CN1876808A - 维吉尼链霉菌及其在转化与降解甾体化合物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种维吉尼链霉菌(Streptomycesvirginiae)，公开了维吉尼链霉菌(Streptomyces virginiae)IBL－14 CCTCC M206045，及其在转化与降解甾体化合物中的应用。本发明的菌种可有效的转化与降解几乎所有类型的甾体化合物，本菌种是一种放线菌，在自然环境中可广泛生存，因此可应用于环境保护领域，以清除甾体污染物，通过本发明菌种可转化降解甾体化合物生成一些新的化合物，具有潜在的药物活性，如该菌种转化薯蓣皂素生成25－羟基薯蓣皂酮。
Description
技术领域
本发明涉及维吉尼链霉菌(Streptomyces virginiae)及其应用。
背景技术
甾体药物对机体起着非常重要的调节功能。微生物对甾体化合物的转化与降解，一直是甾体医药工业与环境保护领域研究的重要内容：
1、甾体的微生物转化
微生物转化在制药工业领域中的正式应用，开端于甾体药物的开发，1952年Peterson和Murry创造性地用黑根霉在黄体酮的11位进行了α-羟基化，使可的松得以问世，并且收率高达90％，这一创造性的工作引起了各国科学家的极大兴趣，从而使微生物转化得以在有机化工领域中快速发展，从而形成了一门独立的学科。同时也正是由于把微生物转化法应用到了甾体药物的生产上，解决了有机化学家难于合成甾体化合物，特别是难于在一些甾体药物上的特定部位引入特定官能团(化学选择性与立体选择性)这一难题，使大量合成各类微量甾体激素成为可能，从而为甾体医药工业的形成奠定了重要的基础。例如，11位羟基化与1位脱氢是生产大部份高效甾体药物必不可少的两步重要反应，其中11位羟基化反应由于涉及到区域选择性与立体选择性问题，是有机化学法难以实现的；而1位脱氢反应由于化学法反应率低且反应需要高毒催化剂对环境污染严重等问题，使得微生物法高选择性1位脱氢成为必然的选择。
另外，薯蓣皂苷元(diosgenin)即薯蓣皂素是薯蓣皂苷水解掉3位糖基的产物，随着国内外对天然产物活性成份的大规模筛选，人们发现薯蓣皂苷元及其结构类似物(或衍生物)具有广泛的药理活性。如薯蓣皂苷元具有广谱抗肿瘤活性；心血管活性等许多功能，如近年上市的地奥心血康，冠心宁等，主要成份为薯蓣皂苷(元)；其衍生物薯蓣皂酮具有抗疟活性等。
因此研究微生物对薯蓣皂苷元等甾体化合物的转化，有望获得有重要药物活性的新化合物或药物中间体。
2、甾体化合物的降解
对甾体化合物微生物降解的研究主要有两个目的：
①分离代谢中间体，克隆相关基因，研究甾体化合物在微生物中的代谢途径，发现新的反应方式及新的化合物，以获得新的甾体药物制造工艺或获得新的甾体药物。植物甾醇的微生物降解生成雄烯二酮就是一个典型的例子，1942年Turfitt报道了胆固醇及植物甾醇可作为分枝杆菌生长的唯一碳源，经过对代谢途径的研究，人们发现该菌可降解甾醇的侧链，生成雄烯二酮，但除此之外，还会进一步降解甾体的骨架，1969年日本Arima等人用添加抑制剂的方法成功抑制了微生物降解甾核的反应，又经过Marscheck等人的努力，获得了降解甾核缺陷的微生物。这一系列工作使得原来自薯芋皂素制备甾体药物的工业生产结构发生了重大的变革，人们可以直接利用微生物切除天然甾醇的侧链生产雄烯二酮，雄烯二酮再经化学方法进行结构改造可得到一系列有价值的甾体激素化合物。这从根本上改变了薯芋皂素法生产某些甾体药物步骤多，得率低，价格贵等不足之处。
②筛选高效降解菌，研究消除环境中的甾体激素污染物。
甾体化合物大都具有激素的作用，是一大类内分泌干扰物，环境中的甾体化合物对人与其它动物生理健康存在严重的危害，特别是人工合成的一些甾体药物，作为内分泌系统的直接效应物，在极低的浓度下就会对内分泌系统产生强烈的破坏作，甚至造成内分泌系统不可逆的损伤。随着上世纪90年代起，人们对环境中内分泌干扰问题的重视和研究，越来越多的人开始关注并研究环境中的甾体化合物的微生物降解。
