CN1210276C - 具有镇咳活性的植物提取物和生物碱 - Google Patents

Abstract

本发明提供具有镇咳活性的植物提取物、分离的生物碱、合成生物碱和混合物。在一些优选实施方式中，植物提取物和分离的生物碱获自一种百部科植物。在另外的优选实施方式中，植物提取物和分离的生物碱来自一种Stemona、Croomia或Stichoneuron属的植物。在最优选实施方式中，植物提取物和分离的生物碱获自Stemona tuberosa植物。本发明进一步提供分离这些植物提取物和生物碱的方法。另外，通过服用具有镇咳活性的植物提取物、生物碱和组合物，本发明提供了减轻和抑制咳嗽的方法。

Description

具有镇咳活性的植物提取物和生物碱

技术领域

本发明涉及具有镇咳活性的植物提取物、分离的生物碱和合成生物碱，其作为药剂能有效减轻或抑制咳嗽。

背景技术

咳嗽能清除气管和支气管网中积累的分泌物和/或异物。引起咳嗽的机理是，适当的刺激物引起深吸气，跟着会厌关闭，横隔膜松弛。其后，肌肉强烈的收缩以对抗关闭的会厌，因此造成在胸内和呼吸道内压力增大。由于周围顺应性外膜的包裹，胸腔内的正压力导致气管变窄，会厌打开。当会厌打开时，在胸腔和大气之间形成的巨大压力差配合气管的变窄，使流经气管的空气速率大增。这种空气流速增加所产生的力量会把咳出的粘液和异物从呼吸道中清除。

咳嗽由多种刺激引起，包括生理、机械或化学刺激。例如，咳嗽可由炎症、机械紊乱和化学及温度变化刺激引起。还例如，炎症刺激也可以是粘膜水肿引起。反过来，水肿可由任何病因引起，例如，细菌或病毒感染、感冒或吸烟过度。炎症刺激也可由渗出过程的刺激引起，例如后鼻滴注和胃液回流。这种刺激可能出现在呼吸道内，例如喉炎、支气管炎、肺炎和肺脓肿。

另外，机械刺激，例如微粒物质的吸入会导致咳嗽。另外引起呼吸道压缩或在呼吸系统任何区域压力增加的机械紊乱会导致咳嗽。这些疾患可由内壁或外壁病因引起。例如，咳嗽的外壁病因包括由主动脉瘤、肉芽瘤、肺瘤、胸腔纵隔肿瘤等引起的外壁压力。内壁损害例如基因性支气管癌、支气管腺瘤、异物的存在或支气管哮喘也导致咳嗽。呼吸膜柔韧性的降低也能导致慢性咳嗽，如患囊纤维化病人的情况一样。

化学刺激，例如刺激性气体的吸入(如香烟或化学烟雾)也能引起咳嗽。其它导致咳嗽的原因是化学刺激及其对呼吸系统自身或对呼吸气体的平衡和吸收的反应性影响。另外，由于与在呼吸过程中所涉及的酶类反应，许多化学制剂诱发咳嗽。最后，温度变化刺激，例如特别热或特别冷的空气的吸入也能导致咳嗽。

一些疾病状态中，咳嗽可能是唯一的或主要的症状。例如，患支气管哮喘的病人会持续不断地咳嗽。此外，一些病情中，例如哮喘，咳嗽本身会进一步恶化病人的情况。哮喘是由于支气管的痉挛收缩引起，这种病况以突发性呼吸困难和复发为特征。这种情况是由多种病因引起的。某些情况下，哮喘是过敏性反应的结果。多种因素包括剧烈锻炼、化学或微粒刺激，甚至心理压力也能刺激或引起咳嗽。此外，伴随着咳嗽的胸腔的强烈收缩使已经受刺激的呼吸膜进一步恶化。Karlsson等人，Pulmonary Pharmacology andTherapeutics(1999) 12：215-238对咳嗽的生理学进行了评述。

治疗咳嗽的镇咳药物已发展有很多种，例如吗啡类化合物和作用于鸦片受体的化合物。然而，这些化合物都有不利的副作用。例如吗啡类化合物的使用会导致成瘾、呼吸抑制、抑制平滑肌的收缩(例如导致便秘)和出现幻觉。特别是可待因高度成瘾，美沙芬能诱发幻觉、妄想或其它精神病症状。此外，具有强镇咳活性的药物例如可待因和美沙芬对中枢神经系统有不利影响。另外，作用于鸦片受体的药物对排尿有不利影响(Leander等人.Pharmacol.Exp.Ther.， 227：35(1983))。Hey等，Annual Reports in MedicinalChemistry  35：53-62(2000)和Bolser，Pulmonary Pharmacology  9：357-364(1996)对镇咳药物进行了评述。

治疗咳嗽的药物有很多种，然而，无副作用如镇静和成瘾的安全和有效的镇咳剂种类有限。由于治疗咳嗽的药物有严重不利的副作用，因此需要研发无此类副作用并能有效减轻和抑制咳嗽的镇咳药物。本发明满足了这些及其它要求。

发明内容

本发明提供了一种新型的具镇咳作用的化合物，其没有吗啡类化合物的副作用并能有效减轻或抑制咳嗽。一方面，这种镇咳化合物是植物提取物或其衍生物，例如来自百部科植物。

如此，在一个实施方式中，本发明提供了具有结构式I的化合物：

在结构式I中，R¹选自氢和α(S)-甲基-γ(S)-丁内酯基；R²选自β氢和α氢；R³选自β氢和α氢；R⁴是羟基；R⁵选自羟甲基和羧基。在一个可选择的实施方式中，R⁴和R⁵与它们所连接的碳一起，形成取代的γ(S)-丁内酯基或取代的呋喃环；R⁶选自β氢和α氢。在另一个实施方式中，R⁴和R⁵与它们所连接的碳一起，形成取代的γ(S)-丁内酯基。R²和R⁶都不存在，形成一个吡咯环，条件是R¹是α(S)-甲基-γ(R)-丁内酯基，R³是α氢。

在另一个实施方式中，本发明提供了一种药物组合物，该药物组合物包括一种具有结构式I的化合物：

R¹选自氢和α(S)-甲基-γ(S)-丁内酯基；R²选自β氢和α氢；R³选

自β氢和α氢；R⁴是羟基；R⁵选自羟甲基和羧基。或者，R⁴和R⁵与它们所连接的碳一起，形成取代的γ(S)-丁内酯基或取代的呋喃环；R⁶选自β氢和α氢。在另一个实施方式中，R⁴和R⁵与它们所连接的碳一起，形成取代的γ(S)-丁内酯基，R²和R⁶都不存在，形成一个吡咯环，条件是R¹是α(S)-甲基-γ(R)-丁内酯基，R³是α氢，和一个药用传递体。

在另一个实施方式中，本发明提供了减轻患者咳嗽的一种方法，该方法包括：服用有效量的具有结构式I的化合物：

其中，R¹选自氢和α(S)-甲基-γ(S)-丁内酯基；R²选自β氢和α氢；R³选自β氢和α氢；R⁴是羟基；R⁵选自羟甲基和羧基。在一个可选择的实施方式中，R⁴和R⁵与它们所连接的碳一起，形成取代的γ(S)-丁内酯基或取代的呋喃环；R⁶选自β氢和α氢。在另一个实施方式中，R⁴和R⁵与它们所连接的碳一起，形成取代的γ(S)-丁内酯基，R²和R⁶都不存在，形成一个吡咯环，条件是R¹是α(S)-甲基-γ(R)-丁内酯基，R³是α氢，从而减轻了患者的咳嗽。

