CN1210302C - 特异结合血管内皮生长因子受体kdr的小肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及序列为C-H-V-I-L-H-P-R-C即半胱氨酸-组氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-亮氨酸-组氨酸-脯氨酸-精氨酸-半胱氨酸的小肽作为先导物质在制备肿瘤和血管增生性相关疾病治疗药物中的应用,以及小肽作为运输病毒、激素和其他物质的载体到新生血管中的应用。
Description
本发明涉及生物医学领域,具体地说是一条与血管内皮生长因子受体KDR有特异结合活性的小肽,作为药物的先导物质在肿瘤治疗及相关疾病治疗中的用途,以及小肽作为载体将病毒、激素和其他物质定向运输到新生血管部位的用途。
实体瘤的发生、发展与新生血管的形成密切相关,新生血管可为实体瘤的快速生长和转移提供充足的氧气和养分。实体瘤组织内部新生血管的形成受多种生长因子的调节,其中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是最重要的一种调节因子,它通过与特异表达在新生血管内皮细胞表面的受体KDR结合,激活一系列生物反应来诱导新生血管的形成。研究表明阻断VEGF/KDR信号通路就可抑制新生血管的形成,从而抑制人体内肿瘤的生长。因此,以KDR为靶向位点进行肿瘤治疗具有很好的临床治疗效果。
常规治疗肿瘤的放化疗药物因为没有定向结合活性,进入人体后在杀死肿瘤细胞的同时也杀死大量的正常细胞,给患者带来很大的毒副作用。KDR是一类特异高表达在新生血管内皮细胞表面,在正常血管内皮细胞表面低表达或不表达的生长因子受体。因此,如果以KDR为靶向位点,将能够特异结合KDR的物质作为先导物质与药物偶联,使药物在体内具备定向结合KDR的活性,就可避免药物的非选择杀伤活性,降低肿瘤治疗药物对人体的毒副作用,减轻肿瘤患者的痛苦。
因此,以KDR为靶向位点就可从抑制新生血管的形成和减轻药物的毒副作用、提高疗效两方面来达到肿瘤治疗的目的。噬菌体展示技术是G.P.Smith于80年代创立的一种技术,它是将编码外源短肽的寡核苷酸以随机组合形式插入到编码噬菌体表面蛋白的基因中,使外源短肽以融合蛋白的形式在噬菌体表面表达,形成一个尽可能多的小肽序列集合体,此项技术为寻找药物的先导物质提供了一种很好的方法。
本项发明是以KDR分子为靶蛋白,利用噬菌体展示技术,从中筛选与KDR有特异结合活性的小肽,研究小肽作为药物的先导物质在肿瘤治疗及相关疾病治疗中的应用,以及小肽作为运输载体在定向运输方面的应用。本发明得到的序列为C-H-V-I-L-H-P-R-C即半胱氨酸-组氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-亮氨酸-组氨酸-脯氨酸-精氨酸-半胱氨酸的小肽,经体外结合活性证明能与KDR特异结合。将小肽与生物素、BSA化学偶联后得到的偶联物,在体外能与KDR分子和细胞表面的KDR分子结合。将小肽与志贺氏毒素的毒性亚基(StxA)以融合蛋白的形式原核表达后得到的重组蛋白,在体外具有特异结合KDR的活性,细胞毒实验表明重组蛋白的毒性没有降低,鸡胚绒毛尿囊膜实验表明重组蛋白具有选择杀伤鸡胚绒毛尿囊膜新生血管形成的活性。上述实验结果说明,本项发明的小肽有希望作为肿瘤治疗及相关疾病治疗药物的先导物质使用,以及作为运输病毒、激素和其他物质到新生血管的载体使用。