如薯蓣皂苷元是一种天然植物雌激素，在人和动物体内起雌性激素作用，现已证实长期接触天然植物雌激素对动物的内分泌产生严重的干扰作用，如雄性器官退化，雌性雄性化等。另外，薯蓣皂苷元是大多数人工合成甾体药物的前体物，研究它的降解机制有助于用于其它甾体药物的降解。
由于上述原因自上世纪六十年代起，国外许多实验室均开展过利用微生物转化与降解薯蓣皂苷元等甾体化合物的工作，试图从薯蓣皂苷元等甾体化合物经微生物转化与降解直接得到有用的药物或中间体以缩短甾体激素药物的生产步骤。
例R.Saunders等(Enzyme Microb.Technol.，1986，9：549-555)利用多种微生物转化降解薯蓣皂素，得到了薯蓣皂酮(diosgenone)与1-脱氢薯蓣皂酮(1-dehydrodiosgenone)，而其它反应产物则不多。R.Howe等(J.C.S.Perkin I，1973：1940-1943)利用一株未知菌实现了薯蓣皂素甾核的降解。目前对甾体化合物母核的降解研究，大多是以睾酮丛单孢菌(commamonas testosterone)和限制诺卡氏菌(Nocardia restrictus)对睾酮的降解为反应模式建立的。对这条途径的研究从上世纪六十年代起经历了40多年，目前仍处于完善阶段。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是公开一株维吉尼链霉菌；
本发明需要解决的另一个技术问题是采用所述的维吉尼链霉菌对甾体化合物进行转化与降解的方法。
本发明提供的维吉尼链霉菌(Streptomyces virginiae)IBL-14是从土壤中新分离到的，该菌株于2006年5月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 206045。
本发明的菌株的筛选方法简述如下：
本发明的微生物使用下述方法从土壤中筛选和分离，1克土壤样品在30毫升无菌生理盐水中振荡稀释，然后吸取3毫升接种至250毫升三角瓶中的30毫升富集培养基中，富集培养基如表1，30℃振荡培养至培养基变浑浊为止。传代培养3次后，将培养液稀释10-1000倍，在筛选培养基上涂布分离长出的微生物菌落，筛选培养基如表1，微生物菌落经纯化保存。分离的微生物在发酵培养基中培养，发酵培养基如表1，投加薯蓣皂苷元后，用HPLC分析薯蓣皂苷元在一定时期内是否发生转化降解。对这样选出的1株具有显著转化与降解薯蓣皂苷元能力的微生物的形态、生理生化特征及16SDNA进行了研究。结果于表2，表3中示出。
表1 所用培养基
| 培养基 | 成份 | 比例(重量) |
| 富集培养基 | 氯化铵酵母粉-玉米浆磷酸氢二钾磷酸二氢钠微量元素溶液 | 0.3％0.01％0.01％0.155％0.085％0.5％ |
| 分离培养基 | 氯化铵磷酸氢二钾磷酸二氢钠微量元素溶液琼脂粉 | 0.3％0.155％0.085％0.5％2％ |
| 发酵培养基 | 氯化铵磷酸氢二钾磷酸二氢钠微量元素溶液葡萄糖酵母粉玉米浆环糊精 | 0.3％0.155％0.085％0.5％0.3％0.3％0.3％0.3％ |
| 微量元素溶液 | 硫酸镁氯化钙硫酸锌硫酸亚铁 | 0.02％微量微量微量 |
表2
| 特征 | 结果 | 特征 | 结果 | ||
| 降解 | 木聚糖分解弹性蛋白腺嘌呤黄嘌呤次黄嘌呤七叶苷arbutinTween 20Tween 40 | +++++++-- | 碳源利用 | 山梨糖葡萄糖棉子糖果糖α-D-甲基葡萄糖苷阿拉伯糖鼠李糖乳糖甘露糖 | -+-++++-+ |
| Tween 60Tween 80 | +- | 肌醇甘露醇核糖菊糖木糖半乳糖蔗糖山梨醇柠檬酸丙酸盐丙二酸盐甲酸盐乙酸盐 | -+--+++++-+++ | ||
| 生长情况 | 45℃NaN3(0.01％)酚(0.1％，w/v))NaCl 3％(w/v)NaCl 5％(w/v)NaCl 7％(w/v)NaCl 10％(w/v) | ---+++- | |||
| 形态革兰氏染色菌丝孢子丝 | 丝状阳性无横隔、不断裂柔曲或弯曲 |
表3
| 16S rDNA部份序列 |
| AGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGATGTGAAAGCCCGAGGCTTAACCTCGGGTCTGCATTCGATACGGGCTAGCTAGAGTGTGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGGGAACTAGGTGTTGGCGACATTCCACGTCGTCGGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATATACCGGAAAGCATTAGAGATAGTGCCCCCCTTGTGGTCGGTATACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTGTGTTGCCAGCATGCCCTTCGGGGTGATGGGGACTCACAGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACA |
| CGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATACCGTGAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCTTGTGGAGGGAGCTGTCGAAG |
根据文献(N.R.Kreig和J.G.Holt，《伯杰氏系统细菌学手册》第1卷(1984)Williams & Wilkins；J.G.Holt，N.R.Krieg，P.H.A.Sneath，J.T.Staley和S.T.Williams《伯杰氏细菌学鉴定手册》第9版(1994)Williams & Wilkins)及对16S rDNA序列与GenBank中相关序列的Blast比较结果，这株菌被鉴定为维吉尼链霉菌，并命名为IBL-14。
本发明的菌种属于维吉尼链霉菌(Streptomyces virginiae)类群，但又与其它维吉尼链霉菌(Streptomyces virginiae)有明显的不同，其主要不同之处在于：其它维吉尼链霉菌不能有效转化降解薯蓣皂素并大量积累代谢中间体。
(1)采用常规的方法培养维吉尼链霉菌(Streptomyces viginiae)CCTCCM 206045；
本发明的维吉尼链霉菌(Streptomyces virginiae)CCTCC M 206045可在含常用碳源、氮源以及必需的无机盐和其它痕量元素的培养基中培养。本发明的微生物优先同化的任何碳源均可使用，培养基中碳源浓度优选例如重量浓度为0.1％～1.0％，但应根据碳源类型而有所变化。可使用的氮源的实例包括有机氮源，如酵母提取物、蛋白胨和肉类提取物，无机氮源的实例包括铵盐和硝酸盐。
氮源重量浓度优选0.1％～1.0％，具体比例应根据所用氮源类型而有所变化。无机盐的优选实例包括金属离子，如钾离子、钙离子、镁离子、二价铁离子，以及阴离子，如磷酸根离子、氯离子和硫酸根离子。
培养方式采用通气培养，优选充足供气培养培养温度为20到37℃，优选28-30℃。
本发明所采用的工艺特征是微生物可采用单级培养或多级培养，优先选用二级培养；
优选的培养基的组分和浓度如表1所示发酵培养基。
(2)以空白培养基的体积5-15％的步骤(1)的种子接种到空白培养基进行培养，在培养过程中，加入甾体化合物，进行甾体化合物的转化与降解，培养时间为12～120小时，培养温度为28～32℃，甾体化合物的投加时间要视具体需要而定，一般来说，甾体化合物于微生物生长对数期投加到培养基中，有利于甾体化合物的降解；甾体化合物于生长对数期末投加到培养基中，有利于甾体化合物代谢中间体的积累；
术语“生长对数期”在教科书中有详细的描述，亦称生长指数期，指的是菌体快速生长时期；
甾体化合物不溶于水，因此，可将甾体化合物溶解于有机溶剂或将甾体化合物配制成为表面活性剂的水乳液，进行投加，优选方案为甾体化合物溶入乙醇进行投加，基于空白培养基的体积，甾体化合物的加入0.1～5克每升培养基；
所说的有机溶剂为可与水互溶的有机溶剂，选自甲醇、乙醇、丙醇、乙二醇或二甲基亚砜，有机溶剂中，甾体化合物的浓度为0.1～1克/毫升；
所说的表面活性剂为非离子型，选自吐温系列或曲拉通系列，水乳液中，甾体化合物的浓度为0.01～1克/毫升，表面活性剂的浓度为0.2～1毫升/毫升；