在另一个实施方式中，本发明提供了一种具有镇咳活性的百部科植物提取物，这种百部科植物提取物抑制了患者的咳嗽。在某一方面，属于百部科的属选自Stemona，Croomia或Stichoneuron。Stemona或Croomia属的种类优选选自S.collinsae，S.japonica，S.mairei，S.parviflora，S.sessilifolia，S.tuberosa，C.japonica和C.heterosepala，其中C.代表Croomia。在一个优选实施方式中，Stemona种类是Stemona tuberosa。这种植物提取物可以是总提取物或总生物碱提取物。

在其它实施方式中，本发明提供了一种药物组合物，包括：一种具有镇咳活性的百部科植物提取物，其中的百部科植物提取物抑制患者的咳嗽。

在另一实施方式中，本发明提供了一种减轻患者咳嗽的方法，包括：服用具有镇咳活性的有效量的百部科植物提取物，其中的百部科植物提取物抑制患者的咳嗽。

在又一实施方式中，本发明提供了一种从百部科植物中提取具有镇咳活性的总生物碱的方法，该方法包括：(a)将百部科植物样本与醇接触形成提取液；(b)将提取液中的醇蒸发形成浆状物；(c)调节浆状物成酸性pH值以形成一个上清液部分；(d)调节上清液部分成pH碱性，然后用有机溶剂提取以形成有机溶液；和(e)蒸发有机溶剂至干燥状态以形成具有镇咳活性的总生物碱提取物。

在又一实施方式中，本发明进一步提供了从上述的总生物碱提取物中制备具有镇咳活性的四种百部生物碱的方法，该方法进一步包括分离、提纯和结晶总生物碱提取物，形成四种具有镇咳活性的百部生物碱。可采用柱层析工艺来分离这四种百部生物碱。

在又一实施方式中，本发明提供了一种从百部科植物中制备具有镇咳活性的水提物的方法，该方法包括：(a)将百部科植物样本与水溶剂接触形成提取液；(b)蒸发提取液至干燥状态以形成具有镇咳活性的水提物。

结合下面详细的描述和附图，这些和其它的实施方式将会更加明了。

附图简要说明

图1表示八种相关的百部生物碱化学结构式。图1A表示化合物B，C，D和E的化学结构式；图1B表示三种合成的植物碱，化合物F，G和H的化学结构式；图1C表示分离的植物碱，neotuberostemonine(化合物A)的化学结构式。

图2表示从Stemona tuberosa中得到的水提取物的镇咳效果。图2A表示阵发性咳嗽次数的对照百分比；图2B表示提取物与对照之间的咳嗽潜伏期比率。括号内的数字是受测试动物的数量。与空白对照相比^*P＜0.05。

图3表示从Stemona tuberosa中得到的总生物碱提取物的镇咳效果。图3A表示阵发性咳嗽次数的对照百分比；图3B表示提取物与对照之间的咳嗽潜伏期比率。括号内的数字是受测试动物的数量。与空白对照相比^**P＜0.01。

图4表示neotuberostemonine(化合物A)的镇咳效果。图4A表示阵发性咳嗽次数的对照百分比；图4B表示化合物A与对照之间的咳嗽潜伏期比率。括号内的数字是受测试动物的数量。与空白对照相比^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001。

图5表示化合物A，B，C和D在动物体内的镇咳效果。图5A表示化合物A，B，C和D的腹腔(133μmol/kg)给药效果；图5B表示化合物A和E的口服(400μmol/kg)给药镇咳效果。括号内的数字是受测试动物的数量。与相应的空白对照相比^*P＜0.05，^***P＜0.001。腹腔给药时，生理盐水用作化合物C和A的赋形剂，含5％吐温80的生理盐水用作化合物B和D的赋形剂；口服给药时，含5％吐温80的生理盐水用作化合物E和A的赋形剂时。

图6表示化合物D，F，G和H腹腔(133μmol/kg)给药的镇咳效果。括号内的数字是受测试动物的数量。与相应的空白对照相比^*P＜0.05。含5％吐温80的生理盐水用作化合物F，D和G的赋形剂，生理盐水用作化合物H的赋形剂。

图7表示钠洛酮对neotuberostemonine(化合物A，100mg/kg)和可待因(30mg/kg)产生的镇咳活性的影响。括号内的数字是受测试动物的数量。与空白对照相比^**P＜0.01，^***P＜0.001；与可待因治疗的组相比，^##P＜0.01。

图8表示化合物A的分子结构。

图9表示化合物B的分子结构。

图10表示化合物C的分子结构。

图11表示化合物D的分子结构。

图12表示化合物E的分子结构。

图13表示化合物F的分子结构。

表1所示为化合物A，B，C，D，E，F，G和H的化学结构式。

表2所示为化合物A，B，C，D，E和F的结晶学数据和参数。

表3所示为五种天然百部生物碱的结构-镇咳活性关系。数据以平均值±SEM来表示。与空白对照相比^*P＜0.05，^***P＜0.001。

表4所示为三种合成百部生物碱和化合物D的结构-镇咳活性关系。数据以平均值±SEM来表示。与空白对照相比^*P＜0.05，^***P＜0.001。

表5所示为不同的拮抗剂对化合物A产生的镇咳活性的影响结果。数据以平均值±SEM来表示。

表6所示为化合物A的放射性同位素示踪受体结合试验结果。±指轻微但不明显的对受体结合的抑制。

具体实施方式

I.概要

本发明提供镇咳化合物如百部生物碱、植物提取物、组合物，及其制备和使用方法。有利的是，该镇咳化合物、植物提取物和组合物均能有效治疗咳嗽并且无吗啡类药物的副作用。该镇咳化合物、植物提取物和组合物能有效减轻和抑制咳嗽。在此，词语“镇咳活性”是指减轻或抑制咳嗽。

A.化合物

本发明提供镇咳化合物，例如有助于减轻或抑制咳嗽的百部生物碱。本领域科技人员不难理解，本发明的拥有不对称碳原子(手性中心)或双键的某些化合物；消旋物、非对映体、对映体、几何异构体和单体异构体都在本发明的保护范围之内。

一方面，镇咳化合物具有结构式I：

其中R¹，R²，R³，R⁴，R⁵和R⁶如前所定义。图1A表示四种分离的新百部生物碱化合物B，C，D和E的化学结构式；图1B表示三种合成的新的与百部相关的生物碱化合物F，G和H的化学结构式；图1C表示分离的已知生物碱neotuberostemonine(化合物A)的化学结构式。在最优选实施方式中，本发明的生物碱由化合物A，B，C，D，E，F，G和H的化学结构式来表示，如表I所示。

表1：化合物A，B，C，D，E，F，G和H的化学结构式

本发明的化合物包括天然产物和合成的类似物。在某一优选方面，本发明的天然产物具有如下结构式：

其中，R¹选自氢和α(S)-甲基-γ(S)-丁内酯基；R²选自β氢和α氢；R³选自β氢和α氢。在一个优选方面，R¹是α(S)-甲基-γ(S)-丁内酯基；R²是α氢；R³是α氢，在此也就是指化合物B。在另外一个优选方面，R¹是α(S)-甲基-γ(S)-丁内酯基；R²是α氢；R³是β氢，在此也就是指化合物C。在又一优选方面，R¹是氢；R²是β氢；R³是β氢，在此也就是指化合物D。在又一优选方面，通式I的化合物具有结构式Ib，在此也就是指化合物E。化合物E具有结构式：

