动物模型还用于检测本发明化合物对动物具体组织的效力。
由于囊性纤维性变症状在多种器官系统中产生，本领域技术人员根据待治疗的症状可选择所述化合物的具体给药途径和给药方法。所述化合物有两亲性并溶于水溶液。或者，可将所述化合物溶解在含表面活性剂的二甲亚砜中。还可将所述化合物溶解在含FREON(1，1，2三氯三氟甲烷)的溶液中，所述溶液有粘度低的优点，并且更容易接近患病组织，因此，对于疾病的急性炎症或疾病早期的治疗是有用的。例如，在患呼吸性疾病的患者中，可将本发明的拮抗剂悬浮或溶解于适宜的可药用载体中，然后用吸入装置如吸入器、喷雾器或涡轮吸入器直接施用至肺中。因此，为了缓解肺中的粘液积累，可将化合物以气雾剂形式直接施用到靶肺组织。或者，可将化合物溶解于FREON中，然后通过肺灌注给药。在雾化水溶液的定期呼吸过程中，可保持所述治疗。
囊性纤维性变的临床症状如粘液粘度是熟知的，本领域人员知道如何确定治疗方法是否可有效缓解或预防囊性纤维性变的这些已知呼吸体征和症状。例如用(99MTc)氧化铁颗粒测量粘液纤毛清除率可确定本发明化合物的治疗效力(Bennett，同上文，1996)。
通过适宜的给药方式，用Ins(3，4，5，6)P4和PtdInsP3的拮抗剂可治疗囊性纤维性变的其他临床症状。例如，用鼻喷雾剂施用药物组合物可治疗窦并发症。这种治疗方法比治疗窦并发症的现有方法有利，现有的方法常常需进行多次内窥镜外科手术，这样会使患囊性纤维性变的患者面部变形。为了缓解囊性纤维性变的肠失调，用适宜的药用载体，通过栓剂或灌肠剂施用试剂。或者经口施用包肠溶衣的片剂。在患胰腺炎的患者中，将药物组合物以静脉内、经口或通过全身性施用化合物，包括施用至胰腺的其他方法施用。
除囊性纤维性变外，与组织中体液积累有关的其他疾病通过改变氯离子分泌很容易治疗。例如与炎症、感染或创伤有关的肿胀如脑肿胀可通过减少氯离子分泌而得到缓解(Berger等，Acta Neurochir.Suppl.(Wien)60：534(1994)；和Staub等，J.Neurotrauma 11：679(1994))。
与氯离子分泌异常低的疾病如囊性纤维性变相反，其他疾病的部分特征在于氯离子分泌水平异常高。例如在分泌性腹泻中发生高水平氯离子分泌。引起分泌性腹泻的侵袭性肠细菌沙门氏菌是发展中国家儿童死亡和发达国家健康问题的一个最重要原因。每年因沙门氏菌(Salmonella)感染有1.3亿以上例患肠炎，有约3百万人死亡。由于分泌性腹泻与跨肠上皮的氯离子流增加有关，因此，减少氯离子分泌可缓解分泌性腹泻的症状。本领域人员应了解用肌醇多磷酸酯的激动剂治疗个体以缓解与上述相似的分泌性腹泻之症状的方法。
本发明提供了通过将细胞与肌醇多磷酸酯的细胞渗透性激动剂或拮抗剂接触来改变跨细胞膜的氯离子分泌的组合物和汇合。本发明还提供了通过给个体施用肌醇多磷酸酯的激动剂或拮抗剂来改变个体的氯离子分泌的方法。本发明进一步提供了通过施用含肌醇多磷酸酯的激动剂或拮抗剂的药物组合物来缓解与异常氯离子分泌有关之疾病的症状的方法。因此，本发明的化合物可作为药物用于缓解部分特征在于氯离子分泌异常的疾病的体征和症状。
下列实施例只是为了说明而不是限制本发明。
                  实施例I
用Ins(3，4，5，6)P4的细胞渗透性衍生物减少T84细胞中
              钙介导的氯离子分泌
本实施例说明通过增加Ins(3，4，5，6)P4的细胞内浓度，Ins(3，4，5，6)P4的细胞渗透性衍生物减少了结肠上皮T84细胞系中钙介导的氯离子分泌。
合成旋光对应体纯的1，2-Bt2-Ins(3，4，5，6)P4/AM以确定1，2-Bt2-Ins(3，4，5，6)P4/AM是否介导了氯离子分泌从细胞内钙浓度中解偶联。将T84细胞(传代18-48次)按以前所述保持(Weymer等，J.Clin.Invest.76：1828(1985))，该文献引入本文作为参考。在SNAP-WELLS(ComingCostar；Cambridge，MA)上保温7-10天后，形成紧密结合的单层。在固定前，将细胞单层与100，200或400μM Bt2-Ins(3，4，5，6)P4/AM预保温30分钟。再过30分钟，加入0.1mM组胺，然后检测氯离子分泌。将氯离子分泌测量为跨T84单层生长至汇合的短环流(Isc)，然后用备电压钳的Ussing室(Physiologic Instruments；San Diego，CA)固定。得到数据并用“Acquire and Analyze”软件(Physiologic Instruments)分析。
用200μM1，2-Bt2-Ins(3，4，5，6)P4/AM时，组胺-刺激的氯离子分泌减少最多，用400μM没有进一步减少(表II)。该结果与以前的研究一致，以前的研究表明Ins(3，4，5，6)P4的细胞内水平接近4μM(等于200μM细胞外浓度)，对应于开始的最大抑制作用(Vajanaphanich等，同上文，1994)。表II用细胞渗透性Ins(3，4，5，6)P4衍生物减少钙依赖性氯离子分泌表II
 Bt2Ins(3，4，5，6)P4/AM(浓度) 施用组胺(10μM)之后的峰ΔIsc(％对照)平均值±SEM  n  vs对照(100％)
100μM  75.1±7.4  8  p＜0.012
 200μM  57.2±15.1  6  p＜0.037
 400μM  69.3±8.7  4  p＜0.041
与Ins(3，4，5，6)P4的细胞渗透性衍生物减少氯离子分泌相反，二丁酰环AMP乙酰氧基甲基酯刺激的氯离子分泌没有受到抑制(峰ΔIsc＝96.3±9.1％或对照；平均值±SEM；n＝4)。该结果与下列观察结果一致：环AMP-介导的氯离子分泌是通过一个与钙-介导的氯离子分泌之通道不同的氯离子通道发生的(McRoberts等，J.Biol.Chem.260：14163(1985))。
这些结果表明通过使细胞与Ins(3，4，5，6)P4的细胞渗透性衍生物接触，不断增加的Ins(3，4，5，6)P4细胞内浓度，通过使氯离子分泌从细胞内钙浓度中解偶联而减少了钙介导的氯离子分泌，而且Ins(3，4，5，6)P4的细胞渗透性衍生物是Ins(3，4，5，6)P4的激动剂。
                实施例II
在兔结肠中用细胞渗透性Ins(3，4，5，6)P4衍生物减少
          钙介导的氯离子分泌
本实施例说明用浓度不断增加的Ins(3，4，5，6)P4的细胞渗透性衍生物可减少兔结肠组织中钙介导的氯离子分泌。
用兔结肠模型系统(Frizzell等，J.Membrane Biol.27：297(1976)和Frizzell and Schultz，Int.Rev.Phvsiol.19：205(1979)，所述文献均引入本文作为参考)证实了用培养的T84结肠上皮细胞得到的上述结果。将兔结肠切割成段作为兔结肠上皮源。简而言之，用含141mM Na+，5mM K+，1.2mM Ca2+，1.2mM Mg2+，122mM Cl-，25mM HCO3，1.6mMHPO4，0.4mM H2PO4和10mM葡萄糖的Ringers溶液洗涤兔结肠段。37℃，用5％CO2和95％O2充气时，该溶液的pH为7.4。将上皮与下面的肌肉层剥离并用改性SNAP WELLS(Frizzell等，同上文，1976)固定。在37℃，将上皮与200μM 1，2-Bt2-Ins(3，4，5，6)P4/AM预保温30分钟，然后用Ussing室固定。按实施例I所述，以4秒的间隔测量短回流(short circuite current)、电导率和电阻。峰Isc是对照的50.9％±10.4，对照是与载体一起保温(图2；平均值±SEM，n＝3；用Student′s双尾t试验，p＜0.05)。图2中表示的％对照代表ΔIsc比用组胺刺激的对照单层的峰Isc。
这些结果表明细胞渗透性衍生物Bt2-Ins(3，4，5，6)P4/AM通过增加细胞内的Ins(3，4，5，6)P4浓度而作为Ins(3，4，5，6)P4激动剂并可减少兔结肠中的氯离子分泌。这些结果还证实细胞内Ins(3，4，5，6)P4的升高将从结肠上皮组织中的细胞内钙浓度中解偶联氯离子分泌。
                   实施例III
用Ins(3，4，5，6)P4拮抗剂逆转Ins(3，4，5，6)P4对组胺-刺激的
          氯离子分泌的抑制作用
本实施例说明Ins(3，4，5，6)P4对组胺刺激的氯离子分泌的抑制作用可通过Ins(3，4，5，6)P4的细胞渗透性衍生物逆转，所述衍生物作为Ins(3，4，5，6)P4的拮抗剂。
实施例I和II中所列的结果表明浓度不断增加的Ins(3，4，5，6)P4减少了钙介导的氯离子分泌。因此，细胞中拮抗Ins(3，4，5，6)P4功能的化合物应该可逆转这种减少。
开始的研究是主要是针对了解Ins(3，4，5，6)P4的结构决定基，所述决定基引起对钙介导的氯离子分泌的抑制作用。合成了一系列细胞渗透性肌醇多磷酸酯衍生物。这些衍生物在1，2或3位上含有一个或两个不可水解的化学基团。将T84单层与200μM 2-Bt-1-Me-Ins(3，4，5，6)P4/AM，Me2-Ins(3，4，5，6)P4/AM，Me2-Ins(1，4，5，6)P4/AM或2-Bt-3-Me-Ins(1，4，5，6)P4/AM一起预保温。
保温后，用Ussing室固定细胞。用组胺(10-4M)刺激钙介导的氯离子分泌。对照值是对共保温单层中组胺的反应。将数据表示为平均值峰ΔIsc±SEM，表示为8-10个试验的％对照。用Student′s双尾t试验鉴定显著性差异。
如表III所示，在用任何衍生物处理的细胞中，均没有抑制作用。这些结果表明在1和2位的氢-键供体电势参与介导了Ins(3，4，5，6)P4对钙介导的氯离子分泌的抑制作用。细胞渗透性Bt2-Ins(3，4，5，6)P4/AM的scyllo衍生物至少与myo衍生物一样是有效的抑制剂，这表明2-羟基位置的方向性与抑制活性无关。
按上述将T84细胞与上述的细胞渗透性肌醇多磷酸酯一起预保温以确定是否有肌醇多磷酸酯衍生物可作为钙介导的氯离子分泌的Ins(3，4，5，6)P4抑制作用的拮抗剂。组胺刺激后，测量短回流。如图3所示，相对于对照细胞，与Bt2-Ins(3，4，5，6)P4/AM保温减少了组胺刺激的氯离子分泌。图3中的％对照代表ΔIsc比用组胺刺激的对照单层的峰Isc。但是，与2-Bt-1-Me-Ins(3，4，5，6)P4/Am的预保温逆转了Bt2-Ins(3，4，5，6)P4/AM的抑制作用。表III用Ins(3，4，5，6)P4的衍生物逆转Ins(3，4，5，6)P4-介导的氯离子分泌的减少表III
 Bt2Ins(3，4，5，6)P4/AM(浓度) 拮抗剂 施用组胺(100μM)之后的峰AIsc(％对照)平均值±SEM  n  vs对照(100％)
100μM  75.1±7.4  8  p＜0.012
 200μM  57.2±15.1  6  p＜0.037
 400μM  69.3±8.7  4  p＜0.041
  -  2-Bt-1-Me-Ins(3，4，5，6)P4/AM(200μM)  87.3±6.6  8  ns
  -  Me2-Ins(3，4，5，6)P4/AM(200μM)  103.9±11.1  8  ns
 Me2-Ins(1，4，5，6)P4/AM(200μM) 120.8±10.6  8  ns
 2-Bt-3-Me-Ins(1，4，5，6)P4/AM(200μM) 105.5±3.7  10  ns
 200μm 2-Bt-1-Me-Ins(3，4，5，6)P4/AM(200μM) 117.7±10.6  8  ns
 200μM  Me2-Ins(3，4，5，6)P4/AM(200μM) 107.13±10.2  8  ns
 200μM  2-Bt-3-Me-Ins(1，4，5，6)P4/AM(200μM) 69.7±5.04  8  p＜0.0005
200μM  Me2-Ins(1，4，5，6)P4/AM(200μM) 68.4±7.3  8  p＜0.003
 Bt2AMP/AM(2μM) 96.3±9.1  4  ns
 Bt5-Ins(1，4，5，6)P4/AM(400μM) 137.9±20.7  4  ns
 D，L-1-Bt-2-Me-Ilns(3，4，5，6)P4/AM(800μM) 114.2±23.7  8  ns
 200μM  D，L-1-Bt-2-Me-Ins(3，4，5，6)P4/AM(400μM) 96.7±14.8  3  ns
 D，L-1，2-Cl2-二脱氧-Ins(3，4，5，6)P4/AM(400μM) 89.39±7.8  8  ns
在表III中列出了各种肌醇多磷酸酯衍生物对组胺刺激的氯离子分泌的作用。Ins(3，4，5，6)P4衍生物2-Bt-1-Me-Ins(3，4，5，6)P4/AM和Me2-Ins(3，4，5，6)P4/AM逆转了Bt2-Ins(3，4，5，6)P4/AM对组胺刺激的氯离子分泌的抑制作用。相反，Ins(1，4，5，6)P4的衍生物Me2-Ins(1，4，5，6)P4/AM和2-Bt-3-Me-Ins(1，4，5，6)P4/AM基本上没有作用。这些结果表明Bt2-Ins(3，4，5，6)P4/AM对氯离子分泌减少的逆转是立体特异性的并表明Ins(3，4，5，6)P4的这些烷基衍生物可作为Ins(3，4，5，6)P4的拮抗剂。
还检测了其他衍生物。与Bt2-Ins(1，4，5，6)P4/AM预保温不能抑制氯离子分泌，而且事实上，使氯离子分泌有轻微的增加。Ins(3，4，5，6)P4衍生物，D，L-1，2-Cl2-二脱氧-Ins(3，4，5，6)P4/AM对氯离子分泌有轻微的抑制作用。D，L-1-Bt-2-Me-Ins(3，4，5，6)P4/AM对氯离子分泌没有抑制并且没有逆转抑制作用Bt2-Ins(1，4，5，6)P4/AM的抑制作用。
细胞内钙浓度的升高导致氯离子分泌增加。为了确保肌醇多磷酸酯衍生物对氯离子分泌的影响都不是因钙水平的变化而引起的，在用肌醇多磷酸酯衍生物处理的细胞中测量细胞内钙浓度。如图4所示，Bt2-Ins(1，4，5，6)P4/AM没有升高细胞内钙或者钙对毒胡萝卜素的反应。所检测的化合物中，没有一个通过其本身改变了细胞内钙水平或改变了用卡巴胆碱或毒胡萝卜素刺激的细胞内钙水平。因此，肌醇多磷酸酯衍生物对氯离子分泌的影响不是因为对细胞内钙浓度的作用而引起的。
这些结果说明Ins(3，4，5，6)P4的细胞渗透性衍生物逆转了钙介导的氯离子分泌的减少，这种减少是起因于由于用1，2-Bt2-Ins(3，4，5，6)P4/AM处理细胞引起的Ins(3，4，5，6)P4的细胞内浓度增加，由此增加了钙介导的由这些细胞的氯离子分泌。相反，立体异构体Ins(1，4，5，6)P4的衍生物不影响由Ins(3，4，5，6)P4介导的氯离子分泌的抑制作用。因此，Ins(3，4，5，6)P4的细胞渗透性衍生物可作为Ins(3，4，5，6)P4拮抗剂。
               实施例IV
  用Ins(3，4，5，6)P4拮抗剂逆转卡巴胆碱介导的
          氯离子分泌的减少
本实施例说明用可作为Ins(3，4，5，6)P4拮抗剂的细胞渗透性Ins(3，4，5，6)P4衍生物可逆转卡巴胆碱介导的氯离子分泌减少。
在上述实施例III中，通过加入细胞渗透性衍生物Bt2-Ins(3，4，5，6)P4增加了细胞内Ins(3，4，5，6)P4，该衍生物被内源酯酶水解产生了Ins(3，4，5，6)P4/AM。在本实施例中，通过用卡巴胆碱延长对细胞的处理来增加细胞内Ins(3，4，5，6)P4。
用D，L-1，2-环亚己基-Ins(3，4，5，6)P4/AM，
     1-Bu-2-Bt-Ins(3，4，5，6)P4/AM，
     Bu2-Ins(3，4，5，6)P4/AM，
     3-Bt-2-Bu-Ins(1，4，5，6)P4/AM，
     Bu2-Ins(1，4，5，6)P4/AM，
     1-Bt-2-Bu-Ins(3，4，5，6)P4/AM或
     3-Bu-2-Bt-Ins(1，4，5，6)P4/AM处理T84结肠上皮细胞，并测量短回流。
将一组细胞与一种肌醇多磷酸酯衍生物预保温30分钟。将另两组细胞与载体或单独预保温。在0时开始测量Isc。在5分钟时，将卡巴胆碱(10-4M)加至与载体单独预保温的一组细胞(在图5中称为“卡巴胆碱”)中，将卡巴胆碱加至与肌醇多磷酸酯衍生物预保温的细胞(在图5A中称为“卡巴胆碱+D，L-1，2-环亚己基-Ins(3，4，5，6)P4/AM”)中。在30分钟时，加入1μM毒胡萝卜素。收集n＝4-6次试验的数据。
图5A列出了使用D，L-1，2-环亚己基-Ins(3，4，5，6)P4/AM的试验。在与Ins(3，4，5，6)P4衍生物预保温的细胞和仅用卡巴胆碱处理的细胞中，加入卡巴胆碱引起短回流的暂时增加。在30分钟时，ΔIsc回到对照水平后，加入1μM毒胡萝卜素以刺激细胞内钙增加。在用毒胡萝卜素处理的对照细胞中可观察到ΔIsc的预期增加，而用卡巴胆碱进行延长处理的细胞中ΔIsc减弱。用D，L-1，2-环亚己基-Ins(3，4，5，6)P4/AM预处理逆转了卡巴胆碱对钙介导的氯离子分泌的抑制作用。因此，D，L-1，2-环亚己基-Ins(3，4，5，6)P4/AM可作为Ins(3，4，5，6)P4的拮抗剂。
如图5所示，Ins(3，4，5，6)P4衍生物D，L-1，2-环亚己基-Ins(3，4，5，6)P4/AM、1-Bu-2-Bt-Ins(3，4，5，6)P4/AM和Bu2-Ins(3，4，5，6)P4/AM逆转了由毒胡萝卜素刺激的卡巴胆碱介导的氯离子分泌的抑制作用，这表明这些Ins(3，4，5，6)P4衍生物可作为Ins(3，4，5，6)P4的拮抗剂(分别为图5A至5C)。相反，1-Bt-2-Bu-Ins(3，4，5，6)P4/AM以及3-Bt-2-Bu-Ins(1，4，5，6)P4/AM、2，3-Bu2-Ins(1，4，5，6)P4/AM和3-Bu-2-Bt-Ins(1，4，5，6)P4/AM不能逆转由毒胡萝卜素刺激的卡巴胆碱介导的氯离子分泌的抑制作用。
这些结果表明Ins(3，4，5，6)P4的细胞渗透性衍生物逆转了用卡巴胆碱延长处理对钙介导的氯离子分泌的抑制作用，因此，可作为Ins(3，4，5，6)P4的拮抗剂。
                    实施例V
细胞内Ins(1，3，4)P3水平的升高增加Ins(3，4，5，6)P4并
        减少钙介导的氯离子分泌
本实施例说明用Ins(1，3，4)P3的细胞渗透性衍生物处理细胞增加了Ins(3，4，5，6)P4，并减少了钙介导的氯离子分泌。
用细胞鉴定了几乎30种肌醇多磷酸酯。用5′肌醇多磷酸酯磷酸酶，将Ins(3，4，5，6)P4转变成Ins(1，3，4)P3。在一体外检测系统中，Ins(1，3，4)P3抑制肌醇1激酶，该激酶催化Ins(3，4，5，6)P4转变成Ins(1，3，4，5，6)P5(Tan等，J.Biol.Chem.272：2285(1997))，该文献引入本文作为参考。
合成细胞渗透性衍生物D，L-Bt3-Ins(1，3，4)P3/AM。在用Ussing室固定前，将结肠上皮T84细胞与400μM D，L-Bt3-Ins(1，3，4)P3/AM预保温30分钟并测量ΔIsc。在10分钟时，加入卡巴胆碱(10-4M)暂时刺激钙介导的氯离子分泌。数据是8次试验的平均值，p＜0.04，未配对的，双边student′st试验。
