CN121450552B

CN121450552B - 一株苏云金芽孢杆菌、菌剂、复合杀虫剂及其应用

Info

Publication number: CN121450552B
Application number: CN202610017885.9A
Authority: CN
Inventors: 周波; 王丽荣; 胡著然; 杨美玲; 樊梅娜; 张婷婷; 陈宏敏; 王滕; 李如雪; 王红
Original assignee: Shandong Greenblue Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shandong Greenblue Biotechnology Co ltd
Filing date: 2026-01-08
Publication date: 2026-05-08
Anticipated expiration: 2046-01-08

Abstract

本发明公开了一株苏云金芽孢杆菌、菌剂、复合杀虫剂及其应用，属于微生物和发酵工程领域。本发明从患病夜蛾死虫中分离到一株苏云金芽孢杆菌BT001，本发明的苏云金芽孢杆菌BT001毒力强，杀虫谱广，具有一定的耐盐、耐重金属离子、耐碱和耐高温性能，对紫外线也具有一定耐受性；且能够耐受多种农药杀虫剂，可以与多种农药杀虫剂复配使用，协同提高杀虫效果；本发明的苏云金芽孢杆菌BT001同时还具有促生作用。因此，本发明的苏云金芽孢杆菌BT001可用于农业虫害的防治，具有重要的应用前景。

Description

一株苏云金芽孢杆菌、菌剂、复合杀虫剂及其应用

技术领域

本发明涉及微生物和发酵工程领域，特别涉及农业微生物防控技术领域，具体涉及一株苏云金芽孢杆菌、菌剂、复合杀虫剂及其应用。

背景技术

在农业生产中，有害生物对作物的危害可依据发生部位划分为地上与地下危害两类，不同类型的有害生物危害方式、造成的影响存在明显区别，严重威胁着全球农作物的安全生产与产量稳定。

鳞翅目害虫是危害农作物的主要地上类群，其中草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）、斜纹夜蛾（Spodoptera litura）和亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis Guené e）等是典型代表。其中：草地贪夜蛾和斜纹夜蛾均具有食性杂、寄主广、繁殖力强、可造成严重危害的特点，能侵害玉米、大豆、花生、马铃薯等多种作物，其危害均来自幼虫期。以斜纹夜蛾为例，初孵幼虫常群集取食叶肉，2龄后分散并啃食叶片下表皮与叶肉，仅留上表皮，3龄后食量增大导致叶片呈斑驳状，4龄后进入暴食期，严重时可将叶片、花器、果实全部破坏。玉米螟主要危害玉米、高粱等禾本科作物。其幼虫钻蛀茎秆和穗轴，破坏植株内部组织，易导致倒折和籽粒灌浆不足，从而造成严重减产。

植物寄生线虫是危害农作物的主要地下类群，这类害虫是重要的土传有害生物，南方根结线虫（Meloidogyne incognita）尤为典型，随着设施蔬菜产业的发展，其危害愈发严重。线虫的侵染过程具有明确规律：卵囊在适宜条件下孵化出二龄幼虫，幼虫在土壤中游动寻找寄主根系，通过口针穿刺根尖等幼嫩组织后侵入内部，迁移至维管束附近建立取食位点，在此过程中，线虫唾液腺分泌的酶类、效应蛋白及植物激素类似物会干扰植物生理代谢，诱导根部细胞形成巨型细胞作为长期营养源，进而导致根系出现根结、腐烂及坏死等病变，破坏根系结构与功能，影响水分和养分的吸收运输，最终使受侵植株地上部表现为生长迟缓、黄化、矮化，严重时整株枯死，造成重大产量损失。

目前针对鳞翅目害虫与线虫的防治，普遍采取以化学防治为核心，生物防治与物理防治为辅的综合策略。在化学防治方面，针对鳞翅目害虫重点防控卵期及低龄幼虫阶段，常用20%氯虫苯甲酰胺悬浮剂2000倍液、6%高效氯氟氰菊酯悬浮剂2000倍液等，施药时需聚焦叶片背面、幼嫩茎秆及心叶等部位。针对土壤中的线虫，可在播种前采用沟施或穴施进行土壤处理，或在作物生长期采用灌根方式施药。常用5%阿维菌素微乳剂1500倍液，或41.7%氟吡菌酰胺悬浮剂3000倍液。在生物防治方面，针对鳞翅目害虫可分阶段施策：卵期释放螟黄赤眼蜂、暗黑赤眼蜂等寄生性天敌；幼虫期投放异色瓢虫、龟纹瓢虫等捕食性天敌。针对线虫，主要应用淡紫拟青霉、厚垣轮枝菌等生防菌剂，通过孢子萌发与菌丝寄生破坏线虫的卵及雌虫结构，从而抑制其种群增长。在物理防治方面，对具趋化性的鳞翅目夜蛾类成虫，可采用糖醋液诱杀或性诱芯配合粘虫板诱捕雄虫，以降低交配率与虫口数量；对线虫则多采用日光消毒、高温闷棚、热水处理土壤或浸泡种苗等方法直接杀灭或削弱其活性，可有效减少田间线虫基数。

但是，上述防治措施存在诸多瓶颈：化学农药易使害虫产生抗药性，且存在农药残留风险，威胁食品安全与生态环境；物理防治成本较高，难以实现规模化应用；生物防治存在天敌昆虫定殖困难、见效缓慢等问题。在此背景下，微生物农药成为当前最具可行性的绿色防治突破口，值得关注的是，苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）作为一类应用广泛的微生物资源，不仅在鳞翅目等害虫防治中展现出良好效果，对线虫亦具有一定的防治潜力，通过“以菌治虫”的生态调控模式，成为绿色植保体系的核心支柱，兼具环境安全性、靶向性与可持续性，代表了现代农业虫害防治的科学方向。但随着Bt制剂的使用，出现了Bt毒力不强、杀虫谱窄、防效不稳定等问题，因此，亟需筛选新的毒力强、杀虫谱广、对环境耐受、稳定性强的苏云金芽孢杆菌。

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一株苏云金芽孢杆菌、菌剂、复合杀虫剂及其应用。本发明的苏云金芽孢杆菌具有毒力强、杀虫谱广、对环境耐受性强的优点；且对多种化学药剂不敏感，可与化学药剂联合使用，对鳞翅目害虫和线虫具有显著的防治效果。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一株苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）BT001，该菌株已于2025年10月27日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，地址：中国武汉，武汉大学），其保藏编号为：CCTCC NO: M 20252346，分类命名为：苏云金芽孢杆菌BT001Bacillus thuringiensisBT001。

本发明的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）BT001与现有报道的苏云金芽孢杆菌相比，其主要特性为：