除天然产物外，本发明还包括合成的类似物。在某些优选方面，本发明的天然产物能衍生出具有结构式Ic的化合物：

其中，R⁴是羟基；R⁵选自羟甲基和羧基。或可选择地，R⁴和R⁵与它们所连接的碳一起，形成取代的呋喃环。在一个优选方面，R⁴是羟基；R⁵是羟甲基，在此也就是指化合物F。在另一个优选方面，R⁴是羟基；R⁵是羧基，在此也就是指化合物G。在又一优选方面，R⁴和R⁵与它们所连接的碳一起，形成取代的呋喃环，在此也就是指化合物H，它具有如下结构式：

制备方法

如上所述，本发明的化合物包括天然产物和合成的类似物。天然产物如具有结构式Ia和Ib的化合物能从百部科植物提取物如S.tuberosa中获得。这些天然产物能从总生物碱提取物中获得。使用根据本发明的方法能产生一种总生物碱提取物。

如此，本发明提供了一种从百部科植物中制备具有镇咳活性的总生物碱的方法，该方法包括：(a)将百部科植物样本与醇例如乙醇接触形成提取液；(b)将提取液中的醇蒸发形成浆状物；(c)调节浆状物到一酸性pH值以形成一个上清液部分；(d)调节上清液部分到一碱性pH值，然后用有机溶剂例如乙醚提取以形成有机溶液。有机溶液此后可被蒸发至干燥状态以形成总生物碱提取物，可进一步使用例如柱层析法进行分离来获得感兴趣的纯生物碱。

在一个实施方式中，一个采用不连续梯度洗脱液系统的硅胶柱用来连续洗脱生产含本发明生物碱的组份。该组份此后可再分离和结晶来生产化合物B，C，D和E。

在某些方面，本发明的天然生物碱有一个稠和的内酯环。这些内酯环的官能团能衍生或还原来产生本发明的另外化合物。在一个优选方面，化合物D能由氢化铝锂还原为化合物F或H。在另一方面，化合物D的内酯环被水解来产生化合物G。如此，在某些方面，本发明提供制备具有通式Ic的化合物的方法。

B.植物提取物

在另一实施方式中，本发明提供具有镇咳活性的植物提取物。在一些优选实施方式中，植物提取物是具有镇咳活性的百部科植物提取物，其中的百部科植物提取物能抑制患者咳嗽。在某些方面，属于百部科的属是例如Stemona，Croomia或者Stichoneuron，优选Stemona或Croomia。Stemona或Croomia属的种可以是例如S.collinsae，S.japonica，S.mairei，S.parviflora，S.sessilifolia，S.tuberosa，C.japonica和C.heterosepala。(其中C.代表Croomia)。优选的Stemona种是Stemona tuberosa。如上所述，这种植物提取物可以是0-95％有机溶剂总提取物或总生物碱提取物。该植物提取物可包括天然产物例如具有结构式Ia和Ib的化合物和表1中描述的化合物A以及它们的混合物。

在一个实施方式中，本发明提供从百部科植物中制备具有镇咳活性的总生物碱提取物的方法，包括：(a)将百部科植物样本与醇接触形成提取液；(b)将提取液中的醇蒸发形成浆状物；(c)调节浆状物到一酸性pH值以形成一个上清液部分；(d)调节上清液部分到一碱性pH值，然后用有机溶剂提取以形成有机溶液；和(e)蒸发有机溶剂至干燥状态以形成具有镇咳活性的总生物碱提取物。

在另一实施方式中，本发明提供了一种从百部科植物中制备具有镇咳活性的水提物的方法，包括：(a)将百部科植物样本与水溶剂接触形成提取液；和(b)蒸发提取液至干燥状态以形成具有镇咳活性的水提物。

C.组合物

在一个实施方式中，本发明提供含本发明化合物或提取物和药用传递体的药物组合物。药用传递体部分地由所服用的特殊组合物决定，也由服用组合物所用的特殊方法来决定。因此，本发明的药物组合物有很多种合适的剂型。适合口服的剂型可包括(a)水溶液，例如有效量的溶解于稀释剂例如水、盐水或PEG400的生物碱；(b)每种包含预定量活性成份的胶囊、袋剂或片剂，液剂、固剂、颗粒剂或明胶；(c)在合适液体中的混悬物；和(d)合适的乳剂。

片剂形式可包括一种或多种乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、磷酸钙、玉米淀粉、马铃薯淀粉、黄芪胶、微晶纤维素、阿拉伯胶、明胶、二氧化硅胶、糊精、滑石粉、硬脂酸镁、硬脂酸和其它的赋形剂、着色剂、填充剂、粘合剂、稀释剂、缓冲剂、湿润剂、防腐剂、香料、染剂、崩解剂和药理上可配伍的传递体。锭剂形式包含的活性成份可在香料内，通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶，如同软锭剂包含的活性成份在无活性基内，例如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶乳剂、凝胶等除活性成份外的本领域已知的传递体。

在一个优选实施方式中，本发明的组合物用来治疗咳嗽。在一个优选实施方式中本发明提供长效的镇咳组合物。上述组合物的用量随多种因素变化，例如特殊物质的药效特性及其给药方式和路线；年龄、健康状况、个体重量；症状的性质和程度、并行治疗的种类、治疗频率和预期效果。

本发明的组合物优选包含合适的药用传递体或稀释剂。合适的药用传递体和制备药剂形式的方法记载在本领域的一个标准参考书《Remington’sPharmaceutical Science》，Mack出版公司。合适的药用稀释剂、赋形剂或传递体根据给药形式如口服片剂、胶囊、糖浆等来选择，与传统药理实践一致。该组合物优选口服，更优选胶囊或浆状物形式，例如止咳糖浆。

对于液体形式的口服给药，口服活性物质可与任何口服无毒的药用无活性传递体例如乙醇、甘油、水等混合。如果希望或需要，合适的粘合剂、润滑剂、崩解剂和着色剂也可掺进药剂中。合适的粘合剂包括淀粉、明胶、天然糖例如葡萄糖或β-乳糖、玉米甜味剂、天然或合成胶例如阿拉伯胶、黄芪胶或藻酸钠、羧甲基纤维素、聚乙烯乙二醇、蜡等。合适的润滑剂包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、醋酸钠、氯化钠等。崩解剂包括淀粉、甲基纤维素、琼脂、皂土、黄原胶等。止咳剂一般包括(除活性成份外)山梨醇、蔗糖、柠檬酸、香料和水。

对于片剂或胶囊形式的口服给药，活性物质可与口服无毒的药用无活性传递体例如乳糖、淀粉、蔗糖、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、磷酸二钙、硫酸钙、甘露醇、山梨醇等混合。明胶胶囊可包含活性物质和粉末状传递体，例如乳糖、淀粉、纤维素衍生体、硬脂酸镁、硬脂酸等。类似的传递体和稀释剂也可用来制备压缩的片剂。片剂和胶囊也能制作成持续释放产品，在一段时间内使活性成份连续释放。压缩片剂可用糖衣或薄膜覆盖以遮住难受的味道并使其与空气隔离来得到保护，或用肠衣在胃肠道中选择分解。口服液剂可包含着色剂和香料来增加患者接受。

