CN1228345C - 不溶性丝素蛋白薄膜及丝素蛋白管的制备 - Google Patents
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Abstract
一种制备不溶性丝素薄膜及管材的新方法，涉及生物高分子材料。选用氯化钙/水/乙醇三元溶液溶解丝素蛋白，经透析制备出20-100mg/ml的丝素蛋白水溶液。将水溶液在低于90℃轻微搅拌下浓缩至100-500mg/ml，此溶液在20-200℃下铺展在聚苯乙烯板上成膜或通过挤出，吹塑，浇铸成型的方法制备丝素管。此方法操作简单，条件温和，薄膜或丝素管湿态机械性能优良，可在水中长期稳定存在，无需化学后处理。所制备膜片或丝素管可直接应用于组织工程，生物材料，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明为制备具有优良生物相容性并可在水中稳定存在的丝素蛋白材料的新方法，涉及生物材料。
背景技术
丝素蛋白作为天然生物蛋白，具有优异的生物相容性和良好的机械及物理性能，近年来受到生物材料界越来越多的关注和研究。其优异的性能使丝素材料可以广泛地应用在人造韧带，人造骨，人造血管等生物材料，并可作为良好的药物缓释材料，酶固化材料。在组织工程中，其优异的促细胞生长性和低炎症反应性也使其具有广泛的应用前景。由于丝素蛋白在自然界以一维丝状态存在，但在实际应用中，则需要制备成二维薄膜或三维管材形态，所以需要对丝素进行溶解再生以制备符合使用要求的材料。
丝素蛋白经除胶溶解后，成为可溶于水的材料，纯丝素蛋白制备成薄膜或其它形态后，呈脆性，其力学性能比较差，同时由于它溶解于水中，在生物体中可能会造成流失，因此很难作为不降解的材料应用。为了利用其良好的生物相容性，人们一直在研究改善其力学性能，现在主要改善力学性能的方法是在丝素蛋白中添加其它高分子材料，诱导丝素蛋白结构的变化，改善其力学性能，包括其水溶性的改善。但是由于添加了一些其它的高分子后，其生物相容性方面则很难得到保证。另一个改善力学性能的方法是将它保持在湿态，如浸泡在甲醇等有机溶剂中，则其溶解性及力学性能可以改善，这样的方法又带来一个有机溶剂特别是甲醇等对人体的危害的问题。到目前为止，不添加有害性的甲醇类有机溶剂浸泡的纯丝素蛋白制备的具有良好力学性能的不溶性丝素蛋白材料没有任何报导，更没见到任何关于制备丝素蛋白管材的报导。
本发明为解决上述问题采用简单的方法，不添加任何其它类型的外加高分子，就可以得到力学性能优异、不溶于水的丝素蛋白材料，且不用甲醇等溶剂浸泡。用这种方法还可制备出纯丝素蛋白管状材料。
常用的丝素蛋白一般以两种结晶状态存在，其中α-螺旋为易溶于水的，而β-折叠为不溶于水的结晶态。自然状态下丝素蛋白以β-折叠存在，不溶于水或其它一般的溶剂，可以溶解在CaCl2/水/乙醇(摩尔比1∶8∶2)三元溶液或其它浓盐溶液中，但是丝素溶解后会破坏丝素蛋白原有的β-折叠结构，并且在干燥成膜后主要以α-螺旋存在，从而易溶于水中，这极大的限制了该材料在生物领域中的使用。对于丝素蛋白再生膜的制备以及不同因素对于材料结晶的影响近年来获得较大进展，其中促进丝素蛋白从α-螺旋向β-折叠晶型转变而制备不溶于水的薄膜的方法主要是通过甲醇处理使丝素蛋白晶型转变。这种甲醇处理的方法虽然比较有效，简单易行，但是甲醇作为毒性较大的化学试剂，如果残余，将对材料的生物学使用产生极大的负面影响。