与400μM D，L-Bt3-Ins(1，3，4)P3/AM保温、使用(3H)-肌醇标记的细胞中的Ins(3，4，5，6)P4增加了3倍，这表明Ins(1，3，4)P3在体内增加了Ins(3，4，5，6)P4。与载体预保温的对照细胞的峰ΔIsc为15.2±2.8。与D，L-Bt3-Ins(1，3，4)P3/AM预保温的细胞的峰ΔIsc为7.9±1.6。因此，通过用细胞渗透性D，L-Bt3-Ins(1，3，4)P3/AM衍生物处理细胞，使钙介导的氯离子分泌降低了约50％。
这些结果表明细胞渗透性Ins(1，3，4)P3衍生物可增加Ins(3，4，5，6)P4的细胞内浓度，从而减少了钙介导的氯离子分泌，因此，可作为Ins(3，4，5，6)P4的激动剂。
                   实施例VI
        沙门氏菌侵染入结肠上皮细胞增加了
           Ins(1，4，5，6)P4的细胞内浓度
本实施例说明沙门氏菌(Salmonella)侵染入结肠上皮细胞增加了Ins(1，4，5，6)P4的细胞内浓度。
侵染性肠细菌进入并穿透肠上皮以接近下层粘膜并开始全身性感染。以前的研究表明沙门氏菌侵染上皮细胞引起肌醇多磷酸酯更新增加，这表明肌醇多磷酸酯在上皮细胞对细菌侵染的反应中起作用(Ruschkowski等，FEMS Microbiol.Lett.74：121(1992))。为了表征由细菌侵染诱导的肌醇多磷酸酯变化，评估侵染细菌对结肠上皮细胞的作用。
在用5％透析新生牛血清补充的无肌醇50％Dulbecco′s改性的Eagle′s(DME)培养基和50％Ham′s F12培养基中，将汇合的结肠上皮T84细胞在6孔平板中与50μCi/孔(3H)-肌醇一起保温4天。用预热培养基(50％DME，50％Ham′s F12和1mg/ml牛血清白蛋白)将培养物洗涤3次，然后用各时期相同培养基中的5×108细菌/孔感染培养物。用冰冷的磷酸缓冲的盐(PBS)将培养物洗涤2次，然后在冰上于10％三氯乙酸和10mM植酸中裂解5分钟。用FREON/叔胺(alamine)中和提取物，然后在Adsorbosphere SAX柱上分辨以分离(3H)-肌醇多磷酸酯。用配有在线放射性检测仪的HPLC，按前述定量分析放射性峰(Kachintom等，同上文，1993)。为了定量分析HPLC上未分辨出的对映异构体用HPLC从所有其他(3H)-InsP4异构体中分离对应于(3H)-Ins(3，4，5，6)P4和Ins(1，4，5，6)P4的峰，脱盐，然后按前述(Vajanaphanich等，同上文，1994)与带有(32P)-标记的Ins(1，4，5，6)P4的内标准的部分纯化的Ins(1，4，5，6)P43-激酶一起保温。通过比较相应量的形成的(3H)-和(32P)-标记的Ins(1，3，4，5，6)P5，在确定在原峰中(3H)-Ins(3，4，5，6)P4和(3H)-Ins(1，4，5，6)P4的比例。
将T84细胞单层用(3H)-肌醇标记并在不同时期用都柏林沙门氏菌(Salmonella dublin)感染。在感染后的60分钟内，myo-肌醇六磷酸酯(InsP6)或其他肌醇多磷酸酯如Ins(1，4，5)P3的水平没有显著变化，这些多磷酸酯一般是在磷酸脂酶C被激活时积累的。相反，在都柏林沙门氏菌感染后10分钟内，未分辨的对映异构体(3H)-Ins(3，4，5，6)P4和(3H)-Ins(1，4，5，6)P4的水平增加。该峰的约85％对应于(3H)-Ins(1，4，5，6)P4。在感染后30-40分钟，比未感染的对照细胞最大增加了14倍(参见表IV)。在40分钟后，(3H)-Ins(1，4，5，6)P4水平缓慢下降，并在感染后3小时恢复至接近基线(参见表IV)。用另一种人肠上皮细胞系LS174T可得到相似的观察结果。在都柏林沙门氏菌感染后，发现(3H)-Ins(1，4，5，6)P4增加了11.3倍，这表明感染后细胞肌醇多磷酸酯的变化反映了上皮细胞的一般反应。
用另一种沙门氏菌菌株伤寒沙门氏菌BRD691(Salmonella typhiBRD691)感染T84细胞也增加了(3H)-Ins(1，4，5，6)P4的水平(参见表IV)。相反，都柏林沙门氏菌的突变株SB133正常粘附于上皮细胞但不侵染上皮细胞，使(3H)-Ins(1，4，5，6)P4的水平增加最少，这表明由沙门氏菌侵染宿主细胞对于该反应是必需的。但是，仅仅细菌侵染不足以提高Ins(1，4，5，6)P4水平，因为用其他一些侵染性革兰氏阴性菌包括韦氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、痢疾志贺氏菌(Shigelladysenteriae)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)和肠侵染性大肠杆菌(Escherichia coli)(血清型O29：NM)感染T84细胞只会使(3H)-Ins(1，4，5，6)P4水平有很小的增加。此外，将非侵染性革兰氏阴性菌如肠出血性大肠杆菌(血清型：O157)或非致病性大肠杆菌(DH5α)加至T84单层，对(3H)-Ins(1，4，5，6)P4水平几乎没有影响。加入10μg/ml细菌脂多糖(LPS)对(3H)-Ins(1，4，5，6)P4水平没有影响。表IV沙门氏菌感染上皮细胞后Ins(1，4，5，6)P4水平的增加
加入的细菌 ……时间后 (3H)-(1，4，5，6)P4水平(感染率/对照)  n
都柏林沙门氏菌泳道 30  1 3.9±0.8  4
都柏林沙门氏菌泳道 60  10.3±1.3  5
都柏林沙门氏菌泳道 120  3.6  2
都柏林沙门氏菌泳道  180  1.9  2
伤寒沙门氏菌BRD691  30  10.5  2
都柏林沙门氏菌SB133(invA)  30  1.9±0.1  3
韦氏志贺氏菌  60  1.9  2
痢疾志贺氏菌  60  2.3  2
小肠结肠炎耶尔森氏菌  60  2.6±0.1  3
大肠杆菌O29：NM  60  2.0±0.1  5
大肠杆菌O157  60  2.3±0.2  4
大肠杆菌DH5α  60  2.1±0.2  4
 LPS  60  1.0  2
这些结果表明沙门氏菌侵染结肠上皮细胞增加了Ins(1，4，5，6)P4的细胞内浓度。在分泌性腹泻中氯离子分泌增加，说明与Ins(1，4，5，6)P4浓度有关，分泌性腹泻是沙门氏菌感染的一种病理学表现。
               实施例VII
      Ins(1，4，5，6)P4逆转EGF-诱导的
         氯离子分泌的抑制作用
本实施例说明通过将细胞与细胞渗透性Ins(3，4，5，6)P4衍生物一起保温而使Ins(1，4，5，6)P4细胞内浓度不断增加，逆转了上皮生长因子(EGF)诱导的氯离子分泌抑制作用。
在上述实施例III和IV中，Ins(1，4，5，6)P4衍生物对Ins(3，4，5，6)P4介导的氯离子分泌减少没有影响。为了检测Ins(1，4，5，6)P4是否影响EGF诱导的氯离子分泌的抑制作用，将T84细胞单层与Bt2Ins(1，4，5，6)P4/AM预保温30分钟。首先测量ΔIsc，在测量5分钟后，将16.3nM EGF加至细胞的嗜碱侧(basolateral)表面。再保温15分钟后，加入100μM卡巴胆碱以急速升高细胞内钙浓度。对照组也用卡巴胆碱刺激，但不与EGF预保温。数据是来自一组代表性试验的两个测量值(共3个试验)的平均值。
如图6和图7所示(组a和b)，EGF抑制卡巴胆碱刺激的氯离子分泌。与被内源细胞酯酶水解成Ins(1，4，5，6)P4的细胞渗透性衍生物Bt2Ins(1，4，5，6)P4/AM预保温，显著逆转了EGF诱导的氯离子分泌抑制作用。相反，加入Ins(1，3，4，5，6)P4的细胞渗透性衍生物未减弱EGF的抑制功能(图7，组C)。加入细胞渗透性Ins(3，4，5，6)P4衍生物，Ins(1，4，5，6)P4的对映异构体也未减弱EGF对氯离子分泌的抑制作用。
加入Bt2Ins(1，4，5，6)P4/AM没有逆转EGF对环AMP介导的氯离子分泌的抑制作用，这表明Ins(1，4，5，6)P4的作用对于钙介导的氯离子分泌是特异性的。
这些结果表明Ins(1，4，5，6)P4作为细胞渗透性衍生物传递至细胞，其水平的升高通过逆转EGF介导的氯离子分泌的抑制作用而提高了钙介导的氯离子分泌。
                   实施例VIII
      Ins(1，4，5，6)P4逆转PtdInsP3对钙介导的
              氯离子分泌的减少作用
本实施例说明PtdInsP3的细胞渗透衍生物减少了钙介导的氯离子分泌。细胞渗透Ins(1，4，5，6)P4衍生物逆转了PtdInsP3介导的氯离子分泌的减少。
将T84细胞单层与PtdInsP3/AM预保温30分钟，然后测量ΔIsc。如图8中所示，浓度不断增加的PtdInsP3/AM抑制卡巴胆碱刺激的氯离子分泌，这表明肌醇多磷酸酯与Ins(3，4，5，6)P4不同，也抑制钙介导的氯离子分泌。
合成其他PI 3-激酶产物PtdInsP3的细胞渗透性衍生物并检测其对氯离子分泌的作用。将细胞与二C16-Bt-PtdInsP3/AM或二C8-Bt-PtdInsP3/AM预保温并按实施例VII所述测量ΔIsc。
如图7所示，用二C16-Bt-PtdInsP3/AM预处理T84细胞(图7d)对钙介导的氯离子分泌的抑制高达74％。同样，二C8-Bt-PtdInsP3/AM对氯离子分泌的抑制达79％。当用预期不会进入细胞的PtdInsP3预处理细胞时，没有观察到对钙介导的氯离子分泌的抑制作用。PtdInsP3的这些细胞渗透衍生物对卡巴胆碱刺激后的钙水平没有影响。用PtdInsP3的这些衍生物观察的水平降低与用EGF处理细胞观察到的结果相当。此外，将EGF加之与细胞渗透性PtdInsP3衍生物预保温的单层中，没有导致附加的钙介导的氯离子分泌的抑制作用，这表明PtdInsP3和EGF通过相同的机理发挥作用。
将T84细胞与细胞渗透性Ins(1，4，5，6)P4衍生物预保温以确定Ins(1，4，5，6)P4是否可逆转PtdInsP3介导的氯离子分泌的减少。如图7d所示，T84单层与膜渗透性Ins(1，4，5，6)P4衍生物预保温部分逆转了PtdInsP3介导的氯离子分泌的减少。
这些结果表明PtdInsP3可减少钙介导的氯离子分泌。另外，Ins(1，4，5，6)P4逆转了钙介导的氯离子分泌中PtdInsP3的减少。
              实施例IX
      人鼻上皮中的氯离子运输
本实施例提供了初级人鼻上皮细胞系统，该系统作为检测化合物改变呼吸上皮中氯离子分泌的效力的模型。
活检得到初级人鼻上皮。为了在单层中进行生物电和钙测量，将初级人鼻上皮细胞铺在固定于O环的多孔Transwell Coll滤纸(孔直径0.4μm，Costar)上，然后在接种5-7天后进行研究，5-7天与最大跨上皮电势差的发展一致。将细胞保持在用胰岛素(10μg/ml)、转铁蛋白(5μg/ml)、内皮细胞生长补充物(3.75μg/ml)、氢化可的松(5nM)、内皮细胞生长补充物(3.75μg/ml)、三碘甲腺原氨酸(30nM)和lmMCaCl2补充的无血清Ham′s F12培养基中。在铺板5-7天后，用小型Ussing室固定人鼻上皮单层。
用Voltage-Clamp/Pulse Generator(Physiologic Instruments，SanDiego，Califomia)检测跨上皮电势差，用两通道记录仪积累生物电。将单层与无钠Ringer接触以计算跨上皮氯化物电阻，一种从其天然钠吸收状态至氯离子分泌状态的变化的测量值。为了进行细胞内钙的测量，将单层用Fura-2负载并固定在与微荧光测量仪相连的显微镜的载物台上。从30-40个细胞的区域或从单个细胞收集荧光强度比。在每个制品中，细胞内钙水平的ΔIsc被归一化。为了确保所述结果反映来自真正单层的响应，将单层按常规固定并对横截面片段进行检测。
初级人鼻上皮细胞对于用Ins(3，4，5，6)P4和PtdInsP3的拮抗剂处理，如在实施例III、IV、VII和VIII中描述的那些是有用的。在初级人鼻上皮细胞中对氯离子分泌增加有效的化合物是缓解囊性纤维性变症状如肺功能不全的良好候选物。
                  实施例X
             产生CFTR-T84细胞
本实施例提供了制备CFTR-T84细胞的方法，该细胞用作囊性纤维性变模型。
为了筛选Ins(3，4，5，6)P4衍生物并最终确定CFTR是否可调节与Ins(3，4，5，6)P4介导的氯离子抑制作用有关之因素的表达，产生了CFTR-T84细胞。
用双选择法失活T84细胞中的CFTR基因，这种方法最初用于产生小鼠胚胎干细胞(ES细胞)中的基因剔除突变(Mansour等，Nature336：348(1988))，该文献引入本文作为参考。用pSSC-9载体(Chauhanand Gottesman，Gene 120：281(1992)，该文献引入本文作为参考)产生致突变的CFTR基因靶向构建体。该载体携带新霉素抗性基因，由胸苷激酶启动子驱动，两侧为hsv-tk基因。另外，pSSC-9在该基因的两侧携带了方便的克隆位点(可用于插入基因靶向片段)和两个Sfil限制位点(用于切割线性形式的致突变弹夹(cassette))。通过G418抗性，对新霉素基因的表达进行筛选，可筛选稳定转染的克隆。用cyclovir对hsv-tk表达进行筛选可扩展经同源重组将所述构建体整合至靶位点的克隆(Mansour等，同上文，1988)。用8.5kb CFTR基因片段(TE2611E8.5，含外显子21)作为CFTR基因序列源(Rommens等，Science245：1059(1989)；和Rommens等，Am.J.Hum.Genet.45：932(1989))，所述文献均引入本文作为参考。或者，可用聚合酶链反应(PCR)直接从T84细胞中克隆适宜的序列。已描述了用于扩增CFTR基因片段的数个PCR引物(Zielinski等，Genomics 10：214(1991))，该文献引入本文作为参考。应扩增至少2-4kb长的片段以确保有足够的同源序列进行同源重组。PCR引物携带与pSSC-9克隆位点相容的限制位点。
用DNA转染方法，例如磷酸钙或电穿孔为基础的方法(MolecularBiology，A Laboratory Manual(分子生物学，实验室手册)，第2版，Sambrook等编，冷泉港实验室出版社，Plainview，NY(1989)，该文献引入本文作为参考)，将致突变构建体转染到T84细胞中。用G418筛选稳定的转染体，扩增并用cyclovir进行第二轮筛选。用不断增加量的G418对抗性克隆进行另一轮筛选，所述克隆可能通过载体的同源重组进入CFTR基因座衍生的。可用该方法(是为了便于用ES细胞在小鼠中产生双剔除突变体而开发的)在细胞系中筛选纯合突变(Chen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：4528(1993)；和Mortenson，Hypertension 22：646(1993))，所述文献均引入本文作为参考。用Southern印迹和PCR分析分析筛选出的克隆以确定neo弹夹被插入到CFTR基因中。
还可用“双构建体法”，其中用两个不同的突变构建体依次完成靶基因诱变(Monenson，同上文，1993；Feldhaus等EMBO J.12：2763(1993)；和Porter and Itzhaki，Eur.J.Biochem.218：273(1993))，所述文献均引入本文作为参考。这些构建体携带了一个neo基因或gpt基因弹夹，可以连续转染并用G418筛选neo基因和用霉酚酸加黄嘌呤筛选gpt基因。用T84细胞的双剔除CFTR突变体评估Ins(3，4，5，6)P4和PtdInsP3拮抗剂的效力。
这些结果表明产生了T84细胞的CFTR-突变体，所述突变体可用作囊性纤维性变的模型。这些细胞提供了与囊性纤维性变患者上皮细胞相似的遗传背景。Ins(3，4，5，6)P4和PtdInsP3的拮抗剂可有效提高CFTR-T84细胞中的氯离子分泌，对于增加囊性纤维性变患者中氯离子分泌是良好的候选物。
                    实施例XI
       制备细胞渗透性肌醇多磷酸酯衍生物
本实施例描述了细胞渗透性肌醇多磷酸酯衍生物的合成。
以前描述过一些细胞渗透性肌醇多磷酸酯衍生物的合成反应(Roemer等，同上文，1996，和Roemer等，同上文，1995)。
以下描述其它肌醇磷酸酯衍生物的合成反应。图9给出了细胞可渗透性PtdInsP3和二C16-Bt-PtdInsP3/AM的结构。图10给出了PtdInsP3/AM衍生物的合成路线。图11给出了1，2-亚环己基Ins(3，4，5，6)P4//AM的合成路线。图12给出了myo-肌醇-1，3，4-三磷酸酯和2，5，6-Bt3-Ins(1，3，4)P3/AM的结构。只给出了D-构型的化合物。图13给出了细胞可渗透性肌醇多磷酸酯衍生物的合成路线。图13中，使用了以下条件：(i)Bt2O，DMAP，pyr.；(ii)TFA，CH3CN/H2O；(iii)αBu2SnO，甲苯，回流；b BnBr，CsF，DMF；(iv)Bt2O，DMAP，pyr.；(v)Pd/C(10％)，AcOH；(vi)α(BnO)2PNiPr2，四唑，CH3CN；b AcOOOH，-40℃；(vii)Pd/C(10％)，AcOH；(viii)AMBr，DIEA，CH3CN。
所有的化学试剂均是高纯度的。如需要，可将溶剂在临用前干燥和/或蒸馏。将乙腈在五氧化二磷存在下蒸馏并保存在3分子筛中，二甲基甲酰胺(DMF)与之相同。吡啶和甲苯保存在4分子筛中。乙基二异丙基胺(DIEA)用钠丝干燥。钯炭(10％)和三氟乙酸来自Acros Chemie。二苄基N，N-二异丙基亚磷酰胺(dibenzylN，N-diisopropylphosphoramidite)、过乙酸(32％v/w)、四唑、氢化钠和乙酰氧甲基溴化物来自Aldrich，Milwaukee，Wisconsin。丁酸酐、DIEA和三(三苯基膦)-氯化铑(I)[tris(triphenylphosphin)-rhodium(I)-chloride]来自Merck。苄基溴、烯丙基溴、丁基碘、氟化铯和4-二甲氨基吡啶(DMAP)来自Fluka。离子交换树脂Dowex50 WX8，H+-型来自Serva，德国的Heidelberg。其它所有试剂均来自Riedel-de Haёn。
高效液相色谱(HPLC)用LDC/Milton Roy Consta Metric III泵和LDC/Milton Roy UV Monitor D(254nm)或Knaur折光率检测器进行。分析柱是填充了RP 18材料(Merck，LiChrosorb：10μm)的Merch Hibar不锈钢管(250mm×4mm)。制备HPLC用Shimadzu LC8A泵和制备LDC UV III Monitor(254nm)或Knaur折光率检测器以及填充了RP 18材料(Merck，LiChrospher 100，10μm)的MerckPrepbar不锈钢柱(250mm×50mm)进行。洗脱剂为甲醇-水混合物；组成以％甲醇(MeOH)给出。