水、合适的油、盐水、葡萄糖水及相关的糖溶液和乙二醇例如丙烯乙二醇或聚乙烯乙二醇可用作肠道外溶液的传递体。这种溶液优选包含活性成份的水溶性盐、合适的稳定剂，如果需要，还可包含缓冲物质。合适的稳定剂包括抗氧化剂例如硫酸氢钠、亚硫酸钠或抗坏血酸，单独或混合的柠檬酸及其盐和EDTA钠。肠道外溶液也可包含防腐剂，例如杀藻胺、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯和氯丁醇。

本发明的化合物也可以脂质体输送体系形式给药，例如小的单层泡囊、大的单层泡囊和多层泡囊。脂质体可由多种磷脂形成，例如胆固醇、十八胺或磷脂酰胆碱。本发明的化合物也可配合可溶性聚合物，这些是可命中目标的药物传递体。这些聚合物例如包括聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羟基丙基-甲基丙烯酰胺-苯酚、聚羟基乙基天冬酰苯丙胺苯酚或由软酯酰残基取代的聚乙烯氧-聚赖氨酸。该物质也可配合用作控制药物释放的生物可降解聚合物。合适的聚合物包括聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸和聚乙醇酸的共聚物、聚ε己内酯、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚缩醇、聚二氢吡喃、聚氰基丙烯酸酯、和交联或两亲嵌段水凝胶共聚物。

在一个组合物中可使用多种本发明的化合物。这些化合物可同时、单独或顺次给药。

D.使用方法

本发明提供一种抑制哺乳动物咳嗽的方法，包括有效量的由化合物A，B，C，D，E，F，G，H的化学结构式表示的一种生物碱或其组合物的给药步骤。另一方面，本发明提供减轻患者咳嗽的一种方法，包括：服用有效量的具有镇咳活性的百部科植物提取物，其中的百部科植物提取物抑制患者咳嗽。

随着时间的过去，本发明上下文中的对患者的给药量应该足够能在患者获得有益的治疗反应。给药量由患者的状况决定。给药量也由伴随对特殊患者给药所产生的任何副作用的存在、性质和程度来决定。在决定获得镇咳效果的生物碱给药的有效量时，标准的定量服法可如本领域已知的Karlsson etal.，Pulmonary Pharmacology和Therapiutics(1999)12：215-238。

另一方面，本发明的特征在于一种减轻动物咳嗽的分离的生物碱的制备方法，包括：(a)提供一个植物样本；(b)将植物样本与醇接触以使可溶性植物化学组合物从植物样本提取到醇中形成提取液；(c)将提取液中的醇蒸发形成浆状物；(d)调节浆状物到一酸性pH值，分离出浆状物中的特殊物质形成上清液部分；(e)调节上清液部分到一碱性pH值，用至少一种溶剂提取可溶性植物化学组合物形成有机溶液；(f)蒸发有机溶液至干燥状态形成总生物碱提取物；(h)纯化、分离和结晶总生物碱提取物形成分离的生物碱；和(i)将分离的生物碱给药于阵发性咳嗽的动物，从而减轻或抑制阵发性咳嗽。

如图2所示，具有镇咳活性的水提物以3g/kg的高用量显著抑制柠檬酸导致的咳嗽在50％左右，增加用量时咳嗽潜伏期延长。图2A-B表示从Stemona tuberosa中提取的有镇咳效果的水提物。图2A表示阵发性咳嗽次数的对照百分比，图2B表示在提取物和对照之间的咳嗽潜伏期比率。

当给药量为150mg/kg时，总生物碱提取物显著减少了咳嗽次数(参见图3)。结果表明从Stemona tuberosa中提取的总生物碱提取物对咳嗽有效。此外，结果还表明由总生物碱提取物产生的镇咳活性非常强，从而证明，存在于百部科植物中的百部生物碱为镇咳活性物质。

在另一实施方式中，提供了一种筛选抑制咳嗽的方法。例如，用0.5M的柠檬酸刺激一只豚鼠。第一次刺激后产生超过10次阵发性咳嗽的豚鼠被挑选为对柠檬酸诱导敏感，并被用于进一步的镇咳测试。动物第一次刺激时的咳嗽次数和咳嗽潜伏期被记作基础对照。经过48小时的恢复后，挑选敏感豚鼠并随机分成不同的组，然后预先腹腔或口服给药。对于腹腔给药，可以是水提物(0.3-3g/kg)、总生物碱提取物(25-150mg/kg)、分离的生物碱例如化合物A(10，30，50和100mg/kg)、或化合物B，C，D，F，G，H(133μmol/kg)，或是认为有镇咳活性的提取物，预先30分钟给药。对于口服给药，可以是化合物A或E(400μmol/kg)，或是认为有镇咳活性的提取物，预先60分钟给药。然后第二次柠檬酸刺激，与基础对照相比，镇咳活性体现在每一个受测试动物的咳嗽次数的减少和咳嗽潜伏期的延长。

每种测试的生物碱镇咳活性强度采用GraphPad PRISM软件(Windows95和NT的3.00版本，GraphPad Software Inc.，San Diego，CA，USA)进行了统计比较。尽可能进行参数检验，因为初步研究表明，阵发性咳嗽次数和潜伏期的数据属于正态分布。为进行两个不同治疗组的药效比较，采用成对或不成对的T检验，挑选数据匹配或不匹配的组。为进行不同组间的比较，采用方差分析(ANOVA)进行Bonfferoni检验。比较不同组的结果所得小于0.05的概率(P)值被认为在统计上显著不同。基于这些检验的统计结果，确定了所有测试的生物碱活性强度，判定了结构与活性间的关系。

II.实施例

原材料

1.使用仪器

熔点由Fisher Scientific仪器测量。样品在MeOH溶液中的旋光度用Perkin-Elmer 341旋光计测定。EI-MS采用直接进样由Finnegan MAT GCQ质谱仪测定，而ESI-MS用Finnegan MAT TSQ 7000仪器测定。¹H和¹³C NMR核磁共振(CDCl₃)由500MHz或300MHz Bruker核磁共振仪测定。化学位移δ(ppm)以TMS为内标，耦合常数(J)以Hz给出。化合物B，C和D的X-光衍射数据用Bruker SMART CCDX-光衍射仪测定分析，化合物A，E和F的X-光衍射用Bruker P4衍射计仪测定。Merck硅胶板(60F254)用作薄层层析(TLC)，斑点用Dragendorff试剂喷雾显色，柱层析用Merck硅胶(70-230目)。

2.植物材料

上述实验中所用的Stemona tuberosa干根茎从香港的一家中药店购买，经鉴定是Stemona tuberosa。这种植物材料的证据样本(#992300)保藏在香港中文大学中医中药研究所中药博物馆。

3.动物

本发明使用雄性成年Dunkin-Hartley豚鼠(体重300-500g)，由香港中文大学实验动物中心提供。豚鼠置于实验室内(温度21±1℃；湿度60％)，自然昼/夜循环，给以标准的食物和水。

实施例1

水提取物

将Stemona tuberosa干的根茎(10g)切碎，用蒸馏水回流提取2小时，过滤后水溶液蒸干得到水提物(3.5g)。

实施例2

总生物碱提取物

为获得总生物碱提取物，将6kg Stemona tuberosa干根茎切碎，用95％的乙醇回流2小时。倒出提取物温液，在10℃下放置过夜。此后，过滤溶液，减压蒸发滤液得到浆状液。将浆状液用稀盐酸溶液(4％)酸化，在5℃下以每分钟3000转离心处理40分钟。将上清液用氨水碱化到pH为9，按顺序分别用乙醚和氯仿提取。蒸干合并的有机溶液得到总生物碱提取物(24g)。