按照本发明优选的方法，在甾体化合物加入到培养液中之前的0-5小时，加入诱导剂，基于培养基的体积，诱导剂的加入量为0.01～0.1克每升。诱导剂的诱导效果强弱与具体的所用的诱导物有关，一般来说诱导物越容易被该微生物降解，其诱导效果越好，这样的诱导物是具有以下特征的甾体化合物：
具有19-27个碳原子，C3位有羟基或酮基和/或在C1和/或C4和/或C5有双键，且A环没有其它取代基时，优选的物质选自有黄体酮、安宫黄体酮、睾酮、异睾酮、ADD、4AD、二氢雄酮、氢化可的松、泼尼松、甲泼尼龙、可的松、表雄酮、异表雄酮、去氢表雄酮、雌酮、雌二醇、雌三醇、地塞米松、倍它米松、沃氏氧化物或奥氏氧化物，以及上述化合物的醋酸酯化衍生物、丙酸酯化衍生物、丁酸酯化衍生物或琥珀酯化衍生物；
这些诱导剂对在微生物对数生长期添加薯蓣皂苷元的降解有明显的促进作用，可使降解效率提高5％-200％；
空白培养基的组分和浓度如表1所示的发酵培养基。
本发明的微生物对所有已知类型的甾体化合物都可进行转化与降解，优选的甾体化合物为薯蓣皂苷元、黄体酮、安宫黄体酮、睾酮、异睾酮、ADD、4AD、二氢雄酮、氢化可的松、泼尼松、甲泼尼龙、可的松、表雄酮、异表雄酮、去氢表雄酮、雌酮、雌二醇、雌三醇、地塞米松、倍它米松、沃氏氧化物或奥氏氧化物，反应强弱与具体的甾体化合物有关，另外该微生物对甾体化合物的降解与转化是可诱导的，其特征在于相对易转化降解的化合物可诱导微生物对相对难转化降解的化合物进行转化与降解。
由所述公开的技术方案可见，本发明的菌种具有以下作用：1)可有效的转化与降解几乎所有类型的甾体化合物，如雌性激素、雄性激素、皮质激素及天然植物激素；2)释放到自然界中的甾体化合物是一种强烈的内分泌干扰物，对人与动物的内分泌系统具有严重的伤害作用，本菌种是一种放线菌，在自然环境中可广泛生存，因此可应用于环境保护领域，以清除甾体污染物；3)甾体化合物具有重要的生理活性，是一大类重要的药物，通过本发明菌种可转化降解甾体化合物生成一些新的化合物，具有潜在的药物活性，如该菌种转化薯蓣皂素生成25-羟基薯蓣皂酮。本发明以薯蓣皂素为唯一碳源进行了长时间的菌种筛选得到了一株能有效转化降解薯蓣皂素的放线菌，该菌经鉴定为维吉尼链霉菌。与以上有关报道相比，该菌种转化与降解甾体化合物有一些全新的特点：1)维吉尼链酶菌转化降解薯蓣皂素生成了全新的化合物，如25-羟基薯蓣皂酮；1-脱氢-25-羟基薯蓣皂酮等；2)维吉尼链酶菌可降解多种类型的甾体化合物，如雌激素，雄激素，皮质激素，天然甾体皂素等，而上述睾酮丛单孢菌(commamonas testosterone)和限制诺卡氏菌(Nocardiarestrictus)不能降解雌激素，也未见其降解天然产物薯蓣皂素的报道。
附图说明
图1，对数期投料，维吉尼链霉菌IBL-14对薯蓣皂苷元的转化与降解。
图2，对数末期投料，维吉尼链霉菌IBL-14对薯蓣皂苷元的转化与降解。曲线1代表薯蓣皂素，曲线2代表薯蓣皂酮，曲线3代表25-羟基薯蓣皂酮。
图3，对数末期投料中，不同诱导物对薯蓣皂苷元转化的影响。
图4、对数期投料，维吉尼链霉菌IBL-14对黄体酮的转化与降解。
图5、对数末期投料，维吉尼链霉菌IBL-14对黄体酮的转化与降解。
图6，维吉尼链霉菌IBL-14对雌酮的转化与降解。
图7，维吉尼链霉菌IBL-14对安宫黄体酮的转化与降解。
具体实施方式
实施例1
维吉尼链霉菌IBL-14对薯蓣皂苷元的转化与降解
于250毫升三角瓶中的30毫升培养基中，30℃条件下，菌株IBL-14经一级培养18小时后，将3毫升的培养物接种于30毫升的第二级培养基中，二级培养处于对数期时，即3小时-9小时，将1毫升浓度为0.02克/毫升的薯蓣皂苷元乙醇溶液加入到30毫升培养液中，继续培养，以TLC及HPLC分析法监测反应进行的情况，无明显代谢中间体积累，降解结果与图1所示。
一级种子培养基与二级培养基的组分和浓度均采用表1所示的发酵培养基。
实施例2
维吉尼链霉菌IBL-14对薯蓣皂苷元的转化与降解
