CN1219761C - 一种从法夫酵母中高效提取纯化虾青素的新工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从法夫酵母中高效提取纯化虾青素的新工艺，它是将物料与提取溶媒按比例混合后进行负压空化混旋固液萃取，经离心得提取液，提取液减压浓缩至小体积与萃取溶剂进行负压空化混旋液液萃取，萃取液水洗、脱水后减压浓缩至油状物，再经负压柱层析和正压柱层析纯化得98%成品。
Description
所属技术领域
本发明涉及一种从法夫酵母中高效提取和纯化虾青素的方法。
背景技术
虾青素(astaxanthin)3，3′-二羟基-4，4′-二酮基-β，β′-胡萝卜素，分子式C4OH52O4，分子量596.86，是一种萜烯类不饱和化合物，呈粉红色，是600多种类胡萝卜素中的一种。虾青素易于氧化，氧化后变为虾红素(astacene)。虾青素的结构式如图1所示：
图I虾青素的结构式
天然虾青素是一种优质、高效、安全的着色剂和天然抗氧化剂。作为新型饲料添加剂，它能提高动物的免疫力和存活率，增加动物产品的营养价值和外观色泽。
目前在国内虾青素提取纯化中，首要解决的问题是原料的破壁问题，由于该原料细胞壁异常坚硬，对于动物，其摄入后难以消化吸收，因此如何进行法夫酵母细胞内色素的释放，是高效提取虾青素的瓶颈，目前已采用的破壁方法主要有物理法、化学法及酶法等。其中以物理方法中的冷热破壁法破壁率最高，几乎近99％的破壁率，但虾青素的提取率却不高，而利用鲜活物料直接高效提取虾青素的研究目前尚属空白。如何解决上述问题已成为目前国内外研究热点。在虾青素产品的纯化方面，一直是目前国内研究难点，市场中主要经营的是含量仅为20％虾青素粗物料，低价出口至日本、美国等国家，纯化后再倾销至中国，在价格上高出原料价格的20倍，因此虾青素纯化已在目前的研究中越来越重要，要提高其纯度首先要解决的问题是防止在操作过程中氧化。
发明内容
本发明针对上述问题，运用负压空化混旋固液萃取法成功解决了鲜物料在不破损细胞壁的前提下，通过改变细胞壁及细胞膜的通透性，同时利用最佳溶剂将细胞内相关物质抽提出来，提高了虾青素提取率，使虾青素的提出率高达90％以上，尤其是运用负压空化固液萃取法对活菌在不破损细胞壁的前提下对其内容物进行高效提取，这在微生物制药领域处于国际领先地位，填补了活体提取的空白。
本发明运用负压干柱层析进行虾青素纯化，使产品的纯度一次性达到80％，同时省略纯化前皂化的处理工艺。再运用常规正压柱层析对粗品进行纯化，可得到纯度为98％的成品。本发明还运用自制的氮气保护柜解决了操作过程中提取物易氧化的问题，简化了纯化步骤。
发明优点
使用本发明的方法提取纯化虾青素具有成本低、周期短、步骤简单、成品纯度高、无污染等优点，打破了提取虾青素必须先破碎细胞壁的陈旧规律，解决了虾青素易氧化的难题，实现了虾青素的提取不用破壁、纯化不用皂化，为微生物制药提供了广阔的前景。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作进一步详细描述：
物料与提取溶媒按比例混合后进行负压空化混旋固液萃取，经离心得提取液，提取液减压浓缩至小体积与萃取溶剂进行负压空化混旋液液萃取，萃取液水洗、脱水后减压浓缩至油状物，再经负压柱层析和正压柱层析纯化得98％成品。
所述的物料为烘干的法夫酵母或鲜活的法夫酵母浓缩物。