1H-NMR和31p-NMR波谱在Bmcker AM 360AM波谱仪上进行。1H-NMR波谱中测得的化学位移是相对于四甲基硅烷的ppm，31P-NMR波谱中测得的化学位移是相对于85％H3PO4的ppm。J-值以Hz给出。质谱用Finnigan Mat 8222质谱仪通过快原子轰击(FAB)解离测得。高分辨质谱相对于质量相差不超过10％的已知化合物测得。熔点(MP)(未校正)用Bchi B-540装置测得。旋光度用Perkin-Elmer 1231旋光计在10cm样品池中、在钠D-线下测定。钯炭催化剂的超过滤在Sartorius过滤装置SM 162 01上用再生纤维素滤纸(Sartorius，SM 116 04)Sartorius Edgewood，NewYork进行。元素分析用Mikroanalytisches(Labor Beller，Gottingen，Germany)进行。
D-1，4，5，6-四-O-苄基-myo-肌醇(ent-9)和D-3，4，5，6-四-O-苄基-myo-肌醇(9)按照以上描述进行合成(Roemer等，文献出处同上)。化合物rac-1，2-二-O-亚环己基-myo-肌醇通过Angyal和Tate的方法合成(Angyal和Tate，化学会志(J.CHem.Soc.)1965：6949(1995))，该文献引入本文作为参考。
磷酸化的一般方法。将选择性保护的myo-肌醇衍生物和四唑在氩气下溶于无水乙腈，然后加入二苄基N，N-二异丙基亚磷酰胺。室温下搅拌给定的时间后，将反应混合物冷却至-40℃并加入过乙酸(32％v/w；1摩尔当量/摩尔当量亚磷酰胺)。混合物升温至室温后，减压蒸除溶剂并将残余的油通过制备HPLC纯化得到所需的肌醇四磷酸酯衍生物。
通过水解脱除苄基的一般方法。分别将完全保护的myo-肌醇四磷酸酯或四苄基-肌醇和钯炭(10％；0.1mol钯/mol苄基)一起在氢气氛围下、在自发产生氢气的装置中剧烈搅拌给定的时间。通过超过滤除去催化剂并将滤液冷冻干燥得到各自的产物。
引入乙酰氢甲基酯的一般方法。将充分干燥的肌醇四磷酸酯衍生物(游离酸)在氩气氛下悬浮于无水乙腈中，然后加入无水DIEA(2.25mol DIEA/mol羟基)和乙酰氧甲基溴(1mol当量/mol当量DIEA)。将混合物于黑暗中室温下搅拌4天，然后减压蒸除所有挥发性组分并将粗品残余物用特定的溶剂通过制备HPLC纯化得到糖浆状肌醇四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
D-3.4.5.6-四-O-苄基-1-O-丁基-mvo-肌醇(10)将干燥的9和无水二丁基氧化锡(116mg，167μmol)在无水甲苯(100毫升)中、在装有活化分子筛(3)的Soxhlet装置中加热回流18小时。将反应混合物冷却至室温并减压蒸发至干。向残余的油中加入CsF(140mg，926μmol)，然后将混合物置于高真空下2小时。将残余的糖浆在氩气下溶于无水DMF(10ml)并加入1-丁基碘(300μl，2.62mmol)。将溶液搅拌48小时后，HPLC分析(90％MeOH 1.5ml/分钟；tR＝7.43分钟)表明无进一步的反应。高真空蒸除过量的1-丁基碘和DMF。将粗产物通过制备HPLC进行色谱分离(93％MeOH；40ml/分钟；tR＝22.30分钟)得到固体状的化合物10(175mg，74％)。Mp：75.4-75.9℃(甲醇)。[α]24 D：+8.4°(c＝0.98，CHCl3)。1H-NMR(CDCl3，360MHZ)：δ0.91(3H，t，J＝7.25Hz，CH3)，1.34-1.44(2H，m，CH2)，1.57-1.65(2H，m，CH2)，2.46(1H，s(br)，OH)，3.23(1H，dd，J＝9.31，2.33Hz，H-1)，3.43(1H，dd，J＝9.78，2.80Hz，H-3)，3.45(1H，dd，J＝9.78，9.31Hz，H4)，3.57(1H，dt，J＝6.99，6.52Hz，OCCH2CH2CH3)，3.75(1H，dt，J＝6.99Hz，OCCH2CH2CH3)，3.91(1H，dd，J＝9.31，9.31Hz，H-5)，3.99(1H，dd，J＝9.78，9.31Hz，H-6)，4.27(1H，dd，J＝2.80，2.33Hz，H-2)，4.71-1.91(8H，m，CH2Ph)，7.25-7.39(20H，m，CH2Ph)MS：m/z(+ve离子FAB)597[(M＋H)+，1]，91[Bn-，100]。
D-1，4，5，6-四-O-苄基-3-O-丁基-mvo-肌醇(ent-10)将二醇ent-9进行类似的反应和后处理得到化合物ent-10。[α]24 D：-8.7°(c＝1.01，CHCl3)。波谱数据与对映体10所得的数据一致。
D-3，4，5，6-四-O-苄基-1-O-丁基-2-O-丁酰-myo-肌醇(11)将10(187mg，298μmol)、丁酸酐(210μl，596μmol)和DMAP(38mg，30μmol)的无水吡啶(3ml)溶液室温搅拌18小时。高真空蒸除溶剂得到油。与辛烷一起蒸发3次除去残余的吡啶。将残余物溶于叔丁基甲基醚(10ml)，用磷酸盐缓冲液(10ml)洗涤一次、用碳酸氢钠(10ml)洗涤一次、用硫酸氢钠(10ml)洗涤一次、再次用磷酸盐缓冲液(10ml)洗涤一次，然后用盐水(10ml)洗涤。将有机层用硫酸钠干燥并过滤。蒸除溶剂得到油状纯净的11(194mg，98％)，[α]24 D：-10.4°(c-1.9，CHCl3)。1H-NMR(CHCl3，360MHZ)：δ0.91(3H，t，J＝7.25Hz，CH3)，0.98(3H，t，J＝7.46 Hz，CH3)，1.32-1.42(2H，m，CH2)，1.50-1.60(2H，m，CH2)，1.69(2H，tq，J＝7.46，7.46Hz，O(O)CCH2CH2CH3)，2.39(2H，t，J＝7.46Hz，O(O)CCH2，CH2CH3)，3.31(1H，dd，J＝9.66，2.63Hz，H-1)，3.44(1H，dt，J＝9.07，6.81Hz，OCH2CH2CH2CH3)，3.48(1H，dd，J＝9.66，3.07Hz，H3)，3.49(1H，dd，J＝9.66，9.22Hz，H-5)，3.67(1H，dt，J＝8.78，6.81Hz，OCH2CH2CH2CH3)，3.81(1H，dd，J＝9.66，9.66Hz，H-4)，3.86(1H，dd，J＝9.66，9.22Hz，H-6)，4.51-4.93(8H，m，CH2Ph)，5.83(1H，dd，J＝3.07，2.63Hz，H-2)，7.26-7.36(20H，m，CH2Ph)。MS：m/z(+ve离子FAB)665[(M＋H)+，21]，91[Bn+，100]。
D-1，4，5，6-四-O-苄基-3-O-丁基-2-O-丁酰-myo-肌醇(ent-11)将化合物ent-10按照以上描述进行丁酰化得到化合物ent-11。[α]24 D：+10.7°(c-2.05，CHCl3)。波谱数据与对映体11的数据一致。
D-l-O-丁基-2-O-丁酰-myo-肌醇(12)将化合物11(178mg，267μmo1)按照一般方法中的描述用钯炭(10％)在氢气下氢化，冷冻干燥后得到固体状的四醇12(81mg，99％)。[α]24 D：+26.5°(c＝2.0，MeOH)。1H-NMR([D6]DMSO，360 MHZ)：δ0.84(3H，t，J＝7.38Hz，CH3)，0.90(3H，t，J＝7.38Hz，CH3)，1.21-1.31(2H，m，CH2)，1.36-1.44(2H，m，CH2)，1.54(2H，tq，J＝7.38，700Hz，O(O)CCH2，CH2CH3)，2.24(2H，t，J＝7.00Hz，O(O)CCH2，CH2CH3)，2.97(1H，dd，J-8.94，8.55Hz，H-5)，3.10(1H，dd，J＝9.72，2.72Hz，H-1)，3.25-3.35(4H，m，H-3，H-4，H-6，OCH2，CH2CH2CH3)，3.50(1H，dt，J＝8.94，6.60Hz，OCH2CH2 CH2CH3)，4.85(4H，s(br)，OH)，5.36(1H dd，J＝2.72，2.33Hz，H-2)。MS：m/z(+ve离子FAB)307[(M＋H)+，21]，71[Bt+，100]。MS：m/z(-ve离子FAB)305[(M－H+)-，27]，87[B＋O-，100]。分析()C：计算值54.89；实测值54.45；H：计算值8.55，实测值8.56。
D-3-O-丁基-2-O-丁基-2-O-丁酰-myo-肌醇(ent-12)将完全保护的化合物ent-11进行类似的反应和后处理得到四醇ent-12。[α]24 D：-26.6°(c＝0.76，MeOH)。波谱数据与对映体12的数据一致。
D-1-O-丁酰-myo-肌醇3，4，5，6-四(二苄基)磷酸酯(20)将四醇12(63mg，206μmol)和四唑(174mg，2.47mmol)的乙腈(2毫升)溶液用二苄基N，N-二异丙基亚磷酰胺(834μl，2.47mmol)处理18小时，用过乙酸氧化，然后按照以上描述进行后处理。通过制备HPLC(93％MeOH；40ml/分钟；tR＝26.45分钟)纯化得到油状的化合物20(165mg，60％)。[α]24 D：-4.9°(c＝1.08，CHCl3)。1H-NMR(CDCl3，360MHZ)：δ0.77(3H，t，J＝7.27Hz，CH3)，0.93(3H，t，J＝7.27Hz，CH3)，1.12-1.21(2H，m，CH2)，1.31-1.46(2H，m，CH2)，1.62(2H，tq，J＝7.26，7.26Hz，O(O)CCH2CH2CH3)，2.24(2H，t，J＝7.26Hz，O(O)CCH2CH2CH3)，3.26(1，H，dt，J＝8.23，5.81Hz，OCH2CH2CH2CH3)，3.37(1H，dd，J＝9.20，2.90Hz，H-1)，3.44(1H，dt，J＝8.23，7.26Hz，OCH2CH2CH2CH3)，4.35(1H，ddd，J＝9.69，2.42Hz，H-3)，4.53(1H，ddd，J＝9.69，9.69Hz，H-5)，4.68(1H，ddd，J＝9.69，9.69，9.20Hz，H-6)，4.91(1H，ddd，J＝9.84，9.69，9.69Hz，H-4)，4.92-5.02(16H，m，CH2Ph)，5.91(1H dd，J＝2.90，2.42Hz，H-2)，7.11-7.30(40H，m，CH2Ph)，31P NMR(CDCl3，1H去偶，145.8MHZ)：δ-1.81(1P，s)，-1.18(1P，s)，-0.72(1P，s)，-0.66(1P，s)。MS：m/z (+ve离子FAB)1347[(M＋H)+，8]；91[Bn+，100]。
D-3-O-丁基-2-O-丁酰-myo-肌醇1，4，5，6-四(二苄基)磷酸酯(ent-20)将四醇ent-12按照关于化合物20的描述进行亚磷酰化(phosphitylated)和氧化得到完全保护的磷酸酯ent-20。[α]24 D：+4.8°(c＝2.09，CHCl3)。波谱数据与对映体20的数据一致。
D-1-O-丁基-2-O-丁酰-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸酯(21)将化合物20(160mg，118μmol)按照一般方法中的描述用钯炭(10％)氢化，冷冻干燥后得到固体状标题化合物21(73mg，99％)。[α]24 D：＝4.1°(c＝1.04，H2O，pH1.6)。1H-NMR(D2O，360 MHZ)：δ0.81(3H，t，J＝7.30Hz，CH3)，0.91(3H，t，J-7.30Hz，CH3)，1.22-1.30(2H，m，CH2)，1.42-1.49(2H，m，CH2)，1.62(2H，tq，J＝7.30，7.30Hz，O(O)CCH2CH2CH3)，2.36，2.54(2H，m，O(O)CCH2CH2CH3)，3.56(1H，dt，J＝9.49，6.46Hz，OCH2CH2CH2CH3)，3.63(1H，dt，J＝9.36，6.74Hz，OCH2CH2CH2CH3)，3.70(1H，dd，J＝9.74，2.62Hz，H-1)，4.27(1H，ddd，J＝9.36，9.36，9.36Hz，H-5)，4.31(1H，ddd，J＝9.74，9.74，2.25Hz，H-3)，4.39(IH，ddd，J＝9.74，9.36，9.36Hz，H-6)，4.49(1H，ddd，J-9.74，9.36，9.00Hz，H-4)，5.75(1H，dd，J＝2.62，2.25Hz，H-2)，31P NMR(D2O，1H去偶，145.8MHZ)：δ-0.10(2P，s)，0.50(1P，s)，0.80(1P，s)。MS：m/z(+ve离子FAB)627[(M＋H)+，4]，71[Bt+，100]。MS：m/z(-ve离子FAB)625[(M－H)+100]。
D-3-O-丁基-2-O-丁酰-myo-肌醇1，4，5，6-四磷酸酯(ent-21)将完全保护的底物ent-20讲行类似的反应，冷冻干燥后得到游离酸ent-21。[α]24 D：＝4.1°(c＝0.78，H2O，pH1.6)。波谱数据与对映体21的数据一致。
D-1-O-丁基-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸酯(5)将化合物21(17mg，27μmol)用1M氢氧化钾(260μl)处理将pH值调至12.8。将溶液室温搅拌2天。将反应混合物直接倒在离子交换柱(Dowex 50 WX 8，Ht)上进行纯化。冷冻干燥得到化合物5(14mg，94％)。-[α]24 D：＝+4.9°(c＝0.53，H2O，pH1.6)。1H-NMR(D2O，360MHZ)：δ0.78(3H，t，J＝7.44Hz，CH3)，1.26(2H，tq，J＝7.44，7.44Hz，CH2)，1.43-1.52(2H，m，CH2)，3.42(1H，dd，J＝9.60，2.78Hz，H-1)，3.52(1H，dt，J＝9.71，6.74Hz，OCH2CH2CH2CH3)，3.59(1H，dt，J＝9.81，6.74Hz，OCH2CH2CH2CH3)，4.16(1H，ddd，J＝9.60，9.60，2.78Hz，H-3)，4.21(1H，ddd，J＝9.37，9.37，9.37Hz，H-5)，4.35(1H，dd，J＝2.78，2.78Hz，H-2)，4.39(1H，ddd，J＝9.60，9.60，9.37Hz，H-6)，4.60(1H，ddd，J-9.60，9.60，9.37Hz，H-4)，31P NMR(D2O，1H去偶，145.8MHZ)：δ0.10(2P，s)，0.70(1P，s)，1.05(1P，s)。MS：m/z(-ve离子FAB)555[(M－H+)100]。
D-3-O-丁基-myo-肌醇1，4，5，6-四磷酸酯(ent-5)将底物ent-21的丁酰基按照上述方法水解得到四磷酸酯ent-5。-[α]24 D：＝+4.6°(c＝0.35，H2O，pH1.6)。波谱数据与对映体5的数据一致。
D-1-O-丁基-2-O-丁酰-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氢甲基)酯(1)将DIEA(131μl，768μmol)和乙酰氧甲基溴(77μl，768μmol)按照一般方法的描述加入到化合物21(30mg，47μmol)的乙腈(2毫升)悬浮液中。通过制备HPLC(73％MeOH；37.5ml/分钟；tR＝19.30分钟)纯化得到糖浆状的化合物1(31mg，55％)。-[α]24 D：+2.0°(c＝1.00，甲苯)。1H-NMR([D8]甲苯，360MHZ)：δ0.85(3H，t，J-7.48Hz，CH3)，0.97(3H，t，J＝7.48Hz，CH3)，1.39(2H，tq，J＝7.48，7.28Hz，CH2)，1.51-1.67(4H，m，2xCH2)1.75-1.75(24H，8s，8x OAc)，2.08-2.13(2H，m，CH2)，3.07(1H，dd，J-9.45，2.76Hz，H-1)，3.46(1H，dt，J＝7.68，5.91Hz，OCH2CH2CH2CH3)，3.62(1H，dt，J＝7.74，7.68Hz，OCH2CH2CH2CH3)，4.62(1H，ddd，J＝9.84，9.84，2.76Hz，H-3)，4.67(1H，ddd，J＝9.84，9.84，9.45Hz，H-5)，4.80(1H，ddd，J＝9.45，9.45，9.16Hz，H-6)5.04(1H，ddd，J-9.84，9.84，9.45Hz，H-4)，5.63-5.96(16H，m，CH2OAc)，6.00(1H，dd，J＝2.76，2.76Hz，H-2)。31P NMR([D8]-甲苯，1H去偶，145.8MHZ)：δ-5.14(1P，s)，-4.49(1P，s)，-4.06(1P，s)，-3.99(1P，s)。MS：m/z(+ve离子FAB)1131[(M－CH2OAc＋2H)+，58]，98.7[((M-3 CH2OAc-＋4H)，100]，MS：m/z(-ve离子FAB)1129[(M－CH2OAc+)-38]，241[OP(OCH2OAc)- 2，100]。
D-3-O-丁基-2-O-丁酰-myo-肌醇1，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯(ent-1)将磷酸酯ent-21按照以上描述进行烷基化得到八(乙酰氧甲基)酯ent-1。[α]24 D：+1.9°(c＝1.46，甲苯)。波谱数据与对映体1的数据一致。
D-1-O-烯丙基-3，4，5，6-四-O-苄基—myo-肌醇(13)将干燥的9(690mg，1.28mmol)和无水二丁基氧化锡(324mg，1.3mol)在无水甲苯(150毫升)中、在装有活化分子筛(3)的Soxhlet装置中加热回流20小时。将反应混合物冷却至室温并减压蒸发至干。向残余的油中加入CsF(388mg，2.56mol)，然后将混合物置于高真空下2小时。将残余的糖浆在氩气下溶于无水DMF(10毫升)并加入1-烯丙基碘(329μl，3.58mmol)。将溶液搅拌20小时后，HPLC分析(95％MeOH；1.5ml/分钟；tR＝3.20分钟)表明无进一步的反应。高真空蒸除过量的1-烯丙基碘和DMF。将粗产物通过制备HPLC进行色谱分离(90％MeOH；40ml/分钟；tR＝26.15分钟)得到固体状的化合物13(448mg，60％)。Mp：71-72℃(甲醇)。-[α]24 D：+4.6°(c＝0.98，CHCl3)。1H-NMR(CDCl3，360 MHZ)：δ3.30(1H，dd，J-973Hz，3.10Hz，H-1)，3.41(1H，dd，J＝9.73，2.65，H-3)，3.44(1H，dd，J＝9.51，9.51，H-5)，3.95(1H，dd，J-9.73，9.51Hz，H-6)，3.99(1H，dd，J＝9.73，2.51Hz，H-4)，4.18(1H，dd，J＝1.65，1.33Hz，OCH2CH2CH2)，4.19(1H，dd，J＝2.65，1.33Hz，OCH2CHCH2)，4.20(1H，dd，J-3.10，2.65Hz，H-2)，4.71-4.92(8H，m，CH2Ph)，5.19(1H，ddt，J＝11.50，1.33，1.33Hz，OCH2CHCH2)，5.29(1H，ddt，J-16.91，2.65，1.33Hz，OCH2CHCH2)，5.94(1H，dddd，J＝16.91，11.50，1.33，1.33Hz，OCH2CHCH2)，7.26-7.37(20H，m，CH2Ph)。MS：m/z (+ve离子FAB)581[(M＋H+)+，1]，91[Bn+，100]。MS：m/z(ve离子FAB)580[(M－H)+6]489[(M－Bn+)-，100]。