结合附图说明本发明的具体实施方法如下:
图1:HUVEC免疫组化结果(SP染色,放大100倍)
图2:WISH免疫组化结果(SP染色,放大100倍)
图3:小肽-StxA和StxA的原核表达的SDS-PAGE图谱
从左到右分别为小肽-StxA包涵体,小肽-StxA表达菌液上清,未诱导细菌,StxA包涵体,StxA表达菌液上清,未诱导细菌
图4:小肽-StxA和StxA的Western blot结果
从左到右分别为小肽-StxA,StxA,标准分子量蛋白,标准分子量蛋白,StxA,小肽-StxA
图5:小肽-StxA对VEGF诱导的鸡胚尿囊膜血管生成的影响
图6:小肽对VEGF诱导的鸡胚尿囊膜血管生成的影响
实施例一:筛选与KDR有特异结合活性的小肽
本实施例的实验步骤及结果
1.筛选噬菌体肽库
包板:将2μg hIgGFc、500ngKDR/IgGFC和50ng KDR/IgGFC溶于0.1M NaHCO3,100μl/孔包被酶联板,4℃潮湿保存待用。
反应:弃掉包被液,加入400μl封闭液于37℃湿盒孵育1h,弃掉封闭液,第一轮先以2μg IgGFC为靶分子,加入10μl原始12肽库、环7肽库,室温作用1hr后,将上清吸出,用TBS洗孔一次,将吸出液和洗液再作为投入噬菌体加到500ngKDR/IgGFC孔中孵育2h,0.1%TBST洗涤6次,酸性洗脱液洗脱产物即为所得噬菌体。第二轮以50ng KDR/IgGFC为靶分子,加入第一轮洗脱所得噬菌体的扩增液,室温潮湿缓摇45min,弃掉未结合的噬菌体悬液,用0.2%TBST洗涤15次,100ng VEGF和酸性洗脱液洗脱产物即为第二轮所得噬菌体。经过两轮筛选噬菌体的回收率有所提高,说明筛选到了与KDR结合的阳性噬菌体克隆。
2.鉴定与KDR有结合活性的阳性噬菌体克隆
从第二轮筛选的结果中,随机挑取40个噬菌体克隆扩增,按照常规操作进行ELISA鉴定。实验结果说明40个噬菌体克隆中有12个能与KDR特异结合,其中序列为C-H-V-I-L-H-P-R-C的小肽与KDR的结合活性最强。
3.鉴定小肽与KDR的结合活性
按照测序结果化学合成序列为C-H-V-I-L-H-P-R-C的小肽,经ELISA和梯度ELISA鉴定,小肽在体外能特异结合KDR,Kd=168.6nM。
实施例二:小肽作为导向物质与生物素、BSA化学偶联制备导向化合物
本实施例的实验步骤和结果
1.化学偶联
吸20μl 1g/L NHS-d-生物素(DMSO溶解)到20μl 10g/L透析过的BSA溶液中,室温缓摇振荡4hrs,用超滤离心的方法弃掉游离的NHS-d-生物素,收集反应液BSA-生物素。将BSA-生物素和小肽以等摩尔浓度加到500μl 0.1M PBS(pH7.5)中,加10μg EDAC为催化剂,室温缓摇过夜,用超滤离心的方法弃掉游离的小肽,收集反应液即为纯化后的化学偶联物小肽-BSA-生物素。
2.鉴定小肽-BSA-生物素与KDR的结合活性
以同样浓度的BSA-生物素为阴性对照做ELISA,实验结果说明小肽-BSA-生物素在体外能与KDR结合,而BSA-生物素和KDR不结合,小肽在导向化合物与KDR的结合中起关键作用。
3.鉴定小肽-BSA-生物素与KDR表达阳性细胞的结合活性