（1）毒力强：对斜纹夜蛾2龄幼虫、草地贪夜蛾1-2龄幼虫的毒杀效果可达100%；

（2）杀虫谱广：对斜纹夜蛾、草地贪夜蛾、玉米螟等地上类群害虫，以及南方根结线虫等地下类害虫均具有杀虫效果；

（3）防效稳定：苏云金芽孢杆菌BT001具有UVC抗性，对现有常用的多种杀虫农药均不敏感，不会产生拮抗反应，对环境耐受性强；

（4）协同增效：将苏云金芽孢杆菌BT001与苦参碱、灭幼脲和噻唑膦等化学药剂复配使用，能够协同提高其防效，取得了1+1>2的防治效果。

（5）促生：能够提高植株鲜重和根系干重，促进植物健康生长。

综上，本发明的苏云金芽孢杆菌BT001集多种优异性能于一体，是一株极具应用前景的生防菌。

本发明的第二方面，提供一种菌剂，所述菌剂中含有上述苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）BT001。

优选的，所述菌剂中，苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）BT001以被培养的活菌、发酵液、菌悬液和孢子液中的一种或多种形式存在。

进一步的，所述的发酵液是指将菌种接种于培养基中，培养一段时间后的液体。

在本发明一些优选的实施方案中，所述发酵液由如下方法制备而成：

将苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）BT001接种于葡萄糖-酵母培养基中，于37 ℃、180 r/min振荡培养48 h。

更优选的，所述葡萄糖-酵母培养基的成分为：葡萄糖5 g/L、酵母提取物5 g/L、蛋白胨5 g/L、磷酸氢二钾1 g/L、硫酸镁0.2 g/L、硫酸锰0.02 g/L。

所述的菌悬液是指发酵液经离心后的菌体沉淀，经重悬得到。

所述的孢子液是指将菌株发酵培养过程中脱落的孢子收集，用无菌水配制成孢子液。

本发明的第三方面，提供上述苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）BT001或菌剂在制备杀虫剂中的应用。

上述应用中，所述杀虫剂防治的害虫种类包括：斜纹夜蛾、草地贪夜蛾、玉米螟和/或南方根结线虫。

本发明的第四方面，提供一种复合杀虫剂，所述复合杀虫剂由苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）BT001与农药化合物复配而成；

所述农药化合物选自苦参碱、灭幼脲、阿维菌素、噻唑膦、氯虫苯甲酰胺中的一种或多种。

优选的，所述复合杀虫剂为如下（1）-（3）任一所示：

（1）苏云金芽孢杆菌-苦参碱复合杀虫剂：苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）BT001发酵液与苦参碱稀释液按体积比为1:1复配而成；

（2）苏云金芽孢杆菌-灭幼脲复合杀虫剂：苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）BT001发酵液与灭幼脲稀释液按体积比为1:1复配而成；

（3）苏云金芽孢杆菌-噻唑膦复合杀虫剂：苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）BT001发酵液与噻唑膦颗粒复配而成。

更优选的，上述苏云金芽孢杆菌-苦参碱复合杀虫剂中，苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）BT001发酵液中的孢子浓度为1×10⁶CFU/mL-1×10⁷CFU/mL；苦参碱稀释液的浓度为5 mg/L-10 mg/L。

更优选的，上述苏云金芽孢杆菌-灭幼脲复合杀虫剂中，苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）BT001发酵液中的孢子浓度为1×10⁷CFU/mL；灭幼脲稀释液的浓度为250 mg/L。

更优选的，上述苏云金芽孢杆菌-噻唑膦复合杀虫剂中，苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）BT001发酵液的活菌数为5×10⁷CFU/mL；苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）BT001发酵液与10%噻唑膦颗粒按200mL:0.2g复配。

本发明的第五方面，提供上述复合杀虫剂在防治植物虫害中的应用；所述植物虫害是由斜纹夜蛾、草地贪夜蛾、玉米螟和/或南方根结线虫引起的。

本发明的有益效果：

（1）本发明从患病夜蛾死虫中分离到一株苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）BT001，本发明的苏云金芽孢杆菌BT001毒力强、杀虫谱广，具有一定的耐盐、耐重金属离子、耐碱和耐高温性能，对紫外线也具有一定耐受性；而且能够耐受多种农药杀虫剂。

（2）本发明的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）BT001可以与农药杀虫剂复配使用，协同提高杀虫效果；本发明的苏云金芽孢杆菌BT001同时还具有促生作用。因此，本发明的苏云金芽孢杆菌BT001可用于农业虫害的防治，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1：患病夜蛾死虫；左为斜纹夜蛾，右为草地贪夜蛾。

图2：死虫中分离的菌落；图中，A为疑似苏云金芽孢杆菌的典型菌落形态；B为该菌落的镜检图，显微形态显示其孢子旁伴有典型的伴孢晶体。

图3：苏云金芽孢杆菌单菌落。

图4：苏云金芽孢杆菌单菌落镜检图，显微形态显示其孢子旁伴有典型的伴孢晶体。

图5：苏云金芽孢杆菌BT001对斜纹夜蛾2龄幼虫的毒杀效果。

图6：四株苏云金芽孢杆菌对化学农药的敏感性试验结果，其中，A为菌株BT001对8种化学药剂的敏感性试验结果；B为菌株NBL-B0207对8种化学药剂的敏感性试验结果；C为菌株NBL-B0249对8种化学药剂的敏感性试验结果；D为菌株NBL-BS33对8种化学药剂的敏感性试验结果；图中，1.吡虫啉；2.灭幼脲；3.阿维菌素；4.高效氯氟氰菊酯；5.印楝素；6.苦参碱；7.氯虫苯甲酰胺；8.噻唑膦，红色圈出表示产生拮抗反应。

图7：四株苏云金芽孢杆菌对紫外线的敏感性试验结果。

图8：苏云金芽孢杆菌BT001使用不同培养基发酵48 h镜检图。

图9：苏云金芽孢杆菌BT001镜检图；葡萄糖-酵母培养基中培养48小时（左），转移至室外环境诱导孢子脱落（中），最终完成脱落（右）。

图10：苏云金芽孢杆菌BT001对白菜防治草地贪夜蛾1龄幼虫的防治效果；图中，B为A中圆圈部位的放大图。

图11：苏云金芽孢杆菌BT001对白菜防治斜纹夜蛾2龄幼虫的防治效果。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。实施例中未注明的试验具体条件，通常按照常规条件，或者按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。其中：

营养肉汤（NB）培养基：蛋白胨10 g，牛肉浸膏3 g，氯化钠5 g，蒸馏水1 L，pH自然，121 ℃灭菌20 min。

NA培养基：蛋白胨10 g，牛肉浸膏3 g，氯化钠5 g，琼脂20 g，蒸馏水1 L，pH自然，121 ℃灭菌20 min。

LB培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，蒸馏水1 L，pH 7，121 ℃灭菌20 min。

葡萄糖-酵母培养基：葡萄糖5 g，酵母提取物5 g，蛋白胨5 g，磷酸氢二钾1 g，硫酸镁0.2 g，硫酸锰0.02 g，蒸馏水1 L，pH 7，其中葡萄糖单独115 ℃灭菌15 min，剩余组分121℃灭菌20 min，将灭菌的葡萄糖在无菌条件下加入已灭菌的剩余组分中。

