CN1225019A

CN1225019A - Ii合成的抑制

Info

Publication number: CN1225019A
Application number: CN97196311A
Authority: CN
Inventors: 罗伯特·E·哈姆费雷斯; 徐民振
Original assignee: Antigen Express Inc
Current assignee: Antigen Express Inc
Priority date: 1996-06-11
Filing date: 1997-06-09
Publication date: 1999-08-04
Anticipated expiration: 2017-06-09
Also published as: CN1260361C; EP0963208B1; EP0963208A1; AU715807B2; ATE439436T1; DE69739534D1; AU3386997A; US5726020A; EP0963208A4; JP2000512500A; CA2257127C; JP4341725B2; WO1997047326A1; CA2257127A1

Abstract

公开了表达逆基因构建物,和寡核苷酸,其特征在于能与Ii mRNA分子杂交,因此抑制Ii mRNA分子的翻译。所涉及的组合物通常作为Ii表达的抑制剂。还公开了含有Ii表达抑制剂的MHC类型Ⅱ－正效抗原呈现细胞。特别重要的一类MHC类型Ⅱ－正效抗原呈现细胞是恶性MHC类型Ⅱ－正效抗原呈现细胞(例如白血病,淋巴瘤和黑素瘤)。还公开了导致与MHC类型Ⅱ蛋白相关的自身决定子肽在MHC类型Ⅱ－正效抗原呈现细胞表面上出现的方法。在该方法中,Ii合成的特定抑制剂被引入MHC类型Ⅱ－正效抗原呈现细胞。特定抑制剂的直接或间接功能是通过与mRNA编码Ii形成双螺旋分子。双螺旋分子的形成功能在翻译水平上抑制Ii合成。还公开了在MHC类型Ⅱ－正效抗原呈现细胞中治疗恶性肿瘤的治疗方法,和从MHC类型Ⅱ－正效抗原呈现细胞分离的自身决定子肽类。

Description

Ii合成的抑制

本发明的技术背景

对特定抗原的免疫应答是通过这些抗原的肽片断的识别被T淋巴细胞调节。在抗原呈现细胞(APC)中，加工抗原的肽片断变为结合在主要组织相容性复合物(MHC)分子的抗原肽结合部位。然后这些肽-MHC复合物被转移到细胞表面而被辅助细胞的或细胞毒性T淋巴细胞上的T细胞受体所识别(外源肽和呈现MHC分子的相邻表面)。

已经鉴定了两类MHC分子。类型ⅠMHC分子从内源性合成蛋白，如感染病毒，在大约类型ⅠMHC分子的合成时候从内质网中得到肽类。MHC类型Ⅰ复合的肽在CD8-正效细胞毒性T淋巴细胞上出现，然后其被活化并且可以直接杀死病毒-表达细胞。然而，MHC类型Ⅱ分子的抗原肽结合部位在合成时被不变体链蛋白[Ii,(Invariant Chain Protein)]阻断。这些MHC类型Ⅱ-Ii蛋白复合物被转移至后-Golgi区室，在那Ii通过蛋白酶解被释放并且特异性抗原肽结合在MHC类型Ⅱ分子上。这些抗原肽通常来自外源性抗原，这些抗原经过非特定胞吞或通过与抗原呈现细胞上的特定细胞表面受体的相互作用被内化。例如，B淋巴细胞上的表面免疫球蛋白识别未损的蛋白抗原。然后抗原被内化，消化并且结合在抗原呈现细胞中的MHC类型Ⅱ分子上。这些抗原肽-MHC类型Ⅱ分子复合物被再表达在抗原呈现细胞表面上并且由CD4-正效辅助细胞T淋巴细胞识别。然后辅助细胞T淋巴细胞经过物理接触帮助细胞毒T淋巴细胞和B淋巴细胞并释放细胞因子。

抗原肽与MHC类型Ⅱ分子的结合以几种方式通过不变体链(其在内质网中的合成时结合MHC类型Ⅱ分子)调节。Ii从后-Golgi区室中的MHC类型Ⅱ分子作为内源性抗原肽结合MHC类型Ⅱ分子的抗原肽结合部位的协同步骤通过蛋白酶解释放[Daibata等人，《分子免疫学》(Molecular Immunology)31:255-260(1994)；Xu等人，《分子免疫学》(Molecular Immunology)31:723-731(1994)]。Ii蛋白防止在细胞质中被衍生及被转移至内质网的内源性抗原肽的出现。这些内源性衍生的抗原肽不能结合MHC类型Ⅱ分子，因为Ii链阻断MHC类型Ⅱ分子的抗原肽结合部位直到它们到达特定后-Golgi区室，在那内源性抗原肽发生结合。Ii的区室蛋白酶解消化/释放发生在与具有抗原肽(得自特定选择的外源性抗原)的MHC类型Ⅱ分子的协同过程中。

在正常情况下，内源性肽(具有强烈导致自身免疫疾病的自身决定子)不能结合MHC类型Ⅱ分子，因为Ii蛋白总是与新生MHC类型Ⅱ分子共合成。因此，通过身体免疫监视系统甚至没有看到与自身决定子肽(在肽通常出现的表面上的抗原呈现细胞中被合成和加工的一种肽)的复合物。因此，就不能开发对这种决定子的耐受性。如果Ii蛋白的表达在某些易于自身免疫疾病的细胞类型中被抑制，这种内源性自身决定子可能变为由MHC类型Ⅱ分子呈现，开始自身免疫应答这些内源性抗原。通过在恶性细胞中的这种工程作用，对内源性肿瘤抗原的这种“自身免疫应答”可在治疗上用于限制生长或消除这些肿瘤细胞。