将经过实验验证的KDR表达阳性的人胚胎脐静脉内皮细胞(human umbilical veinendothelial cell,HUVEC)和KDR表达阴性的人Wish细胞接种于无菌的内置盖玻片的培养平皿中,待细胞铺满盖玻片后,将盖玻片取出,置于4%甲醛固定30min,按照SABC酶联免疫试剂盒操作说明进行。实验结果如图1,2(SP染色,放大100倍)所示,即小肽-BSA-生物素与HUVEC细胞结合,细胞表面呈棕色(图1),小肽-BSA-生物素与Wish细胞不结合,细胞表面呈蓝色(图2)。实验结果说明小肽可以作用导向物质将与其化学偶联的物质带到KDR部位。
实施例三:小肽作为导向物质与StxA融合表达制备导向毒素
本实施例的实验步骤和结果
一.原核表达小肽-StxA和StxA
1.PCR扩增小肽-StxA和StxA片段
根据小肽和StxA序列设计小肽-StxA和StxA片段的扩增引物,小肽-StxA的上游引物序列是:5’G GAA TTC C ATG TGT CAT GTG ATT TTG CAT CCT CGT TGC GGT GGT ACA GGGGAT AAT TTG TTT 3’,下游引物序列是:5’CG GGA TCC CG GAT GCA TGA TGA TGA C 3’。StxA片段的上游引物序列是:5’G GAA TTC C ATG ACA GGG GAT AAT TTG TTT 3’,下游引物序列是:5’CG GGA TCC CG GAT GCA TGA TGA TGA C 3’。PCR扩增参数为:94℃变性1min、50℃或55℃退火1min(前5个反应用50℃,后25个反应用55℃)、72℃延伸2min,共进行30个反应。扩增StxA片段时,退火温度统一用55℃。DNA琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物在500bp和750bp之间,扩增产物与预期结果一致,得到了正确的目的片段。
2.小肽-StxA和StxA的原核表达质粒和菌株的构建
pBV220:一种原核表达质粒,EcoRI,BamHI:核酸内切酶酶切位点,T4连接酶:T4DNA连接酶。将上述两种PCR扩增产物与pBV220经EcoRI,BamHI双酶切回收的3.64kb的片段以摩尔比3∶1连接,转化感受态大肠杆菌JM109,以小量快速抽提质粒DNA法鉴定阳性重组子。以pBV220为阴性对照,所以阳性克隆质粒经EcoRI,BamHI双酶切均能切下插入条带,并且分子量大小正确。克隆细菌在30℃培养至A600=0.45,迅速升温至42℃,继续振荡培养6小时,收集菌体,经SDS-PAGE鉴定,有小肽-StxA和StxA的特异表达产物(图3,从左到右分别为小肽-StxA包涵体,小肽-StxA表达菌液上清,未诱导细菌,StxA包涵体,StxA表达菌液上清,未诱导细菌)。
3.小肽-StxA和StxA的纯化和复性
将表达产物用8M尿素变性,稀释法复性,S-200分子筛层析柱分离,SDS-PAGE鉴定分离到了分子量正确的目的蛋白,可用于后续实验。
二.导向毒素小肽-StxA与KDR的结合活性测定
1.ELISA法鉴定小肽-StxA与KDR的结合活性
以10μg/孔包被小肽-StxA和StxA,加入100ngKDR做ELISA实验,并以100ng血管生成素为阴性对照。结果显示小肽-StxA与KDR结合,与血管生产素不结合,StxA与KDR和血管生产素都不结合,说明导向毒素小肽-StxA具备了体外结合KDR的特性。
2.Western blot检测小肽-StxA与KDR的结合活性