D-3-O-烯丙基—1，4，5，6-四-O-苄基-myo-肌醇(ent-13)将二醇ent-9进行类似的反应和后处理得到化合物ent-13。-[α]24 D：+3.9°(c＝0.82，CHCl3)。波谱数据与对映体13数据一致。
D-1-O-烯丙基-3，4，5，6-四-O-苄基-2-O-丁基-myo-肌醇(14)室温及黑暗中，将氢化钠(46mg，1.92mmol)加入到搅拌中的13(445mg，767μmol)的无水DMF(5毫升)溶液中。将混合物搅拌5小时，然后加入1一丁基碘(306μl，2.68mmol)。将该悬浮液于80℃搅拌18小时，HPLC(95％MeOH；1.5ml/分钟；tR＝7.35分钟)证实有产物形成。减压蒸除过量的1-丁基碘和DMF。将混合物溶于叔丁基甲基醚(40毫升)，然后依次用磷酸盐缓冲液(20毫升)、连二亚硫酸钠水溶液(20毫升)和盐水(20毫升)各洗涤一次。将有机层用硫酸钠干燥，过滤并蒸除醚得到油。将粗品油通过制备HPLC(93％MeOH；40ml/分钟；tR＝37.10分钟)纯化得到油状的标题化合物14(458mg，94％)。-[α]24 D：+1.5°(c＝2.29，CHCl3)。1H NMR(CDCl3，360MHZ)：δ0.95(3H，t，J＝7.27Hz，CH3)，1.39-1.49(2H，m，CH2)，1.58-1.66(2H，m，CH2)，3.24(1H，dd，J＝9.69，2.42Hz，H-1)，3.36(1H，dd，J＝9.93，2.42，H-3)，3.46(1H，dd，J＝9.45，9.45，H-5)，3.78(2H，t，J＝6.54Hz，OCH2CH2CH2CH3)，3.89(1H，dd，J＝2.42，2.42 Hz，H-2)，3.98(1H，dd，J-9.45，9.45 Hz，H-6)，4.03(1H，dd，J-9.45，9.45Hz，H-4)，4.15(1H，dd，J-5.81，1.00Hz，OCH2CHCH2)，4.16(1H，dd，J-6.06，1.00Hz，OCH2CHCH2)，4.72，4.95(8H，m，CH2Ph)，5.19(1H，ddt，J-10.66，1.45，1.45Hz，OCH2CHCH2)，5.32(1H，ddt，J-16.95，1.45，1.45Hz，OCH2CHCH2)，5.95(1H，dddd，J-16.95，10.66，1.45，1.45Hz，OCH2CHCH2)，7.26-7.40(20H，m，CH2Ph)。MS：m/z(+ve离子FAB)637[(M＋H)+，1]，91[Bn+，100]。
D-3-O-烯丙基-1，4，5，6-四-O-苄基-2-O-丁基-myo-肌醇(ent-14)将化合物ent-13讲行类似的反应和后处理得到化合物ent-14。[α]24 D：-1.6°(c＝1.87，CHCl3)。波谱数据与对映体14的数据一致。
D-3，4，5，6-四-O-苄基-2-O-丁基-myo-肌醇(15)在将14的50％乙醇(90ml)悬浮液在回流下加热7h之前，向其中中加入三(三苯基膦)-氯化铑(I)(140mg，150μmol)和DIEA(25μl，140μmol)。在加入三氟乙酸(7ml)之前，将反应混合物冷却至室温，并且在HPLC(90％MeOH；1.5ml/min；tR＝4.03min)显示无起始原料以后，将该溶液继续搅拌24h。然后用2N NH4OH溶液中和。在减压下蒸发除去乙醇得到糖浆。将该糖浆溶解于叔丁基甲基醚(40ml)中，顺序用磷酸盐缓冲液(20ml)和盐水各洗涤一次。有机层在硫酸钠上干燥，过滤，蒸除醚得到油。粗品油用制备HPLC(92％MeOH；40ml/min；tR-27.40min)纯化得到固体状15(275mg，74％)。-[α]24 D：+24.6°(c＝0.97，CHCl3)。1H NMR(CDCl3，360MHZ)：δ0.92(3H，t，J-7.36Hz，CH3)，1.32-1.43(2H，m，CH2)，1.53-1.61(2H，m，CH2)，3.41(1H，dd，J＝9.96，2.60Hz，H-1)，3.45(1H，dd，J-9.25，2.60Hz，H-3)，3.46(1H，dd，J-9.31，9.31Hz，H-5)，3.61(1H，dt，J-9.09，6.49Hz，OCCH2CH2CH3)，3.74(1H，dd，J-9.52，9.31Hz，H-4)，3.86(1H，dd，J＝2.60，2.60Hz，H-2)，3.95(1H，dt，J-8.95，6.49Hz，OCCH2CH2CH3)，3.98(1H，dd，J-9.96，9.31，Hz，H-6)，4.79-4.94(8H，m，CH2Ph)，7.26-7.36(20H，m，CH2Ph)。MS：m/z(ve离子FAB)597[(M＋H)+，1]，91[Bn+，100]。MS：m/z(-ve离子FAB)595[(M－H+)-，100]，[(M－Bn+)-，20]。C：计算值76.48；实测值76.52；H：计算值7.43，实测值7.40。
D-1，4，5，66-四-O-苄基-2-O-丁基-myo-肌醇(ent-15)将二醇ent-15进行类似的反应和后处理得到化合物ent-15。[α]24 D：+24.9°(c＝1.00，CHCl3)。波谱数据与对映体15的数据一致。
D-3，4，5，6-四-O-苄基-2-O-丁基-1-O-丁酰myo-肌醇(16)室温下用丁酸酐(158μl，447μmol)和DMAP(38mg，29μmol)处理在无水吡啶(4ml)中的乙醇15(178mg，298μmol)并搅拌。当HPLC分析(90％MeOH；1.5ml/分钟；tR＝6.40分钟)显示无起始材料(18h)时，减压蒸馏反应混合物得到粗品油。为了除去残余的吡啶，将该油溶解在辛烷中并蒸发三次。残余物溶解在叔丁基甲基醚(20ml)中，并用磷酸盐缓冲液(10ml)、碳酸氢钠(10ml)、硫酸氢钠(10ml)各洗涤一次，再用磷酸盐缓冲液(10ml)洗涤一次，然后用盐水(10ml)洗涤。将有机层在硫酸钠上干燥，过滤。蒸除溶剂得到纯的油状16(176mg，89％)。-[α]24 D：-15.4°(c＝1.00，CHCl3)。1H NMR(CHCl3，360MHZ)；δ 0.91(3H，t，J＝7.21Hz，CH3)，0.93(3H，t，J＝7.21Hz，CH3)，1.35-1.56(4H，m，2X CH2)，1.58-1.72(2H，m，CH2)，2.21-2.26(2H，m，CH2)，3.48(1H，dd，J-9.61，2.40Hz，H-3)，3.51(1H，dd，J-9.66，9.37，Hz，H-5)，3.52(2H，tq，J-8.97，6.25，Hz，O(O)CCH2CH2CH3)，3.76(2H，t，J-9.13，6.25，Hz，O(O)CCH2CH2CH3)，3.94(1H，dd，J-2.40，2.40Hz，H-2)，4.00(1H，dd，J＝9.61，9.61Hz，H-4)，4.02(1H，dd，J＝9.85，9.31Hz，H-6)，4.73(1H，dd，J＝9.85，2.40Hz，H-1)，4.65-4.93(8H，m，CH2Ph)，7.25-7.34(20H，m，CH2Ph)。MS：m/z(+ve离子FAB)665[(M＋H)+，1]，91[Bn+，100]。
D-1，4，5，6-四-O-苄基-3-O-丁基-2-O-丁酰-myo-肌醇(ent-16)将化合物ent-15进行上述对另外的对映体的丁酰基化得到化合物ent-16。-[α]24 D：+15.9°(c＝1.10，CHCl3)。波谱数据与对映体16的数据一致。
D-2-O-丁基-1-O-丁酰-myo-肌醇(17)按一般步骤用钯炭(10％)在氢气下对化合物16(170mg，255μmol)进行氢化，冷冻干燥后得到固体状的四醇17(75mg，97％)。[α]24 D：+41.9°(c＝1.10，MeOH)。1H NMR([D6]DMSO，360 MHZ)；δ0.87(3H，t，J＝7.16Hz，CH3)，0.89(3H，t，J＝7.33Hz，CH3)，1.28-1.48(4H，m，2x CH2)，1.52-1.62(2H，m，CH2)，2.24-2.36(2H，m，CH2)，2.96(1H，dd，J＝9.21，9.21Hz，H-5)，3.26(1H，dd，J-9.55，2.39Hz，H-3)，3.35(1H，dd，J＝9.55，9.21Hz，H-4)，3.44(1H，dt，J＝9.43，6.39Hz，OCH2CH2CH2CH3)，3.52(1H，dd，J＝10.23，9.21Hz，H-6)，3.57(1H，dd，J＝2.39，2.39Hz，H-2)，4.47(2H，dt，J＝9.21，6.39Hz，OCCH2CH2CH3)，4.47(1H，dd，J＝10.23，2.39Hz，H-1)，4.71(2H，s(br)，OH)，4.82(1H，s(br)，OH)，4.86(1H，s(br)，OH)，MS：m/z(+ve离子FAB)307[(M＋H)+，100]，MS：m/z(-ve离子FAB)305[(M＋H)+，34]，87(Bto-，100)。C：计算值54.89；实测值54.90；H：计算值8.55，实测值8.51。
D-2-O-丁基-3-O-丁酰-myo-肌醇(ent-17)对全面进行了保护的化合物ent-16进行类似的反应和后处理，得到四醇ent-17。-[α]24 D：-40.5°(c＝1.00，MeOH)。波谱数据与对映体17的数据一致。
D-2-O-丁基-1-O-丁酰-myo-肌醇3，4，5，6-四(二苄基)磷酸酯(22)将化合物17(55mg，178μmol)和四唑(152mg，2.15mmol)的乙腈(2毫升)溶液用二苄基N，N-二异丙基亚磷酰胺(726μl，2.15mmol)处理22小时，用过乙酸氧化，然后按照以上描述进行后处理。通过制备HPLC(92％MeOH；40ml/分钟；tR＝20.00分钟)纯化得到油状的化合物22(192mg，80％)。[α]24 D：-3.4°(c＝1.02，CHCl3)。1H-NMR(CDCl3，360 MHZ)：δ0.79(3H，t，J＝7.30Hz，CH3)，0.86(3H，t，J＝7.30Hz，CH3)，1.23-1.38(2H，m，CH2)，1.41-1.57(4H，m，2x CH2)，2.01-2.17(2H，m，CH2)，3.45(1H，dt，J＝8.52，6.63Hz，OCH2CH2CH2CH3)，3.60(1H，dt，J＝8.52，7.74Hz，OCH2CH2CH2CH3)，4.13(1H，dd，J＝2.52，2.52Hz，H-2)，4.22(1H，ddd，J＝9.73，9.73，2.52Hz，H-3)，4.43(1H，ddd，J＝9.51，9.51Hz，H-5)，4.44(1H，ddd，J＝9.51，9.51，9.28Hz，H-6)，4.89(1H，ddd，J-9.73，9.73，9.51Hz，H-4)，4.91-5.08(17H，m，CH2Ph，H-1)，7.13-7.27(40H，m，CH2Ph)。31P NMR(CDCl3，1H去偶，145.8MHZ)：δ-1.64(1P，s)，-1.42(1P，s)，-0.76(1P，s)，-0.53(1P，s)。MS：m/z(+ve离子FAB)1347[(M＋H)+，33]；71[Bt-，100]。MS：m/z(-ve离子FAB)1255[(M－Bn+)-，16]；277[OPO(OBn)2 -，100]。
D-2-O-丁基-3-O-丁酰-myo-肌醇1，4，5，6-四(二苄基)磷酸酯(ent-22)将ent-12按照关于化合物22的描述进行亚磷酰化(phosphitylated)和氧化得到完全保护的磷酸酯ent-22。[α]24 D：+3.1°(c＝1.10，CHCl3)。波谱数据与对映体22的数据一致。
D-2-O-丁基-1-O-丁酰-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸酯(23)。按一般步骤用钯炭(10％)在氢气下对化合物22(190mg，141μmol)进行氢化，冷冻干燥后得到固体状的题述化合物23(87mg，99％)。-[α]24 D：9.9°(c＝1.10，H2O，pH1.6)。1H NMR(D2O，360 MHZ)；δ0.75(3H，t，J-7.15Hz，CH3)，0.76(3H，t，J＝7.31Hz，CH3)，1.19-1.29(2H，m，CH2)，1.38-1.53(4H，m，2x CH2)，2.30(2H，t，J-7.47，O(O)CCH2CH2CH3)，3.58(1H，dt，J-9.64，6.44Hz，OCH2CH2CH2CH3)，3.67(1H，dt，J-9.64，6.36Hz，OCH2CH2CH2CH3)，4.01(1H，dd，J＝2.54，2.23Hz，H-2)，4.22(1H，ddd，J-9.22，9.22，8.90Hz，H-5)，4.23(1H，ddd，J＝9.54，9.54，2.54Hz，H-3)，4.43(1H，ddd，J＝9.90，9.22Hz，H-6)，4.48(1H，ddd，J-9.54，9.54，9.54Hz，H-4)，4.94(1H，dd，J＝9.90，2.23Hz，H-1)。31P NMR(D2O，1H去偶，145.8Hz)，δ-0.20(2P，s)，0.40(1P，s)，0.50(1P，s)。MS：m/z(+ve离子FAB)627[(M＋H)+，8]，71[Bt+，100]。MS：m/z(-ve离子FAB)625[(M－H)+，35]，79[OP(O)2，100]。
D-2-O-丁基-3-O-丁酰-myo-肌醇1，4，5，6-四磷酸酯(ent-23)对全面进行了保护的化合物ent-23进行类似的反应和后处理，冻干后得到游离酸ent-23。[α]24 D：-9.7°(c＝1.00，H2O，pH1.6)。波谱数据与对映体23的数据一致。
D-2-O-丁基-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸酯(6)。用1M KOH(453μl)处理化合物23(33mg，52μmol)，将其pH值调整到12.8。溶液在室温下搅拌2天。将反应混合物直接倾入离子交换柱(Dowex 50WX8，H+)进行纯化。冻干给出化合物6(27mg，93％)。--[α]24 D：-1.1°(c＝0.89，H2O，pH1.6)。1H NMR(D2O，360MHZ)；δ0.77(3H，t，J-7.37Hz，CH3)，1.21-1.31(2H，m，CH2)，1.39-1.52(2H，m，CH2)，3.63(1H，dt，J＝9.30，6.18Hz，OCH2CH2CH2CH3)，3.67(1H，dd，J＝10.00，2.63Hz，H-1)，3.75(1H，dt，J-9.30，6.56Hz，OCH2CH2CH2CH3)，3.94(1H，dd，J-2.63，2.37Hz，H-2)，4.13(1H，ddd，J-9.21，9.21，9.21Hz，H-5)，4.17(1H，ddd，J-9.47，9.47，2.37Hz，H-3)，4.30(1H，ddd，J-9.47，9.47，9.21Hz，H-4)，4.43(1H，ddd，J-10.00，9.73，9.21Hz，H-6)。31P NMR(D2O，1H去偶，145.8MHZ)，δ-0.18(1P，s)，0.55(2P，s)，0.55(2P，s)，0.95(1P，s)。MS：m/z (+ve离子FAB)557[(M＋H+)-，100]。MS：m/z(ve离子FAB)555[(M－H)-，100]。
D-2-O-丁基-myo-肌醇1，4，5，6-四磷酸酯(ent-6)通过上述类似的方法对底物ent-23的丁酰基进行氢化，给出四磷酸酯ent-6。-[α]24 D：+1.6°(c＝0.60，H2O，pH1.6)。波谱数据与对映体6的数据一致。
D-2-O-丁基-1-O-丁酰-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯(2)将DIEA(182μl，1.06mmol)和乙酰氧甲基溴(107μl，1.06mmol)按照一般方法的描述加入到化合物23(37mg，59μmol)的乙腈(2毫升)悬浮液中。通过制备HPLC(72％MeOH；40ml/分钟；tR＝21.12)纯化得到糖浆状的化合物2(33mg，46％)。[α]24 D+1.1°(c＝1.07，甲苯)。1H-NMR([D8]甲苯，360 MHZ)：δ0.93(3 H，t，J＝7.28Hz，CH3)，0.97(3H，t，J-7.48Hz，CH3)，1.39-1.49(2H，m，CH2)，1.51-1.60(2H，m，CH2)，1.77-1.86(24H，8s，8x OAc)，2.39(1H，dt，J-16.67，7.38Hz，CH2)，2.63(1H，dt，J＝16.67，7.68，CH3)，3.78(1，H，dt，J＝9.45，6.30Hz，OCH2CH2CH2CH3)，3.87(1H，dt，J＝9.06，6.30Hz，OCH2CH2CH2CH3)，4.40(1H，dd，J＝2.36，2.36Hz，H-2)，4.68(1H，ddd，J＝9.55，9.55，2.36Hz，H-3)，4.79(1H，ddd，J＝9.55，9.45，9.45Hz，H-5)，5.03(1H，ddd，J＝9.55，9.55，9.55Hz，H-4)，5.09(1H，ddd，J-10.04，9.55，9.55Hz，H-6)，5.21(1H，dd，J-10.04，2.36Hz，H-1)，5.58-5.93(16H，m.CH2OAc)。31P NMR([D8]-甲苯，1H去偶，145.8MHZ)：δ-4.42(1P，s)，-3.98(1P，s)，-3.48(2P，s)。MS：m/z(+ve离子FAB)1131[(M－CH2OAc+＋2H)，44]，987[(M-3CH2OAc+＋4H)+，100]，MS：m/z(-ve离子FAB)1129[(M－CH2OAc+)18]，241[OP(OCH2OAc)2，100]。
D-2-O-丁基-3-O-丁酰-myo-肌醇1，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯(ent-2)将磷酸酯ent-23按照以上描述进行烷基化得到八(乙酰氧甲基)酯ent-2。[α]24 D：1.9°(c＝0.60，甲苯)。波谱数据与对映体2的数据一致。
