CN121380098A - 突变一个重金属结合蛋白TaHMAP提高小麦赤霉病抗性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开突变一个重金属结合蛋白TaHMAP提高小麦赤霉病抗性的方法。本发明创制了TaHMAP基因的纯合三突变体株系KO‑1~3，发现TaHMAP基因功能缺失突变体赤霉病抗性提高。对突变体中木质素合成通路基因研究发现，TaHMAP基因突变后木质素调控基因表达提高。木质素含量测定表明TaHMAP基因的纯合三突变体木质素含量显著高于野生型植株。因此，TaHMAP突变体株系在解析小麦抗赤霉病信号通路及提高小麦对赤霉病抗性方面具有潜在价值，可以作为小麦抗赤霉病育种的遗传资源。

Description

突变一个重金属结合蛋白TaHMAP提高小麦赤霉病抗性的方法

技术领域

本发明属于基因工程领域，公开了通过突变一个重金属结合蛋白TaHMAP提高小麦赤霉病抗性的方法，并创制了赤霉病抗性提高的小麦种质。

背景技术

赤霉病（Fusaria Head Blight, FHB）是全球小麦主要病害之一，主要由禾谷镰刀菌（Fusarium Graminearum）造成，不仅造成全球小麦及其他谷类作物大幅减产，还会造成呕吐毒素（DON）污染而严重影响谷物品质。我国长江中下游麦区因其在小麦抽穗期高温高湿的气候特点，是我国小麦赤霉病的传统高发区，常年发生面积4000 ~ 5000万亩，超过我国小麦播种面积的1/10。近年来，由于气候变化和耕作方式改变，小麦赤霉病呈现出明显的北进西扩现象，在我国小麦主产区——黄淮冬麦区开始大面积爆发。2023年，我国小麦赤霉病实际防控面积达3.53亿亩次，极大增加了小麦生产成本。因此，挖掘遗传资源，克隆并利用抗性基因，培育抗病品种，减少农药施用量，是防治小麦赤霉病最为经济有效的手段。

赤霉病抗性是由多个数量性状位点（Quantitive Trait Loci, QTL）控制的复杂性状。已经命名的抗赤霉病QTL包括Fhb1 ~ Fhb9，只有Fhb1和Fhb7被克隆，二者均已在我国小麦育种中被利用。尤其Fhb1，被认为是迄今为止效应最大的主效QTL，在过去半个世纪中已被全球小麦育种项目广泛利用。虽然我国科学家已在这一领域取得国际领先的进展，但赤霉病抗性位点多数为微效QTL，抗性鉴定结果受到环境因素影响极大，使利用正向遗传学手段克隆小麦赤霉病抗性基因面临极大挑战。

小麦是异源六倍体作物，拥有A、B、D三个亚基因组。近年来，通过遗传改造感病基因提高作物抗病性，实现作物广谱抗病种质创制的工作开始被报道，小麦赤霉病感病基因的存在也不断得到证实。因此，通过生化筛选、多组学分析等挖掘小麦赤霉病感病基因，通过基因编辑或诱变创制抗性等位，并应用于抗病品种选育，将是增加小麦赤霉病抗性遗传资源、培育小麦赤霉病抗性品种的可行办法。

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发明内容

本发明提供基因TaHMAP在提高小麦赤霉病抗性中的应用。

本发明提供一种基因组TaHMAP，A亚基因组序列如SEQ ID NO.8所示，A亚基因组编码区如SEQ ID NO.11所示，B亚基因组序列如SEQ ID NO.9所示，B亚基因组编码区如SEQ IDNO.12所示，D亚基因组序列如SEQ ID NO.10所示，D亚基因组编码区如SEQ ID NO.13所示。

本发明还提供一种能够实现TaHMAP功能敲除的的基因编辑靶标，TaHMAPT1，位于在基因TaHMAP的第二个外显子。在一种具体的实例中，靶标TaHMAPT1的序列为GGTGGCAGCGGGCGCAATCC（SEQ ID NO.1）。