所述的提取溶媒为50-100％的乙醇溶液。提取溶媒的体积为活体法夫酵母体积的10-30倍；干物料为每克加10-30ml提取溶媒。
所述的负压空化混旋固液萃取，其工艺条件为萃取次数为三次，每次空化时间为0.5-2小时，压力为-0.06--0.1Mpa，空化的空气流量为2-8立方米/小时，所通气体为空气或氮气，空化柱底部放复合材料。
所述的提取液减压浓缩，其温度为40-60℃，压力为-0.06--0.1Mpa，氮气保护。
所述的萃取溶剂为二氯甲烷或三氯甲烷。
所述的负压空化混旋液液萃取的工艺条件为通气量为2-8立方米/小时，压力为-0.06--0.1Mpa，时间为2-15分钟，液液体积比为1∶1，充分萃取后，缓慢加入蒸馏水促使分层，分层后收集有机相。
所述的水洗次数为3-5次，脱水使用的脱水剂为无水硫酸钠、氧化铝或硅胶。
所述的萃取液减压浓缩的温度为30-40℃，压力为-0.06--0.1Mpa，氮气保护。
实施例1：
将500ml法夫酵母鲜物料与5000ml浓度为90％的乙醇溶液混合，负压空化混旋固液萃取40分钟，离心保留上清液，将剩余固形物加5000ml浓度为90％的乙醇溶液，负压空化混旋固液萃取40分钟，离心保留上清液，剩余固形物再加5000ml浓度为90％的乙醇溶液，负压空化混旋固液萃取40分钟，离心弃沉淀，将三次离心所得的上清液合并后减压浓缩至150ml，压力为-0.06--0.1Mpa，温度为50℃，将浓缩液与150ml二氯甲烷混合后进行负压空化混旋液液萃取，空化时间为5分钟，空气流量为2-8立方米/小时，压力为-0.06--0.1Mpa，静止后缓慢加入蒸馏水促使分层，取下面二氯甲烷层水洗4次，加过量无水硫酸钠脱水，然后减压浓缩除去二氯甲烷得油状物，浓缩温度为35℃，压力为-0.06--0.1Mpa，加3ml石油醚溶解油状物，再使用负压柱层析对油状物进行纯化，取吸附有目标产物的硅胶，用二氯甲烷和乙醇的比例为100∶1的混合液进行洗脱，滤除硅胶，减压除去洗脱液，温度为35℃，压力为-0.06--0.1Mpa，得油状物质，加入2ml石油醚溶解油状物，密封后放入冰箱，1-3天后取出下层晶体，纯度为80.1％，再使用正压柱层析法进行纯化，最后得到纯度为98.1％的成品0.246g，得率为4.1‰。
实施例2：
将2L法夫酵母鲜物料与30L浓度为85％的乙醇溶液混合，负压空化混旋固液萃取1小时，离心保留上清液，将剩余固形物加30L浓度为85％的乙醇溶液，负压空化混旋固液萃取1小时，离心保留上清液，剩余固形物再加30L浓度为85％的乙醇溶液，负压空化混旋固液萃取1小时，离心弃沉淀，将三次离心所得的上清液合并进行减压浓缩至900ml，压力为-0.06--0.1Mpa，温度为50℃，将浓缩液与900ml二氯甲烷混合后进行负压空化混旋液液萃取，空化时间为4分钟，空气流量为2-8立方米/小时，压力为-0.06--0.1Mpa，静止后缓慢加入蒸馏水促使分层，取下面二氯甲烷层水洗5次，加过量无水硫酸钠脱水，然后减压浓缩除去二氯甲烷得油状物，温度为35℃，压力为-0.06--0.1Mpa，加12ml石油醚溶解油状物，再使用负压干柱层析对油状物进行纯化，取吸附有目标产物的硅胶，用二氯甲烷和乙醇的比例为100∶1的混合液进行洗脱，滤除硅胶，减压除去洗脱液，温度为35℃，压力为-0.06--0.1Mpa，得油状物质，加入10ml石油醚溶解油状物，密封后放入冰箱，1-3天后取出下层晶体，纯度为80.5％，再使用正压柱层析法进行纯化，最后得到纯度为98.3％的成品1.032g，得率为4.3‰。