已经证明了在MHC类型Ⅱ-负效细胞中增加MHC类型Ⅱ表达的治疗效果[Clements等人，《免疫学》(Immunol.),149:2391-2396(1992)；Baskar等人，《(细胞免疫学》(Cell.Immunol.),155:123-133(1 994)；和Baskar等人，《实验药物学杂志》(J.Exp.Med.),181:619-629(1995)]。在这些研究中，MHC类型Ⅱ分子基因至MHC类型Ⅱ-负效鼠肉瘤的转染产生MHC类型Ⅱ-正效、Ii-负效肿瘤细胞系。将这些细胞注射MHC相容宿主中导致亲代肿瘤的生长延缓。Ii蛋白基因至肉瘤细胞系和MHC类型Ⅱ基因的共转染抑制MHC类型Ⅱ基因的肿瘤治疗效果，因为Ii链阻断内源性肿瘤抗原的出现。

本发明的概述

本发明一方面涉及表达逆基因构件，及寡核苷酸，其特征在于它们能与Ii mRNA分子杂交，因此抑制Ii mRNA分子的翻译。所涉及的这些组合物通常被称为Ii表达的抑制剂。通过对Ii的mRNA的作用，这些抑制剂在治疗细胞中降低了Ii蛋白表达多达约90％。降低Ii表达使MHC类型Ⅱ分子与内源性T细胞呈现抗原决定子结合，否则，这种决定子将永远不会被免疫系统看到。

本发明另一方面涉及含有Ii表达抑制剂的MHC类型Ⅱ-正效抗原呈现细胞。一类特别重要的MHC类型Ⅱ-正效抗原呈现细胞是恶性MHC类型Ⅱ-正效抗原呈现细胞(例如白血病，淋巴瘤和黑素瘤)。

本发明还涉及在MHC类型Ⅱ-正效抗原呈现细胞表面上导致与MHC类型Ⅱ蛋白相关的自身决定子肽出现的方法。在这种方法中，Ii合成的特定抑制剂被引入MHC类型Ⅱ-正效抗原呈现细胞。这种特定抑制剂的直接或间接功能是通过mRNA编码Ii的双螺旋分子的形成。双螺旋分子形成的功能是在翻译水平上抑制Ii合成。

本发明其它方面包括在MHC类型Ⅱ-正效抗原呈现细胞和从MHC类型Ⅱ-正效抗原呈现细胞分离的自身决定子肽中治疗恶性肿瘤的治疗方法。

附图简要说明

附图1是在RSV.5-mIi(R)和RSV.5-mIi(ss)的构建物中使用的克隆策略的图解说明。

本发明的详细叙述

本发明以发现Ii表达可以特定和有效地在细胞中被抑制为基础，并且这种抑制可以探索治疗方案。如上所述，MHC类型Ⅱ分子的抗原肽结合部位在MHC类型Ⅱ合成时通过Ii结合被阻断。类型ⅡMHC-Ii复合物被转移至后-Golgi区室，在那Ii通过蛋白酶解被释放并且特定抗原肽(通常得自内化外源性抗原)被结合在MHC类型Ⅱ分子上。因此，Ii蛋白防止在细胞质中被衍生及被转移至内质网的内源性抗原肽的出现。通常，这种内源性衍生的抗原肽不能结合MHC类型Ⅱ分子，因为Ii链阻断MHC类型Ⅱ分子的抗原肽结合部位直到它们被转移至后-Golgi区室。

如上所述，通过抑制Ii表达，现在可以将MHC类型Ⅱ分子与得自内源性合成的蛋白的肽结合。MHC类型Ⅱ分子与得自内源性合成蛋白的肽结合的能力能通过患者自身免疫系统靶向患者中不良细胞(例如恶性细胞)来摧毁这些细胞。

本发明方法和组合物适用一般的哺乳动物系统。编码Ii蛋白的cDNA已经从许多哺乳动物系统分离的mRNA产生并且已经测定了核酸序列[Singer等人，EMBO J.3:873-877(1984)；Strubin, M.等人，EMBO J.3:869-872(1984)；Henkes,W.等人，《核酸研究》(Nucl.Acids Res.)16:11822(1988)]。已经测定编码Ii的哺乳动物基因是高度保守的。例如，已经测定编码鼠和人Ii的cDNA序列约为85％同源性。小鼠和大鼠序列间的保守程度大于90％[Henkes,W.等人，《核酸研究》(Nucl.Acids Res.)16:11822(1988)]。

本发明另一方面涉及表达逆基因构建物。逆基因构建物是表达DNA构建物，其表达产生mRNA分子，这种分子互补编码野生型Ii的mRNA分子。当在Ii产生细胞中共表达时，表达逆基因构建物的mRNA产物可以杂交编码Ii的mRNA，因此形成双螺旋结构。这种双螺旋结构的形成对编码Ii的mRNA的翻译具有抑制作用。这种双螺旋形成的净效果是降低细胞中Ii蛋白水平。细胞中Ii水平的降低使Ⅱ类MHC能与得自内源性合成抗原的抗原肽结合。

逆基因构建物优选用从其中逆基因将被表达的相应细胞类型的生物体的编码Ii的cDNA合成。如上所述，已经出版了编码Ii的人cDNA序列。根据哺乳动物Ii基因之间的高度保守性，对任何实际上有意义的哺乳动物系统的cDNA库都可以用Ii探针(例如人或鼠物种)筛选以分离相应的Ii基因。

对用于构建逆基因构建物的表达载体背景的选择是根据在其中发生的表达是所需要的表达的细胞类型而进行的。可以得到许多适当的载体并且本领域技术人员不需要过分的实验就能从多种可获得的载体中选择出适用的载体。类似地，可以根据需要表达的细胞类型来选择有效表达所需的调节信号。这种调节信号的要求在本领域是已知的并且这种信号的非限制源通常是已知的。

