CN1223681C - 雄甾－1，4双烯－3，17－双酮生物转化浊点系统的优化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物技术领域。本发明提供了浊点系统在微生物转化中应用的优化方法，特别是公开了从胆固醇生产ADD和4-AD的浊点系统的优化参数。采用本发明方法底物浓度为0.5-2.0/100ml时，可使微生物转化ADD和4-AD产率高达3.5-10g/L，对应的转化率为80-93%，显著优于其它转化系统。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域。具体涉及雄甾-1，4双烯-3，17-双酮生物转化浊点系统的优化方法
背景技术
生物催化剂的特殊性质使得生物转化技术重新受到企业界和科研工作者的重视。特别是高选择性和反应条件温和，特别适合于合成和修饰天然化合物。即使对某一生物转化反应开发了简单的化学合成途径，生物转化的高化学选择性和空间选择性也可排除化学合成途径中必要的保护和去保护步骤。然而，尽管人们对生物转化有着浓厚的兴趣，工业应用常受到实际困难的制约。如疏水性底物在水中的溶解度低，限制了其生物利用度；底物、产物可能抑制或毒害微生物。非水介质因其独特的功能在生物转化中起着重要的作用，近年来取得了很大的进步。本发明人已经开发了一种新系统，该系统是非离子表面活性剂胶束溶液，在温度高于其浊点或有诱导物存在的条件下，会自动分相形成表面活性剂稀相和富含表面活性剂的凝集层相。即采用一种或一种以上非离子表面活性剂形成浊点低于微生物转化培养温度的水溶液系统即浊点系统(cloud point system，CPS)，作为微生物转化的介质。在CPS中，形成了油包水和水包油的微观乳浊液。表面活性剂液滴具有增溶能力，充当着底物的储藏库和产物的抑制剂。强化了底物的利用度，排除了产物的抑制。连续的表面活性剂相中存在水泡，相当于一个微反应器，能使微生物免受表面活性剂的毒害作用。浊点系统的生物相容性和对底物生物利用度的强化作用已被证实。
利用分枝杆菌(Mycobacterium sp.)微生物菌种保藏号为NRRLB-3683进行胆固醇的边链切除生产ADD(雄甾-1，4双烯-3，17-双酮)和4-AD(雄甾-4烯-3，17-双酮)的途径如式1所示。在这微生物转化中，ADD和4-AD的摩尔比为10∶1。
式1胆固醇的生物转化生产ADD和4-AD的途径：
尽管引入新的甾体药物已很有限，但提高选择性微生物转化的产率，特别是甾醇的边链切除的产率以便利用价格低廉的天然原料一直是人们努力的方向。人们尝试了各种方法以增加底物的溶解度或排除产物的抑制作用，如双水相系统、有机溶剂两相系统、有机介质、脂质体系统等。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于设计浊点系统应用中提高生物转化产率的优化方法，特别是提供胆固醇边链切除生产ADD(雄甾-1，4双烯-3，17-双酮)和4-AD(雄甾-4烯-3，17-双酮)的浊点系统转化优化生产方法。
本发明经大量的实验证明，在浊点系统中表面活性剂浓度和底物浓度对转化产率具有较大的影响。本发明通过优化底物、表面活性剂浓度，建立了生产ADD和4-AD的CPS的优化条件，底物浓度和转化效率和其它转化系统相比都有明显提高。
本发明公开的优化生产ADD和4-AD的浊点系统参数为：非离子表面活性剂采用Triton X-100和Triton X-114，其质量比是1∶0.5-1.5；混合表面活性剂的浓度是5-10g/100ml；底物胆固醇的浓度是0.5-2.0g/100ml；微生物菌种采用Mycobacterium sp.NRRL B-3683，微生物转化时间为5-9天。在此优化条件下，ADD+4-AD产率高达3.5-10g/L，对应的转化率为80-93％。
下面通过具体的实验过程对本发明以胆固醇为原料生产ADD和4-AD的CPS的优化条件作进一步描述：
1、微生物与培养
微生物
微生物菌种Mycobacterium sp.NRRL B 3683。它能实现胆固醇的边链切除，生成产物ADD和4-AD，其比例为10∶1。
培养基
斜面培养基(100ml)：0.5g酵母浸出膏，1.2g琼脂粉，1g甘油，0.05g K2HPO4，0.1g(NH4)2SO4，0.05g MgSO4·7H2O。
种子培养基(100ml)：0.5g(NH4)2SO4，0.45g Na2HPO4，0.34gKH2PO4，0.05g MgSO4·7H2O，1.0g甘油，0.2g胆固醇，0.2g TritonX-100。