于250毫升三角瓶中的30毫升培养基中，30℃条件下，菌株IBL-14经一级培养18小时后，将4毫升的培养物接种于30毫升的第二级培养基中，二级培养对数生长末期(约15小时)时，将1毫升浓度为0.02克/毫升的薯蓣皂苷元乙醇溶液加入到30毫升培养液中，继续培养，以TLC及HPLC分析法监测反应进行的情度，结果与图2所示，图2中，1代表薯蓣皂素，2代表薯蓣皂酮，3代表25-羟基薯蓣皂酮，有明显代谢中间体积累，其中有两个中间体可大量积累分别是3-酮-4-烯-螺甾(spirost-4-en-3-one，diosgenone)与3-酮-4-烯-25-羟基螺甾(25-hydroxyspirost-4-en-3-one，isonuatigenone)；种子培养基和第二级培养基的组分和浓度如实施例1。
实施例3
维吉尼链霉菌IBL-14对薯蓣皂苷元的转化与降解
在250毫升三角瓶中的30毫升培养基中，于30℃条件下，菌株IBL-14经一级培养至对数生长末期后，将3毫升的培养物接种于30毫升的第二级培养基中，二级培养对数生长期末期(约15小时)，将1毫升浓度为0.02克/毫升的薯蓣皂苷元乙醇溶液加入到30毫升培养液中，继续培养，以TLC及HPLC分析法监测反应进行的情度，以LC-MS监测薯蓣皂素的代谢产物可得到产物1-脱氢薯蓣皂酮(1-dehydrodiosgenone)及1-脱氢-25-羟基薯蓣皂酮(1-dehydroisonuatigenone)。
实施例4
维吉尼链霉菌IBL-14对薯蓣皂苷元的转化与降解
在250毫升三角瓶中的30毫升培养基中，于30℃条件下，菌株IBL-14经一级培养至对数生长末期后，将3毫升的培养物接种于30毫升的第二级培养基中，二级培养至第9小时，加入10克每升的黄体酮乙醇溶液至黄体酮在培养基中的终浓度为0.05克每升，然后将1毫升浓度为0.02克/毫升的薯蓣皂苷元乙醇溶液加入到30毫升培养液中，继续培养，以TLC及HPLC分析法监测反应进行的情度。结果表明黄体酮对薯蓣皂素的转化与降解有明显的促进作用，可使降解效率提高5％-200％。种子培养基和第二级培养基的组分和浓度如实施例1。
实施例5
维吉尼链霉菌IBL-14对薯蓣皂苷元的转化与降解
在250毫升三角瓶中的30毫升培养基中，于30℃条件下，菌株IBL-14经一级培养至对数期末期时，将3毫升的培养物接种于30毫升的第二级培养基中，二级培养至第9小时，加入10克每升的某诱导剂乙醇溶液至该诱导剂在培养基中的终浓度为0.05克每升，然后将1毫升浓度为0.02克/毫升的薯蓣皂苷元乙醇溶液加入到30毫升培养液中，继续培养，以TLC及HPLC分析法监测反应进行的情度。
所用诱导剂分别为黄体酮、二氢雄酮、表雄酮、氢化可的松、睾雄酮、氢表雄酮、雌酮和胆固醇。
图3为上述几种诱导剂对薯蓣皂苷元代谢所产生的影响，图中横坐标上的0代表未诱导的对照组、1代表二氢雄酮、2是睾酮、3为表雄酮、4为去氢表雄酮、5代表黄体酮、6是氢化可的松、7是胆固醇、8是薯蓣皂素。图3中的10代表25-羟基薯蓣皂酮，11代表薯蓣皂素，12代表薯蓣皂酮。
种子培养基和第二级培养基的组分和浓度如实施例1。
实施例6
维吉尼链霉菌IBL-14对其它甾体化合物的转化与降解
在于250毫升三角瓶中的30毫升培养基中，30℃条件下，菌株IBL-14经一级培养至对数期末期后，将3毫升的培养物接种于30毫升的第二级培养基中，二级培养9小时，加入甾体化合物至在培养基的终浓度为0.2克每升，继续培养2天，所有甾体化合物均可100％被转化降解。
由此可见，大部份甾体化合物可被维吉尼转化与降解。
所用甾体化合物分别为黄体酮，睾酮，异睾酮，ADD，4AD，二氢雄酮，氢化可的松，泼尼松，甲泼尼龙，可的松，表雄酮，异表雄酮，去氢表雄酮，雌酮，雌二醇，雌三醇、地塞米松，倍它米松，沃氏氧化物，奥氏氧化物，及它们的醋酸酯化，丙酸酯化，丁酸酯化，琥珀酯化的衍生物。种子培养基和第二级培养基的组分和浓度如实施例1。
实施例7
维吉尼链霉菌IBL-14对其它甾体化合物的转化与降解
在250毫升三角瓶中的30毫升培养基中，于30℃条件下，菌株IBL-14经一级培养至对数期末期后，将3毫升的培养物接种于30毫升的第二级培养基中，二级培养6小时，加入1毫升浓度为0.3克每升的黄体酮乙醇溶液至30毫升培养基中，培养24小时，黄体酮被完全降解，见图4。种子培养基和第二级培养基的组分和浓度如实施例1。