D-3，4，5，6-四-O-苄基-1.2-二-O-丁基-myo-肌醇(18)室温及黑暗中，将氢化钠(13mg，522μmol)加入到搅拌中的9(94mg，174μmol)的无水DMF(3毫升)溶液中。将混合物搅拌5小时，然后加入1-丁基碘(120μl，1.04mmol)。将该悬浮液于80℃搅拌36小时，HPLC(95％MeOH；1.5ml/分钟；tR＝7.26)证实有产物形成。减压蒸除过量的1-丁基碘和DMF。将混合物溶于叔丁基甲基醚(30毫升)，然后依次用磷酸盐缓冲液(10毫升)、连二亚硫酸钠水溶液(10毫升)和盐水(10毫升)各洗涤一次。将有机层用硫酸钠干燥，过滤并蒸除醚得到油。将粗品油通过制备HPLC(95％MeOH；40ml/分钟；tR＝27.24分钟)纯化得到油状的标题化合物18(100mg，88％)。[α]24 D：+1.3°(c＝1.00，CHCl3)。1H NMR(CDCl3，360MHZ)：δ0.092(3H，t，J＝7.52Hz，CH3)，1.36-1.47(4H，m，2x CH2)，1.55-1.63(4H，m，2x CH2)，3.14(1H，dd，J-9.57，2.28Hz，H-3)，3.34(1H，dd，J-10.02，2.28，H-1)，3.43(1H，dd，J＝9.34，9.34，H-5)，3.52(1H，dt，J＝9.11Hz，6.60Hz，OCCH2CH2CH3)，3.60(1H，dt，J＝9.11，6.60Hz，OCCH2CH2CH3)，3.75(2H，t，J-6.60Hz，OCCH2CH2CH3)，3.89(1H，dd，J＝2.28，2.28Hz，H-2)，3.92(1H，dd，J-9.57，9.34Hz，H-4)，4.00(1H，dd，J＝10.02，9.34Hz，H-6)，4.71-4.93(8H，m，CH3Ph)，7.24-7.39(20H，m，CH2Ph)。MS：m/z(+ve离子FAB)653[(M＋H)+，1]，91[Bn+，100]。MS：m/z 653.383(M＋H)+C42H53O6计算值653.384)。
D-1，4，5，6-四-O-苄基-2，3-二-O-丁基-myo-肌醇(ent-18)将化合物ent-9讲行类似的反应和后处理得到化合物ent-18。[α]24 D：1.2°(c＝2.20，CHCl3)。波谱数据与对映体18的数据一致。
D-1，2-二-O-丁基-myo-肌醇(19)将化合物18(100mg，153μmol)按照一般方法中的描述用钯炭(10％)在氢气下氢化，冷冻干燥后得到固体状的四醇19(40mg，92％)。(从乙醇中)[α]24 D.+18.7°(c＝0.80，MeOH)。1H-NMR([D6]DMSO，360 MHZ)：δ0.89(3H，t，J＝7.52Hz，CH3)，0.91(3H，t，J＝7.38Hz，CH3)，1.24-1.39(4H，m，CH2)，1.41 1.53(4H，m，CH2)，2.88(1H，dd，J＝9.55，2.63Hz，H-3)，2.93(1H，dd，J＝9.93，2.63Hz，H-1)，3.14(1H，dt，J＝9.51，6.42Hz，OCCH2CH2CH2CH3)，3.31(1H，dd，J＝9.52，9.52Hz，H-5)，3.39-3.67(6H，m，3x OCCH2CH2CH3，H-2，H-4，H-6)，4.43(1H，s，OH)，4.52(1H，S，OH)，4.59(2H，s(br)，OH)，MS：m/z(+ve离子FAB)293[(M＋H)+，100]。MS：m/z(-ve离子FAB)291[(M－H+)，100]。
D-2，3-二-O-丁基-myo-肌醇(ent-19)将完全保护的化合物ent-18进行类似的反应和后处理得到四醇ent-19。[α]24 D：-18.9°(c＝1.36，MeOH)。波谱数据与对映体19的数据一致。
D-1，2-二-O-丁基-myo-肌醇3，4，5，6-四(二苄基)磷酸酯(24)将化合物19(40mg，137μmol)和四唑(115mg，1.64mmol)的乙腈(2ml)溶液用二苄基N，N-二异丙基亚磷酰胺(552μl，1.64mmol)处理18小时，用过乙酸氧化，然后按照以上描述进行后处理。通过制备HPLC(93％MeOH；40ml/分钟；tR＝26.05分钟)纯化得到油状的化合物24(133mg，73％)。[α]24 D：-2.3°(c-1.00，CHCl3)。1H-NMR(CDCl3，360MHZ)：δ0.79(3H，t，J＝7.31Hz，CH3)，0.86(3H，t，J＝7.31Hz，CH3)，1.13-1.38(4H，m，2x CH2)，1.41-1.56(4H，m，2x CH2)，3.24(1H，dd，J＝9.89，2.15Hz，H-1)，3.36(1H，dt，J＝8.31，7.41Hz，OCH2CH2CH2CH3)，3.41(1H，dt，J＝8.31，5.87Hz，OCH2CH2CH2CH3)，3.60(1H，dt，J＝8.88，6.55Hz，OCH2CH2CH2CH3)，3.71(1H，dt，J＝8.88，6.55Hz，OCH2CH2CH2CH3)，4.16(1H，ddd，J＝9.89，9.89，2.47Hz，H-3)，4.21(1H，dd，J＝2.47，2.15Hz，H-2)，4.48(1H，ddd，J＝9.67，9.67，9.67Hz，H-5)，4.79(1H，ddd，J＝9.89，9.67，9.67Hz，H-6)，4.95(1H，ddd，J＝9.89，9.67，9.67Hz，H-4)，4.96-5.09(16H，m，CH2Ph)，7.12-7.32(40H，m，CH2Ph)。31P NMR(CDCl3，1H去偶，145.8MHz)：δ-1.82(1P，s)，-1.59(1P，s)，-0.81(1P，s)，-0.68(1P，s)。MS：m/z(+ve离子FAB)1333[(M＋H)+，2]，91[Bn+，100]。MS：m/z(-ve离子FAB)1241[(M－Bn-)-，8]，277[OPO(OBn)- 2，100]。
D-2，3-二-O-丁基-myo-肌醇1，4，5，6-四(二苄基)磷酸酯(ent-24)将ent-19按照关于化合物24的描述进行亚磷酰化(phosphitylated)和氧化得到完全保护的磷酸酯ent-24。[α]24 D+2.5°(c＝1.15，CHCl3)。波谱数据与对映体24的数据一致。
D-1，2-二-O-丁基-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸酯(7)将化合物24(134mg，100μmol)按照一般方法中的描述用钯炭(10％)在氢气下氢化，冷冻干燥后得到固体状的标题化合物7(52mg，87％)。(c＝1.10，H2O，pH1.6)。1H-NMR(D2O，360MHZ)：δ0.70(3H，t，J＝7.37Hz，CH3)，0.71(3H，t，J＝7.37Hz，CH3)，1.13-1.24(4H，m，2xCH2)，1.32-1.46(4H，m，2x CH2)，3.39(1H，dd，J＝9.47，2.33Hz，H-1)，3.45(1H，dt，J＝8.59，8.16Hz，OCH2CH2CH2CH3)，3.51(1H，dt，J＝8.59，5.79Hz，OCH2CH2CH2CH3)，3.56(1H，dt，J＝9.47，6.31Hz，OCH2CH2 CH2CH3)，3.65(1H，dt，J＝9.47，6.84Hz，OCH2CH2CH2CH3)，4.02-4.08(2H，m，H-2，H-3)，4.1 1(1H，ddd，J＝9.47，9.47，9.47Hz，H-5)，4.27(1H，ddd，J＝9.47，9.47，9.47Hz，H-4)，4.39(1H，ddd，J＝9.47，9.21，9.21Hz，H-6)。31P NMR(D2O，1H去偶，145.8MHZ)：δ-0.69(1P，s)，-0.41(2P，s)，-0.12(1P，s)。MS：m/z(+ve离子FAB)613[(M＋H)+，15]，81[PO(OH)- 2，100]。MS：m/z (-ve离子FAB)611[(M－H+)-，90]79[OP(O)- 2，100]。
D-2，3-二-O-丁基-myo-肌醇1，4，5，6-四磷酸酯(ent-7)将完全保护的底物ent-24进行类似的反应得到游离酸ent-7。(c＝1.00，H2O，pH 1.6)。波谱数据与对映体7的数据一致。
D-1，2-二-O-丁基-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氢甲基)酯(3)将DIEA(187μl，1.00mmol)和乙酰氧甲基溴(111μl，1.00mmol)按照一般方法的描述加入到化合物7(34mg，55μmol)的乙腈(2ml)悬浮液中。通过制备HPLC(73％MeOH；40ml/分钟；tR＝20.40)纯化得到糖浆状的化合物3(42mg，65％)。[α]24 D-2.3°(c＝1.03，甲苯)。1H-NMR([D8]甲苯，360 MHZ)：δ0.92(3H，t，J＝7.28Hz，CH3)，0.99(3H，t，J＝7.48Hz，CH3)，1.33-1.47(4H，m，2x CH2)，1.48-1.54(2H，m，CH2)，1.61-1.69(2H，m，CH2)，1.77-1.87(24H，8s，8xOAc)，3.11(1H，dd，J＝9.84，2.36Hz，H-1)，3.46(1H，dt，J＝8.79，7.28Hz，OCH2CH2CH2CH3)，3.56(1H，dt，J＝8.79，7.28Hz，OCH2CH2CH2CH3)，3.84(1H，t，J＝6.50Hz，2x OCH2CH2CH2CH3)，4.34(1H，dd，J＝2.36，2.36Hz，H-2)，4.49(1H，ddd，J＝9.45，9.45，2.36Hz，H-3)，4.68(1H，ddd，J＝9.65，9.65，9.65Hz，H-5)，4.90(1H，ddd，J＝9.65，9.45，9.45Hz，H-4)，5.06(1H，ddd，J＝9.84，9.65，9.65Hz，H-6)，5.68-5.96(16H，m.CH2OAc)。31P NMR([D8]-甲苯，1H去偶，145.8 MHZ)：δ-5.12(1P，s)，-3.98(1P，s)，-3.69(1P，s)，-3.42(1P，s)。MS：m/z(+ve离子FAB)1189[(M＋H)+，3]，1045[(M-2xCH2OAc+＋3H)+，100]，MS：m/z(-ve离子FAB)1116[(M－CH2OAc+)-，30]，241[OP(OCH2OAc)- 2，100]。
D-2，3-二-O-丁基-myo-肌醇1，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯(ent-3)将磷酸酯ent-7按照以上描述进行烷基化得到八(乙酰氧甲基)酯ent-3。[α]24 D：+2.5°(c＝1.10，甲苯)。波谱数据与对映体3的数据一致。
rac-1，2-二-O-环亚己基-myo-肌醇3，4，5，6-四(二苄基)磷酸酯(rac-26)将rac-25(130mg，500μmol)和四唑(350mg，5.00mmol)的乙腈(6ml)溶液用二苄基N，N-二异丙基亚磷酰胺(1.68ml，5.00mmol)处理26小时，用过乙酸氧化，然后按照以上描述进行后处理。通过制各HPLC(93％MeOH；40ml/分钟；tR＝22.35分钟)纯化得到油状的化合物rac-26(306mg，47％)。1H-NMR(CDCl3，360MHZ)δ1.20-1.80(10H，m，CH2(环己基))，4.26(1H，dd，J＝6.01，6.01Hz，H-1)，4.66(1H，dd，J＝6.01，3.43Hz，H-2)，4.76-4.81(2H，m，H-3，H-5)4.92-5.17(18H，m，CH2Ph，H-4，H-6)，7.20-7.40(40H，m，CH2Ph)。31P NMR(CDCl3，1H去偶，145.8MHZ)：δ-1.69(1P，s)，-1.59(1P，s)，-1.52(1P，s)，-1.00(1P，s)。MS：m/z(-ve离子FAB)1209[(M－Bn+)-，1]，277[OPO(OBn)- 2，100]。
rac-1，2-二-O-环亚己基-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸酯(rac-8)。在将无水的乙基-二异丙基胺(95μl，560μmol)加入之前，将乙基-二异丙基氨基盐rac-26(91mg，70μmol)溶解在乙醇(4ml)中，接着是钯炭(10％)(84mg，840μmol)。在氢气的气氛下将该溶液在室温下搅拌6天，滤出催化剂，冻干滤液得到标题化合物rac-8(108mg，96％)。1H NMR，(D2O，360 MHZ)：δ1.30-1.90(10H，m，CH2(环己基))，(1H，ddd，J＝9.08，9.08，8.23Hz，H-5)，4.18-4.26(2H，m，H-1，H-3)，4.32-4.40(2H，m，H-4，H-6)，4.55(1H，dd，J＝1.26，3.69Hz，H-2)。31P-NMR(D2O，1H去偶，145.8MHZ)：δ-0.24(1P，s)，0.10(1P，s)，0.85(1P，s)，0.90(1P，s)。
rac-1，2-二-O-环亚己基-myo-肌醇3，4，5.6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯(rac-4)将DIEA(205μl，1.20mmol)和乙酰氧甲基溴(120μl，1.20mmol)按照一般方法的描述加入到化合物rac-8(108mg，66μmol)的乙腈(2ml)悬浮液中。通过制备HPLC(68％MeOH；40ml/分钟；tR＝19.35)纯化得到糖浆状的化合物rac-4(50mg，65％)。1H-NMR([D8]甲苯，360MHZ)：δ1.20-1.75(10H，m，CH2(环己基))，1.811.92(24H，8s，8x OAc)，4.28(1H，dd，J＝5.51，5.51Hz，H-1)，4.77(1H，dd，J＝5.51，3.54Hz，H-2)，4.91-4.99(2H，m，H-5，H-6)，5.07(1H，ddd，J＝8.66，8.27，3.54Hz，H3)，5.17(1H，ddd，J＝9.05，8.66，7.08Hz，H-4)，5.65-5.94(16H，m，CH2OAc)。31P NMR([D8]-甲苯，1H去偶，145.8MHZ)：δ-4.56(1P，s)，-4.07(1P，s)，-3.67(1P，s)，-3.55(1P，s)。MS：m/z(-ve离子FAB)1083[(M－CH2OAc+)-35]，241[OP(OCH2OAc)- 2，100]。
rac-3，4，5，6-四-O-苄基-2-脱氧-2-碘代-1-O-(4-甲氧基苄基)-myo-肌醇(rac-56)。无水的rac-55(rac-3，4，5，6-四-O-苄基-1-O-(4-甲氧基苄基)-myo-肌醇)(1.32g，2mmol)，三苯基膦(2.15g，8.2mmol)，咪唑(549mg，8.2mmol)，和碘(1.52g，6mmol)在无水甲苯(100ml)的回流下搅拌41小时。反应混合物冷却至室温，加入饱和的碳酸氢钠水溶液(100ml)，混合物搅拌10分钟。加入部分的碘。当甲苯相保持碘着色时，再搅拌15分钟。过量的碘通过加入连二亚硫酸钠的水溶液除去。在一个分液漏斗中分离有机相和水相，并用盐水洗涤有机相(两次)。甲苯相用硫酸钠干燥并过滤。蒸发混合物并结晶，得到纯的rac-56(1.01g，73％)。Mp.：131.5-132.4℃(从甲醇)。1H NMR(CDCl3，360 MHZ)：δ3.49(1H，dd，J＝9.27，9.27Hz)，3.50(1H，dd，J＝9.27，9.27Hz)，3.80(3H，s，OMe)，(1H，dd，J＝9.78，9.31Hz，H-4)，4.06(1H，dd，J＝11.08，11.08Hz)，4.82-4.92(10H，m，4x CH2Ph和PMB的CH2，6.87(2H，d，PMBArH)，7.23-7.37(22H，m，4x CH2Ph和PMB ArH)。MS：m/z(+ve离子FAB)924[(M＋NBA＋H)+，1]，121[PMB+，100]。
rac-3，4，5，6-四-O-苄基-2-脱氧-1-O-(4-甲氧基苄基)-myo-肌醇(rac-57)。无水的rac-56溶解在甲苯(150ml)中，并且加入AIBN(63mg，355μmol)和n-Bu3SnH(1.63ml，6.3mmol)。该溶液在氩气气氛下加热2小时。反应混合物被冷却并用磷酸盐缓冲液(30ml)和盐水(30ml)各洗涤一次。有机层用硫酸钠干燥并过滤。蒸发混合物并结晶之，得到57(692mg，76％)。Mp.：76.2-76.8℃(从甲醇)。1H-NMR(CDCl3，360MHZ)：δ1.64(1H，ddd，J＝12.73，12.73，12.73Hz，H-2(ax))，2.39(1H，ddd，J＝12.73，4.39，4.39Hz，H-2(eq))，3.39-3.46(2H，m，H-1，H-3)，3.46(1H，dd，J＝9.22，8.87Hz，H-5)，3.55(1H，dd，J＝9.22，9.22Hz，H-4)，3.56(1H，dd，J＝9.22，9.22Hz，H-6)，3.81(3H，s，OMe)，4.60-4.94(10H，m，4x CH2Ph和PMB的CH2)，6.86(2H，d，PMB ArH)，7.24-7.33(22H，m，4x CH2Ph和PMB ArH)。MS：m/z(-ve离子FAB)643[(M－H+)-，1]，523[M－PMB+)-，100]。
rac-3，4，5，6-四-O-苄基-2-脱氧-myo-肌醇(58)。将DDQ(367mg，1.62mmol)加入含有少量水(5％)的rac-57(600mg，931μmol)的CH2Cl2(10ml)溶液中。在室温下搅拌该悬浮液28分钟之后，HPLC分析(90％MeOH；1.5ml/min；tR＝4.27min)显示反应完成。反应混合物在减压下蒸发，并用制备HPLC(90％MeOH；40ml/min；20.00min)纯化，得到固体状的rac-58(232mg，48％)。Mp.：126.7℃(从甲醇)。1H-NMR(CDCl3，360MHZ)：δ1.64(1H，ddd，J＝12.73，12.73，12.73，12.73Hz，H-2(ax))，2.39(1H，ddd，J＝12.73，4.39，4.39Hz，H-2(eq))，3.39-3.46(2H，m，H-1，H-3)，3.46(1H，dd，J＝9.22，8.87Hz，H-5)，3.55(1H，dd，J＝9.22，9.22Hz，H-4)，3.56(1H，dd，J＝9.22，9.22Hz，H-6)，3.81(3H，s，OMe)，4.60-4.94(10H，m，4xCH2Ph和PMB的CH2)，6.86(2H，d，PMB ArH)，7.24-7.33(22H，m，4x CH2Ph和PMB ArH)。MS：m/z(+ve离子FAB)525[(M＋H)+，1]，91[Bn+)-，100]。