转化培养基(100ml)：1.0g(NH4)2SO4，0.45g Na2HPO4，0.34gKH2PO4，0.2g MgSO4·7H2O，一定量的胆固醇和混合表面活性剂Triton X-100：Triton X-114＝1∶1)。
微生物培养
微生物在28℃、220rpm、有氧、20/250ml装量条件下活化培养3天，取活化种子按1∶10比例在装量为22/250ml条件下转化培养7天。取转化培养液分析。
2、分析方法
取1ml样品用4ml甲醇浸泡2hr。离心后取0.8ml上清进行HPLC分析。用Hypersil C18柱，流动相为甲醇∶水(4∶1)，流速为0.7ml/min，检测波长为254nm。
3、结果与讨论
1)微生物转化时间的优化
混合表面活性剂的质量比为Triton X-100与Triton X-114之比为1∶1。以底物浓度为1.5g/100ml、表面活性剂浓度为4g/100ml进行微生物转化，时间的影响如图1所示。图1为微生物转化的时间曲线。结果表明7天时的产物浓度最高。再延长转化时间反而降低。这表明产物可被微生物进一步降解。可能菌种诱变时使ADD和4-AD进一步降解的关键酶，9a-羟化酶没有完全失活。
2)混和表面活性剂浓度的影响
混和表面活性剂浓度为0.5～4.0g/100ml，底物浓度为0.5g/100ml时微生物转化的结果如图2所示。图2为最终产物浓度随表面活性剂浓度的变化。在表面活性剂浓度较低时，产率随表面活性剂浓度的增加而增加，这可归因于表面活性剂的增溶能力。表面活性剂胶束充当底物的储存库和产物的萃取剂，随表面活性剂浓度的增加，底物的生物利用度增加且产物的抑制作用被解除。但在表面活性剂浓度较高时，产率随表面活性剂浓度的增加而降低，表现出高表面活性剂浓度的抑制作用。最终产物浓度随表面活性剂浓度变化的曲线表明，对一定底物浓度存在最优的表面活性剂浓度。
3)底物浓度的影响
底物浓度为0.025～3g/100ml，混和表面活性剂浓度为2g/100ml时微生物转化结果如图3所示。图3为产物随底物浓度的变化。在底物浓度较小，产率随底物浓度的增加而稳定地增加且表现出较好的线性关系。当底物浓度较高时，产率稳定于一个常数。这可归因于表面活性剂的增溶能力。结果表明，要得到较高的产物浓度和转化率，对一定的表面活性剂浓度存在一个对应的临界底物浓度(如表面活性剂浓度为2g/100ml，最大终产物浓度为6200mg/L，对应的临界底物浓度为0.85g/100ml)。
4)底物浓度的优化
高底物浓度是影响微生物转化经济性的一个重要因素。底物和表面活性剂浓度相互影响着最终产物浓度。故采用底物浓度1～2.2g/100ml，不同的混和表面活性剂浓度进行微生物转化，结果如图4所示。图4为底物浓度的优化。从图4可估计出在一定表面活性剂浓度时最大最终产物浓度对应的临界底物浓度。结果如图5所示。图5为临界底物浓度和表面活性剂浓度的相互关系。在表面活性剂浓度为2～8g/100ml时，对应一定表面活性剂浓度时的最大产物浓度随表面活性剂浓度的增加而增加。当表面活性剂浓度达到10g/100ml时，其最大产物浓度不再明显增加，高表面活性剂浓度时最大产物浓度出现停滞现象。随表面活性剂浓度的增加，可能导致物质传递，特别是氧传递受到抑制。
表1微生物转化系统的基本参数
| 底物 | 产物 | 介质 | 微生物 | 底物浓度 | 转化率 |
| 胆固醇谷甾醇植物甾醇谷甾醇胆固醇 | ADD，4-AD4-AD4-AD4-ADADD，4-AD | 双水相系统有机介质PPG溶剂有机两相系统浊点系统 | 分枝杆菌固定化分枝杆菌分枝杆菌固定化分枝杆菌分枝杆菌 | 1g/L12mM5-30g/L5g/L1.45g/100ml | 80％89％90％70％93％ |
定义转化率为ADD和4-AD与胆固醇的摩尔数之比。1g胆固醇完全转化时可到0.74g ADD和4-AD(ADD∶4-AD＝10∶1)。从图6可得到在表面活性剂浓度为8g/100ml时对应的临界底物浓度为1.45g/100ml。如表1所示，转化率，特别是底物浓度(对应着最终产物浓度)都有很大的提高。
结论
表面活性剂浓度和底物浓度对转化产率相互影响。本发明通过优化底物、表面活性剂浓度，建立了CPS的优化条件。底物的浓度和转化效率和其它转化系统相比都有明显提高，表明CPS是优良的转化系统。
附图说明
图1微生物转化的时间曲线
图2最终产物浓度随表面活性剂浓度的变化
图3产率随底物浓度的变化
图4底物浓度的优化
表面活性剂浓度(g/100ml)：×(2)；◇(4)；△(6)；○(8)；
●(10)
图5临界底物浓度和表面活性剂浓度的相互关系
具体实施方式
实施例胆固醇的边链切除，优化CPS的系统参数
实施例1.