实施例8
维吉尼链霉菌IBL-14对其它甾体化合物的转化与降解
在250毫升三角瓶中的30毫升培养基中，于30℃条件下，菌株IBL-14经一级培养至对数期末期后，将3毫升的培养物接种于30毫升的第二级培养基中，二级培养15小时，加入1毫升浓度为0.3克每升的黄体酮乙醇溶液至30毫升培养基中，培养24小时，黄体酮被完全降解，见图5。种子培养基和第二级培养基的组分和浓度如实施例1。
实施例9
维吉尼链霉菌IBL-14对其它甾体化合物的转化与降解
在250毫升三角瓶中的30毫升培养基中，于30℃条件下，菌株IBL-14经一级培养至对数期末期后，将3毫升的培养物接种于30毫升的第二级培养基中，二级培养6小时，加入1毫升浓度为0.3克每升的乙醇雌酮溶液至30毫升培养基中，雌酮可在2天内完全降解，见图6。种子培养基和第二级培养基的组分和浓度如实施例1。
实施例10
维吉尼链霉菌IBL-14对其它甾体化合物的转化与降解
在于250毫升三角瓶中的30毫升培养基中，30℃条件下，菌株IBL-14经一级培养至对数期末期后，将3毫升的培养物接种于30毫升的第二级培养基中，二级培养6小时，加入1毫升浓度为0.3克每升的乙醇安宫黄体酮溶液至30毫升培养基中，安宫黄体酮可在5天内降解大于50％，并有多个中间体积累，见图7。种子培养基和第二级培养基的组分和浓度如实施例1。
序列表
<110>华东理工大学
<120>维吉尼链霉菌及其在转化与降解甾体化合物中的应用
<130>SPI068133
<160>1
<170>Patent in Version 2.1
<210>1
<211>907
<212>DNA
<213>维吉尼链霉菌(Streptomyces Virginiae)
<220>
<221>CDS
<400>1
AGA GCT CGT AGG CGG CTT GTC ACG TCG GAT GTG AAA GCC CGA GGC 45
TTA ACC TCG GGT CTG CAT TCG ATA CGG GCT AGC TAG AGT GTG GTA 90
GGG GAG ATC GGA ATT CCT GGT GTA GCG GTG AAA TGC GCA GAT ATC 135
AGG AGG AAC ACC GGT GGC GAA GGC GGA TCT CTG GGC CAT TAC TGA 180
CGC TGA GGA GCG AAA GCG TGG GGA GCG AAC AGG ATT AGA TAC CCT 225
GGT AGT CCA CGC CGT AAA CGT TGG GAA CTA GGT GTT GGC GAC ATT 270
CCA CGT CGT CGG TGC CGC AGC TAA CGC ATT AAG TTC CCC GCC TGG 315
GGA GTA CGG CCG CAA GGC TAA AAC TCA AAG GAA TTG ACG GGG GCC 360
CGC ACA AGC GGC GGA GCA TGT GGC TTA ATT CGA CGC AAC GCG AAG 405
AAC CTT ACC AAG GCT TGA CAT ATA CCG GAA AGC ATT AGA GAT AGT 450
GCC CCC CTT GTG GTC GGT ATA CAG GTG GTG CAT GGC TGT CGT CAG 495
CTC GTG TCG TGA GAT GTT GGG TTA AGT CCC GCA ACG AGC GCA ACC 540
CTT GTC CTG TGT TGC CAG CAT GCC CTT CGG GGT GAT GGG GAC TCA 585
CAG GAG ACC GCC GGG GTC AAC TCG GAG GAA GGT GGG GAC GAC GTC 630
AAG TCA TCA TGC CCC TTA TGT CTT GGG CTG CAC ACG TGC TAC AAT 675