经济型发酵培养基：豆饼粉20 g，玉米淀粉10 g，磷酸氢二钾1 g，碳酸钙2 g，蒸馏水1 L，pH 7，121 ℃灭菌20 min。

苏云金芽孢杆菌NBL-B0207、NBL-B0249、NBL-BS33均由山东碧蓝生物科技有限公司科创中心菌种资源库提供。

吡虫啉、灭幼脲、阿维菌素、高效氯氟氰菊酯、印楝素、苦参碱、氯虫苯甲酰胺和噻唑膦均为市售产品。

实施例1：菌株的分离、鉴定

1、菌株的分离：

从实验室内饲养的患病夜蛾死虫中分离筛选生防菌，死亡的虫体表面发黑（如图1所示），将染病死虫先用5%的次氯酸钠消毒3 min，然后用75%酒精消毒30 s，再用无菌水依次冲洗5 min、4 min、3 min，最后将洗干净的虫体放入灭菌研钵中，加入少量无菌水没过虫体，进行研磨，研磨充分后，吸取1 mL研磨过的虫体置于0.9%的生理盐水99 mL中，放入30℃、180r/min摇床中摇晃1 h。取出摇瓶，用0.9%的生理盐水进行梯度稀释（至10^-3、10^-4），最后取100 μL稀释液均匀涂布于NA培养基平板上，37 ℃倒置培养3d。

患病夜蛾死虫中生防菌的筛选结果如图2所示，10^-4稀释液所涂布的平板上出现多个单菌落，其中有类似苏云金芽孢杆菌的单菌落，对单菌落进行镜检，类似苏云金芽孢杆菌的单菌落镜检发现孢子旁出现伴孢晶体，初步推断该菌为苏云金芽孢杆菌，命名为BT001，并进行进一步鉴定工作。

2、菌株的鉴定：

2.1菌落形态鉴定

将菌株BT001单菌落划线至NA培养基平板上，平板倒置于37 ℃恒温培养箱，培养24 h后，形成灰白色至乳白色、不透明、表面干燥粗糙的菌落，菌落边缘呈不规则锯齿状或扩散状，菌落直径为2-5 mm，质地较硬，易挑起（图3）。

2.2菌体、孢子形态鉴定

通过革兰氏染色观察，菌株BT001为革兰氏阳性（G⁺）大杆菌，呈短链或单细胞排列，菌体大小约为1.0-1.2 μm × 3-5 μm。在营养生长期，菌体两端钝圆，细胞质均匀染色；进入孢子形成期后，菌体中央出现无色透明区域（芽孢前体），37℃培养48h后孢子开始脱落，芽孢为椭圆形、端生或近端生，直径略小于菌体，经结晶紫染色后，光学显微镜下观察孢子中空，周围伴随有紫色菱形伴孢晶体（图4）。

2.3分子生物学鉴定

对菌株BT001进行基于16S rRNA基因序列进行测序鉴定，提取菌株BT001基因组，使用的引物为16S rRNA基因序列通用引物（16S-1序列：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）（16S-2序列：5’-CGGCTACCTTGTTACGAC-3’），送往生工生物工程股份有限公司进行测序，菌株BT001 16S rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。

通过Ezbiocloud分析，菌株BT001为芽孢杆菌属（Bacillus），其与苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensisSXFB3）（99.93%）、苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensisB62）（99.86％）和苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensisZG608）（99.79%）共享最高16s rRNA基因序列相似性。

综上，结合菌落形态鉴定、菌体和孢子形态鉴定、分子生物学鉴定结果，将菌株BT001鉴定为苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）。

实施例2：生防菌的毒杀对比试验

1、试验方法

将实施例1筛选的苏云金芽孢杆菌BT001和苏云金芽孢杆菌NBL-B0207、NBL-B0249、NBL-BS33作为试验生防菌，进行毒杀对比试验，考察其对鳞翅目2龄斜纹夜蛾幼虫的毒杀能力。斜纹夜蛾1-6龄幼虫特征如表1所示：

表1：斜纹夜蛾1-6龄幼虫特征

发酵液制备：分别挑取上述四株苏云金芽孢杆菌的单菌落，接种于营养肉汤（NB）培养基，于37 ℃、180 r/min条件下振荡培养48 h，待镜检显示80%孢子脱落后终止培养，用无菌水将四株苏云金芽孢杆菌的发酵液活菌数均调整为5×10⁷CFU/mL。

采用拌食饲喂法，每10 g人工饲料中加入3 mL发酵液搅拌均匀，确保饲料充分吸收发酵液后再进行饲喂，以2龄斜纹夜蛾幼虫为供试虫源，毒杀试验于一次性塑料培养皿内进行。具体试验方案如下：

试验共设置6个处理，处理1：饲料中拌入苏云金芽孢杆菌BT001发酵液；处理2：饲料中拌入苏云金芽孢杆菌NBL-B0207发酵液；处理3：饲料中拌入苏云金芽孢杆菌NBL-B0249发酵液；处理4：饲料中拌入苏云金芽孢杆菌NBL-BS33发酵液；处理5：饲料中拌入等量的以1000倍稀释的阿维菌素（有效成分5%）作为阳性对照；处理6：饲料中拌入等量的NB培养基作为阴性对照。每处理20头幼虫，重复3次。处理后置于26±1℃，相对湿度60-70%，光周期16:8（L:D）的条件下饲养，持续观察7 d，记录幼虫死亡数，死亡率的计算公式如下：

死亡率=（死亡虫数/总供试虫数）×100%

2、试验结果：

四株苏云金芽孢杆菌对2龄斜纹夜蛾幼虫毒杀结果如表2所示。

表2：四株苏云金芽孢杆菌对2龄斜纹夜蛾幼虫的毒杀结果

结果表明：阴性对照幼虫死亡率0，阳性对照幼虫死亡率为100%，菌株BT001对斜纹夜蛾2龄幼虫表现出较高的毒杀效果，菌株BT001拌食处理后5 d培养皿内幼虫均死亡（图5），死亡率高达100%；但其他三株苏云金芽孢杆菌NBL-B0207、NBL-B0249、NBL-BS33拌食处理后幼虫死亡率均低于70%。因此通过4株苏云金芽孢杆菌的体外毒杀试验，初步确定菌株BT001对夜蛾幼虫毒杀效果最优，可作为高效能生防菌株进一步挖掘。

实施例3：苏云金芽孢杆菌对化学农药的敏感性试验

1、试验方法

将实施例1筛选的苏云金芽孢杆菌BT001和苏云金芽孢杆菌NBL-B0207、NBL-B0249、NBL-BS33作为试验生防菌，按实施例2的方法制备四株苏云金芽孢杆菌的发酵液，用无菌水将四株苏云金芽孢杆菌的发酵液活菌数均调整为5×10⁷CFU/mL。

供试农药：1.吡虫啉（70%有效成分含量）、2.灭幼脲（25%有效成分含量）、3.阿维菌素（5%有效成分含量）、4.高效氯氟氰菊酯（10%有效成分含量）、5.印楝素（0.5%有效成分含量）、6.苦参碱（0.5%有效成分含量）、7.氯虫苯甲酰胺（20%有效成分含量）、8.噻唑膦（3%有效成分含量）；各种供试农药均稀释1000倍用做试验。