直接从丝素水溶液中干燥获得不溶于水的薄膜及其它形式的材料如管状材料是比较理想的制备方法，制备条件温和，质量均匀，反应条件易控制，重复性好，适合工业大规模生产并且没有其它化学试剂的负面影响。虽然有研究表明温度在40℃以上会促进丝素溶液在干燥过程中向β晶型转变，但一直没有文献和研究报道可以直接从水溶液中获得不溶于水的丝素薄膜。
发明内容
本发明的目的是为克服上述丝素蛋白的缺点而发明一种制备具有优良生物相容性并可在水中稳定存在的丝素蛋白材料的新方法。通过在低于90℃下轻微搅拌浓缩丝素溶液，获得100～500mg/ml透明的高浓度丝素蛋白水溶液，并在20～200℃温度下干燥，将高浓度的透明丝素蛋白水溶液倾倒在聚苯乙烯板或玻璃板上，在干燥箱中20～200℃下挥发干燥成不溶于水的丝素薄膜。
将高浓度的透明丝素水溶液浇铸在不同直径的聚苯乙烯棒或玻璃管上，在干燥箱中20～200℃下，控制干燥速度，缓慢挥发干燥成丝素蛋白管状材料。
将高浓度的透明丝素水溶液在20～200℃干燥至半凝固状态经机械挤出或吹塑成管状，制成具有优异机械性能的不同直径的不溶于水的丝素蛋白管材。
利用丝素蛋白在一定温度和高浓度下的自发晶型转变获得不溶于水的丝素薄膜或在进一步浓缩的条件下，直接通过挤出，吹塑，浇铸的方法制成管状结构。反应条件温和，成膜均匀，易于控制，不破坏丝素蛋白的一级结构，此方法利于薄膜及管材的大规模制备，并可以保持丝素蛋白良好的机械和生物性能。
本发明的具体实现是：将蚕丝在0.5％的Na2CO3溶液中100℃煮60min，以去除蚕丝外部的丝胶蛋白并将煮过的丝素蛋白用蒸馏水多次洗涤后干燥，获得纯的丝素蛋白。将一定量的丝素蛋白溶于CaCl2/水/乙醇(摩尔比1∶8∶2)三元溶液或其它浓盐溶液中，并用透析带透析三天，去除溶液中的氯化钙和乙醇，从而得到纯净的丝素蛋白水溶液。将此溶液在磁力加热搅拌器轻微搅拌的情况下，在低于90℃的范围中对此溶液进行浓缩，获得浓度为100～500mg/ml的透明丝素浓溶液，搅拌目的是防止丝素溶液在浓缩过程中凝固。将此高浓度的透明的丝素水溶液倾倒在聚苯乙烯或玻璃板上，在温度为20～200℃的干燥箱中常压干燥，控制干燥速度，制得透明的不溶于水的丝素蛋白薄膜。还可以将溶液铺展在聚苯乙烯或玻璃板上后，通过将其部分覆盖，控制溶液的挥发速度，制备出透明的丝素蛋白薄膜。
此透明溶液经浇铸、挤出及吹塑可以得到力学性能优异的不溶于水的丝素蛋白管材。
本发明首次通过水溶液挥发的方法直接制得不溶于水的丝素蛋白薄膜或丝素蛋白管，使丝素蛋白薄膜或管材的制备大大简化。
本发明直接从丝素蛋白水溶液中制备不溶于水的薄膜或管材，条件温和，关键技术在于：1.轻微搅拌防止浓缩时凝固，2.浓缩后的浓度，3.浓缩温度，4.干燥温度，5.干燥速率。
对于不溶性丝素蛋白薄膜的制备，从蚕丝中丝素蛋白主要是β-折叠而不溶于水，而蚕吐丝前丝素蛋白是高浓度的丝素水溶液考虑，在溶液干燥前，先进行浓缩。为防止在浓缩过程中，丝素蛋白相互缠结而凝固，用搅拌器进行轻微的搅拌。这样可以获得高浓度的透明丝素蛋白溶液。对于浓缩温度的选取，考虑在蚕体内溶液浓缩时的实际温度和部分文献指出在40℃以上在丝素蛋白溶液中α-螺旋会向β-折叠转变，将浓缩温度设定在低于90℃。考虑到蚕吐丝前丝素蛋白溶液的浓度，一般将丝素溶液浓缩至100mg/ml以上，然后在合适的温度下进行干燥成膜或用挤出，吹塑或浇铸的方法制备成管材。在溶液干燥过程中可以通过控制挥发速度来延长干燥时间，从而进一步改善成膜性能。
制备出的丝素薄膜或管材用红外光谱，红外表面全反射，X射线衍射，及在水中丝素蛋白薄膜24小时的流失率来测定薄膜的结构和在水中的溶解性。结果表明，在浓度大于100mg/ml，干燥温度20～200℃时可以获得几乎完全不溶于水的薄膜，结构测试表明主要的结晶态为β-折叠。对材料机械性能测定发现其最大拉伸强度不小于10MP，最大拉伸率不小于30％，机械性能优良。