将小肽-StxA和StxA的包涵体进行SDS-PAGE电泳,用半干转印仪将胶上的表达带转移到硝酸纤维素膜(NC)上,5%BSA封闭后,依次将NC膜与1μg KDR、12.5μg抗KDR单抗和1∶200倍稀释羊抗鼠二抗作用,DAB显色,H2SO4终止反应。结果显示小肽-StxA与KDR结合,而StxA与KDR不结合(图4,从左到右分别为小肽-StxA,StxA,标准分子量蛋白,标准分子量蛋白,StxA,小肽-StxA)。
三.小肽-StxA和StxA的细胞毒性测定
将生长状态良好的HUVEC、SMMC-7721细胞和Wish细胞以每孔5000个接种于96孔酶联板上,加20μl 3.5g/L的小肽-StxA和StxA溶液到细胞培养上清中,作用30min后,换用新鲜培养液继续培养,2~3天后细胞培养孔中加入25μl MTT混匀,继续于CO2孵箱中培养4-6hr,小心弃掉培养液上清,每孔加入100μl DMSO,振荡混匀,酶标仪上测定A620值。结果显示小肽-StxA和StxA对细胞的毒性基本一样,说明小肽与毒素融合表达后,对毒素活性基本没有影响。
四.小肽-StxA的选择杀伤活性测定
用鸡胚绒毛尿囊膜(chorioallantoic membrane,CAM)实验测定小肽的选择杀伤活性,取新鲜受精鸡卵,无菌蒸馏水洗净,75%酒精插拭后晾干,大头朝上小头朝下,置于于37℃温箱中(内置盛有蒸馏水的蝶皿)孵育,每日早晚反转鸡卵180°各一次。
孵育至9天,在照卵灯观察下,先用钻在气室顶端打1-2mm小孔,然后在距胚头前1公分,两条前卵黄静脉之间的卵壳投影部位,用铅笔画出1×1.5公分长方形区。
75%酒精消毒后,用高压灭菌的牙科细砂轮沿长方形区的边线磨切透卵壳(小心勿伤及下方卵壳膜),用平嘴眼科镊夹住长方形卵壳两缘,平行向上提起,使下方的卵壳膜暴露,倾去卵壳粉尘。
用注射针头在卵壳膜上轻轻划破直径1mm小孔,滴加无菌蒸馏水少许,然后用尖嘴眼科镊轻轻拨起小孔边缘的卵壳膜,让液体浸入卵壳膜与CAM之间,待CAM下沉后,剪除长方框内卵壳膜。
将无菌小滤纸片置于CAM无血管区,将50ngVEGF+25μl 2.5g/L小肽-StxA、50ngVEGF+25μl 2.5g/L StxA和50ngVEGF+15μl 3.5g/L的小肽加到滤纸片上,用透明胶纸封闭卵壳开口,继续置37℃温箱中孵育,为保证无菌,以上操作宜在超净台中进行。孵育至第11天,用眼科镊去掉CAM平面以上的卵壳及卵壳膜,勿伤及CAM血管,加4%的甲醛固定测试区10min后,将测试区域的CAM剪下,置于盛有蒸馏水的蝶皿中,用弯头吸管展开后,倾去皿中的蒸馏水,在皿底摊平CAM,反转贴于滤纸上,落射光摄影,阴干后长期保存。
结果显示StxA对鸡胚的生长和对VEGF活性的发挥都有明显的抑制作用,测试物周围基本没有血管形成,鸡胚已死亡。小肽-StxA对鸡胚的生长没有明显的影响,对VEGF刺激血管的生产有一定抑制作用,测试物周围血管没有明显增粗现象,毛细血管走向没有以测试物为中心呈辐射状分布(图5)。小肽对鸡胚的生长和对VEGF刺激血管细胞的生长影响作用都不大(图6)。说明导向毒素小肽-StxA因小肽的存在具备了一定的选择杀伤活性。
Claims (3)
1.一种小肽分子,其氨基酸序列如下所示:
C-H-V-I-L-H-P-R-C
即半胱氨酸—组氨酸—缬氨酸—异亮氨酸—亮氨酸—组氨酸—脯氨酸—精氨酸—半胱氨酸。
2.权利要求1所述的小肽分子作为先导物质在制备肿瘤治疗药物中的应用。
3.权利要求1所述的小肽分子作为先导物质在制备靶向新生血管药物中的应用。
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