首先分别吸取四株苏云金芽孢杆菌发酵液100 μL均匀涂布于NA培养基平板上，将双层无菌滤纸片均匀分布在涂布好的培养基上，分别吸取5μL农药滴至滤纸片上，重复三次，平板置37℃培养箱中培养24 h后观察平板有无透明圈，以确定是否产生拮抗反应。

2.试验结果

菌株BT001对所使用的8种化学药剂（1.吡虫啉；2.灭幼脲；3.阿维菌素；4.高效氯氟氰菊酯；5.印楝素；6.苦参碱；7.氯虫苯甲酰胺；8.噻唑膦）均耐受（如图6中的A所示），没有拮抗反应，可与这8种农药进行复配形成产品或大田混合使用于作物上。

菌株NBL-B0207对所使用的8种化学药剂（1.吡虫啉；2.灭幼脲；3.阿维菌素；4.高效氯氟氰菊酯；5.印楝素；6.苦参碱；7.氯虫苯甲酰胺；8.噻唑膦）部分不耐受（如图6中的B所示），与1.吡虫啉、3.阿维菌素、7.氯虫苯甲酰胺有拮抗反应，不适合与这3种农药进行复配形成产品，在大田施药时不建议一起混用。

NBL-B0249对所使用的8种化学药剂（1.吡虫啉；2.灭幼脲；3.阿维菌素；4.高效氯氟氰菊酯；5.印楝素；6.苦参碱；7.氯虫苯甲酰胺；8.噻唑膦）部分不耐受（如图6中的C所示），与1.吡虫啉、2.灭幼脲、7.氯虫苯甲酰胺有拮抗反应，不适合与这3种农药进行复配形成产品，在大田施药时不建议一起混用。

NBL-BS33对所使用的8种化学药剂（1.吡虫啉；2.灭幼脲；3.阿维菌素；4.高效氯氟氰菊酯；5.印楝素；6.苦参碱；7.氯虫苯甲酰胺；8.噻唑膦）部分不耐受（如图6中的D所示），与1.吡虫啉、2.灭幼脲、4.高效氯氟氰菊酯、7.氯虫苯甲酰胺有拮抗反应，不适合与这4种农药进行复配形成产品，在大田施药时不建议一起混用。

实施例4：苏云金芽孢杆菌的耐受性试验

1.试验方法

将实施例1筛选的苏云金芽孢杆菌BT001和苏云金芽孢杆菌NBL-B0207、NBL-B0249、NBL-BS33作为试验生防菌，按实施例2的方法制备四株苏云金芽孢杆菌的发酵液。发酵液经80℃水浴30min，再用无菌水进行稀释调整得到最终孢子数均为550CFU/mL的孢子液，以此孢子液作为后述试验的处理液备用。

1.1不同含量NaCl试验

分别吸取0.2mL 4株苏云金芽孢杆菌的孢子液涂布于NaCl含量分别为0%（对照）、1%、5%、10%、15%、20%的NA培养基平板上，除去误差和死亡的菌细胞，每个平板上约有100个活孢子，共6个处理组，每个处理组设置3个重复。将平板放置于37℃恒温培养箱中培养24h，观察菌株生长情况。通过计数各平板菌落数，计算存活率（存活率＝各盐度处理组平均菌落数/对照组平均菌落数×100%），评估盐胁迫对各菌株生长的影响。

1.2不同含量镉离子（Cd²⁺）试验

分别吸取0.2mL 4株苏云金芽孢杆菌的孢子液涂布于Cd²⁺浓度分别为0 g/L（对照）、0.1g/L、0.2g/L、0.4g/L、0.8g/L、1.0g/L的NA培养基平板上，除去误差和死亡的菌细胞，每个平板上约有100个活孢子，共6个处理组，每个处理组设置3个重复。将平板放置于37℃恒温培养箱中培养24h，观察菌株生长情况。通过计数各平板菌落数，计算存活率（存活率＝各Cd²⁺浓度处理组平均菌落数/对照组平均菌落数×100%），评估不同Cd²⁺浓度对各菌株生长的抑制效应。

1.3不同pH试验

分别吸取0.2mL 4株苏云金芽孢杆菌的孢子液涂布于pH值分别为5、7（对照）、9、12的NA培养基平板上，除去误差和死亡的菌细胞，每个平板上约有100个活孢子，共4个处理组，每处理组设置3个重复。将平板放置于37℃恒温培养箱中培养24h，观察菌株生长情况。通过计数各平板菌落数，并计算存活率（存活率＝各pH处理组平均菌落数/对照组平均菌落数×100%），评估不同pH对各菌株生长的抑制效应。

1.4不同温度试验

分别吸取0.2mL 4株苏云金芽孢杆菌的孢子液涂布于NA培养基平板上，除去误差和死亡的菌细胞，每个平板上约有100个活孢子。处理设置三个温度梯度：90℃、80℃、70℃，每个温度分别处理5分钟和10分钟，另设一组未经热处理的孢子悬液作为对照。共7个处理组，每个处理组设置3个重复。分别将孢子悬液在相应温度水浴处理后，立即涂布于NA平板。所有平板置于37℃恒温培养箱培养24h，计数菌落数，并计算存活率（存活率＝各热处理组平均菌落数/对照组平均菌落数×100%），评估不同温度-时间组合对各菌株存活率的影响。

1.5紫外照射不同时间试验

分别吸取2mL 4株苏云金芽孢杆菌的孢子液涂布于NA培养基平板上，除去误差和死亡的菌细胞，每个平板上约有1000个活孢子。将平板置于30 W低压汞灯（主波长254 nm）下方垂直30 cm进行照射，分别照射0min（对照）、1min、5min、15min、30min、60min，共6个处理组，每个处理组设置3个重复，然后将平板放置于37℃恒温培养箱中培养24h，观察菌株生长情况。

2.试验结果

2.1不同含量NaCl试验

不同含量NaCl处理四株苏云金芽孢杆菌的存活率结果如表3所示。

表3：不同含量NaCl处理四株试验菌的存活率（％）

根据盐分耐受性试验数据，所有四株苏云金芽孢杆菌在盐分含量1%至5%范围内均表现出较高的存活率，且随盐浓度增加呈现规律性下降趋势。菌株间耐盐能力差异较为明显，其中BT001的耐盐性最强。从10% NaCl开始，除BT001有低存活（4.27%）外，其余三株均完全不能生长。结果表明，菌株BT001表现出相对更优的耐盐适应性。

2.2不同含量Cd²⁺试验

不同含量Cd²⁺处理四株苏云金芽孢杆菌的存活率结果如表4所示。

表4：不同含量Cd²⁺处理4株试验菌的存活率（％）

根据四株苏云金芽孢杆菌对镉离子（Cd²⁺）的耐受性试验结果，各菌株的存活率均随Cd²⁺浓度升高而显著下降。在0.1–0.2 g/L Cd²⁺浓度范围内，所有菌株仍保持较高存活率（68.65%–93.04%），显示出一定的耐受能力。当浓度提升至0.4 g/L时，存活率急剧下降至33.66%–54.97%。浓度达到0.8 g/L时，存活率已普遍低于13%，说明该浓度对菌株生长构成严重抑制。至1.0 g/L Cd²⁺条件下，所有菌株存活率均为零，表明该浓度已完全抑制其生长。其中，菌株BT001在0.1-0.8 g/L Cd²⁺浓度下均表现出最高的耐受能力，显示出相对更强的重金属抗性潜力。