制备逆基因构建物是通过将Ii cDNA片断以相对启动子并与野生型取向比较为逆取向而引入到表达载体中来实现的。根据这样一个事实，即已知mRNA假定为能干扰其杂交互补分子的复合二级结构，全长逆基因构建物(即编码mRNA分子的逆基因构建物，这种分子互补编码Ii的全长mRNA)不总是最有效的设计。为了开发用于Ii抑制的更有效的构建物，经常需要进行常规实验以鉴别小于全长的CDNA片断，并且当引入逆基因构建物时，这种片断在抑制Ii合成中是有效的。

在设计小于全长构建物时，经常需要鉴别编码Ii的mRNA的功能重要区域，并且设计逆基因构建物以便由逆基因构建物编码的mRNA与功能重要区域互补。例如，功能重要区域包括涉及mRNA的核糖体识别区域，翻译起始位点，mRNA剪接点和聚腺苷酸化需要的翻译末端密码子的3’区域。

在真核细胞中，起始核糖体与mRNA接合的机理不同于原核生物的机理。在真核生物中，最靠近5’-端的甲硫氨酸特异性密码子通常是用作翻译起始点的。真核mRNAs的5’末端具有包括在5’-5’焦磷酸酯连接(经常称为5’帽结构)中连接第一个未修饰的核苷酸的甲基化鸟苷酸基的修饰的末端。例如，实验已经证明，缺乏5’-帽结构的mRNA不能有效被翻译。因此，真核生物中翻译起始似乎涉及5’-帽结构的识别及AUG密码子周围的共有序列的定位。接近蛋白编码序列的核糖体识别的共有序列是“5’-ACCAUGG-”。

通过将基因组的DNA序列(其编码初级转录物)与相应的cDNA序列(从加工的转录物产生)比较可以测定在初级转录物中的剪接点的定位。在这种比较中发现的不连续，标记内含子/外显子的边界。这种边界研究已经揭示了在内含子/外显子边界的中等保守的、短共有序列及仅在3’剪接点上游的富含嘧啶区域的趋势。另外，在前两个(GU)和最后两个(AG)内含子位置发现完全保守的核苷酸。

聚腺苷酸化需要多聚A信号，AAUAAA，以及自多聚A附加部位往下游的约30个核苷酸。聚腺苷酸化稳定mRNA，因此延长细胞中的半衰期。

在下面实施例部分所述的实验中，设计和试验了用于抑制鼠细胞中Ii表达的逆基因构建物。鼠Ii蛋白由215个氨基酸残基组成[[Singer等人，EMBO J.3:873-877(1984)]。因此，编码该分子的全长cDNA包括645个碱基对的编码序列。

在以下实施例中，一个全长逆基因构建物，及小于全长的一个逆基因构建物被设计和试验。更具体地，RSV.5-mIi(R)逆基因构建物含有得自鼠含mIi cDNA质粒pcEXV-mIi31的EcoR1片断[Miller和Germain，《实验药物学杂志》(J.Experi.Med.),164:1478-1489(1986)]。该构建物含有逆取向的全鼠Ii cDNA编码序列。当在鼠A20细胞中表达时[Kim等人，《免疫学杂志》(J.Immunol.),122:549-554(1979)]，在进行的两个试验中测定了全长逆基因构建物RSV.5-mIi(R)对Ii表达的抑制为39.5％和71.9％。

小于全长的构建物RSV.5-mIi(SS)的产生是，通过Sal1和Sac1消化RSV.5-mIi(R)以产生含有47个上游5’未翻译序列的核苷酸和前97个Ii编码序列的核苷酸的IicDNA片断。当在鼠A20细胞中表达时，在进行的两个试验中测定了小于全长逆基因构建物RSV.5-mIi(SS)对Ii表达的抑制为89.3％和95.3％。

如上所述，用抑制翻译的逆基因构建物抑制内源性蛋白表达的有效性在很大程度上依赖于mRNA编码内源性蛋白的二级结构。这里所述实验说明，Ii蛋白特别易于发生通过逆基因构建物的抑制表达。该结果基于的事实是，甚至全长逆基因构建物也显示出抑制Ii表达的显著能力。而且，甚至逆基因构建物的截短变体也产生更高的抑制。该实验工作以及已知哺乳动物Ii基因间的高度保守性，可以认为是对逆基因构建物活性在其它哺乳动物系统，包括人系统的有效性的预测。

除了逆基因构建物外，可以使用在或接近Ii mRNA的功能重要区域特异性杂交的寡核苷酸以在翻译水平抑制Ii表达[参见，例如，Helene和Toulme,Biochimica et Biophsica Acta 1049:99-125,(1990)；和Eguchi,Annu.Rev.Biochem.60:631-652,(1991)]。IimRNA的各种功能重要区域可以这种方式被靶向。

例如，可以使用对翻译起始位点和/或与核糖体识别有关的重要上游区域为互补的寡核苷酸来抑制翻译。类似地，可以使用对剪接和腺苷酸化有关的重要特定序列为互补的寡核苷酸在翻译水平抑制Ii表达。

如以下实施例部分所述，将A20细胞在96孔微盘(每孔105个细胞)中在含有公开在SEQ ID NOS:1-3中的寡核苷酸的混合物存在下培养。在混合物中每种寡核苷酸浓度为90μM时，测定Ii表达被抑制约66％。在SEQ ID NO:1中特定的寡核苷酸互补于被认为是与翻译起始相关重要的Ii mRNA的区域。在SEQID NO:2中特定的寡核苷酸互补于被认为是与内含子剪接相关重要的Ii mRNA的区域。最后，在SEQ ID NO:3中特定的寡核苷酸互补与被认为是与聚腺苷酸化相关重要的Ii mRNA的区域。