实施例3

五种百部生物碱(化合物A-E)的分离

实施例2的总生物碱提取物(24g)于乙醚中进行回流溶解，室温下放置过夜，得到淡黄色沉淀物，即粗制的化合物A(3.4g)。粗制的化合物A进一步用乙醇结晶，得到纯的生物碱(化合物A，2.5g)。合并母液并蒸干，形成生物碱混合物。生物碱混合物经硅胶柱层析分离，分别用CHCl₃∶MeOH∶NH₄OH(98∶2∶0.05)，(96∶4∶0.05)和(92∶8∶0.05)不连续梯度洗脱。洗脱液用薄层层析(TLC)跟踪检测并合并为4个部分1-4。CHCl₃∶MeOH∶NH₄OH(98∶2∶0.05)洗脱的部分1(0.9g)进一步经硅胶柱层析纯化，以己烷-乙酸乙酯(70∶30)为洗脱液，得到化合物E(Eipbisdehydrotuberostemonine J，380mg)。CHCl₃∶MeOH∶NH₄OH(98∶2∶0.05)洗脱的部分2(0.8g)进一步经硅胶柱层析纯化，以己烷-乙酸乙酯(60∶40)为洗脱液，得到化合物B(Tuberostemonine J，245mg)。CHCl₃∶MeOH∶NH₄OH(96∶4∶0.05)洗脱的部分3(2.3g)进一步经硅胶柱层析纯化，以己烷-乙酸乙酯(50∶50)为洗脱液，分别得到化合物C(Tuberostemonine H，470mg)和化合物A(98mg)。CHCl₃∶MeOH∶NH₄OH(92∶8∶0.05)洗脱的部分4(3.1g)进一步经硅胶柱层析纯化，以己烷-乙酸乙酯(35∶65)为洗脱液，得到化合物D(Neostenine，600mg)。

每种化合物的特性如下。

化合物A(Neotuberostemonine)：无色针状晶体，结晶于己烷/乙酸乙酯。mp：159.5-161℃；[α]_D ²⁰＝+83°(c，0.1；MeOH)；IRν_max ^KBrcm^-1：1762，1456，1167，1015；ESI-MSm/z(％强度)：376[M+H]⁺(63)；EI-MSm/z(％强度)：375[M]⁺(5)，276[M-C₅H₇O₂]⁺(100)。¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ：0.96(3H，t，J＝7.3Hz，H-17)，1.20(3H，d，J＝7.1Hz，H-15)，1.22(3H，d，J＝7.0Hz，H-22)，1.3-2.0(14H，H-1，2H-2，2H-6，2H-7，2H-8，H-9，H-10，2H-16，H-19)，2.05(1H，ddd，J＝15.0，3.3，6.6Hz，H-12)，2.34(1H，ddd，J＝5.4，13.3，15.2Hz，H-19)，2.58(1H，ddq，J＝5.3，7.0，12.1Hz，H-20)，2.84(1H，dq，J＝6.6，6.9Hz，H-13)，2.92和3.03(各1H，m，2H-5)，3.16(1H，dd，J＝3.8，3.9Hz，H-9a)，3.29(1H，dd，J＝7.7，14.0Hz，H-3)，4.36(1H，ddd，J＝5.4，7.7，11.2Hz，H-18)，4.49(1H，dd，J＝3.3，3.0Hz，H-11)。X-光衍射数据汇总于表2和图8。

化合物B(Tuberostemonine J)：无色棱晶(prism)，结晶于己烷/乙酸乙酯。mp：180-182℃；[α]_D ²⁰＝+36.4°(c，0.1；MeOH)；EI-MS m/z(％强度)：375[M]⁺(1.5)，276[M-C₅H₇O₂]⁺(100)。¹H NMR(500MHz，CDCl₃)δ：1.01(3H，t，J＝7.5Hz，H-17)，1.18(3H，d，J＝7.5Hz，H-15)，1.22(3H，d，J＝7.5Hz，H-22)，1.40-2.10(15H，H-1，2H-2，2H-6，2H-7，2H-8，H-9，H-10，H-12，2H-16，H-19)，2.25(1H，m，H-19)，2.50(1H，m，H-20)，2.74(1H，m，H-13)，2.74和2.98(各1H，m，2H-5)，3.02(2H，m，H-3和H-9a)，4.19(1H，br，H-11)，4.37(1H，m，H-18)；¹³CNMR(125MHz，CDCl₃)δ：11.60(C-17)，12.90(C-15)，14.80(C-22)，25.45(C-16)，29.45(C-7)，30.62(C-6)，32.40(C-2)，33.27(C-8)，34.30(C-19)，34.52(C-9)，34.77(C-10)，38.38(C-12)，41.11(C-20)，45.05(C-13)，45.80(C-1)，50.09(C-5)，64.59(C-3)，66.28(C-9a)，80.18(C-11)，81.28(C-18)，179.18(C-14)，179.26(C-21)。X-光衍射数据汇总于表2和图9。

化合物C(Tuberostemonine H)：无色针状晶体，结晶于己烷/乙酸乙酯。mp：183-185℃；[α]_D ²⁰＝+77.6°(c，0.1；MeOH )；IRν_max ^KBrcm^-1：1769，1454，1174，1016；EI-MSm/z(％强度)：375[M]⁺(0.9)，276[M-C₅H₇O₂]⁺(100)。¹HNMR(500MHz，CDCl₃)δ：1.00(3H，t，J＝7.2Hz，H-17)，1.18(3H，d，J＝7.2Hz，H-15)，1.22(3H，d，J＝7.2Hz，H-22)，1.3-2.0(15H，H-1，2H-2，2H-6，2H-7，2H-8，H-9，H-10，H-12，2H-16，H-19)，2.35(1H，m，H-19)，2.45(1H，m，H-20)，2.61(1H，m，H-13)，2.78和2.84(各1H，m，2H-5)，3.01(1H，m，H-9a)，3.20(1H，m，H-3)，4.37(1H，ddd，J＝4.6，5.9，10.5Hz，H-18)，4.57(1H，d，J＝3.6Hz，H-11)；¹³C NMR(125MHz，CDCl₃)δ：11.61(C-15)，11.88(C-17)，15.05(C-22)，21.17(C-16)，24.10(C-7)，27.10(C-8)，27.34(C-6)，31.15(C-2)，33.42(C-19)，35.31(C-10)，41.10(C-9)，41.90(C-20)，44.14(C-12)，44.84(C-1)，47.22(C-13)，54.70(C-5)，67.46(C-9a)，77.97(C-3)，79.24(C-18)，80.67(C-11)，179.10(C-21)，179.45(C-14)。X-光衍射数据汇总于表2和图10。