2.3不同pH试验

不同pH处理四株苏云金芽孢杆菌的存活率结果如表5所示。

表5：不同pH处理4株试验菌的存活率（％）

根据四株苏云金芽孢杆菌在不同碱性pH条件下的耐受性试验结果，四株菌株在pH9环境中均表现出较高存活率（85.43%–96.08%），当环境达到强碱性pH 12时，仅菌株BT001仍保留微量生长（3.26%），其余菌株几乎无法存活，说明pH 12已接近或达到其生长的致死临界值。整体而言，菌株BT001在酸碱环境下均表现出相对较强的耐受性。

2.4不同温度试验

不同温度处理四株苏云金芽孢杆菌的存活率结果如表6所示。

表6：不同温度处理4株试验菌的存活率（％）

根据四株苏云金芽孢杆菌在不同热胁迫处理下的结果，高温（90°C）短时处理即四株苏云金芽孢杆菌存活率均显著下降，而延长处理时间会进一步加剧热致死效应，尤其在80°C和90°C条件下时间敏感性更为明显。相较之下，70°C的热处理对所有菌株生长影响较小。在严苛的高温条件下（如90°C处理10分钟），菌株BT001表现出相对最强的热耐受性，存活率最高（43.09%），显示出其芽孢结构可能具有更好的热稳定性。

2.5紫外照射不同时间试验

四株苏云金芽孢杆菌生长情况如图7所示，从上到下四行依次为菌株BT001、NBL-B0207、NBL-B0249、NBL-BS33。菌株BT001在波长254nm紫外线照射0-5min平板长满菌落，各菌株间没有差异，紫外照射15min、30min、60 min后，仍有部分存活，菌株BT001平板存活菌落数明显均优于其他三株苏云金芽孢杆菌（NBL-B0207、NBL-B0249、NBL-BS33），表明其具有更强的UVC抗性。该结果印证了BT001具备优异的DNA损伤修复能力与细胞结构耐受性，尽管自然日光（含UVA/UVB）的胁迫机制与UVC存在差异，但此种内在抗逆性也预示着该菌株在自然环境下可能具备更优的生存潜力。

综上所述，苏云金芽孢杆菌BT001不仅表现出最强的毒力，还对多种农药具有良好的耐受性，同时具备一定的耐热、耐盐碱、耐重金属及抗UVC胁迫能力。因此，选择苏云金芽孢杆菌BT001作为生防菌进行后续试验，并将其在中国典型培养物保藏中心（CCTCC）进行专利程序的生物保藏，其保藏编号为CCTCC NO : M 20252346。

实施例5：苏云金芽孢杆菌BT001的发酵培养基优化

1.试验方法

用接种环挑取菌株BT001单菌落分别接种于LB培养基、葡萄糖-酵母培养基和经济型发酵培养基这三种培养基中，于37℃、180r/min振荡培养，培养至24h和48h时分别取样，用结晶紫染色液镜检产孢及孢子脱落情况。若孢子脱落率＞90%，则对该发酵液用梯度稀释涂布法进行活菌计数和孢子计数，同时设置3个平行重复以确保数据可靠性。

2.试验结果

结果如图8-图9所示，结果表明：培养基类型显著影响菌株BT001的产孢能力与孢子脱落率。在LB培养基中，菌株BT001培养至48 h仍未见产孢；在经济型发酵培养基中，培养至24 h开始产孢，但48h后乃至静置2天均无孢子脱落。相比之下，葡萄糖-酵母培养基表现最佳，其产孢进程正常，且在静置2天后孢子脱落率高达90%。相应的计数结果证实，葡萄糖-酵母培养基培养48h的活菌数（2.12×10⁸CFU/mL）与孢子数（1.50×10⁸CFU/mL）均显著高于其它培养基，凸显了其在促进菌株BT001高效培养、产孢及孢子脱落方面的综合优势。

实施例6：苏云金芽孢杆菌BT001对草地贪夜蛾不同龄期幼虫的体外毒杀试验

1、试验方法

根据实施例5优选的结果，选择葡萄糖-酵母培养基制备菌株BT001的发酵液（37℃、180r/min振荡培养48h），调整发酵液活菌数为5×10⁷CFU/mL；备用。

草地贪夜蛾1-6龄幼虫特征如表7所示：

表7：草地贪夜蛾1-6龄幼虫特征

注：草地贪夜蛾核心鉴别要点为头部倒Y形纹+腹末正方形排列的4个黑点。

草地贪夜蛾幼虫处理采用两种方式：

喷洒处理，即使用喷壶将发酵液均匀喷洒于虫体表面，以形成液膜且不滴落、饲养盒内无积水为准；

拌食处理，具体操作同实施例2。

试验设置1、2龄幼虫每处理20头，3、4、5、6龄幼虫每处理12头，每个处理重复3次，每龄期幼虫均设阴性对照，阴性对照为等量的纯水。处理后均置于26±1℃，相对湿度60-70%，光周期16:8（L:D）的条件下饲养，持续观察7 d，分别记录处理组与阴性对照组的死亡数量并计算死亡率，再依据公式记算校正死亡率。

校正死亡率（%）=（处理死亡率-阴性对照死亡率）/（1-阴性对照死亡率）×100%。

2、试验结果

发酵液的不同处理方式对草地贪夜蛾幼虫的毒杀效果如表8所示。

表8：菌株BT001发酵液不同处理对不同龄期草地贪夜蛾幼虫的校正死亡率（%）

试验结果表明，菌株BT001培养48 h的发酵液对草地贪夜蛾1-6龄幼虫均具有毒杀作用，且毒杀效果随虫龄增大而减弱。对3龄以下幼虫的毒杀效果尤为明显，两种处理方式下1-3龄幼虫校正死亡率均≥94%。

实施例7：苏云金芽孢杆菌BT001对斜纹夜蛾不同龄期幼虫的体外毒杀试验

1.试验方法

根据实施例5优选的结果，选择葡萄糖-酵母培养基制备菌株BT001的发酵液（37℃、180r/min振荡培养48h），调整发酵液活菌数为5×10⁷CFU/mL，备用。

采用喷洒和拌食两种方式处理斜纹夜蛾不同龄期幼虫，具体处理方法同实施例6。试验设置1、2龄幼虫每处理20头，3、4、5、6龄幼虫每处理12头，每个处理重复3次，每龄期幼虫均设阴性对照，阴性对照为等量的纯水。处理后均置于26±1℃，相对湿度60-70%，光周期16:8（L:D）的条件下饲养，持续观察7 d，分别记录处理组与对照组的死亡数量并计算死亡率，再依据公式记算校正死亡率。