如上所述，抗原肽与MHC类型Ⅱ分子的结合以几种方式通过不变体链被调节，不变体链在MHC类型Ⅱ分子于内质网中合成时结合MHC类型Ⅱ分子。在从后-Golgi区室中的MHC类型Ⅱ分子对Ii的释放，是作为外源性抗原肽插入在MHC类型Ⅱ分子的抗原肽结合部位中的协同步骤的蛋白酶解的结果。Ii蛋白防止在细胞质中被衍生并且被转移到内质网的内源性抗原肽的出现。这些内源性衍生的抗原肽不能结合MHC类型Ⅱ分子，因为，Ii链阻断MHC类型Ⅱ分子的结合部位直到它们到达特定后-Golgi区室，并在那里发生外源性抗原肽结合。在该区室，蛋白酶解消化/Ii释放是以与将特定选择的外源性抗原的抗原肽插入MHC类型Ⅱ分子的过程为协同过程的方式发生的[Daibata等人，《分子免疫学》(Molecular Immunology)31:255-260(1994)；和Xu等人，《分子免疫学》(Molecular Immunology)31:723-731(1994)]。

通过抑制感兴趣细胞中的Ii表达，内源性自身决定子可以结合MHC类型Ⅱ分子并且通过MHC类型Ⅱ分子出现在细胞表面。这种情况导致刺激对内源性自身决定子肽的免疫应答。在恶性细胞中产生这种效果导致对内源性肿瘤抗原的“自身免疫应答”。这种应答在治疗上对于限制生长或消除肿瘤细胞是有用的。

这种治疗方法与其它用反义构建物治疗疾病的方法比较的重要价值在于临时和偶尔使用公开的组合物导致免疫系统中灌注肿瘤特异性或肿瘤相关性的决定子。灌注后，没有附加的反义治疗的情况下，免疫系统能抵制肿瘤。相反，在多数目前用于控制疾病(例如病毒疾病如HIV)使用的反义治疗中，在中断反义治疗后，病毒会复发。如上所述，在体内或体外使用反义药物可以用于实现对抗肿瘤的免疫应答的灌注。

在下述实验中，使用含或不含上述类型的逆基因构建物的恶性MHC类型Ⅱ-正效抗原呈现鼠A20细胞接种小鼠。下表2显示用A20细胞接种的小鼠存活百分数。这些实验证明接种带有逆基因构建物RSV.5-mIi(ss)的A20细胞的鼠与接种没有携带外源性质粒的A20细胞或仅携带RSV.5载体(给予潮霉素抗性)但没有Ii插入的A20细胞的鼠比较，显示了更高的存活率。

因此，本发明另一方面涉及含有Ii合成抑制剂的MHC类型Ⅱ正效细胞。例如，这种细胞用于选择性治疗患有恶性肿瘤(例如白血病，淋巴瘤和黑素瘤)的患者的治疗方案中。恶性MHC类型Ⅱ-正效抗原呈现细胞从患者中被分离。这些方法遵循免疫治疗中的一般方法[Clements等人，《免疫学》(Immunol.),149:2391-2396(1992)；Basker等人，《细胞免疫学》(Cell.Immunol.),155:123-133(1994)；Basker等人，《实验药物学杂志》(J.Exp.Med.),181:619-629(1995)；Hersey，《药物》(Drugs),47:373(1994)和Pardoll,《当代免疫学》(Immunol.Today),14:310(1993)]。Ii表达抑制剂被引入细胞并且培养细胞。如上所述，这种抑制剂包括逆基因构建物和反义寡核苷酸。由于Ii被抑制，内源性产生的抗原(包括恶性特异性抗原)在培养的细胞表面上呈现。然后将培养的细胞再灌注至患有恶性肿瘤的患者。再灌注前，优选阻断细胞增生(例如用放射治疗)。这种再灌注细胞刺激患者自身免疫系统产生直接针对恶性细胞的响应。通过使用这种策略，刺激患者免疫系统产生直接特异性针对恶性细胞的自身免疫响应。

除了使用从要治疗的患者中分离的恶性细胞外，Ii合成抑制剂也可以被引入建立的恶性细胞培养物，或新鲜恶性组织的外植体中。在该方法中处理的细胞还可以用于上述类型的相关治疗中。

另一方面，Ii抑制产物的鉴定，其用于修饰Ii蛋白表达方法的具体要求将导致用于控制自身免疫疾病的新治疗和诊断方法。一个具体的实例是使用本发明产物和方法鉴定相关自身免疫疾病的自身决定子。MHC类型Ⅱ-正效细胞的Ii-反义治疗导致结合了扩大的所有成分和/或增加量的自身决定子结合到MHC类型Ⅱ分子上。从其中Ii表达已经被例如用上述组合物抑制的细胞而来的免疫纯化的MHC类型Ⅱ分子中，可以洗脱那些呈现T细胞、疾病诱发的肽。这些自身决定子(其中一些是肿瘤特异性决定子)的发现是在开发疾病特异性的自身免疫治疗中的第一步。一旦得到了这种自身决定子肽类，那么，开发新治疗方法就仅仅是常规实验了。

本发明另一方面涉及提高可以导致消除患者中不良细胞的内源性抗原的出现。本发明这方面可以应用到消除以存在非天然细胞内蛋白(其是抗原上可区别于天然细胞内蛋白)为特征的任何细胞。如上所述，恶性细胞包括在这类细胞中，因为它们含有，例如抗原上可区别于其天然细胞相应物的致癌基因产物。除了上述恶性细胞外，可以通过抑制Ii表达消除其它非恶性细胞(例如病毒感染细胞)。在该方案中，在体外治疗中可以使用Ii合成抑制剂。或者，将适于患者组织特异性表达的表达载体用于将逆基因构建物引入到细胞或患者中。组织特异性调节信号可以提供用于这种治疗方法中的精细表达需要。

例如，用Ii反义构建物治疗的病毒感染细胞可以提高导致破坏这些感染细胞和/或增加调节免疫球蛋白介导响应病毒感染的辅助T淋巴细胞的病毒决定子的MHC类型Ⅱ的出现。为此，仅部分病毒感染的细胞需要用Ii反义构建体外治疗及再灌注患者。对于EB病毒感染的正常B细胞，且已经证明其中Ii被大大过度表达以部分抑制抗-EBV免疫应答，这种治疗对于提高抗-EBV免疫应答是有效的。同样，对于HIV-感染的CD4+T淋巴细胞(可在活化后表达MHC类型Ⅱ抗原)，用抗-Ii构建物治疗这些细胞可以提高抗-HIV免疫应答。

