CN1207566C - 一种检测作物种子纯度的方法 - Google Patents

一种检测作物种子纯度的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1207566C
CN1207566C CN 03101887 CN03101887A CN1207566C CN 1207566 C CN1207566 C CN 1207566C CN 03101887 CN03101887 CN 03101887 CN 03101887 A CN03101887 A CN 03101887A CN 1207566 C CN1207566 C CN 1207566C
Authority
CN
China
Prior art keywords
sds
seed
crop
crop seed
purity
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN 03101887
Other languages
English (en)
Other versions
CN1430058A (zh
Inventor
陈宏�
程罗根
王振英
彭永康
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianjin University
Tianjin Normal University
Original Assignee
Tianjin Normal University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjin Normal University filed Critical Tianjin Normal University
Priority to CN 03101887 priority Critical patent/CN1207566C/zh
Publication of CN1430058A publication Critical patent/CN1430058A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1207566C publication Critical patent/CN1207566C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Landscapes

  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

一种检测作物种子纯度的方法，涉及SDS-PAGE微量蛋白电泳结合超敏感银染检测作物种子纯度的方法。本发明解决了传统的田间种植检测费工费时、检测结果易受环境影响；RAPD技术方法实验技术复杂、实验条件要求高、费用昂贵；同工酶和贮藏蛋白质谱带少，方法复杂、技术难度大、成本高的问题。该方法利用作物种子所含蛋白质种类的不同，采用微量蛋白电泳和超敏感银染技术鉴定种子纯度。该方法包括作物种子处理、SDS-PAGE微量蛋白电泳、超敏感银染、结果分析步骤。本发明的检测方法与现有方法相比，具有简单易行、灵敏度高、蛋白质谱带多、高效、快速、费用低、便于推广应用的优点。