1.微生物与培养
微生物
微生物菌种Mycobacterium sp.NRRL B 3683。它能实现胆固醇的边链切除，生成产物ADD和4-AD，其比例为10∶1。
培养基
斜面培养基(100ml)∶0.5g酵母浸出膏，1.2g琼脂粉，1g甘油，0.05g K2HPO4，0.1g(NH4)2SO4，0.05g MgSO4·7H2O。
种子培养基(100ml)∶0.5g(NH4)2SO4，0.45g Na2HPO4，0.34gKH2PO4，0.05g MgSO4·7H2O，1.0g甘油，0.2g胆固醇，0.2g TritonX-100。
转化培养基(100ml)∶1.0g(NH4)2SO4，0.45g Na2HPO4，0.34gKH2PO4，0.2g MgSO4·7H2O，1.5g胆固醇，10g表面活性剂(TritonX-100：Triton X-114＝1∶1)。
微生物培养
微生物在28℃、220rpm、有氧、20/250ml装量条件下活化培养3天，取活化种子按1∶10比例在装量为22/250ml条件下转化培养7天。取转化培养液分析。
分析方法
取1ml样品用4rl甲醇浸泡2hr。离心后取0.8ml上清进行HPLC分析。用Hypersil C18柱，流动相为甲醇∶水(4∶1)，流速为0.7ml/min，检测波长为254nm。
结果
产物浓度(ADD∶4-AD＝10∶1)为10g/L。
实施例2.
1.微生物与培养
微生物
微生物菌种Mycobacterium sp.NRRL B 3683。它能实现胆固醇的边链切除，生成产物ADD和4-AD，其比例为10∶1。
培养基
斜面培养基(100ml)：0.5g酵母浸出膏，1.2g琼脂粉，1g甘油，0.05g K2HPO4，0.1g(NH4)2SO4，0.05g MgSO4·7H2O。
种子培养基(100ml)：0.5g(NH4)2SO4，0.45g Na2HPO4，0.34gKH2PO4，0.05g MgSO4·7H2O，1.0g甘油，0.2g胆固醇，0.2g TritonX-100。
转化培养基(100ml)：1.0g(NH4)2SO4，0.45g Na2HPO4，0.34gKH2PO4，0.2g MgSO4·7H2O，1.5g胆固醇，6g表面活性剂(TritonX-100∶Triton X-114＝1∶1.2)。
微生物培养
微生物在28℃、220 rpm、有氧、20/250ml装量条件下活化培养3天，取活化种子按1∶10比例在装量为22/250ml条件下转化培养7天。取转化培养液分析。
分析方法
取1ml样品用4ml甲醇浸泡2hr。离心后取0.8ml上清进行HPLC分析。用Hypersil C18柱，流动相为甲醇∶水(4∶1)，流速为0.7ml/min，检测波长为254nm。
结果
产物浓度(ADD∶4-AD＝10∶1)为8g/L。
实施例3.
1.微生物与培养
微生物
微生物菌种Mycobacterium sp.NRRL B 3683。它能实现胆固醇的边链切除，生成产物ADD和4-AD，其比例为10∶1。
培养基
斜面培养基(100ml)：0.5g酵母浸出膏，1.2g琼脂粉，1g甘油，0.05g K2HPO4，0.1g(NH4)2SO4，0.05g MgSO4·7H2O。
种子培养基(100ml)：0.5g(NH4)2SO4，0.45g Na2HPO4，0.34gKH2PO4，0.05g MgSO4·7H2O，1.0g甘油，0.2g胆固醇，0.2g TritonX-100。
转化培养基(100ml)：1.0g(NH4)2SO4，0.45g Na2HPO4，0.34gKH2PO4，0.2g MgSO4·7H2O，1.0g胆固醇，10g表面活性剂(TritonX-100∶Triton X-114＝1∶0.8)。
微生物培养
微生物在28℃、220rpm、有氧、20/250ml装量条件下活化培养3天，取活化种子按1∶10比例在装量为22/250ml条件下转化培养7天。取转化培养液分析。
分析方法
取1ml样品用4ml甲醇浸泡2hr。离心后取0.8ml上清进行HPLC分析。用Hypersil C18柱，流动相为甲醇∶水(4∶1)，流速为0.7ml/min，检测波长为254nm。
结果
产物浓度(ADD∶4-AD＝10∶1)为7g/L。
Claims (1)
1.雄甾-1，4双烯-3，17-双酮生物转化浊点系统的优化方法，该方法以胆固醇为原料，以分枝杆菌(Mycobacterium sp.)微生物菌种保藏号NRRL B-3683为菌种进行微生物转化，其特征在于该方法所用的介质为浊点系统，各参数为：非离子表面活性剂采用质量比是1∶0.5-1.5的Triton X-100和Triton X-114，混合表面活性剂的浓度是5-10g/100ml，底物胆固醇的浓度是0.5-2.0g/100ml，微生物转化时间为5-9天。
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