本发明还可用于治疗病原自身免疫疾病中。更具体地，在自身免疫疾病循环的某些阶段提高内源性抗原的出现的刺激，是为了降低调节病原性自身免疫应答。例如，已经证明，在某些动物关节炎模型(例如大鼠佐剂关节炎)中，当疾病侵入发展阶段开始后，抑制因子T淋巴细胞(直接对抗开始病原过程的相同抗原决定子)将抑制这些免疫应答。在疾病过程的降低调节的第二阶段期间(临床称为缓解指示)，与Ii-反义构建物接触的细胞中的内源性自身抗原出现的提高将减缓疾病。而且，Ii反义构建物治疗缺乏共同刺激信号的细胞(例如，没有B7的细胞，或其中用B7反义构建物治疗抑制了B7的表达的细胞)将导致无反应性的响应。

实际中，首先用标准技术从患者中分离细胞种群(例如淋巴细胞)。然后，将细胞种群如上所述用Ii合成抑制剂体外处理。然后监视患者缓解信号。当观察到症状缓解(由预先确定的临床信号和症状决定)后，用Ii合成抑制剂处理的细胞再灌注患者。

在本发明的另一方面，在控制组织特异性启动子的情况下，可将通过Ii基因的基因插入使Ii蛋白表达增加应用到抑制包括这些组织的自身免疫疾病中。适用Ii引入患者细胞的载体在文献中已经被详细描述了。例如，在控制胰岛素启动子的情况下，插入Ii基因将导致提高糖尿病中被破坏的β细胞中的Ii表达。另外，在控制甲状腺球蛋白启动子的情况下，插入Ii基因将导致提高在某些形式甲状腺炎中被破坏的甲状腺雌酮细胞中的Ii表达。在预防自身免疫疾病中，这种构建物的机理被认为是随着在细胞活化过程中Ii组成型表达增加，例如，病毒感染，可能发现其中MHC类型Ⅱα和β链的表达增加而Ii蛋白表达没有随之增加。没有通过Ii蛋白“保护”的MHC类型Ⅱ抗原结合部位将发生增加自身抗原的出现。这种治疗概念是一种为了提高自身决定子的出现而应用Ii反义构建物的镜象概念。

实施例

实施例1:逆基因构建物的设计和合成

如附图1所示，将含有鼠Ii(mIi)基因的质粒pcEXV-mIi31[Miller和Germain，《实验药物学杂志》(J.Experi.Med.)164:1478-1489(1986)]用限制内切核酸酶Eco RI消化以释放mIi基因。纯化后，将mIi基因克隆到Bluescript载体(Stratagene)的Eco RJ结合部位。通过用BglI限制内切核酸酶消化图谱分析测定mIi基因的取向。如图1选择用转录SalI定向取向的含有mIi基因的Bluescript-mIi构建物。

然后用限制内切核酸酶SalⅠ和Bam HⅠ消化Bluescript-mIi构建物以释放含有mIi基因的片段。将该片段亚克隆至已经被SalⅠ和Bam HⅠ内切核酸酶消化的RSV.5表达载体上[Long,Hum.《免疫学》(Immunol.),31:229-235(1991)]。RSV.5载体也含有潮霉素抵抗基因，因此可以用潮霉素选择。所得含有整个逆mIi基因的RSV.5--mIi反义构建物被称为RSV.5-mIi(R)。

将RSV.5-mIi(R)构建物进一步用限制内切核酸酶SalⅠ和SacⅠ消化。用这些酶消化产生的Ii编码片段含47个5’未翻译区的核苷酸和编码序列的前94个核苷酸。用凝胶电泳纯化长片段后，用Klenow DNA聚合酶处理Ii片段以填补SalⅠ和SacⅠ末端，因此得到平端。用T4 DNA连接酶连接该平端。所得含有Ii结构基因的前94个核苷酸和在逆取向中上游序列的47个核苷酸的mIi反义质粒被命名为RSV.5-mIi(SS)。

RSV.5-mIi(R)和RSV.5-mIi(SS)构建物的构建策略如附图1所示。由Rous Sarcoma病毒长末端重复(LTR)的启动子驱动的RSV.5-mIi(R)和RSV.5-mIi(SS)的反义质粒构建物可转录为反义RNA，与Ii mRNA互补，并因此而与Ii mRNA杂交，以使Ii mRNA失活。Ii cDNA插入RSV.5-mIi(SS)的序列在SEQ ID NO:4中给出。

实施例2:转染的细胞系的产生

将A20细胞[Kim等人，《免疫学》(Immunol.),122:549-554(1979)](15×10⁶)用预热的没有血清的RPMI-1640培养基(Gibco)洗涤两次并再悬浮在0.5ml RPMI-1640培养基中。将15μg质粒DNA[RSV.5-mIi(R)或RSV.5-mIi(SS)]与细胞悬浮液混合。将该混合物用电穿孔仪在每0.5ml为300V,625μF的条件下进行电穿孔。将细胞悬浮液在室温培养10分钟。然后用10ml含有胎牛血清的RPMI-1640培养基稀释该细胞并在24孔微量滴定盘中培养24小时。然后加入抗菌素潮霉素(每毫升800μg)用于选择。每两天改变一次含有每毫升800μg潮霉素的RPMI-1640培养基直到看到克隆。用细胞内抗-鼠Ii单克隆抗体，In.1[Koch,N.等人，《自然》(Nature),299:644-645(1982)]染色检测Ii蛋白表达的抑制。在该鉴定中，将细胞涂片在显微镜的载玻片上，空气干燥，固定在丙酮中并与大鼠抗-鼠Ii单克隆抗体培养40分钟。用磷酸钠缓冲的盐水溶液洗涤载玻片两次并与荧光黄异硫氰酸酯-标记的山羊抗-鼠Ig(H,L)抗体培养。