Description

一种检测作物种子纯度的方法
技术领域
本发明属于检测作物种子纯度的方法，特别涉及SDS-PAGE微量蛋白电泳，结合超敏感银染检测作物种子纯度的方法。
技术背景
种子的真伪和纯度检测是种子生产上的一项重要工作，直接关系到农业的发展和农民的切身利益，因此受到国家的高度重视。种子公司检测种子的真伪和纯度传统方法是田间种植即生长测验，就是把有代表性的种子播种，通过成株的表型来判断真伪及纯度。但这种检测方法费工费时，且检测结果易受环境影响。
目前蛋白质指纹图谱技术具有分辨率高、多态性强，并且具重演性、高度的个体特异性和环境稳定性，因此能鉴别生物个体之间的微小差异，故能用于种子的真伪和纯度鉴定。蛋白质指纹图谱中的同工酶和贮藏蛋白如谷蛋白、醇溶蛋白，作为生化指标检测作物种子真伪与纯度在我国有很多的报导，但同工酶由于其蛋白质谱带少，多态性少，已不能满足农业上作物种子纯度检测的需要，而贮藏蛋白如醇溶蛋白用于种子纯度鉴定，1986年国际种子检验协会已制定出标准程序，规定应用pH3.2的PAGE，并建立了小麦、大麦等禾谷类作物种子醇溶蛋白指纹图谱数据库。美国、加拿大、法国已把这一技术运用于种子真伪和纯度检测。但在我国利用该方法检测作物种子纯度还存在困难，原因是该方法复杂、技术难度大、成本昂贵。
RAPD技术方法，这是一种分子生物学的方法，即利用随机引物扩增多态性来检测种子纯度及真假。这种方法用于某种作物真假种子的鉴定方面有积极的意义，但用于种子纯度的检测同样存在实验技术复杂、实验条件要求高、费用昂贵等特点，所以在生产上推广受到一定的限制。
发明内容：
本发明解决了上述实验技术中的问题，提供了一种方法简单易行、灵敏度高、蛋白质谱带多、高效、快速、费用低便于推广应用的检测种子纯度方法。
本发明的技术方案是：利用作物种子所含蛋白质种类的不同，根据每一种作物都有各自特定的蛋白质指纹图谱的原理，通过分析单株幼苗间蛋白质指纹图谱可能存在的差异可鉴别作物种子的真伪与纯度。具体方法是采用微量蛋白电泳和超敏感银染技术鉴定种子纯度，该方法包括作物种子处理、SDS-PAGE微量蛋白电泳、超敏感银染、结果分析步骤。
作物种子处理是将禾本科作物或蔬菜豆类种子，用10％安替福民消毒10min，蒸馏水彻底冲洗后，在27℃下浸种24h，转入培养皿中，在(24±1)℃下避光培养2-3d，取黄化幼苗子叶、根、胚轴为实验材料。
蛋白质样品制备与SDS-PAGE微量蛋白电泳是通过分析单株幼苗间蛋白质指纹图谱可能存在的差异可鉴别作物种子的真伪与纯度，具体是取作物种子幼苗鲜嫩组织即实验材料0.1g，剪碎，加1ml0.1M/L pH7.0磷酸缓冲液，匀浆后置冷冻离心机内5000r/min离心5min，取上清0.2ml，加等体积蛋白变性液，沸水浴中变性3min后冷却，取10μl，进行微量蛋白SDS-PAGE分析。浓度分离胶浓度为12.5％，浓缩胶浓度为2.5％，首先灌分离胶，待分离胶凝固后，插入塑料梳，然后再灌浓缩胶在120mA条件下电泳7h，凝胶配方如下：
分离胶配方：蒸馏水              8.3ml
            30％丙烯酰胺        10.0ml
            1.5mol/lTris        0.3ml
            10％SDS             0.25ml
            10％AP              0.25ml
            TEMED               0.01ml
浓缩胶配方：蒸馏水              2.54ml
            30％丙烯酰胺        1.0ml
            A液                 1.25ml
            10％SDS             0.10ml
            TEMED               0.005ml
            10％AP              0.10ml
超敏感银染与结果分析是将凝胶置20％三氯乙酸中浸泡过夜，以除去SDS，ddH2O冲洗3次，每次20min，去三氯乙酸，然后置1％戊二醛中摇动4h以上，弃去戊二醛，加ddH2O冲洗3次，每次10min，弃去ddH2O，备染、显色；
染液配方：NaOH        0.1mmol\L      20ml
          浓氨水                     1.4ml
          硝酸银      15％           4ml
把4ml硝酸银溶液慢慢滴入混合液中，边滴加边摇动，全部滴完后用无离子水定溶至200ml
在洗净的蛋白质凝胶中加染液100ml，摇动染色10-30min。弃去氨银染液，加ddH2O100ml冲洗3-5min，加显色液100ml，不断摇动10-30min至显色条带清晰为止，弃去显色液，加ddH2O100ml冲洗3-5min；
显色液配方：甲醛：40％     50ul
            柠檬酸：1％    0.5ml