2.试验结果

发酵液的不同处理方式对斜纹夜蛾幼虫的毒杀效果如表9所示。

表9：菌株BT001发酵液的不同处理对不同龄期斜纹夜蛾幼虫校正死亡率（%）

试验结果显示，菌株BT001培养48 h的发酵液对斜纹夜蛾1-6龄幼虫均表现出毒杀活性。在两种处理方式下，菌株BT001对1-3龄幼虫的毒杀率均≥91%，毒杀效果随龄期增加呈下降趋势。但是6龄幼虫在拌食处理中的死亡率出现异常升高。推测这可能与斜纹夜蛾从5龄进入6龄时虫体进入暴食期，虫体快速增大，此时幼虫摄食量显著增加，导致摄入的菌株BT001发酵液剂量相应提高，从而引起死亡率突增。

实施例8：苏云金芽孢杆菌BT001及其复配苦参碱对草地贪夜蛾的毒力测定

1.试验方法

1.1供试发酵液制备：

根据实施例5优选的结果，选择葡萄糖-酵母培养基制备菌株BT001的发酵液（37℃、180r/min振荡培养48h），先取5mL发酵液测定孢子浓度，测得发酵液的孢子浓度为1.5×10⁸CFU/mL，备用。

1.2处理组设置

处理组分别为以下6组：

处理组1（T1）：为菌株BT001单剂不同稀释组，即为菌株BT001的发酵液用纯水稀释得到四个孢子浓度的发酵液：1×10⁵CFU/mL、1×10⁶CFU/mL、1×10⁷CFU/mL、1×10⁸CFU/mL。用于计算菌株BT001发酵液的半致死浓度LC₅₀。

处理组2（T2）：0.5%苦参碱单剂不同稀释组，即为0.5%苦参碱用纯水稀释成三个浓度，分别稀释500、1000、1500倍液，稀释后所对应终浓度分别为10mg•L^-1、5mg•L^-1、3.33mg•L^-1，用于计算苦参碱半致死浓度LC₅₀。

根据处理组1与处理组2的苏云金芽孢杆菌与苦参碱相容性及2种药剂对草地贪夜蛾幼虫毒力测定的结果（LC₅₀），再设置复配组药剂比例，具体为：先用纯水将0.5%苦参碱稀释至对应终浓度分别为10mg•L^-1、5 mg•L^-1，再按下面各处理中所需的菌株BT001孢子浓度取等体积的菌株BT001发酵液复配，所有混剂均为1:1，然后混匀后使用；

处理组3（T3）：50mL孢子数为 1×10⁷CFU/mL的菌株BT001发酵液与50mL浓度为10mg•L^-1的苦参碱混合；

处理组4（T4）：50mL孢子数为 1×10⁷CFU/mL的菌株BT001发酵液与50mL浓度为5mg•L^-1的苦参碱混合；

处理组5（T5）：50mL孢子数为 1×10⁶CFU/mL的菌株BT001发酵液与50mL浓度为10mg•L^-1苦参碱混合；

处理组6（T6）：50mL孢子数为1×10⁶CFU/mL的菌株BT001发酵液与50mL浓度为5mg•L^-1的苦参碱混合。

1.3毒力测定方法

采用拌食饲喂法进行毒杀试验，以3龄草地贪夜蛾幼虫为供试虫源，每10 g人工饲料中分别加入3 mL上述处理液，充分搅拌均匀，待饲料完全吸收处理液后进行饲喂。将拌好药剂的饲料均匀放入12孔板中，再放入3龄草地贪夜蛾幼虫，每个处理30头试虫，重复三次，置于26±1℃，相对湿度60-70%，光周期16:8（L:D）的条件下饲养，处理后连续观察7d，并记录死亡率。

SPSS软件计算单一药剂与混合处理液的LC₅₀，95%置信区间、毒力回归方程，按照Sun-Johnson法计算共毒系数（CTC）；

毒力指数（TI）=标准药剂LC₅₀/供试药剂LC₅₀×100（标准药剂指菌株BT001发酵液，供试药剂为0.5%苦参碱）；

混剂实测毒力指数（ATI）=标准药剂LC₅₀/混合药剂LC₅₀×100（混合药剂指T3-T6）；

混剂理论毒力指数（TTI）=A药剂毒力指数×A药剂在混剂中的百分含量+B药剂毒力指数×B药剂在混剂中的百分含量；

共毒系数（CTC）=(混合药剂实测毒力指数（ATI）)/(混合药剂理论毒力指数（TTI）)×100；

复配剂的共毒系数（CTC）>120表现为增效作用；CTC≤80表现为拮抗作用；80<CTC<120表现为相加作用。

2.试验结果

试验结果如表10所示。

表10：菌株BT001及其复配苦参碱对草地贪夜蛾的毒力测定

根据共毒系数判断标准，本次苏云金芽孢杆菌BT001与苦参碱的复配结果表明，不同孢子浓度的菌株BT001发酵液与不同浓度的苦参碱复配组合，均表现出极强的协同增效作用。其中孢子数为1×10⁷CFU/mL的菌株BT001发酵液与浓度为5 mg•L^-1的苦参碱的组合协同效应最为突出，其共毒系数高达500.76，即使协同效应最弱的T5组合，其共毒系数也达到了293.07，远高于协同效应的阈值，也表现显著的出协同增效作用。

实施例9：苏云金芽孢杆菌BT001及其复配灭幼脲对斜纹夜蛾的毒力测定

1.1供试发酵液制备：

1.2处理组设置

处理组分别为以下6组：

处理组1（T1）：为菌株BT001单剂不同稀释组，即为菌株BT001发酵液用纯水稀释得到四个孢子浓度的发酵液：1×10⁵CFU/mL、1×10⁶CFU/mL、1×10⁷CFU/mL、1×10⁸CFU/mL。用于计算菌株BT001发酵液半致死浓度LC₅₀。

处理组2（T2）：25%灭幼脲单剂不同稀释组，即为25%灭幼脲用纯水稀释成三个浓度，分别稀释1000、1500、2000倍液，稀释后所对应终浓度分别为250mg•L^-1、166.7mg•L^-1、125mg•L^-1，用于计算灭幼脲半致死浓度LC₅₀。

根据处理组1与处理组2的苏云金芽孢杆菌与灭幼脲相容性及2种药剂对斜纹夜蛾幼虫毒力测定的结果（LC₅₀），再设置复配组药剂比例，具体为：先用纯水将25%灭幼脲稀释至对应终浓度分别为250mg•L^-1、166.7mg•L^-1，再按下面各处理中所需的菌株BT001孢子浓度取等体积的菌株BT001发酵液复配，所有混剂均为1:1，然后混匀后使用；