本发明还提供基因TaHMAP在提高小麦抗赤霉病中的应用，具体为敲除或降低基因TaHMAP在小麦中的表达。

本发明还提供一种小麦赤霉病抗性育种中的应用，具体为将小麦中的基因TaHMAP敲除或降低表达，获得小麦赤霉病抗性品种。

所述应用优选的是通过本发明所述的基因编辑靶标来敲除或降低基因TaHMAP在小麦中的表达。

本发明还提供一种基因编辑靶标检测引物。

本发明还提供三对基因编辑靶标检测引物，分别命名为TaHMAP-A-F和TaHMAP-A-R，TaHMAP-B-F和TaHMAP-B-R，TaHMAP-D-F和TaHMAP-D-R，序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3所示，或者如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，或者如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。分别特异扩增A、B、D三个亚基因组，位于靶标位点TaHMAPT1上下游位置，分别可扩增出1119bp，1166bp，542bp的条带，可用于Sanger测序或二代测序检测突变体中TaHMAP的突变类型

本发明所述的基因TaHMAP编辑靶标检测引物在鉴定小麦赤霉病抗性品种中的应用。

本发明利用基因编辑技术突变一个编码重金属结合蛋白的基因TaHMAP，获得了多个独立的TaHMAP的A、B、D三个亚基因组拷贝全部突变的纯合突变体KO-1 ~ 3（图1）。通过对3个独立突变体株系的表型鉴定，确认了突变体株系赤霉病抗性高于野生型对照Fielder，且其株高、每穗小穗数和千粒重等产量相关性状无明显变化（图2），确认了TaHMAP的纯合突变体KO-1 ~ 3在小麦抗赤霉病育种中应用的可行性。实时定量PCR和木质素含量测定表明TaHMAP参与抑制木质素合成信号通路基因，敲除该基因后小麦穗部木质素含量的提高可能是小麦赤霉病抗性提高的关键原因（图3）。

有益效果：

1、本发明公开的敲除TaHMAP的基因编辑靶点，为在Fielder等常见小麦品种中高效敲除TaHMAP基因，创制抗赤霉病育种材料提供了便利。

2、本发明中公开了一种通过功能敲除TaHMAP基因实现小麦赤霉病抗性提高，同时不改变小麦产量相关性状，包括株高、每穗小穗数和千粒重等的方法。

3、本发明中创制的TaHMAP的A、B、D三个亚基因组拷贝纯合突变体KO-1 ~ 3为小麦抗赤霉病育种提供了种质资源。

附图说明

图1、TaHMAP的基因编辑突变体的创制。（A）TaHMAP蛋白结构域示意图，该蛋白包含一个重金属蛋白结合结构域和一个脯氨酸富集区；（B）TaHMAP的基因结构及其CRISPR/Cas9靶标的位置；（C）TaHMAP基因编辑靶标的序列及其PAM序列；（C）TaHMAP基因的三个基因编辑突变体株系KO-1，KO-2和KO-3基因型鉴定结果。红色“-”或字母分别表示被删除或添加的核苷酸。

图2、TaHMAP基因编辑突变体株赤霉病抗性表型鉴定结果。（A）TaHMAP基因编辑突变体和野生型Fielder生长发育表型和赤霉病抗性表型代表性图片；（B）TaHMAP基因编辑突变体赤霉病抗性表型鉴定统计结果。PSS%表示每个穗子上的赤霉病发病小穗率，“**”表示Student TTEST结果P < 0.01。（C）TaHMAP基因编辑突变体株高（Plant height）、每穗小穗数（Spikelet number）和千粒重（Thousand kernel weight）统计结果。

图3、功能敲除TaHMAP提高小麦穗部木质素含量。（A）实时定量PCR结果表明木质素合成信号通路关键基因PAL1 ~ 6，CCR和CAD在TaHMAP基因编辑突变体穗部表达量较野生型显著提升；（B）野生型Fielder和TaHMAP基因编辑突变体开花前小穗用禾谷镰刀菌侵染，72h后取样切片，并用间苯三酚染色。组织中木质素含量与染色强度正相关。（C）野生型Fielder和TaHMAP基因编辑突变体开花前小穗用禾谷镰刀菌侵染，72h后取样测定木质素含量。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1、TaHMAP基因编辑靶标的设计

根据小麦品种Fielder参考基因组，获取TaHMAP基因序列。通过同源序列比对，在TaHMAP基因三个亚基因组高度同源的区域，设计可以同时靶向三个同源拷贝的CRISPR/Cas9靶标，将该靶标命名为TaHMAPT1，其靶标序列为GGTGGCAGCGGGCGCAATCC（SEQ IDNO.1），CRISPR/Cas9实现基因编辑所需的PAM序列为AGG（图1）。