实施例3：
将120g法夫酵母干物料与2.4L浓度为90％的乙醇溶液混合，负压空化混旋固液萃取1小时，离心保留上清液，将剩余固形物加2.4L浓度为90％的乙醇溶液，负压空化混旋固液萃取1小时，离心保留上清液，剩余固形物再加2.4L浓度为90％的乙醇溶液，负压空化混旋固液萃取1小时，离心弃沉淀，将三次离心所得的上清液合并进行减压浓缩至500ml，压力为-0.06--0.1Mpa，温度为50℃，将浓缩液与500ml二氯甲烷混合后，进行负压空化混旋液液萃取，空化时间为6分钟，空气流量为2-8立方米/小时，压力为-0.06--0.1Mpa，静止后缓慢加入蒸馏水促使分层，取下面二氯甲烷层水洗5次，加过量无水硫酸钠脱水，然后减压浓缩除去二氯甲烷得油状物，温度为35℃，压力为-0.06--0.1Mpa，加5ml石油醚溶解油状物，再使用负压干柱层析对油状物进行纯化，取吸附有目标产物的硅胶，用二氯甲烷和乙醇的比例为100∶1的混合液进行洗脱，滤除硅胶，减压除去洗脱液，温度为35℃，压力为-0.06--0.1Mpa，得油状物质，加入5ml石油醚溶解油状物，密封后放入冰箱，1-3天后取出下层晶体，纯度为80.4％，再使用正压柱层析法进行纯化，最后得到纯度为98.2％的成品0.48g，得率为4‰。
Claims (7)
1.一种从法夫酵母中高效提取纯化虾青素的新工艺，包括下列步骤：
步骤1.将物料与提取溶媒按比例混合后进行负压空化混旋固液萃取，其工艺条件为萃取次数为三次，每次空化时间为0.5-2小时，压力为-0.06--0.1Mpa，空化的空气流量为2-8立方米/小时，所通气体为空气或氮气，空化柱底部放复合材料；
步骤2.离心得提取液，提取液减压浓缩至小体积与萃取溶剂进行负压空化混旋液液萃取，其工艺条件为通气量为2-8立方米/小时，压力为-0.06--0.1Mpa，时间为2-15分钟，液液体积比为1∶1，充分萃取后，缓慢加入蒸馏水促使分层，分层后收集有机相；
步骤3.萃取液水洗、脱水后减压浓缩至油状物；
步骤4.油状物再经负压柱层析和正压柱层析纯化得98％成品。
2.按照权利要求1所述的一种从法夫酵母中高效提取纯化虾青素的新工艺，其特征在于：物料为烘干的法夫酵母或鲜活的法夫酵母浓缩物。
3.按照权利要求1所述的一种从法夫酵母中高效提取纯化虾青素的新工艺，其特征在于：提取溶媒为50-100％的乙醇溶液；提取溶媒的体积为活体法夫酵母体积的10-30倍；干物料为每克加10-30ml提取溶媒。
4.按照权利要求1所述的一种从法夫酵母中高效提取纯化虾青素的新工艺，其特征在于：提取液减压浓缩，其温度为40-60℃，压力为-0.06--0.1Mpa，氮气保护。
5.按照权利要求1所述的一种从法夫酵母中高效提取纯化虾青素的新工艺，其特征在于：萃取溶剂为二氯甲烷或三氯甲烷。
6.按照权利要求1所述的一种从法夫酵母中高效提取纯化虾青素的新工艺，其特征在于：萃取液的水洗次数为3-5次，脱水使用的脱水剂为无水硫酸钠、氧化铝或硅胶。
7.按照权利要求1所述的一种从法夫酵母中高效提取纯化虾青素1的新工艺，其特征在于：萃取液减压浓缩的温度为30-40℃，压力为-0.06--0.1Mpa，氮气保护。
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