rac-3，4，5，6-四-O-苄基-1-O-丁酰-2-脱氧-myo-肌醇(rac-59)。将rac-58(186mg，355mmol)，丁酸酐(70μl，426μmol)和DMAP(12mg，10μmol)的吡啶(5ml)溶液在室温下搅拌18小时。高真空下蒸除溶剂得到油状物。残留的吡啶通过用辛烷蒸三次除去。残留物溶解在叔丁基甲基醚(30ml)中，依次用磷酸盐缓冲液(20ml)、碳酸氢钠(20ml)、硫酸氢钠(20ml)各洗涤一次，再用磷酸盐缓冲液(20ml)洗涤一次，然后用盐水(20ml)洗涤一次。有机层用硫酸钠干燥并过滤。蒸发溶剂得到固体状的醇rac-59 (196mg，94％)。Mp.：110.1-110.3℃(从甲醇)。1H-NMR(CHCl3，360 MHZ)：δ0.91(3H，t，J＝7.25Hz，CH3)，0.98(3H，t，J＝7.46Hz，CH3)，1.32-1.42(2H，m，CH2)，1.50-1.60(2H，m，CH2)，1.69(2H，tq，J＝7.46，7.46Hz，O(O)CCH2CH2CH3)，2.39(2H，t，J＝7.46Hz，O(O)CCH2CH2CH3)，3.31(1H，dd，J＝9.66，2.63Hz，H-1)，3.44(1H，dt，J＝9.07，6.81Hz，OCH2CH2CH2CH3)，3.48(1H，dd，J＝9.66，3.07Hz，H-3)，3.49(1H，dd，J＝9.66，9.22Hz，H-5)，3.67(1H，dt，J＝8.78，6.81Hz，OCH2CH2CH2CH3)，3.81(1H，dd，J＝9.66，9.66Hz，H-4)，3.86(1H，dd，J＝9.66，9.22Hz，H-6)，4.51-4.93(8H，m，CH2Ph)，5.83(1H，dd，J＝3.07，2.63Hz，H-2)，7.26-7.36(20H，m，CH2Ph)。MS：m/z(+ve离子FAB)595[(M＋H)+，21]，91[Bn+，100]。
rac-1-O-丁酰-2-脱氢-myo-肌醇(rac-60)将化合物rac-59(177mg，297μmol)按照一般方法中的描述用钯炭(10％)在氢气下氢化，冷冻干燥后得到固体状的四醇rac-60(68mg，98％)。Mp.：174.9-175.9℃(从乙醇)。1H-NMR([D6]DMSO，360MHZ)：δ0.84(3H，t，J＝7.38Hz，CH3)，0.90(3H，t，J＝7.38Hz，CH3)，1.21-1.31(2H，m，CH2)，1.36-1.44(2H，m，CH2)，1.54(2H，tq，J＝7.38，7.00Hz，O(O)CCH2CH2CH3)，2.24(2H，t，J＝7.00Hz，O(O)CCH2CH2CH3)，2.97(1H，dd，J＝8.94，8.55Hz，H-5)，3.10(1H，dd，J＝9.72，2.72Hz，H-1)，3.25-3.35(4H，m，H-3，H-4，H-6，OCH2CH2CH2CH3)，3.50(1H，dt，J＝8.94，6.60Hz，OCH2CH2CH2CH3)，4.85(4H，s(br)，OH)，5.36(1H，dd，J＝2.72，2.33Hz，H-2)。MS：m/z(+ve离子FAB)235[(M＋H)+，100]。MS：m/z (-ve离子FAB)233[(M－H+)-，27]，87[BtO-，100]。
rac-1-O-丁酰-2-脱氧-myo-肌醇3，4，5，6-四(二苄基)磷酸酯(rac-61)将rac-60(44mg，190μmol)和四唑(160mg，2.28mmol)的乙腈(2ml)溶液用二苄基N，N-二异丙基亚磷酰胺(767μl，2.28mmol)处理36小时，用过乙酸氧化，然后按照以上描述进行后处理。通过制备HPLC(92％MeOH；40ml/分钟；tR＝21.55分钟)纯化得到油状的化合物rac-61(172mg，71％)。1H-NMR(CDCl3，360MHZ)δ0.79(3H，t，J＝7.57Hz，CH3)，1.45(2H，tqu，J＝7.57，7.57Hzβ-CH2)，1.46(1H，ddd，J＝12.92，11.14，11.14Hz，H-2(ax))，2.08(2H，t，J＝7.57Hz，α-CH2)，2.58(1H，ddd，J＝12.92，4.90，4.90Hz，H-2(eq))，4.28-4.37(1H，m，H-3)，4.44(1H，dd，J＝9.24，9.24，9.24Hz，H-5)，4.53(1H，ddd，J＝9.24，9.02，9.02Hz，H-4)，4.56(1H，ddd，J＝9.24，9.24，9.24Hz，H-6)，4.83-5.08(17H，m，8x CH2Ph，H-1)，7.12-7.32(40H，m，8x CH2Ph)。31P NMR(CDCl3，1H去偶，145.8MHZ)：δ-1.67(1P，s)，-1.33(1P，s)，-0.85(1P，s)，-0.64(1P，s)。MS：m/z(+ve离子FAB)1275[(M＋H)+，4]91[Bn+，100]。MS：m/z(-ve离子FAB)1183[(M－Bn+)-，16]，277[OPO(OBn)-，100]。
rac-1-O-丁酰-2-脱氧-myO-肌醇3，4，5，6-四磷酸酯(rac-62)将化合物rac-61(165mg，130μmol)按照一般方法中的描述用钯炭(10％)在氢气下氢化，冷冻干燥后得到固体状的四醇rac-62(65mg，90％)。1H-NMR(D2O，360MHZ)：δ0.67(3H，t，J＝7.41Hz，CH3)，1.33-1.43(2H，m，β-CH2)，1.62(1H，ddd，J＝11.72，11.71，11.38Hz，H-2(ax))，2.17(2H，m，α-CH2)，2.25(1H，ddd，J＝11.38，2.24，2.24Hz，H-2(eq))，4.07-4.23(4H，m，H-3，H-4，H-5，H-6)，4.85(1H，m，H-1)。31P NMR(D2O，1H去偶，145.8MHZ)：δ-0.39(2P，s)，-0.13(1P，s)，0.41(1P，s)。MS：m/z(+ve离子FAB)555[(M＋H)+，100]，485[M-Bt+＋2H+]，40]。MS：m/z(-ve离子FAB)553[(M－H+)-，100]。
rac-1-O-丁酰-2-脱氧-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯(rac-51)将DIEA(201μl，1.19mmol)和乙酰氧甲基溴(119μl，1.19mmol)按照一般方法的描述加入到化合物rac-62(37mg，66μmol)的乙腈(2ml)悬浮液中。通过制备HPLC(69％MeOH；40ml/min；tR＝12.10)纯化得到糖浆状的化合物rac-51(31mg，50％)。1H-NMR([D8]甲苯，360 MHZ)：δ0.96(3H，t，J＝7.48Hz，CH3)，1.54(1H，ddd，J＝12.70，12.70，12.31Hz，H-2(ax))，1.63-1.74(2H，m，β-CH2)，1.81-1.87(24H，8s，8x OAc)，2.30(1H，dt，J＝16.28，7.68Hz，α-CH2)，2.52(1H，dt，J＝16.28，7.88Hz，α-CH2)，2.64(1H，ddd，J＝12.31，5.31，5.31Hz，H-2(eq))，4.40-4.59(4H，m，H-3，H-4，H-5，H-6)，5.03(1H，ddd，J＝12.20，9.53，5.31Hz，H-1)，5.65-5.95(16H，m，8x CH2OAc)。31P NMR([D8]-甲苯，1H去偶，145.8 MHZ)：δ-4.68(1P，s)，-4.32(1P，s)，-3.77(1P，s)，-3.65(1P，s)。MS：m/z(+ve离子FAB)1131[(M＋H)+，12]，987[(M-2CH2OAc+＋3H)+，100]，MS：m/z(-ve离子FAB)1059[(M－Bt+)-，16]，241[OP(OCH2OAc)2，100]。
rac-2-脱氧-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸酯(rac-53)。用1M KOH(260μl)处理化合物62，将其pH值调整到12.8。溶液在室温下搅拌2天。将反应混合物直接倾入离子交换柱(Dowex 50WX8，H+)进行纯化。冻干给出化合物rac-53。1H NMR(D2O，360MHZ)；δ1.55(1H，ddd，J＝12.09，12.09，12.09Hz，H-2(ax))，2.24(1H，ddd，J＝12.09，4.31，4.31Hz，H-2(eq))，4.79(1H，ddd，J＝12.09，8.77，4.31Hz，H-1)，5.14(1H，ddd，J＝9.25，9.25，8.83Hz，H-5)，5.18-5.73(3H，m，H-3，H-4，H-6)。31P NMR(D2O，1H去偶，145.8MHZ)，δ-0.08(1P，s)，0.28(1P，s)，0.34(1P，s)，0.90(1P，s)。MS：m/z(+ve离子FAB)485[(M＋H)-，100]。MS：m/z(-ve离子FAB)483[(M－H+)-，100]。
rac-1-O-苄基-6-O-丁酰-2，3，4，5-二-O-环亚己基-myo-肌醇(100)将rac-1-O-苄基-2，3-4，5-二-环亚己基-myo-肌醇(200mg，465μmol)、丁酸酐(144μl，571μmol)和DMAP(6mg，50μmol)的无水吡啶(3ml)溶液在室温搅拌36小时。高真空蒸除溶剂得到油。与辛烷一起蒸发3次除去残余的吡啶。将残余物溶于叔丁基甲基醚(40毫升)，用磷酸盐缓冲液(20毫升)洗涤一次、用碳酸氢钠(20毫升)洗涤一次、用硫酸氢钠(20毫升)洗涤一次、再次用磷酸盐缓冲液(20毫升)洗涤一次，然后用盐水(20毫升)洗涤。将有机层用硫酸钠干燥并过滤。蒸除溶剂得到油状纯净的rac-100(186mg，80％)。1H-NMR(CHCl3，360 MHZ)：δ0.94(3H，t，J＝7.40Hz，CH3)，1.39-1.79(12H，m，CH2(环己基)，CH2(β-CH2))，2.23-2.37(2H，m，α-CH2)，3.60(1H，dd，J＝2.85，2.08Hz，H-1)，3.63(1H，dd，J＝10.86，8.09Hz，H-5)，4.31(1H，dd，J＝7.17，2.85Hz，H-2)，4.34(1H，dd，J＝10.86，8.56Hz，H-4)，4.38(1H，dd，J＝8.56，7.17Hz，H-3)，4.78(2H，AB，J＝10.01Hz，CH2-Ph)，5.24(1H，dd，J＝8.09，2.08Hz，H-6)，7.24-7.39(5H，m，CH2Ph)。MS：m/z(+ve离子FAB)501[(M＋H)+，2]，91[Bn+，100]。
rac-1-O-苄基-6-O-丁酰-myo-肌醇(101)将rac-100(186mg，372μmol)在CH3CN/H2O(100∶1，8ml)的溶液与三氟乙酸(4ml)在室温搅拌2小时。高真空蒸除溶剂得到标题化合物rac-101(125mg，98％)。1H-NMR(CHCl3，360MHZ)：δ0.86(3H，t，J＝7.35Hz，CH3)，1.44-1.56(2H，m，β-CH2)，2.13-2.31(2H，m，α-CH2)，3.12(1H，dd，J＝9.13，9.13Hz，H-5)，3.15(1H，dd，J＝9.58，2.45Hz，H-3)，3.32(1H，dd，J＝10.05，2.45Hz，H-1)，3.44(1H，dd，J＝9.36，9.36Hz，H-4)，4.01(1H，dd，J＝2.45，2.45Hz，H-2)，4.44(2H，AB，J＝9.93Hz，CH2-Ph)，5.12(1H，dd，J＝10.05，9.13Hz，H-6)，7.24-7.34(5H，m，CH2Ph)。MS：m/z(+ve离子FAB)341[(M＋H)+，10]91[Bn+，100]。MS：m/z(-ve离子FAB)339[(M－H+)-，14]，87[BtO-，100]。
rac-1-O-苄基-6-O-丁酰-myo-肌醇2，3，4，5-四(二苄基)磷酸酯(rac-102)将化合物rac-101(145mg，426μmol)和四唑(358mg，5.11mmol)的乙腈(3ml)溶液用二苄基N，N-二异丙基亚磷酰胺(1.72ml，5.1lmmol)处理22小时，用过乙酸氧化，然后按照以上描述进行后处理。通过制备HPLC(94％MeOH；40ml/min；tR＝22.40min)纯化得到油状的化合物rac-102(297mg，50％)。1H-NMR(CDCl3，360 MHZ)：δ0.78(3H，t，J＝7.38Hz，CH3)，1.21-1.52(2H，m，β-CH2)，2.06-2.20(2H，m，α-CH2)，3.41(1H，ddd，J＝10.01，2.03，2.03Hz，H-3)，4.28-4.34(2H，m，H-1，H-5)，4.49(1H，ddd，J＝9.41，9.41，9.41Hz，H-4)，4.78-5.18(18H，m，CH2Ph)，5.50(1H，ddd，J＝9.15，2.03，2.03Hz，H-2)，5.64(1H，dd，J＝10.14，10.14Hz，H-6)，7.07-7.32(45H，m，CH2Ph)。31P NMR(CDCl3，1H去偶，145.8MHZ)：δ-1.94(1P，s)，-1.03(1P，s)，-0.79(1P，s)，-0.32(1P，s)。MS：m/z(+ve离子FAB)1381[(M＋H)+，1]，71[Bt+，100]。MS：m/z(-ve离子FAB)1279[(M－Bn+)-，16]，277[OPO(OBn)- 2，100]。
rac-6-O-丁酰-myo-肌醇2，3，4，5-四磷酸酯(rac-103)将化合物rac-102(290mg，210μmol)按照一般方法中的描述用钯炭(10％)在氢气下氢化，冷冻后得到固体状的标题化合物rac-103(119mg，99％)。1H NMR(D2O，360 MHZ)：δ0.87(3H，t，J＝7.38Hz，CH3)，1.51-1.61(2H，m，β-CH2)，2.39(2H，d，J＝7.52Hz，α-CH2)，2.96(1H，ddd，J＝9.36，7.45，2.03Hz，H-1)，3.88(1H，ddd，J＝9.51，2.03，2.03Hz，H-3)，4.29(1H，ddd，J＝9.94，9.51，9.51Hz，H-5)，4.30(1H，dddd，J＝9.36，9.36，2.03，2.03Hz，H-2)，4.52(1H，ddd，J＝9.51，9.51，9.51Hz，H-4)，5.22(1H，dd，J＝9.94，9.94Hz，H-6)。31P NMR(D2O，1H去偶，145.8MHZ)：δ0.19(2P，s)，0.42(1P，s)，0.89(1P，s)。MS：m/z(+ve离子FAB)571[(M＋H)+，10]，71[Bt+，100]。MS：m/z(-ve离子FAB)569[(M－H+)-，35]，79[OP(O)- 2，100]。
rac-1-O-[1.2-二棕榈酰基-sn-甘油(glycerole]-6-O-丁酰-myo-肌醇3，4，5-三磷酸六(乙酰氧甲基)酯(rac-104)将DIEA(190μl，1.12mmol)和乙酰氧甲基溴(126μl，1.26mmol)加入到化合物rac-103(40mg，70μmol)的无水乙腈(1.5ml)悬浮液中。在黑暗及室温下搅拌该混合物3h，加入1，2-二棕榈酰基-sn-甘油(20mg，35μmol)，并将溶液于黑暗中在4℃下搅拌4天。降压下蒸除溶剂并将残留物用甲苯萃取，得到糖浆状的标题化合物rac-104。
rac-1-O-[1，2-二辛酰基-sn-甘油(glycerole)]-6-O-丁酰-myo-肌醇3，4，5-三磷酸六(乙酰氧甲基)酯(rac-105)将DIEA(136μl，800μmol)和乙酰氧甲基溴(90μl，900μmol)加入到化合物rac-103(28mg，50μmol)的无水乙腈(1.5ml)悬浮液中。在黑暗及室温下搅拌该混合物3h，加入1，2-二棕榈酰基-sn-甘油(23mg，70μmol)，并将溶液于黑暗中在4℃下搅拌4天。降压下蒸除溶剂并将残留物用甲苯萃取，得到糖浆状的标题化合物rac-105。材料——所有的化学试剂均是高纯度的。如需要，可将溶剂在临用前干燥和/或蒸馏。将乙腈在五氧化二磷存在下蒸馏并保存在3分子筛中，二甲基甲酰胺(DMF)与之相同。吡啶和甲苯保存在4分子筛中。乙基二异丙基胺(DIEA)用钠丝干燥。钯炭(10％)和三氟乙酸来自Acros Chemie。二苄基N，N-二异丙基亚磷酰胺(dibenzyl N，N-diisopropylphosphoramidite)、过乙酸(32％v/w)、四唑和乙酰氧甲基溴化物来自Aldrich。丁酸酐、DIEA来自Merck。苄基溴、氟化铯和4-二甲氨基吡啶(DMAP)来自Fluka。其它所有试剂均来自Riedel-de Haёn。rac-3，4-二-O-苄基-1，2-环亚己基-myo-肌醇(1)按照以前所描述的从myo-肌醇按三步合成成(Angyal et al.，J.Chem.Soc.4116(1961)；Jiang and Baker，Carbohydr.Chem.5：615(1986))，这两篇文献都引入本文作为参考。所有的混合物都是外消旋的。
3，4-二-O-苄基-5，6-二-O-丁酰-1，2-环亚己基-myo-肌醇(152)将151(130mg，295μmol)、丁酸酐(193μl，1.18mmol)和DMAP(40mg，33μmol)的无水吡啶(2ml)溶液室温搅拌2天。高真空蒸除溶剂得到油。与辛烷一起蒸发3次除去残余的吡啶。将残余物溶于叔丁基甲基醚(10ml)，用磷酸盐缓冲液(10ml)洗涤一次、用碳酸氢钠(10ml)洗涤一次、用硫酸氢钠(10ml)洗涤一次、再次用磷酸盐缓冲液(10ml)洗涤一次，然后用盐水(10ml)洗涤。将有机层用硫酸钠干燥并过滤。蒸除溶剂得到油状纯净的152(171mg，98％)。1H-NMR(CHCl3，360 MHZ)：δ0.87(3H，t，J＝7.30Hz，CH3)，0.91(3H，t，J＝7.30Hz，CH3)，1.26-1.87(14H，m，CH2(环己基)，2x β-CH2(Bt))，2.12-2.17(2H，m，α-CH2)，2.22-2.31(2H，m，α-CH2)，3.76(1H，dd，J＝9.29，4.05Hz，H-3)，3.97(1H，dd，J＝9.29，8.85Hz，H-4)，4.01(1H，dd，J＝7.74，5.09Hz，H-1)，4.27(1H，dd，J＝5.09，4.05Hz，H-2)，4.65-4.99(4H，m，2x CH2Ph)，4.96(1H，dd，J＝10.51，8.85Hz，H-5)，5.29(1H，dd，J＝10.51，7.74Hz，H-6)，7.26-7.38(10H，m，CH2Ph)。MS：m/z(+ve离子FAB)581[(M＋H)+，1]，91[Bn+，100]。MS：m/z 581.311(M＋H)+(C34H45O8的计算值581.311)。
3，4-二-O-苄基-5，6-二-O-丁酰-myo-肌醇(153)-将152(166mg，286μmol)在5ml CH3CN/H2O(100∶1)的溶液与三氟乙酸(2ml)在室温搅拌2小时。减压蒸发该反应混合物，产物用叔丁基甲基醚萃取。有机层用盐水洗，用硫酸钠干燥，过滤并蒸发得到油状的153(140mg，99％)。1H-NMR(CHCl3，360 MHZ)：δ0.88(3H，t，J＝7.40Hz，CH3)，0.92(3H，t，J＝7.40Hz，CH3)，1.50-1.66(4H，m，2xβ-CH2)，2.11-2.13(2H，m，α-CH2)，2.21-2.36(2H，m，α-CH2)，3.05(2H，s(br)，2x OH)，3.54(1H，dd，J＝9.48，2.77Hz，H-3)，3.58(1H，dd，J＝9.86，2.77Hz，H-1)，3.95(1H，dd，J＝9.71，9.48Hz，H-4)，4.17(1H，dd，J＝2.77，2.77Hz，H-2)，4.62-4.87(4H，m，2x CH2Ph)，5.01(1H，dd，J＝9.71，9.71Hz，H-5)，5.29(1H，dd，J＝9.86，9.71Hz，H-6)，7.23-7.34(10H，m，CH2Ph)。MS：m/z(+ve离子FAB)523[(M＋Na)+，22]，91[Bn+，100]。MS：m/z(-ve离子FAB)499[(M＋H+)-，2]，87[Bt-，100]。MS：m/z 539.207(M＋K)+(C28H36O8K的计算值539.205)。