实施例2、TaHMAP突变体的创制

为实现TaHMAP基因的敲除，将TaHMAPT1的靶标序列构建至CRISPR/Cas9载体pBUE411（Addgene编号#62200），并通过农杆菌侵染转化至小麦品种Fielder。其步骤包括，以小麦品种Fielder开花后12-14天的未成熟幼胚为受体材料，经预培养后，用含有重组CRISPR/Cas9载体的农杆菌菌株EHA105（OD₆₀₀=0.6-0.8）侵染30分钟。随后在含有100μM乙酰丁香酮的共培养基上黑暗培养3天，促进T-DNA转移。将共培养后的外植体转入选择培养基中进行抗性筛选，每2-3周继代一次，诱导抗性愈伤组织形成。最后将愈伤组织转移至分化培养基，获得再生植株。获得再生植株后，通过以下引物扩增各个遗传转化株系中TaHMAPT1的靶位点，并通过测序对各个株系基因型进行鉴定。最终获得三个TaHMAP基因三突变体，KO-1，KO-2和KO-3（图1）。

基因编辑靶位点测序检测引物如下，

实施例3、TaHMAP突变体赤霉病抗性表型与产量相关性状鉴定

为评价TaHMAP基因敲除突变体在小麦赤霉病抗性育种中的利用价值，将野生型品种Fielder及TaHMAP基因敲除突变体种植于15厘米×15厘米的花盆中，在温室内进行培育，昼/夜温度分别维持26℃和20℃，每日光照时间16小时，光照强度3000 lux。在小麦扬花初期，将禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）分生孢子悬浮液注入穗部中央小穗的小花中，接种后用湿塑料罩覆盖整个穗子保湿48小时。通过统计接种后7天、9天与11天每穗的发病小穗数和总小穗数，评估禾谷镰孢菌在穗内的扩展情况。各品系的赤霉病严重度通过计算穗部发病小穗比例（PSS）进行评估。

结果如图2所示，通过对3个独立突变体株系的表型鉴定，确认了突变体株系赤霉病抗性显著高于野生型对照Fielder，且其株高、每穗小穗数和千粒重等产量相关性状无明显变化，确认了TaHMAP的纯合突变体KO-1 ~ 3在小麦抗赤霉病育种中应用的可行性。

实施例4、TaHMAP突变体赤霉病抗性表型机制解析

为便于更好地指导小麦赤霉病抗性分子育种，进一步解析了TaHMAP突变体赤霉病抗性提高的机制，通过实时定量PCR，确认了TaHMAP突变体中多个木质素合成信号通路基因PAL1 ~ 6、CCR和CAD等表达量较野生型显著提高。为确认突变TaHMAP可以提高小麦穗部木质素含量，将禾谷镰孢菌侵染过的野生型Fielder和TaHMAP突变体扬花期小穗切片，用间苯三酚染色确认二者的木质素含量差异。此外，利用商业化试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号：BC4200）对野生型Fielder和TaHMAP突变体扬花期小穗的木质素含量进行了量化测定，进一步确认TaHMAP功能缺失可以提高小麦穗部木质素含量。

实时定量PCR和木质素含量测定表明TaHMAP参与抑制木质素合成信号通路基因，结果如图3所示，敲除该基因后小麦穗部木质素含量相对于野生型显著提高，这可能是小麦赤霉病抗性提高的关键原因。

Claims (9)

1.一个实现基因TaHMAP功能敲除的的基因编辑靶标，命名为TaHMAPT1，位于在TaHMAP基因的第二个外显子。

2.根据权利要求1所述的基因编辑靶标，序列如SEQ ID NO.1所示。

3.基因TaHMAP在提高小麦抗赤霉病中的应用，具体为敲除或降低基因TaHMAP在小麦中的表达。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，敲除或降低基因TaHMAP表达的编辑靶标如权利要求1或2所示。

5.一种小麦赤霉病抗性育种中的应用，具体为将小麦中的基因TaHMAP敲除或降低表达，获得小麦赤霉病抗性品种。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，敲除或降低基因TaHMAP表达的编辑靶标如权利要求1或2所示。

7.一对基因TaHMAP编辑靶标检测引物。

8.根据权利要求7所述的检测引物，序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；或者如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示；或者如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。

9.权利要求7或8所述的基因TaHMAP编辑靶标检测引物在鉴定小麦赤霉病抗性品种中的应用。