实施例3：在转染细胞中Ii的表达

将在A20细胞(A20)、用RSV.5-mIi(R)稳定转染的A20细胞[A20(R)]、用RSV.5-mIi(SS)稳定转染的A20细胞[A20(SS)]中的Ii蛋白表达通过用于内源性Ii蛋白(用In.1单克隆抗体鉴定)的细胞内免疫荧光染色定量。然后将染色细胞的载玻片用定量荧光图象扫描显微镜检查。每个试验载玻片配以从作为阳性对照的A20细胞小孔来制备的载玻片。观察对细胞中带有逆基因构建物的Ii表达的抑制。携带逆基因构建物的细胞系中的Ii表达的抑制被表示为阳性对照的百分比。在两个如表1所示的试验中，用RSV.5-mIi(R)稳定转染的质粒导致Ii合成的抑制为39.5％和71.9％。如表1所示，在用RSV.5-mIi(SS)转染的质粒的两个试验中，观察到Ii蛋白表达抑制为89.3％和95.3％。还如表1所示，获得这些结果的同时，并没有观察到显著影响MHC类型Ⅱ蛋白的表达的结果。在该表中，(R1)和(R2)，(SS1)和(SS2)分别是用RSV.5-mIi(R)和RSV.5-mIi(SS)质粒转染的患者的细胞系。

表1．在A20,A20(R)，和A20(SS)中Ii的表达

细胞系 MHC类型Ⅱ的表达 Ii的表达

A20 100 100

A20(R1) 96 60.5

A20(R2) 99 28.1

A20(SS1) 84 10.7

A20(SS1) 92 4.7

实施例4：用转染细胞接种鼠的存活率

在肿瘤细胞接种前，用0.5ml姥鲛烷/鼠灌注小鼠一星期。将每只小鼠用3×10⁶下列物质腹膜内注射：A20细胞(没有携带质粒)(在表2中称为A20)，或A20(hygro)细胞(仅含有RSV.5质粒)[在表2中称为A20(hygro)]，或携带RSV.5-mIi(SS)质粒的A20细胞[在表2中称为“A20(SS)”]。分别测定接种三种类型细胞系的小鼠的存活率。接种A20细胞的小鼠的存活率与接种A20(hygro)细胞的小鼠的存活率没有明显不同。接种携带RSV.5-mIi(SS)质粒的A20细胞的小鼠的存活率明显长于用A20细胞或潮霉素抵抗质粒(表2)稳定转染的A20细胞接种的小鼠的存活率。例如，在第22天，用携带RSV.5-mIi(SS)质粒的A20细胞接种的小鼠存活率为100％，相比之下，仅用A20细胞，或只含有RSV.5质粒的A20细胞接种的小鼠的存活率为40％。

表2.接受用有或没有Ii反义的A20细胞处理

的小鼠的存活百分数天细胞系

A20 A20(hygro) A20(SS)2 100 100 1004 100 100 1006 100 100 1008 100 100 10010 80 80 10012 80 80 10014 40 40 10016 40 40 10018 40 40 10020 40 40 10022 40 40 10024 40 40 8026 20 20 6028 20 20 6030 0 20 4032 0 20 4034 0 20 4036 0 20 4038 0 20 4040 0 20 20

实施例5：用反义寡核苷酸抑制Ii表达

将A20细胞(105)在96孔微盘中，在37℃及在寡核苷酸1(SEQ ID NO:1),2(SEQ ID NO:2)，和3(SEQ ID NO:3)的混合物存在下的100μ1培养基中培养2.5小时。更具体地，试验含有10,30或90μM每种寡核苷酸的三种寡核苷酸的混合物。如前所述，称为SEQ ID NO:1的寡核苷酸是互补被认为与翻译起始有关的重要的Ii mRNA的区域；称为SEQ ID NO:2的寡核苷酸是互补被认为与内含子剪接有关的重要的Ii mRNA的区域；及称为SEQ ID NO:3的寡核苷酸是互补被认为与聚腺苷酸化有关的重要的Ii mRNA的区域。

除去培养基并在相同浓度寡核苷酸1,2和3的存在下加入100μl标记的培养基(没有甲硫氨酸)和50μCi[³⁵S]甲硫氨酸2.5小时。收集细胞并用磷酸盐缓冲液洗涤并裂解。用抗-鼠Ii单克隆抗体，In.1免疫沉淀细胞裂解液。计算免疫沉淀物的放射性。通过放射性测定可知，寡核苷酸1,2和3的浓度分别为90μM时，Ii表达被抑制约66％。混合物浓度为10μM和30μM时没有效果。以试验浓度的寡核苷酸应用于患者时也没有观察到效果。

序列表

(1)一般信息

(ⅰ)申请人：Antigen Express,Inc.

(ⅱ)发明名称：Ii合成的抑制

(ⅲ)序列数：4

(ⅳ)通信地址：

(A)收信人：Kevin M.Farrell,P.C.

(B)街道：P.O.Box 999

(C)城市：York Harbor

(D)州：ME

(E)国家：US

(F)邮政编码：03911

(ⅴ)计算机可读形式：

(A)媒体类型：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容

(C)操作系统：PC-DOC/MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release #1.0,Version#1.25

(ⅵ)本申请数据：

(A)申请号：

(B)申请日：

(C)分类：

(ⅶ)在先申请数据：

(A)申请号：08/661,627

(B)申请日：1996年6月11日

(C)分类：

(ⅷ)律师/代理人信息

(A)姓名：Farrell.Kevin M.