1，3，4-三-O-苄基-5，6-二-O-丁酰-myo-肌醇(1 54)-将153(143mg，286μmol)和无水二丁基氧化锡(71mg，300μmol)在无水甲苯(100ml)中、在装有活化分子筛(3)的Soxhlet装置中加热回流4小时。将反应混合物冷却至室温并减压蒸发至干。向残余的油中加入CsF(92mg，572μmol)，然后将混合物置于高真空下2小时。将残余的糖浆在氩气下溶于无水DMF(5ml)并加入苄基溴(270μl，2.28mmol)。将溶液搅拌18小时后，HPLC(Merck Hibar钢管(250mm×4mm)，填充RP 18材料(Merck，Lichrosorb；10μm))分析(95％MeOH；1.5ml/min；tR＝3.20min)表明无进一步的反应。高真空蒸除过量的苄基溴和DMF。将粗产物通过制备HPLC(MerckPrepbar钢管(250mm×50mm)，填充RP 18材料(Merck，LiChrospher；10μm))进行色谱分离(88％MeOH；40ml/min；tR＝17.20min)得到固体状的化合物154(448mg，75％)。1H-NMR(CHCl3，360 MHZ)：δ0.87(3H，t，J＝7.46Hz，CH3)，0.90(3H，t，J＝7.25Hz，CH3)，1.48-1.68(4H，m，2x β-CH2)，2.09-2.22(4H，m，2xα-CH2)，2.52(1H，s(br)，OH)，3.40(1H，dd，J＝9.99，2.63Hz，H-1)，3.44(1H，dd，J＝9.66，2.63Hz，H-3)，4.03(1H，dd，J＝9.88，9.66Hz，H-4)，4.19(1H，dd，J＝2.63，2.63Hz，H-2)，4.51-4.88(6H，m，3xCH2Ph)，5.04(1H，dd，J＝10.09，9.88Hz，H-5)，5.48(1H，dd，J＝l0.09，9.99Hz，H-6)，7.23-7.34(15H，m，CH2Ph)。MS：m/z(+ve离子FAB)613[(M＋Na)+，6]，9l[Bn+，100]。MS：m/z613.277(M＋Na)+(C35H42O8Na的计算值613.278)。
1，3，4-三-O-苄基-2，5，6-三-O-丁酰-myo-肌醇(155)-将154(98mg，166μmol)、丁酸酐(68μl，415μmol)和DMAP(5mg，4μmol)的无水吡啶(2ml)溶液室温搅拌2小时。按与对化合物2所进行的类似的后处理得到油状纯净的155(106mg，99％)。1H-NMR(CHCl3，360 MHZ)：δ0.87(3H，t，J＝7.47Hz，CH3)，0.89(3H，t，J＝7.96Hz，CH3)，0.96(3H，t，J＝7.47Hz，CH3)，1.23-1.41(2H，m，CH2)，1.51-1.60(2H，m，CH2)，1.65-1.73(2H，m，CH2)，2.13(2H，t，J＝7.47Hz，α-CH2)，2.20(2H，t，J＝7.47Hz，α-CH2)，2.43(2H，t，J＝7.47Hz，α-CH2)，3.46(1H，dd，J＝10.03，2.77Hz，H-1)，3.53(1H，dd，J＝9.82，2.99Hz，H-3)，3.86(1H，dd，J＝9.82，9.82 Hz，H-4)，4.40-4.83(6H，m，3x CH2Ph)，5.06(1H，dd，J＝10.03，9.82Hz，H-5)，5.37(1H，dd，J＝10.03，10.03Hz，H-6)，5.86(1H，dd，J＝2.99，2.77Hz，H-2)，7.19-7.34(15H，m，CH2Ph)。MS：m/z(+ve离子FAB)661[(M＋H)+，1]，91[Bn+，100]。MS：m/z661.338(M＋H)+(C29H49O9的计算值661.334)。
2，5，6-三-O-丁酰-myo-肌醇(156)-在将钯炭(10％)(80mg，795μmol)加入之前，将155(105mg，159μmol)溶解于乙酸中。在氢气的气氛下将该溶液在室温下搅拌6h，超滤除去催化剂，滤液冻干得到标题化合物156(53mg，86％)。Mp：113.4-114.4℃(从MeOH)。1H-NMR([D]6-DMSO)：δ0.94(3H，t，J＝7.53Hz，CH3)，0.95(3H，t，J＝7.53Hz，CH3)，0.99(3H，t，J＝7.53Hz，CH3)，1.59-1.76(6H，m，3xβ-CH2)，2.25-2.36(4H，m，2xα-CH2)，2.43(2H，t，J＝7.32 Hz，α-CH2)，3.72(1H，dd，J＝9.77，2.84Hz，H-3)，3.85(1H，dd，J＝10.17，2.84Hz，H-1)，3.85(1H，dd，J＝9.77，9.77Hz，H-4)，5.02(1H，dd，J＝9.77，9.77Hz，H-5)，5.25(1H，dd，J＝10.17，9.77Hz，H-6)，5.53(1H，dd，J＝2.84，2.84Hz，H-2)。MS：m/z(+ve离子FAB)391[(M＋H)+，5]，71[Bt+，100]。MS：m/z(-ve离子FAB)389[(M－H+)-，11]，87[BtO-，100]。分析：计算值C18H30O9：C，55.37；H，7.74。实测值：C，55.43；H，7.84。
2，5，6-三-O-丁酰-myo-肌醇1，3，4-三(二苄基)磷酸酯(157)-将三醇156(48mg，123μmol)和四唑(104mg，1.48mmol)的乙腈(2ml)溶液用二苄基N，N-二异丙基亚磷酰胺(500μl，1.48mmol)处理18小时，冷却到-40℃，强烈搅拌下用过乙酸(32％v/w，340μl，1.48mmol)氧化(Yu and Fraiser-Reid，Tetrahedror Lett.29：979(1988))，将其引入本文作为参考。使该混合物升温到室温。减压下除去溶剂，用制备HPLC(92％MeOH；40ml/min；tR＝17.50min)纯化残留物得到化合物157(104mg，72％)。1H-NMR(CHCl3，360 MHz)：δ0.76(3H，t，J＝7.32Hz，CH3)，0.78(3H，t，J＝7.32Hz，CH3)，0.93(3H，t，J＝7.32Hz，CH3)，1.32-1.50(4H，m，2x β-CH2)，1.57-1.67(2H，m，β-CH2)，2.04(2H，t，J＝7.57Hz，α-CH2)，2.13(2H，t，J＝7.57Hz，α-CH2)，2.35(2H，t，J＝7.57Hz，α-CH2)，4.38(1H，ddd，J＝9.28，9.28，2.69Hz，H-3)，4.47(1H，ddd，J＝9.99，9.99，2.69Hz，H-1)，4.82-5.04(13H，m，3x CH2Ph，H-4)，5.14(1H，dd，J＝9.77，9.77Hz，H-5)，5.45(1H，dd，J＝9.99，9.77Hz，H-6)，6.04(1H，dd，J＝2.69，2.69Hz，H-2)，7.20-7.34(30H，m，CH2Ph)。31P-NMR(CHCl3，1H去偶，145.8MHZ)：δ-1.25(1P，s)，-1.18(1P，s)，-1.15(1P，s)。MS：m/z(+ve离子FAB)1171[(M＋H)+，4]，91[Bn+，100]。MS：m/z(-ve离子FAB)1079[(M－Bn+)-，45]，277[OPO(OBn)2 -，100]。
2，5，6-三-O-丁酰-myo-肌醇1，3，4-三磷酸酯(158)-将游离酸157(100mg，85μmol)按如上所述氢化，冻干后得到标题化合物158(47mg，88％)。1H-NMR(D2O，360MHz)：δ0.83(3H，t，J＝7.40Hz，CH3)，0.84(3H，t，J＝7.40Hz，CH3)，0.92(3H，t，J＝7.40Hz，CH3)，1.46-1.56(4H，m，2x β-CH2)，1.61-1.71(2H，m，β-CH2)，2.32(2H，t，J＝7.22Hz，α-CH2)，2.34(2H，t，J＝7.22Hz，α-CH2)，2.47(2H，t，J＝7.22Hz，α-CH2)，4.44-4.55(2H，m，H-1，H-3)，4.61(1H，ddd，J＝9.57，9.39，9.39Hz，H-4)，5.26(1H，dd，J＝9.57，9.57Hz，H-5)，5.35(1H，dd，J＝9.75，9.75Hz，H-6)，5.77(1H，s(br)，H-2)。31P NMR(D2O，1H去偶，145.8 MHZ)：δ-0.94(1P，s)，-0.09(1P，s)，-0.06(1P，s)。MS：m/z(+ve离子FAB)669[(M＋K)+，20]，71[Bt+，100]。MS：m/z (-ve离子FAB)629[(M－H+)-，30]，97[OP(OH)2 -，100]。
2，5，6-三-O-丁酰-myo-肌醇1，3，4-三磷酸六酯(乙酰氧甲基)酯(159)-将DIEA(209μl，1.23mmol)和乙酰氧甲基溴(123μl，1.23mmol)加入到化合物158(39mg，61μmol)的无水乙腈(2ml)悬浮液中。黑暗中将该混合物在室温下搅拌4天之后，减压下蒸除所有的挥发性组分，通过制备HPLC(73％MeOH；40ml/min；tR＝20.25)纯化残留物得到糖浆状的化合物159(44mg，67％)。1H-NMR([D]8甲苯，360MHz)：δ0.83(3H，t，J＝7.28Hz，CH3)，0.92(3H，t，J＝7.28Hz，CH3)，0.97(3H，t，J＝7.48Hz，CH3)，1.50-1.60(2H，m，β-CH2)，1.67-1.76(4H，m，2x β-CH2)，1.79-1.96(18H，6xs，6xOAc)，2.08-2.13(2H，m，α-CH2)，2.33-2.47(2H，m，α-CH2)，2.52-2.61(2H，m，α-CH2)，5.05(1H，ddd，J＝9.64，9.64，2.17Hz，H-3)，5.09(1H，ddd，J＝9.64，9.06，9.06 Hz，H-4)，5.11(1H，ddd，J＝9.84，9.84，2.17Hz，H-1)，5.50-5.83(14H，m，6x CH2OAc，H-5，H-6)，6.21(1H，dd，J＝2.17，2.17Hz，H-2)。31P-NMR(D2O，1H去偶，145.8MHZ)：δ-4.17(1P，s)，-4.05(1P，s)，-3.97(1P，s)。 MS：m/z (+ve离子FAB)[(M＋K)+，20]，71[Bt+，100]。MS：m/z(-ve离子FAB)[(M－H+)-，30]，97[，100]。
虽然本发明是参考以上所提供的实施例进行描述的，但应当理解在不偏离本发明精神的情况下本发明还可以作出各种改动。因此，本发明仅应收到权利要求书的限制。

Claims (157)

1.肌醇多磷酸酯的细胞渗透性拮抗剂，含有myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸酯的烷基或亚烷基衍生物或所述衍生物的模拟物。
2.权利要求1的细胞渗透性拮抗剂，其中所述衍生物是选自1-O-烷基、2-O-烷基和1，2-二-O-烷基衍生物的烷基衍生物。
3.权利要求2的烷基衍生物，其中所述烷基独立地是丁基。
4.权利要求2的烷基衍生物，其中所述衍生物是1，2-二-O-烷基-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
5.权利要求4的烷基衍生物，其中所述烷基独立地是丁基。
6.权利要求5的烷基衍生物，其中所述衍生物是1，2-二-O-丁基-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
7.权利要求2的烷基衍生物，其中所述衍生物是2-O-酰基-1-O-烷基-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
8.权利要求7的烷基衍生物，其中所述酰基是丁酰。
9.权利要求7的烷基衍生物，其中所述烷基独立地是丁基。
10.权利要求9的烷基衍生物，其中所述衍生物是1-O-丁基-2-O-丁酰-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
11.权利要求2的烷基衍生物，其中所述衍生物是2-O-烷基-1-O-酰基-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
12.权利要求11的烷基衍生物，其中所述衍生物是2-O-烷基-1-O-丁酰-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
13.权利要求12的烷基衍生物，其中所述烷基独立地是丁基。
14.权利要求1的细胞渗透性拮抗剂，其中所述衍生物是1，2-二-O-亚烷基衍生物。
15.权利要求14的烷基衍生物，其中所述衍生物是D，L-1，2-二-O-环亚己基-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
16.磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸酯的细胞渗透性拮抗剂，提供的所述拮抗剂不是1，2-二-O-丁酰-myo-肌醇1，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
17.提高细胞氯离子分泌的方法，该方法包括将所述细胞与肌醇多磷酸酯的细胞渗透性拮抗剂接触，其中所述拮抗剂是肌醇多磷酸酯衍生物或其模拟物。
18.权利要求17的方法，其中所述肌醇多磷酸酯是myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸酯。
19.权利要求18的方法，其中所述细胞渗透性拮抗剂是myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸酯的衍生物。
20.权利要求19的方法，其中所述衍生物是选自1-O-烷基、2-O-烷基和1，2-二-O-烷基衍生物的烷基衍生物。
21.权利要求20的方法，其中所述烷基独立地是甲基或丁基。
22.权利要求20的方法，其中所述烷基衍生物是1，2-二-O-烷基-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
23.权利要求22的方法，其中所述烷基独立地是甲基或丁基。
24.权利要求23的方法，其中所述烷基衍生物是1，2-二-O-丁基-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
25.权利要求20的方法，其中所述烷基衍生物是2-O-酰基-1-O-烷基-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
26.权利要求25的方法，其中所述酰基是丁酰基。
27.权利要求25的方法，其中所述烷基独立地是甲基或丁基。
28.权利要求27的方法，其中所述烷基衍生物是2-O-丁酰-1-O-甲基-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
29.权利要求27的方法，其中所述烷基衍生物是1-O-丁基-2-O-丁酰-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
30.权利要求20的方法，其中所述烷基衍生物是2-O-烷基-1-O-酰基-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
31.权利要求30的方法，其中所述烷基衍生物是2-O-烷基-1-O-丁酰-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
32.权利要求31的方法，其中所述烷基独立地是甲基或丁基。
33.权利要求19的方法，其中所述衍生物是1，2-二-O-亚烷基衍生物。
34.权利要求33的方法，其中所述亚烷基衍生物是D，L-1，2-二-O-环亚己基-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
35.权利要求17的方法，其中所述肌醇多磷酸酯是磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸酯。
36.权利要求35的方法，其中所述细胞渗透性拮抗剂是myo-肌醇1，4，5，6-四磷酸酯的衍生物。
37.权利要求36的方法，其中所述衍生物是1，2-二-O-酰基-myo-肌醇1，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
38.权利要求37的方法，其中所述衍生物是1，2-二-O-丁酰-myo-肌醇1，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
39.增加个体中氯离子分泌的方法，该方法包括给所述个体施用肌醇多磷酸酯的细胞渗透性拮抗剂，其中所述拮抗剂是肌醇多磷酸酯衍生物或其模拟物。
40.权利要求39的方法，其中所述肌醇多磷酸酯是myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸酯。
41.权利要求40的方法，其中所述细胞渗透性拮抗剂是myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸酯的衍生物。
42.权利要求41的方法，其中所述衍生物选自1-O-烷基、2-O-烷基和1，2-二-O-烷基衍生物的烷基衍生物。
43.权利要求42的方法，其中所述烷基独立地是甲基或丁基。
44.权利要求42的方法，其中所述烷基衍生物是1，2-二-O-烷基-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
45.权利要求44的方法，其中所述烷基独立地是甲基或丁基。
46.权利要求45的方法，其中所述烷基衍生物是1，2-二-O-丁基-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
47.权利要求42的方法，其中所述烷基衍生物是2-O-酰基-1-O-烷基-myo-肌醇(3，4，5，6)四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
48.权利要求47的方法，其中所述酰基是丁酰基。