本发明的优点有：溶液浓缩和干燥都在常压和200℃以下，反应条件极其温和，不破坏丝素蛋白的一级结构，而且制备条件极其简单，易于控制，重复性好，容易获得质量均匀的薄膜或管材。成型后不需要经过进一步的化学试剂处理，没有对生物有毒的溶剂存在，安全性高。所需设备简单，可以大规模的生产。因此，本发明对于丝素蛋白在生物材料领域中的进一步广泛应用具有重大意义和实际使用价值。
实施例
实施例1：
将蚕丝在0.5％的Na2CO3溶液中100℃煮60min，以去除蚕丝外部的丝胶蛋白并将煮过的丝素蛋白用蒸馏水仔细洗涤后干燥，获得纯的丝素蛋白。将1克的丝素蛋白溶于10毫升CaCl2/水/乙醇(摩尔比1∶8∶2)三元溶液中，并将此丝素溶液在透析带中透析三天，去除溶液中的氯化钙和乙醇，从而得到纯净的丝素蛋白水溶液。将溶液倒入烧杯，在低于90℃水浴加热情况下，用磁力加热搅拌器轻微搅拌，挥发浓缩。将溶液浓缩至150-300mg/ml，为透明溶液。随后将此浓溶液在聚苯乙烯板上铺展，在干燥箱中50-200℃下干燥成膜，其厚度可以通过溶液质量控制。所成薄膜均匀透明。
实施例2：
制备纯的丝素蛋白水溶液如实施例1所示。
将纯丝素蛋白水溶液放置在烧杯中，在低于90℃水浴加热情况下，用磁力加热搅拌器轻微搅拌，挥发浓缩。获得溶液浓度为200-350mg/ml的透明溶液，将此浓溶液在聚苯乙烯板上均匀铺展，在干燥箱中50℃下常压挥发干燥成膜。
实施例3：
制备纯的丝素蛋白水溶液如实施例1所示。
将纯丝素蛋白水溶液放置在烧杯中，在低于90℃水浴加热情况下，用磁力加热搅拌器轻微搅拌，挥发浓缩。获得溶液浓度为200-350mg/ml的透明溶液，将此浓溶液在静止状态下，在干燥箱中50-200℃下常压挥发干燥成半凝固状态，然后用机械挤出的方法制备出丝素蛋白管。
实施例4：
制备纯的丝素蛋白水溶液如实施例1所示。
将纯丝素蛋白水溶液放置在烧杯中，在低于90℃水浴加热情况下，用磁力加热搅拌器轻微搅拌，挥发浓缩。获得溶液浓度为200-350mg/ml的透明溶液，将此浓溶液在干燥箱中50-200℃下干燥成半凝固状态，然后用吹塑的方法制备出丝素蛋白管。
实施例5：
制备纯的丝素蛋白水溶液如实施例1所示。将纯丝素蛋白水溶液放置在烧杯中在低于90℃水浴加热情况下，用磁力加热搅拌器轻微搅拌，挥发浓缩。获得溶液浓度为200～350mg/ml的透明溶液，将此溶液浇铸在套管中，在20～200℃下干燥，制备出丝素蛋白管。
Claims (4)
1.一种不溶性稳定丝素薄膜或管材的制备方法，其特征在于：将丝素蛋白水溶液轻微搅拌，使之低于90℃浓缩至100-500mg/ml的高浓度的透明丝素蛋白水溶液，在20-200℃下挥发干燥。
2.如权利要求1所述的一种不溶性稳定丝素薄膜或管材的制备方法，其特征在于：将高浓度的丝素水溶液倾倒在聚苯乙烯板或玻璃板上，在干燥箱中20-200℃下挥发干燥成不溶于水的丝素薄膜。
3.如权利要求1所述的一种不溶性稳定丝素薄膜或管材的制备方法，其特征在于：将高浓度的透明丝素水溶液浇铸在不同直径的聚苯乙烯棒或玻璃管上，在干燥箱中20-200℃下，控制干燥速度，缓慢挥发干燥成丝素蛋白管状材料。
4.如权利要求1所述的一种不溶性稳定丝素薄膜或管材的制备方法，其特征在于：将高浓度的透明丝素水溶液在20-200℃干燥至半凝固状态经机械挤出或吹塑成管状，制成具有优异机械性能的不同直径的不溶于水的丝素蛋白管材。
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