GGC CGG TAC AAT GAG CTG CGA TAC CGT GAG GTG GAG CGA ATC TCA 720
AAA AGC CGG TCT CAG TTC GGA TTG GGG TCT GCA ACT CGA CCC CAT 765
GAA GTC GGA GTC GCT AGT AAT CGC AGA TCA GCA TTG CTG CGG TGA 810
ATA CGT TCC CGG GCC TTG TAC ACA CCG CCC GTC ACG TCA CGA AAG 855
TCG GTA ACA CCC GAA GCC GGT GGC CCA ACC CTT GTG GAG GGA GCT 900
GTC GAA G 907
Claims (10)
1.一种维吉尼链霉菌(Streptomyces virginiae)IBL-14 CCTCCM 206045。
2.采用权利要求1的维吉尼链霉菌CCTCC M 206045对薯蓣皂苷元等甾体化合物进行转化与降解的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)培养维吉尼链霉菌(Streptomyces virginiae)CCTCC M206045；
(2)以步骤(1)的种子接种到空白培养基进行培养，在培养过程中，加入甾体化合物，进行甾体化合物的转化与降解。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将甾体化合物溶解于有机溶剂或将甾体化合物配制成为表面活性剂的水乳液，进行投加。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，将甾体化合物溶入乙醇进行投加，甾体化合物的乙醇溶液浓度为0.1～1克/毫升。基于空白培养基的体积，甾体化合物的加入量为0.1～5克每升培养基。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)的培养方式采用通气培养，培养温度为20～37℃，步骤(2)以空白培养基的体积5-15％的步骤(1)的种子接种到空白培养基进行培养，在培养过程中，加入甾体化合物，进行甾体化合物的转化与降解，培养时间为12～120小时，培养温度为28～32℃。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，甾体化合物于微生物生长对数期投加到培养基中或于生长对数期末投加到培养基中。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在甾体化合物加入到培养液中之前的0-5小时，加入诱导剂，基于培养基的体积，诱导剂的加入量为0.01～0.1克每升。所说的诱导物是具有以下特征的甾体化合物：具有19-27个碳原子，C3位有羟基或酮基和/或在C1和/或C4和/或C5有双键，且A环没有其它取代基时。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，诱导剂选自黄体酮、安宫黄体酮、睾酮、异睾酮、ADD、4AD、二氢雄酮、氢化可的松、泼尼松、甲泼尼龙、可的松、表雄酮、异表雄酮、去氢表雄酮、雌酮、雌二醇、雌三醇、地塞米松、倍它米松、沃氏氧化物或奥氏氧化物，以及上述化合物的醋酸酯化衍生物、丙酸酯化衍生物、丁酸酯化衍生物或琥珀酯化衍生物。
9.根据权利要求2～8任一项所述的方法，其特征在于，所说的甾体化合物具有以下特征：19-27个碳原子，C3位有羟基或酮基和/或在C1和/或C4和/或C5有双键，且A环没有其它取代基。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，甾体化合物选自黄体酮、安宫黄体酮、睾酮、异睾酮、ADD、4AD、二氢雄酮、氢化可的松、泼尼松、甲泼尼龙、可的松、表雄酮、异表雄酮、去氢表雄酮、雌酮、雌二醇、雌三醇、地塞米松、倍它米松、沃氏氧化物或奥氏氧化物，以及上述化合物的醋酸酯化衍生物、丙酸酯化衍生物、丁酸酯化衍生物或琥珀酯化衍生物。
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