49.权利要求47的方法，其中所述烷基独立地是甲基或丁基。
50.权利要求49的方法，其中所述烷基衍生物是2-O-丁酰-1-O-甲基-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
51.权利要求49的方法，其中所述烷基衍生物是1-O-丁基-2-O-丁酰-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
52.权利要求42的方法，其中所述烷基衍生物是2-O-烷基-1-O-酰基-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
53.权利要求52的方法，其中所述烷基衍生物是2-O-烷基-1-O-丁酰-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
54.权利要求53的方法，其中所述烷基独立地是甲基或丁基。
55.权利要求41的方法，其中所述衍生物是1，2-二-O-亚烷基衍生物。
56.权利要求55的方法，其中所述亚烷基衍生物是D，L-1，2-二-O-环亚己基-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
57.权利要求39的方法，其中所述肌醇多磷酸酯是磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸酯。
58.权利要求57的方法，其中所述细胞渗透性拮抗剂是myo-肌醇1，4，5，6-四磷酸酯的衍生物。
59.权利要求58的方法，其中所述的衍生物是1，2-二-O-酰基-myo-肌醇1，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
60.权利要求59的方法，其中所述衍生物是1，2-二-O-丁酰-myo-肌醇1，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
61.缓解个体中与囊性纤维性变有关的体征或症状的方法，该方法包括给所述个体施用肌醇多磷酸酯细胞渗透性拮抗剂，其中所述拮抗剂是肌醇多磷酸酯衍生物或其模拟物。
62.权利要求61的方法，其中所述体征或症状是肺功能不全。
63.权利要求61的方法，其中所述施用是经吸入给药。
64.权利要求61的方法，其中所述体征或症状选自肠功能不全和胰腺功能不全。
65.权利要求61的方法，其中所述肌醇多磷酸酯是myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸酯。
66.权利要求65的方法，其中所述细胞渗透性拮抗剂是myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸酯的衍生物。
67.权利要求66的方法，其中所述衍生物是选自1-O-烷基、2-O-烷基和1，2-二-O-烷基衍生物的烷基衍生物。
68.权利要求67的方法，其中所述烷基独立地是甲基或丁基。
69.权利要求67的方法，其中所述烷基衍生物是1，2-二-O-烷基-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
70.权利要求69的方法，其中所述烷基独立地是甲基或丁基。
71.权利要求70的方法，其中所述烷基衍生物是1，2-二-O-丁基-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
72.权利要求67的方法，其中所述烷基衍生物是2-O-酰基-1-O-烷基-myo-肌醇(3，4，5，6)四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
73.权利要求72的方法，其中所述酰基是丁酰基。
74.权利要求72的方法，其中所述烷基独立地是甲基或丁基。
75.权利要求74的方法，其中所述烷基衍生物是2-O-丁酰-1-O-甲基-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
76.权利要求74的方法，其中所述烷基衍生物是1-O-丁基-2-O-丁酰-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
77.权利要求67的方法，其中所述烷基衍生物是2-O-烷基-1-O-酰基-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
78.权利要求77的方法，其中所述烷基衍生物是2-O-烷基-1-O-丁酰-myo-肌醇(3，4，5，6)四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
79.权利要求78的方法，其中所述烷基独立地是甲基或丁基。
80.权利要求66的方法，其中所述衍生物是1，2-二-O-亚烷基衍生物。
81.权利要求80的方法，其中所述亚烷基衍生物是D，L-1，2-二-环亚己基-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
82.权利要求61的方法，其中所述肌醇多磷酸酯是磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸酯。
83.权利要求82的方法，其中所述细胞渗透性拮抗剂是myo-1，4，5，6-四磷酸酯的衍生物。
84.权利要求83的方法，其中所述衍生物是1，2-二-O-酰基-myo-肌醇1，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
85.权利要求84的方法，其中所述衍生物是1，2-二-O-丁酰-myo-肌醇1，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
86.肌醇多磷酸酯的细胞渗透性激动剂，含有肌醇多磷酸酯衍生物或其模拟物。
87.权利要求86的细胞渗透性激动剂，其中所述肌醇多磷酸酯是myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸酯。
88.权利要求87的细胞渗透性激动剂，其中所述细胞渗透性激动剂是myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸酯。
89.权利要求88的衍生物，其中所述衍生物是D，L-1-O-丁酰-2-O-脱氧-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
90.权利要求87的细胞渗透性激动剂，其中所述细胞渗透性激动剂是myo-肌醇1，3，4-三磷酸酯。
91.权利要求90的衍生物，其中所述衍生物是D，L-2，5，6-三-O-酰基-myo-肌醇1，3，4-三磷酸六(乙酰氧甲基)酯。
92.权利要求91的衍生物，其中所述衍生物是D，L-2，5，6-三-O-丁酰-myo-肌醇1，3，4-三磷酸六(乙酰氧甲基)酯。
93.权利要求86的细胞渗透性激动剂，其中所述肌醇多磷酸酯是磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸酯。
94.权利要求93的细胞渗透性激动剂，其中所述细胞渗透性激动剂是磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸酯的衍生物。
95.权利要求94的衍生物，其中所述衍生物是二-棕榈酰-D，L-O-酰基-磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸七(乙酰氧甲基)酯。
96.权利要求95的衍生物，其中所述衍生物是sn-二-O-棕榈酰-D，L-6-O-丁酰-磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸七(乙酰氧甲基)酯。
97.权利要求94的衍生物，其中所述衍生物是sn-二-O-辛酰-D，L-6-O-丁酰-磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸七(乙酰氧甲基)酯。
98.用于减少细胞的氯离子分泌的方法，该方法包括将所述细胞与权利要求86的细胞渗透性激动剂接触。
99.权利要求98的方法，其中所述肌醇多磷酸酯是myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸酯。
100.权利要求99的方法，其中所述细胞渗透性激动剂是myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸酯的衍生物。
101.权利要求100的方法，其中所述衍生物是1，2-二-O-酰基-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
102.权利要求101的方法，其中所述衍生物是1，2-二-O-丁酰-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
103.权利要求101的方法，其中所述衍生物是1，2-二-O-丁酰-scyllo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
104.权利要求100的方法，其中所述衍生物是D，L-1-O-丁酰-2-O-脱氧-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
105.权利要求99的方法，其中所述细胞渗透性激动剂是myo-肌醇1，3，4-三磷酸酯。
106.权利要求105的方法，其中所述衍生物是D，L-2，5，6-三-O-酰基-myo-肌醇1，3，4-三磷酸六(乙酰氧甲基)酯。
107.权利要求106的方法，其中所述所述衍生物是D，L-2，5，6-三-O-丁酰-myo-肌醇1，3，4-三磷酸六(乙酰氧甲基)酯。
108.权利要求98的方法，其中所述肌醇多磷酸酯是磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸酯。
109.权利要求108的方法，其中所述细胞渗透性激动剂是磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸酯的衍生物。
110.权利要求109的方法，其中所述衍生物是二-棕榈酰-D，L-O-酰基-磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸七(乙酰氧甲基)酯。
111.权利要求110的方法，其中所述衍生物是sn-二-O-棕榈酰-D，L-6-O-丁酰-磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸七(乙酰氧甲基)酯。
112.权利要求109的方法，其中所述衍生物是sn-二-O-辛酰-D，L-6-O-丁酰-磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸七(乙酰氧甲基)酯。
113.减少个体中氯离子分泌的方法，该方法包括给所述个体施用权利要求86的细胞渗透性激动剂。
114.权利要求113的方法，其中所述肌醇多磷酸酯是myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸酯。
115.权利要求114的方法，其中所述细胞渗透性激动剂是myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸酯的衍生物。
116.权利要求115的方法，其中所述衍生物是1，2-二-O-酰基-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
117.权利要求116的方法，其中所述衍生物是1，2-二-O-丁酰-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
118.权利要求116的方法，其中所述衍生物是1，2-二-O-丁酰-scyllo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
119.权利要求115的方法，其中所述衍生物是D，L-1-O-丁酰-2-O-脱氧-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
120.权利要求114的方法，其中所述细胞渗透性激动剂是myo-肌醇1，3，4-三磷酸酯的衍生物。
121.权利要求120的方法，其中所述衍生物是D，L-2，5，6-三-O-酰基-myo-肌醇1，3，4-三磷酸六(乙酰氧甲基)酯。
122.权利要求121的方法，其中所述所述衍生物是D，L-2，5，6-三-O-丁酰-myo-肌醇1，3，4-三磷酸六(乙酰氧甲基)酯。
123.权利要求113的方法，其中所述肌醇多磷酸酯是磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸酯。
124.权利要求123的方法，其中所述细胞渗透性激动剂是磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸酯的衍生物。
125.权利要求124的方法，其中所述衍生物是二-棕榈酰-D，L-O-酰基-磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸七(乙酰氧甲基)酯。
126.权利要求125的方法，其中所述衍生物是sn-二-O-棕榈酰-D，L-6-O-丁酰-磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸七(乙酰氧甲基)酯。
127.权利要求124的方法，其中所述衍生物是sn-二-O-辛酰-D，L-6-O-丁酰-磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸七(乙酰氧甲基)酯。
128.缓解个体中与分泌性腹泻有关的体征或症状的方法，该方法包括给所述个体施用权利要求86的细胞渗透性激动剂。
129.权利要求128的方法，其中所述肌醇多磷酸酯是myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸酯。
130.权利要求129的方法，其中所述细胞渗透性激动剂是myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸酯的衍生物。
131.权利要求130的方法，其中所述衍生物是1，2-二-O-酰基-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
132.权利要求131的方法，其中所述衍生物是1，2-二-O-丁酰-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
133.权利要求131的方法，其中所述衍生物是1，2-二-O-丁酰scyllo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
134.权利要求130的方法，其中所述衍生物是D，L-1-O-丁酰-2-O-脱氧-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
135.权利要求129的方法，其中所述激动剂是myo-肌醇1，3，4-三磷酸酯的衍生物。
136.权利要求135的方法，其中所述衍生物是D，L-2，5，6-三-O-酰基-myo-肌醇1，3，4-三磷酸六(乙酰氧甲基)酯。
137.权利要求136的方法，其中所述所述衍生物是D，L-2，5，6-三-O-丁酰-myo-肌醇1，3，4-三磷酸六(乙酰氧甲基)酯。
138.权利要求128的方法，其中所述肌醇多磷酸酯是磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸酯。
139.权利要求138的方法，其中所述细胞渗透性激动剂是磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸酯的衍生物。
140.权利要求139的方法，其中所述衍生物是二-棕榈酰-D，L-O-酰基-磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸七(乙酰氧甲基)酯。
141.权利要求140的方法，其中所述衍生物是sn-二-O-棕榈酰-D，L-6-O-丁酰-磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸七(乙酰氧甲基)酯。
142.权利要求139的方法，其中所述衍生物是sn-二-O-辛酰-D，L-6-O-丁酰-磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸七(乙酰氧甲基)酯。
143.缓解个体中与脑肿胀有关的体征或症状的方法，该方法包括给所述个体施用权利要求86的细胞渗透性激动剂。
144.权利要求143的方法，其中所述肌醇多磷酸酯是myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸酯。
145.权利要求144的方法，其中所述细胞渗透性激动剂是myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸酯的衍生物。
146.权利要求145的方法，其中所述衍生物是1，2-二-O-酰基-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
147.权利要求146的方法，其中所述衍生物是1，2-二-O-丁酰-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
148.权利要求146的方法，其中所述衍生物是1，2-二-O-丁酰-scyllo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
149.权利要求145的方法，其中所述衍生物是D，L-1-O-丁酰-2-O-脱氧-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
150.权利要求144的方法，其中所述细胞渗透性激动剂是myo-肌醇1，3，4-三磷酸酯的衍生物。
151.权利要求150的方法，其中所述衍生物是D，L-2，5，6-三-O-酰基-myo-肌醇1，3，4-三磷酸六(乙酰氧甲基)酯。
152.权利要求151的方法，其中所述所述衍生物是D，L-2，5，6-三-O-丁酰-myo-肌醇1，3，4-三磷酸六(乙酰氧甲基)酯。
153.权利要求143的方法，其中所述肌醇多磷酸酯是磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸酯。
154.权利要求153的方法，其中所述激动剂是磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸酯的衍生物。
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