化合物D(Neostenine)：无色棱晶(prism)，结晶于己烷/乙酸乙酯。mp：90-92℃；[α]_D ²⁰＝+73.6°(c，0.1；MeOH)；EI-MS m/z(％强度)：277[M]⁺(74)，276[M-H]⁺(100)，233(32)，204(76)，191(67)。¹H NMR(500MHz，CDCl₃)δ：0.97(3H，t，J＝7.5Hz，H-17)，1.20(3H，d，J＝7.2Hz，H-15)，1.3-2.0(14H，H-1，2H-2，2H-6，2H-7，2H-8，H-9，H-10，H-12，和2H-16)，2.27(1H，m，H-13)，2.45(2H，m，H-3)，2.81和2.89(各1H，m，2H-5)，3.22(1H，m，H-9a)，4.50(1H，br，H-11)；¹³C NMR(125MHz，CDCl₃)δ：10.67(q，C-17)，11.84(q，C-15)，21.63(t，C-16)，21.70(t，C-7)，28.67(t，C-8)，28.86(t，C-6)，30.65(t，C-2)，34.79(t，C-9)，37.81(d，C-10)，37.97(d，C-12)，43.04(d，C-13)，43.38(d，C-1)，56.28(t，C-5)，56.44(t，C-3)，71.52(d，C-9a)，79.87(d，C-11)，180.24(s，C-14)。X-光衍射数据汇总于表2和图11。

化合物E(Epibisdehydrotuberostemonine J)：无色棱晶(prism)，结晶于己烷/乙酸乙酯。mp：186-188℃；[α]_D ²⁰＝-16.1°(c，0.1；MeOH)；IRν_max ^KBrcm^-1：2932，2864，1763，1454，1158，997，923；EI-MSm/z(％强度)：371[M]⁺(68)，327(28)，298(100)，272[M-C₅H₇O₂]⁺(71)。¹H NMR(500MHz，CDCl₃)δ：1.06(3H，t，J＝7.0Hz，H-17)，1.35(3H，d，J＝7.0Hz，H-22)，1.37(3H，d，J＝7.0Hz，H-15)，1.47(1H，t，J＝11.5Hz，H-10)，1.80(2H，m，H-16)，1.95(2H，m，H-8)，2.06和1.16(各1H，m，2H-6)，2.08和1.47(各1H，m，2H-7)，2.07(1H，d，J＝11Hz，H-19)，2.7-2.9(3H，m，H-13，H-19，H-20)，3.01(1H，t，J＝7.0Hz，H-9)，3.56(1H，dd，J＝5.0，5.8Hz，H-12)，3.79(1H，dd，J＝13.3，14.0Hz，H-5)，4.24(1H，dd，J＝5.0，14.0Hz，H-5)，4.67(1H，d，J＝4.0Hz，H-11)，5.36(1H，dd，J＝5.0，11.0Hz，H-18)，5.99(1H，s，H-2)；¹³C NMR(125MHz，CDCl₃)δ：11.39(C-17)，11.88(C-15)，14.97(C-22)，23.25(C-16)，28.58(C-6)，28.88(C-7)，30.97(C-19)，34.87(C-10)，35.04(C-8)，36.10(C-9)，39.57(C-12)，41.80(C-13)，41.94(C-20)，44.85(C-5)，71.70(C-18)，80.89(C-11)，107.13(C-2)，108.59(C-1)，126.60(C-9a)，137.58(C-3)，178.87(C-14)，178.87(C-21)。X-光衍射数据汇总于表2和图12。

表2：化合物A，B，C，D，E和F的结晶学数据和参数

参数	化合物
							生物碱	A	B	C	D	E	F
尺寸(mm)	0.30×0.40×0.75	0.38×0.36×0.77	0.22×0.34×0.65	0.26×0.28×0.82	0.12×0.40×0.72	0.38×0.30×0.8
							化学结构式	C22H33NO4	C22H33NO4	C22H33NO4	C17H27NO2	C22H29NO4	C17H31NO2
分子量	375.49	375.49	375.49	277.40	371.46	281.43
							晶系	斜方晶	斜方晶	斜方晶	斜方晶	单斜晶	斜方晶
空间组	P2(1)2(1)2(1)	P2(1)2(1)2(1)	P2(1)2(1)2(1)	P2(1)2(1)2(1)	P2(1)	P2(1)2(1)2(1)
							晶胞尺寸	a＝6.459(2)	a＝9.0115(11)	a＝5.5337(5)	a＝5.8368(4)	a＝6.3596(19)	a＝7.9979(14)

	b＝14.228(3)	b＝10.612(4)	b＝19.0275(18)	b＝9.6805(7)	b＝18.495(3)	b＝18.495(3)
								c＝23.033(3)	c＝22.074(3)	c＝20.0554(19)	c＝27.789(2)	c＝8.3875(15)	c＝21.515(4)
					β＝92.521(18)
							体积3	2116.8(9)	2110.9	2111.7	1570.1(2)	985.6(4)	1640.7(5)
Z	4	4	4	4	2	4
							密度(计算出)mg/m3	1.178	1.182	1.162	1.173	1.252	1.139
所测反射	2891	3109	12774	7580	2449	9269
							I独立	2690	2902	4138	2277	1914	2909
观察反射	1661	1750	1805	1744	1383	1872
							参数	246	246	244	182	246	183
F2适合性	1.060	1.017	0.999	0.986	1.048	0.999
							最终R指数[I＞4σ]	0.050	0.058	0.069	0.038	0.045	0.046
R指数(所有数据)	0.098	0.108	0.181	0.058	0.077	0.092

实施例4

化合物D的类似物的合成：化合物F，G和H

化合物F的合成

化合物D(250mg)和氢化铝锂(120mg)的混合物在四氢呋喃中搅拌回流加热3小时。冷却后，在混合物中加入几滴水来破坏掉多余的氢化铝锂。过滤混合物，滤液在40℃下减压蒸干，得到白色残留物。将残留物溶解于4％的盐酸溶液，用乙醚提取来除去非生物碱化合物。分离出水层并用25％的氨水碱化，然后用乙醚提取。水洗乙醚层并蒸发得到干粉，在己烷-乙酸乙酯中结晶得到棱晶(prism)(165mg)。所得合成化合物称为Neostenine-diol。Neostenine-diol的特性如下。

以己烷-乙酸乙酯重结晶得棱晶(prism)；mp130-132℃；ESI-MS m/z(％强度)：282[M+H]⁺(100)。¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ：0.93(3H，t，J＝7.5Hz，H-17)，1.04(3H，d，J＝7.5Hz，H-15)，2.4-2.7(2H，m，H-3)，2.9-3.1(2H，m，H-5)，3.34(1H，m，H-9a)，3.61(2H，m，H-14)，3.90(1H，m，H-11)；¹³C NMR(75.5MHz，CDCl₃)δ：12.18(C-17)，18.90(C-15)，21.58(C-7)，22.26(C-16)，28.09(C-2)，29.59(C-8)，30.03(C-6)，35.59(C-10)，38.58(C-12)，39.45(C-9)，43.83(C-1)，44.99(C-13)，56.87(C-3)，58.91(C-5)，65.49(C-14)，71.43(C-9a)，73.04(C-11)。X-光衍射数据汇总于表2和图13。

化合物G的合成

化合物D(148mg)溶解于2毫升4％的氢氧化钠溶液中，60℃水浴搅拌加热1.5小时。混悬液变为清液。用冰冷却溶液，搅拌下逐渐加入2％的盐酸溶液调节pH到8。加入冷却的蒸馏水到最终体积20ml，合成化合物F最终浓度26.67mM。所得溶液在0-5℃下保存。该化合物称为Neostenine-酸。