处理组3（T3）：50mL孢子数为 1×10⁷CFU/mL的菌株BT001发酵液与50mL浓度为250mg•L^-1的灭幼脲混合；

处理组4（T4）：50mL孢子数为 1×10⁷CFU/mL的菌株BT001发酵液与50mL浓度为166.7 mg•L^-1的灭幼脲混合；

处理组5（T5）：50mL孢子数为 1×10⁶CFU/mL的菌株BT001发酵液与50mL浓度为250mg•L^-1灭幼脲混合；

处理组6（T6）：50mL孢子数为1×10⁶CFU/mL的菌株BT001发酵液与50mL浓度为166.7 mg•L^-1的灭幼脲混合。

1.3毒力测定方法

按照实施例8对草地贪夜蛾的毒力测定方法处理3龄斜纹夜蛾幼虫。

2.试验结果

根据共毒系数判断标准，本次菌株BT001发酵液与灭幼脲稀释液处理斜纹夜蛾的复配结果表明，与实施例8中混剂处理草地贪夜蛾的效果相比有显著差异，出现了协同、相加和拮抗三种情况（表11）。

表11：菌株BT001及其复配灭幼脲对斜纹夜蛾的毒力测定

从表11中可以看出，T3组的共毒系数为123.20，表现为强协同作用。T4组的共毒系数为82.64，表现为相加作用。T5和T6组的共毒系数均＜80，表现为拮抗作用。

因此苏云金芽孢杆菌与灭幼脲的联合效应高度依赖于两者的浓度配比。高浓度的菌株BT001发酵液与高浓度的灭幼脲稀释液复配效果最好，产生协同效应；而低浓度的菌株BT001发酵液与高浓度的灭幼脲稀释液复配反而会产生拮抗作用，降低了药效。

实施例10：菌株BT001对草地贪夜蛾盆栽试验毒杀效果验证

1.试验方法

盆栽白菜处理：每盆种植10颗，高度长至15 cm后开始接虫。对盆栽白菜分别接种1、2龄草地贪夜蛾幼虫，每盆接种10头草地贪夜蛾幼虫，每个龄期的幼虫均设两个处理，每个处理重复三次，处理组1（T1）：清水对照组；处理2（T2）：喷洒菌株 BT001发酵液，喷洒时要求各处理液均匀覆盖白菜叶片，在叶片上成膜不滴落，处理后持续观察7 d。

测量总叶面积：在释放幼虫前，随机选取与试验植株长势一致的对照组植株，测量其健康叶片的总面积，作为初始平均叶面积。

测量受害后剩余面积：在试验结束后，摘下所有受害叶片，用叶面积仪扫描，得到剩余的健康叶面积。

叶片面积使用便携式叶面积仪LI-3000C测量，试验数据用Excel处理，SPSS软件继续数据统计及差异显著性分析。

表12：虫害分级

单株被害指数=

各处理组被害指数=

校正防效（%）=×100%

危害叶片面积（%）=×100%

2.试验结果

7d后调查防治效果，依据表12的虫害分级及下面的公式进行计算，结果如表13和图10（对1龄草地贪夜蛾防治效果）所示。

表13：白菜上接种草地贪夜蛾1、2龄幼虫防治效果

菌株BT001对白菜上释放的1、2龄草地贪夜蛾幼虫防治效果显著，对白菜上接种的1龄草地贪夜蛾幼虫进行处理，48 h校正防效达100%，对白菜上接种的2龄草地贪夜蛾幼虫进行处理，48 h校正防效为75.68%，盆栽试验证实菌株BT001对于草地贪夜蛾1、2龄幼虫均表现出一定防治效果。

实施例11：菌株BT001及复配阿维菌素对斜纹夜蛾盆栽试验毒杀效果验证

1.试验方法

阿维菌素杀虫机理：胃毒为主，触杀为辅，能刺激昆虫神经肌肉系统释放γ-氨基丁酸，从而对昆虫的神经传导产生抑制作用，幼虫与阿维菌素接触后即出现麻痹症状，不活动、不取食，2～4天后死亡。

盆栽白菜处理：每盆种植10颗，高度长至15 cm后开始接虫。对盆栽白菜分别接种1、2龄斜纹夜蛾幼虫，每盆接种10头斜纹夜蛾幼虫，每个龄期的幼虫均设4个处理，每个处理重复三次，处理组1（T1）：清水对照组；处理2（T2）：喷洒菌株BT001发酵液；处理3（T3）：喷洒阿维菌素稀释液（5%阿维菌素稀释1000倍）；处理4（T4）：喷洒按体积比1:1复配的菌株BT001发酵液+阿维菌素稀释液（5%阿维菌素稀释1000倍），各处理喷洒时要求处理液均匀覆盖白菜叶片，在叶片上成膜不滴落，处理后持续观察7 d。

虫害分级标准以及被害指数、校正防效的计算同实施例10。

用金正均法计算Q值，评估菌株BT001发酵液和阿维菌素稀释液的相互作用效果。

Q=Ea+b/（Ea+Eb- Ea×Eb）

其中，Ea+b为合并用药的抑制率；Ea和Eb分别为A药和B药单独用药的抑制率。

式中分子代表“实测合并效应”，分母是“期望合并效应”，Q是两者之比。Q﹤0.85为拮抗，0.85≤Q＜1.15为相加，Q≥1.15为协同。

2.试验结果

7d后调查防治效果，结果如表14和图11（对2龄斜纹夜蛾防治效果）所示。

表14：白菜上接种斜纹夜蛾1、2龄幼虫防治效果

菌株BT001对白菜上释放的1、2龄斜纹夜蛾幼虫防治效果显著，菌株BT001发酵液处理1龄和2龄幼虫防治效果分别为71.01%和62.00%，对1、2龄斜纹夜蛾幼虫防治效果均略低于化学农药阿维菌素。菌株BT001发酵液复配阿维菌素稀释液后对1、2龄斜纹夜蛾幼虫盆栽防治效果均≥80%，经计算Q值均＞0.85，表现为相加作用，展现出苏云金芽孢杆菌BT001与化药阿维菌素联用的防治优势。

实施例12：菌株BT001对感染番茄的南方根结线虫毒杀试验及促生功能测定

1.试验材料与方法

1.1苏云金芽孢杆菌BT001对南方根结线虫防效测定方法

番茄穴盘育苗，选取高度10 cm大小一致的番茄苗进行定植工作，每盆按基质:宁阳基地大棚内的病土=1:1进行装混，对番茄苗进行移栽，设置4组处理，每组处理10个重复。

四组处理分别为：处理1（T1）：浇灌200 mL清水作为对照组（CK）；处理2（T2）：浇灌200 mL苏云金芽孢杆菌BT001发酵液；处理3（T3）：浇灌200 mL清水+0.2 g 10%噻唑膦颗粒组（番茄苗移栽时噻唑膦颗粒预先拌入花盆内土中，然后再浇清水）；处理4（T4）：浇灌200mL苏云金芽孢杆菌发酵液+0.2 g 10%噻唑膦颗粒（番茄苗移栽时噻唑膦颗粒预先拌入花盆内土中，然后再浇发酵液），处理后光照、温度均一致，处理后15d后再进行二次浇灌各处理液，再连续观察30 d.，总计观察45d。

盆栽45 d后，各处理分别取100 g土样，过三层筛网（依次为200目、300目、500目）后取样镜检虫口密度，与对照组相比计算虫口减退率。调查病株及根系受侵染程度，计算病情指数和防治效果。