(B)注册号：35,505

(C)参考/案号：REH-9501 WO

(ⅸ)通讯信息：

(A)电话：(207)363-0558

(B)传真：(207)363-0528

(2)SEQ ID NO:l信息

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：24个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链：单链

(D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：cDNA

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1CGTTGGTCATCCATGGCTCTAGCC 24

(2)SEQ ID NO:2信息

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：22个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链：单链

(D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：cDNA

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2CACACATACCTTTCTGGCTCTC 22

(2)SEQ ID NO:3 言息

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：23个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链：单链

(D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：cDNA

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:3GCGCTGCTGCTGTGCAGAGCTGG 23

(2)SEQ ID NO:4信息

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：141个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链：单链

(D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：cDNA

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:4TGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGTGGGAAAAACTAGAGATTAGAGCCATGGATGACCAAC 60GCGACCTCATCTCTAACCATGAACAGTTGCCCATACTGGGCAACCGCCCTAGAGAGCCAG 120AAAGGTGCAG CCGTGGAGCTC 141

Claims

1．一种表达逆基因构建物，包括编码第一个mRNA分子的DNA分子，第一个mRNA分子互补编码哺乳动物Ii蛋白的第二个mRNA分子，第一个mRNA分子的特征在于能与第二个mRNA分子杂交，因此抑制第二个mRNA分子的翻译。

2．权利要求1的表达逆基因构建物，其中DNA分子是cDNA分子。

3．权利要求2的表达逆基因构建物，其中第一个mRNA分子与第二个mRNA分子在全长Ii编码序列上互补。

4．权利要求1的表达逆基因构建物，其中第一个mRNA分子互补部分第二个mRNA分子，该部分包括小于全长Ii编码序列。

5．权利要求4的表达逆基因构建物，其中第一个mRNA分子与第二个mRNA分子的一部分互补，所述的这一部分包括翻译起始位点到至少部分第二个外显子的部分。

6．权利要求5的表达逆基因构建物，其中编码第一个mRNA分子的DNA序列包括SEQ ID NO:4。

7．一种互补编码哺乳动物Ii的mRNA分子的寡核苷酸，该寡核苷酸特征在于能与编码哺乳动物Ii的mRNA分子特异性杂交，因此抑制mRNA分子的翻译。

8．权利要求7的寡核苷酸，其互补翻译起始位点。

9．权利要求8的寡核苷酸，包括SEQ ID NO:1。

10．权利要求7的寡核苷酸，其抑制内含子剪接。

11．权利要求10的寡核苷酸，其互补第一个外显子的部分3’末端和第一个内含子的5’末端。

12．权利要求11的寡核苷酸，包括SEQ ID NO:2。

13．权利要求7的寡核苷酸，其互补末端编码子的3’区域。

14．权利要求13的寡核苷酸，包括SEQ ID NO:3。

15．含有Ii表达抑制剂的MHC类型Ⅱ-正效抗原呈现细胞。

16．权利要求15的MHC类型Ⅱ-正效抗原呈现细胞，其中类型Ⅱ-正效细胞是恶性细胞。

17．权利要求16的MHC类型Ⅱ-正效抗原呈现细胞，其中恶性细胞选自白血病，淋巴瘤和黑素瘤类。

18．权利要求16的MHC类型Ⅱ-正效抗原呈现细胞，其中相关抗原肿瘤肽在与MHC类型Ⅱ蛋白有关的细胞表面出现。

19．权利要求15的MHC类型Ⅱ-正效抗原呈现细胞，其中Ii表达抑制剂是表达逆基因构建物，该表达逆基因构建物包括编码第一个mRNA分子的DNA分子，第一个mRNA分子互补编码哺乳动物Ii蛋白的第二个mRNA分子，第一个mRNA分子的特征在于能与第二个mRNA分子杂交，因此抑制第二个mRNA分子的翻译。

20．权利要求19的MHC类型Ⅱ-正效抗原呈现细胞，其中DNA分子是cDNA分子。

21．权利要求19的MHC类型Ⅱ-正效抗原呈现细胞，其中第一个mRNA分子与第二个mRNA分子在全长Ii编码序列上互补。

22．权利要求19的MHC类型Ⅱ-正效抗原呈现细胞，其中第一个mRNA分子互补部分第二个mRNA分子，该部分包括小于全长Ii编码序列。

23．权利要求22的MHC类型Ⅱ-正效抗原呈现细胞，其中第一个mRNA分子与第二个mRNA分子的一部分互补，所述的这一部分包括翻译起始位点到至少部分第二个外显子的部分。

24．权利要求15的MHC类型Ⅱ-正效抗原呈现细胞，其中编码第一个mRNA分子的DNA序列包括SEQ ID NO:4。

25．权利要求15的MHC类型Ⅱ-正效抗原呈现细胞，其中Ii表达抑制剂包括互补编码Ii的mRNA分子的寡核苷酸，该寡核苷酸特征在于能与mRNA分子杂交形成双螺旋，因此抑制mRNA分子的翻译。

26．权利要求25的MHC类型Ⅱ-正效抗原呈现细胞，其中寡核苷酸互补翻译起始部位。

27．权利要求26的MHC类型Ⅱ-正效抗原呈现细胞，其中寡核苷酸包括SEQ ID NO:1。

28．权利要求25的MHC类型Ⅱ-正效抗原呈现细胞，其中寡核苷酸跨越Ii基因的第一和第二外显子的接合点。

29．权利要求28的MHC类型Ⅱ-正效抗原呈现细胞，其中寡核苷酸包括SEQ ID NO:2。

30．权利要求25的MHC类型Ⅱ-正效抗原呈现细胞，其互补末端信号的3’区域。

31．权利要求30的MHC类型Ⅱ-正效抗原呈现细胞，其中寡核苷酸包括SEQ ID NO:3。

32．一类MHC类型Ⅱ-正效抗原呈现细胞，其表面上出现与自身决定子肽相关的MHC类型Ⅱ蛋白。

33．一种导致在MHC类型Ⅱ-正效抗原呈现细胞表面上出现与MHC类型Ⅱ蛋白相关的自身决定子肽的方法，该方法包括：

(a)提供MHC类型Ⅱ-正效抗原呈现细胞；及

(b)向MHC类型Ⅱ-正效抗原呈现细胞引入Ii合成特异性抑制剂，该抑制剂的功能是直接或间接地作用于与mRNA编码Ii形成双螺旋，该双螺旋分子形成的功能是在翻译水平抑制Ii合成。