化合物G的ESI质谱表明仅有一个化合物，分子离子峰为296[M+H]⁺(100)。

化合物H的合成

化合物D(500mg)和氢化铝锂(250mg)的混合物在四氢呋喃中回流4小时。冷却后，在混合物中加入几滴水来破坏掉多余的氢化铝锂。过滤混合物得一残留物。将残留物溶解于4％的盐酸溶液，用乙醚提取来除去非生物碱化合物。分离出水层并用25％的氨水碱化，然后用乙醚提取。蒸干乙醚溶液。将残留物与20毫升10％的硫酸溶液水浴加热5小时，用乙醚提取酸性溶液，然后用K₂CO₃碱化。所得碱性溶液用乙醚提取。水洗有机层，与K₂CO₃一起干燥，蒸干得到一种油。进一步经硅胶柱层析纯化并用溶剂CHCl₃∶EtOAc∶MeOH(7∶1∶2)洗脱得到一种称为Neosenine-醚(245mg)的无色油。该化合物特性如下。

ESI-MSm/z(％强度)：264[M+H]⁺(100)。¹H NMR(300CDCl₃)δ：0.93(3H，t，J＝7.5Hz，H-17)，0.98(3H，d，J＝7.5，H-15)，3.22(1H，m，H-9a)，3.45(1H，dd，J＝8.1，10.2Hz，H-14)，3.87(1H，dd，J＝8.1，8.1Hz，H-14)，4.1(1H，m，H-11)；¹³C NMR(75.5MHz，CDCl₃)δ：12.13(C-17)，12.97(C-15)，21.93(C-16)，22.19(C-7)，29.31(C-2)，29.49(C-8)，31.31(C-6)，35.09(C-10)，37.03(C-12)，38.69(C-9)，38.81(C-13)，42.89(C-1)，56.93(C-3)，57.13(C-5)，72.41(C-14)，72.64(C-9a)，80.06(C-11)。

实施例5

镇咳活性的测定

采用先前Gallico等人(1994)中描述的方法并经过下面修改。豚鼠被单个置于密封透明的有机玻璃室(25×cm×12cm×12cm)内，通入雾化的0.5M的柠檬酸水溶液8分钟。使用超声波喷雾器(OMRONNE-U12，东京，日本)，产生粒子平均直径1-5微米的气溶胶。每分钟大约雾化0.5毫升0.5M的柠檬酸溶液。其间豚鼠被受过训练的观察员监测，8分钟内的阵发性咳嗽和潜伏期被观察员检测和计算。咳嗽的声音同时由室内放置的麦克风记录和放大。声波由采用Cool Edit 2000软件(Syntrillium，Phenix，USA)的微机分析。由此，咳嗽的计数是基于电脑处理的声音数据和人为观察双重指标，以此方式来测定咳嗽的减轻或抑制(即镇咳活性)。

实施例6

提取物和纯百部生物碱的镇咳活性鉴定

用0.5M的柠檬酸对豚鼠进行第一次刺激。第一次刺激后产生超过10次阵发性咳嗽的豚鼠被挑选为对柠檬酸诱导敏感，并被用于进一步的镇咳测试。动物第一次刺激时的咳嗽次数和咳嗽潜伏期被记作基础对照。经过48小时的恢复后，挑选敏感豚鼠并随机分成不同的组，每组至少有4只豚鼠，然后在第二次柠檬酸刺激前30分钟腹腔给药：水提物(0.3-3g/kg)、总生物碱提取物(25-150mg/kg)、化合物A(10，30，50和100mg/kg)和化合物B，C，D，F，G，H(133μmol/kg)。与基础对照相比，镇咳活性体现在每一个受测试动物的咳嗽次数的减少和咳嗽潜伏期的延长。此外，也对化合物A和E(400μmol/kg)的口服给药途径进行了同样的镇咳测试。另外，作为阳性对照，同时研究了可待因(5，10和30mg/kg，i.p.)的镇咳活性。

实施例7

提取物和化合物A的镇咳活性

如图2所示，具有镇咳活性的水提物以3g/kg的最高剂量显著抑制柠檬酸导致的咳嗽达50％左右，增加用量时咳嗽潜伏期延长。图2A-B表示从Stemona tuberosa提取的有镇咳效果的水提物。图2A表示阵发性咳嗽次数的对照百分比，图2B表示在提取物和对照组之间的咳嗽潜伏期比率。

当给药量为150mg/kg时，总生物碱提取物显著减少了咳嗽次数(参见图3)。结果表明从Stemona tuberosa提取的总生物碱提取物对咳嗽有效。此外，结果还表明由总生物碱提取物产生的镇咳活性非常强，因此，存在于这种提取物中的百部生物碱为镇咳活性化合物。

从Stemona tuberosa中分离出的纯百部生物碱，化合物A能抑制柠檬酸导致的咳嗽，并且其活性具量效关系，并且用50和100mg/kg(参见图4)的剂量也显著延长咳嗽的潜伏期。此外，采用临床常用止咳药可待因作为阳性对照进行对比研究。结果表明化合物A和可待因的ED₅₀值相似。

实施例8

结构-镇咳活性关系

对百部生物碱化合物B-H的镇咳活性进行了测定并将它们的活性强度与化合物A(参见图5)进行了比较。结果表明化合物A和D均能显著抑制阵发性咳嗽，并具量效关系。化合物C，B，F和H能明显减轻阵发性咳嗽。表3列出了五种天然百部生物碱的结构-镇咳活性关系。

表3：五种天然百部生物碱的结构-镇咳活性关系

表4列出了三种合成百部生物碱和化合物D的结构-镇咳活性关系。

表4：三种合成百部生物碱和化合物D的结构-镇咳活性关系

止咳活性强度的排序是：化合物A＝D＞C≈F≈H≈B。结果表明定义的三环体系(环A，B和C)(图1)是产生镇咳活性的主要关键结构，在三个环连接处的所有顺式构造是最佳结构。此外，环A上的3位取代基和环C上的11和12位取代基也影响这些生物碱的止咳活性，当α-甲基-γ-丁内酯基环取代在环C11和12位时，其止咳活性为所有测试的百部生物碱中最强。

实施例9

确定镇咳活性机制的活体动物测试

进一步的研究描绘了具有代表性的百部生物碱，即化合物A产生的镇咳活性机制。同样地，在第一次柠檬酸刺激后挑选出敏感动物并恢复24小时。在第二次刺激中，动物在腹腔给药-化合物A(50或100mg/kg)之前按不同的时间皮下注射不同的拮抗剂。试验的拮抗剂包括刺激前40分钟给予10mg/kg的SCH50911(GABA_B受体拮抗剂)，刺激前60分钟给予1mg/kg的WAY-100635(5-HT_1A受体拮抗剂)，刺激前45分钟给予1mg/kg的氟哌丁苯(多巴胺，D₂受体拮抗剂)。另外，在化合物A(30和100mg/kg)腹腔给药20分钟后皮下给予5mg/kg的钠洛酮(非选择性鸦片受体拮抗剂)。通过比较在单独给药化合物A的动物组和同时给药化合物A和每种测试的拮抗剂的组间阵发性咳嗽次数和咳嗽潜伏期的变化，以测试这些拮抗剂对化合物A镇咳活性的影响。此外，作为阳性对照，同时还测定了钠洛酮对可待因(30mg/kg)镇咳活性的拮抗作用。结果表明所有测试的拮抗剂未能显著影响百部生物碱的镇咳活性(图7，表5)。

表5：不同拮抗剂对化合物A镇咳活性的影响结果

拮抗剂	受体	％化合物A的镇咳活性
			钠洛酮	opioid，(非选择性)	86.51±11.57
SCH 50911	GABAB	83.25±16.73
			WAY-100635	5-HT1A	100.50±1.67
氟哌丁苯	多巴胺(D2)	115.21±7.05