线虫减退率（%）=×100%

病情指数（DI）=×100

防治效果（%）=×100%

试验数据用Excel处理，SPSS软件继续数据统计及差异显著性分析。

表15：线虫病害分级标准

1.2苏云金芽孢杆菌BT001对番茄植株的促生功能测定

收获时用清水洗干净根系，室温晾干后，用电子天平测定番茄植株的鲜质量，测量鲜重完毕后于65℃烘箱中烘干至恒重，再测定根系干质量。

2.结果

2.1苏云金芽孢杆菌BT001对南方根结线虫防效测定结果

结果如表16所示，苏云金芽孢杆菌BT001与化学药剂噻唑膦在防治南方根结线虫上均表现出显著效果。单独使用菌株BT001发酵液（T2组）与单独使用噻唑膦（T3组）相比，两者在线虫减退率（60.08%和67.12%）、防治效果（29.63%和38.89%）上表现相近，噻唑膦略优。将菌株BT001发酵液与噻唑膦复合使用后（T4组），所有指标均大幅提升，取得了最佳防治效果，线虫减退率高达77.46%，病情指数降至30.00，防治效果达到66.67%，经计算Q值为1.17，两者复合使用对南方根结线虫具有协同增效作用（判定方法同实施例11）。

表16：苏云金芽孢杆菌BT001及其复合化药噻唑膦对南方根结线虫的防治

2.2苏云金芽孢杆菌BT001及其复合化药噻唑膦对番茄植株的促生功能试验结果

根据表17中数据，苏云金芽孢杆菌BT001发酵液及其与化学农药噻唑膦的复合处理对番茄植株表现出显著的促生作用。

表17：苏云金芽孢杆菌BT001及其复合化药噻唑膦对番茄植株的促生功能

注：同列肩标不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）

与清水对照组相比，T2-T4组均能有效提升植株鲜重和根系干重。其中，T2和T3组均已表现出显著的促生效果。值得注意的是，T4组的促生效果最为突出，植株鲜重和根系干重均达到最大值，且根系干重显著高于其他各处理组，因此苏云金芽孢杆菌BT001和化药噻唑膦复合使用不仅能有效防治南方根结线虫，还能进一步促进作物健康生长。

实施例13：菌株BT001及其复配氯虫苯甲酰胺对玉米螟的田间毒杀效果验证

1.试验方法

根据实施例5优选的结果，选择葡萄糖-酵母培养基制备菌株BT001的发酵液（37℃、180r/min振荡培养48h），先取5mL发酵液测定孢子浓度，测得发酵液的孢子浓度为1.5×10⁸CFU/mL，将该发酵液用纯水稀释成孢子浓度分别为1×10⁸CFU/mL、1×10⁷CFU/mL的发酵液，备用。

田间设置不同处理，对玉米螟幼虫进行田间毒杀效果验证。试验设置6个处理组：处理1（T1）：为阴性对照组（喷洒葡萄糖-酵母培养基）；处理2（T2）：喷洒菌株BT001孢子浓度为1×10⁸ CFU/mL的发酵液组；处理3（T3）：喷洒菌株BT001孢子浓度为1×10⁷CFU/mL的发酵液组；处理4（T4）：喷洒20%氯虫苯甲酰胺稀释液（稀释1000倍）；处理5（T5）：喷洒按体积比1:1复配的菌株BT001（孢子浓度为1×10⁸ CFU/mL）的发酵液与20%氯虫苯甲酰胺1000倍稀释液；处理6（T6）：喷洒按体积比1:1复配的菌株BT001（孢子浓度为1×10⁷CFU/mL）的发酵液与20%氯虫苯甲酰胺1000倍稀释液。

田间设置6个地块分别喷洒上述6个处理液，每地块40m×40m，每地块均匀喷洒一种处理液，要求各处理液喷洒时药剂均匀覆盖叶片，成膜不滴落。处理后14 d每个地块采用五点取样法调查，每点于1m×1 m样方内统计幼虫死亡率、茎秆被蛀情况，每点调查5株。

被害株减退率（%）=（对照组蛀茎-处理组蛀茎）/对照组蛀茎×100%

虫口减退率（%）=（药前虫量-药后虫量）/药前虫量×100%

2.试验结果

结果如表18所示。

表18：苏云金芽孢杆菌及其复配氯虫苯甲酰胺对玉米螟幼虫的田间毒杀效果验证

注：同列肩标不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）

根据表18提供的田间毒杀效果数据，苏云金芽孢杆菌（BT001）与氯虫苯甲酰胺复配处理对玉米螟幼虫表现出一定的防治效果，其中高浓度复配组（T5组）在多个指标上表现较优。

在被害株减退率方面，T5处理组达到78.95%，高于各处理组。在活虫数方面，T5组活虫数为0.32头/株，显著低于各处理组虫口数量，表明复配处理对幼虫数量的压制作用更强。综合来看，T5组在各项指标中均表现最佳，表明两者复配能够更有效地控制玉米螟幼虫的危害。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围。

Claims

1.一种复合杀虫剂，其特征在于，所述复合杀虫剂由苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）BT001与农药化合物复配而成；

所述苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）BT001的保藏编号为CCTCC NO : M20252346；

所述复合杀虫剂为如下（1）-（3）任一所示：

（1）苏云金芽孢杆菌-苦参碱复合杀虫剂：苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）BT001发酵液与苦参碱稀释液按体积比为1:1复配而成；

（2）苏云金芽孢杆菌-灭幼脲复合杀虫剂：苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）BT001发酵液与灭幼脲稀释液按体积比为1:1复配而成；

（3）苏云金芽孢杆菌-噻唑膦复合杀虫剂：苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）BT001发酵液与噻唑膦颗粒复配而成；

苏云金芽孢杆菌-苦参碱复合杀虫剂中，苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）BT001发酵液中的孢子浓度为1×10⁶CFU/mL-1×10⁷CFU/mL；苦参碱稀释液的浓度为5 mg/L-10 mg/L；

苏云金芽孢杆菌-灭幼脲复合杀虫剂中，苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）BT001发酵液中的孢子浓度为1×10⁷CFU/mL；灭幼脲稀释液的浓度为250 mg/L；

苏云金芽孢杆菌-噻唑膦复合杀虫剂中，苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）BT001的发酵液的活菌数为5×10⁷ CFU/mL；苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）BT001的发酵液与10%噻唑膦颗粒按200mL:0.2g复配。

2.根据权利要求1所述的复合杀虫剂，其特征在于，苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）BT001发酵液由如下方法制备而成：

将苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）BT001接种于葡萄糖-酵母培养基中，于37 ℃、180 r/min振荡培养48 h；

所述葡萄糖-酵母培养基的成分为：葡萄糖5 g/L、酵母提取物5 g/L、蛋白胨5 g/L、磷酸氢二钾1 g/L、硫酸镁0.2 g/L、硫酸锰0.02 g/L。

3.权利要求1或2所述的复合杀虫剂在防治植物虫害中的应用，其特征在于，所述植物虫害是由斜纹夜蛾、草地贪夜蛾或南方根结线虫引起的。