34．权利要求33的方法，其中Ii合成的特异性抑制剂包括互补mRNA编码Ii的寡核苷酸。

35．权利要求34的方法，其中寡核苷酸互补选自翻译起始部位，内含子剪接连接，和翻译末端编码子的3’区域的部分编码Ii的mRNA。

36．权利要求33的方法，其中Ii合成的特异性抑制剂包括表达逆基因构建物，该构建物包括编码第一个mRNA分子的DNA分子，第一个mRNA分子互补编码哺乳动物Ii蛋白的第二个mRNA分子，第一个mRNA分子的特征在于能与第二个mRNA分子杂交，因此抑制第二个mRNA分子的翻译。

37．权利要求36的方法，其中DNA分子是cDNA分子。

38．权利要求36的方法，其中第一个mRNA分子与第二个mRNA分子在全长Ii编码序列上互补。

39．权利要求36的方法，其中第一个mRNA分子互补部分第二个mRNA分子，该部分包括小于全长Ii编码序列。

40．权利要求39的方法，其中第一个mRNA分子与第二个mRNA分子的一部分互补，所述的这一部分包括翻译起始位点到至少部分第二个外显子的部分。

41．权利要求40的方法，其中编码第一个mRNA分子的DNA序列包括SEQ ID NO:4。

42．一种在MHC类型Ⅱ-正效抗原呈现细胞中治疗恶性肿瘤的治疗方法，该方法包括：

(a)提供用表达逆基因构建物转染的MHC类型Ⅱ-正效恶性细胞系，该构建物包括编码第一个mRNA分子的DNA分子，第一个mRNA分子互补编码哺乳动物Ii蛋白的第二个mRNA分子，第一个mRNA分子的特征在于能与第二个mRNA分子杂交，因此抑制第二个mRNA分子的翻译；和

(b)将转染的人细胞系引入被诊断为具有恶性MHC类型Ⅱ-正效抗原呈现细胞的患者。

43．权利要求42的治疗方法，其中用表达逆基因构建物转染的MHC类型Ⅱ-正效人恶性细胞系是从开始由要治疗的患者分离的MHC类型Ⅱ-正效恶性黑素瘤或B谱系细胞建立的。

44．权利要求43的治疗方法，其中恶性B谱系细胞选自白血病和淋巴瘤类。

45．权利要求43的治疗方法，其中相关抗原肿瘤肽在与MHC类型Ⅱ肽相关的转染MHC类型Ⅱ-正效人恶性细胞系的表面上出现。

46．一种治疗黑素瘤或B谱系恶性肿瘤的方法，其中该方法包括：

(a)提供MHC类型Ⅱ-正效人恶性细胞系；

(b)向MHC类型Ⅱ正效人恶性细胞系引入互补编码Ii的mRNA分子的寡核苷酸，该寡核苷酸的特征在于能与mRNA分子杂交形成双螺旋，因此抑制mRNA分子翻译；和

(c)将步骤(b)中的MHC类型Ⅱ-正效人恶性细胞系引入至被诊断为黑素瘤B谱系恶性肿瘤的患者。

47．权利要求46的方法，其中用表达逆基因构建物转染的MHC类型Ⅱ-正效人恶性细胞系是从开始由要治疗的患者分离的MHC类型Ⅱ-正效恶性黑素瘤或B谱系细胞建立的。

48．权利要求47的方法，其中恶性肿瘤B谱系细胞选自白血病和淋巴瘤类。

49．权利要求47的治疗方法，其中相关抗原肿瘤肽在与MHC类型Ⅱ肽相关的含有寡核苷酸MHC类型Ⅱ-正效人恶性细胞系的表面上出现。

50．用以下步骤分离的自身决定子肽：

(a)提供MHC类型Ⅱ-正效抗原呈现细胞；

(b)向MHC类型Ⅱ-正效抗原呈现细胞引入Ii合成的特异性抑制剂，其功能是直接或间接地与编码Ii的mRNA形成双螺旋，该双螺旋分子的形成在翻译水平抑制Ii合成；

(c)溶解步骤b)的MHC类型Ⅱ-正效抗原呈现细胞；

(d)免疫纯化MHC类型Ⅱ分子；及

(e)从用酸处理的步骤d)的MHC类型Ⅱ分子中洗脱自身决定子肽。

51．一种从患者中消除不良细胞的方法，不良细胞的特征在于存在抗原上可区别于天然细胞内蛋白的非-天然细胞内蛋白，该方法包括：

(a)从患者中分离包括不良细胞的种群；

(b)向该细胞种群引入Ii合成抑制剂，因此提高了从对不良细胞为特异性的非-天然细胞内蛋白衍生的抗原决定子的出现；及

(c)给患者再灌注经过处理的步骤(b)的细胞种群。

52．权利要求51的方法，其中不良细胞是病毒感染细胞。

53．权利要求51的方法，其中不良细胞是恶性细胞。

54．一种治疗患者自身免疫疾病的方法，包括：

(a)从患者中分离细胞种群；

(b)用Ii合成抑制剂体外处理该细胞种群；

(c)监视患者缓解信号；及

(d)检出缓解信号后，给患者再灌注步骤b)的细胞。

55．一种在组织特异性自身免疫失调危险时预防组织特异性自身免疫失调开始的方法，包括：

(a)在控制组织特异性自身免疫失调影响组织中活化的启动子的情况下提供含有Ii基因的表达构建物；和

(b)给组织特异性自身免疫开始失调前的危险时的患者引入步骤a)的表达构建物。