实施例10

镇咳活性机制的体外受体结合试验

代表性百部生物碱化合物A被用来进行下面主要的受体结合试验。在10微摩尔浓度的条件下通过Novascreen Biosciences Crop.(7170StandardDrive，Hanover，Maryland 21076，USA)进行双份的标准放射性同位素示踪配体结合试验。监测的受体包括所有已知的涉及产生镇咳活性的受体，例如[³H]Deltorphin(δ₁-opioid receptor)，[³H]Naltrindole(δ₂-opioid receptor)，[³H]DAMGO(μ-opioid receptor)，[³H]U69593(κ₁-opioid receptor)，[³H]CGP54626A(GABA_B receptor)，[³H]8-OH-DPAT(5HT_1A receptor)，和[³H]Glibenclamide(Dopamine D₂-receptor)。体外受体结合试验(表6)表明化合物A与以上所有的受体均未显示任何的亲和力。因此，从活体动物和体外研究获得的结果证实，所有四种有效的新百部生物碱和化合物A的镇咳活性机理与吗啡受体无关。

表6：化合物A的放射性同位素示踪配体结合试验结果

受体	组织来源	配体	配体结合抑制百分比(平均)	亲合力
					Opioid，δ1	鼠前脑	[3H]Deltrophin	5.95	无
Opioid，δ2	人的重组子	[3H]Naltrindole	8.32	无

Opioid，κ	豚鼠小脑	[3H]U-69593	14.40	无
					Opioid，μ	鼠前脑	[3H]DAMGO	7.37	无
GABAB	鼠皮质	[3H]CGP	8.06	无
					5-HT1A	牛脑内海马状突起	[3H]8-OH-DPAT	-18.42	无
多巴胺，D2	Rate纹状体	[3H]Glibenclami	33.39	±

在此描述的实施例和实施方式仅起说明目的，本领域科技人员会明白其各种改进和变化，各种改进和变化包含在本申请及所附权利要求的主旨和范围内。在此引述的所有出版物、专利和专利申请包含在参考文献内。

Claims (26)

1.一种化合物，具有结构式：

其中：

R¹选自氢和α(S)-甲基-γ(S)-丁内酯基；

R²选自β氢和α氢；

R³选自β氢和α氢；

R⁴是羟基；

R⁵选自羟甲基；

或者可选择地，

R⁴和R⁵与它们所连接的碳一起形成取代的γ(S)-丁内酯基或取代的呋喃环，条件是当R⁴和R⁵与它们所连接的碳一起形成取代的γ(S)-丁内酯基时，R¹不是α(S)-甲基-γ(S)-丁内酯基；及

R⁶选自β氢和α氢；

2.如权利要求1所述的化合物，其中所述的化合物具有结构式：

其中：

R¹选自氢；

R²选自β氢和α氢；

R³选自β氢和α氢。

3.如权利要求1所述的化合物，其中

R¹是α(S)-甲基-γ(S)-丁内酯基；

R²是α氢；

R³是α氢；及

R⁴和R⁵与它们所连接的碳一起形成取代的γ(S)-丁内酯基。

4.如权利要求1所述的化合物，其中

R¹是α(S)-甲基-γ(S)-丁内酯基；

R²是α氢；

R³是β氢；及

R⁴和R⁵与它们所连接的碳一起形成取代的γ(S)-丁内酯基。

5.权利要求1所述的化合物，其中

R¹是氢；

R²是β氢；

R³是β氢；及

R⁴和R⁵与它们所连接的碳一起形成取代的γ(S)-丁内酯基。

6.如权利要求1所述的化合物，其中所述的化合物具有结构式

其中：

R⁴是羟基；及

R⁵选自羟甲基；

或者可选择地，

R⁴和R⁵与它们所连接的碳一起形成取代的呋喃环。

7.如权利要求6所述的化合物，其中

R⁴是羟基；及

R⁵是羟甲基。

8.权利要求6的化合物，其中所述的化合物具有结构式

9.一种药物组合物，所述药物组合物包括有效量的活性组分及药学上可接受的载体，所述活性组分包括具有下述结构式的化合物

其中：

R¹选自氢和α(S)-甲基-γ(S)-丁内酯基；

R²选自β氢和α氢；

R³选自β氢和α氢。

R⁴是羟基；

R⁵选自羟甲基；

或者可选择地，

R⁴和R⁵与它们所连接的碳一起形成取代的γ(S)-丁内酯基或取代的呋喃环；及

R⁶选自β氢和α氢。

10.如权利要求9所述的药物组合物，其中所述活性组分是来自具有镇咳活性的百部科植物提取物，所述百部科植物提取物抑制患者的咳嗽。

11.如权利要求10所述药物组合物，其中所述百部科植物选自Stemona，Croomia或Stichoneuron属。

12.如权利要求11所述的药物组合物，其中所述属为Stemona或Croomia。

13.如权利要求12所述药物组合物，其中Stemona或Croomia属的种类选自S.collinsae，S.japonica，S.mairei，S.parviflora，S.sessilifolia，S.tuberosa，C.japonica和C.heterosepala。

14.如权利要求13所述药物组合物，其中所述百部的种类为Stemona tuberosa。

15.如权利要求10所述药物组合物，其中所述植物提取物为总提取物。

16.如权利要求10所述药物组合物，其中所述植物提取物为总生物碱提取物。

17.如权利要求10所述药物组合物，其中所述植物提取物包括具有下列结构式的化合物

其中：

R¹选自氢和α(S)-甲基-γ(S)-丁内酯基；

R²选自β氢和α氢；及

R³选自β氢和α氢。

18.如权利要求10所述药物组合物，其中所述的活性成分包括至少两种或多种选自结构式Ia的化合物所组成的混合物

其中：

R¹选自氢和α(S)-甲基-γ(S)-丁内酯基；

R²选自β氢和α氢；及

R³选自β氢和α氢。

19.制备权利要求1所述的化合物的方法，所述方法包括：

(a)使百部科植物样品与0-95％的有机溶剂接触形成溶液；和

(b)蒸发所述溶液中的溶剂形成具有镇咳活性并含有如权利要求1所述的化合物的总提取物；

(c)调节所述的总提取物到pH值为酸性，形成上清液；

(d)调节上清液为碱性pH，然后用有机溶剂提取，形成有机溶液；

(f)蒸发有机溶液至干形成具有镇咳活性的总生物碱提取物；及

(g)从所述总生物碱提取物中分离将权利要求1所述的化合物，需要时将权利要求1所述的化合物转化为另一种权利要求1所述的化合物。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述溶剂为乙醇。

21.如权利要求19所述的方法，其中所述有机溶剂为乙醚。

22.如权利要求19-21之中任一项所述的方法，其中所述百部科植物选自Stemona，Croomia或Stichoneuron属。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述属为Stemona或Croomia。

24.如权利要求23所述的方法，其中Stemona或Croomia属的种类选自S.collinsae，S.japonica，S.mairei，S.parviflora，S.sessilifolia，S.tuberosa，C.japonica和C.heterosepala。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述百部的种类为Stemonatuberosa。

26.如权利要求19-21中任一项所述的方法，其中所述总提取物和总生物碱提取物包括至少两种或多种选自具有结构式Ia的化合物所组成的混合物，

其中：

R¹选自氢和α(S)-甲基-γ(S)-丁内酯基；

R²选自β氢和α氢；及

R³选自β氢和α氢。

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