            无离子水定溶至100ml
本发明的有益效果是：克服了现有技术中的不足，本研究中建立的蛋白质指纹图谱技术，采取微量蛋白质电泳和超敏感银染方法，此法可以检出ng级的极微量蛋白，提高了检测方法上敏感性，因此能鉴别生物个体之间的微小差异，具有分辨率高、多态性强，并且具重演性、高度的个体特异性和和环境稳定性，与以往用醇溶蛋白指纹图谱、同工酶指纹图谱检测作物种子纯度相比较，是一种具有简单易行、灵敏度高、蛋白质谱带多、高效、快速、费用低的作物种子纯度的测定方法。在生产上的推广应用是很有价值的。
附图说明
图1：为本发明方法用于检测黄瓜胚轴的SDS-PAGE微量蛋白银染指纹图谱；
图2：为本发明方法用于检测菜豆胚轴的SDS-PAGE微量蛋白银染指纹图谱；
图3：为本发明方法用于检测菜豆胚根的SDS-PAGE微量蛋白银染指纹图谱；
图4：为本发明方法用于检测小麦叶片的SDS-PAGE微量蛋白银染指纹图谱；
具体实施方式
实施例1：
将黄瓜种子，用10％安替福民消毒10min，蒸馏水彻底冲洗后，在27℃下浸种24h，转入培养皿中，在(24±1)℃下避光培养2-3d，取黄化幼苗胚轴为实验材料。蛋白质样品制备与SDS-PAGE微量蛋白电泳是通过分析单株幼苗间蛋白质指纹图谱可能存在的差异可鉴别作物种子的真伪与纯度，具体是取作物种子幼苗鲜嫩组织即实验材料0.1g，剪碎，加1ml0.1M/L pH7.0磷酸缓冲液，匀浆后置冷冻离心机内5000r/min离心5min，取上清0.2ml，加等体积蛋白变性液，沸水浴中变性3min后，冷却，取10ul，进行微量蛋白SDS-PAGE分析。分离胶浓度为12.5％，浓缩胶浓度为2.5％，首先灌分离胶，待分离胶凝固后，插入塑料梳，然后再灌浓缩胶，在120mA条件下电泳7h，凝胶配方如下：
分离胶配方：蒸馏水                8.3ml
            30％丙烯酰胺          10.0ml
            1.5mol/lTris          0.3ml
            10％SDS               0.25ml
            10％AP                0.25ml
            TEMED                 0.01ml
浓缩胶配方：蒸馏水                2.54ml
            30％丙烯酰胺          1.0ml
            A液                   1.25ml
            10％SDS               0.10ml
            TEMED                 0.005ml
            10％AP                0.10ml
超敏感银染与结果分析是将凝胶置20％三氯乙酸中浸泡过夜，以除去SDS，ddH2O冲洗3次，每次20min，去三氯乙酸，然后置1％戊二醛中摇动4h以上，弃去戊二醛，加ddH2O冲洗3次，每次10min，弃去ddH2O，备染、显色；
染液配方：NaOH       0.1mmol\L    20ml
          浓氨水                  1.4ml
         硝酸银        15％        4ml
把4ml硝酸银溶液慢慢滴入混合液中，边滴加边摇动，全部滴完后用无离子水定溶至200ml
在洗净的蛋白质凝胶电泳中加染液100ml，摇动染色10-30min。弃去氨银染液，加ddH2O100ml，冲洗3-5min，加显色液100ml，不断摇动10-30min至显色条带清晰为止，弃去显色液，加ddH2O100ml冲洗3-5min；
显色液配方：甲醛：40％     50ul
            柠檬酸：1％    0.5ml
            无离子水定溶至100ml
图1展示了11粒黄瓜种子的全蛋白SDS-PAGE银染图谱，所检测到的谱型及谱带数完全一致，各谱带的着色性也基本相同，证明我们所用的黄瓜种子比较纯。
实施例2：
将菜豆种子进行处理，其方法同实施例1，选取菜豆胚轴为实验材料。其它同实施例1。图2展示菜豆胚轴的微量蛋白SDS-PAGE银染指纹图谱。菜豆幼苗内蛋白质比较丰富，胚轴至少有50多条谱带被检测到，个体间在谱带数、谱型、谱带着色性上完全一致，说明种子纯度高。
实施例3：将菜豆种子进行处理，其方法同实施例1，选取菜豆胚根为实验材料。其它同实施例1。图3展示了菜豆胚根的微量蛋白SDS-PAGE银染指纹图谱。菜豆幼苗内蛋白质比较丰富，胚根中含有60多条谱带，个体间在谱带数、谱型、谱带着色性上完全一致，说明种子纯度高。
实施例4：将小麦种子进行处理，其方法同实施例1。选取小麦叶片为实验材料，其它同实施例1。图4是小麦叶片的微量蛋白SDS-PAGE银染指纹图谱。图4中左面两个泳道是硬粒小麦、右面三个泳道是普通小麦叶片的微量蛋白SDS-PAGE银染指纹图谱。结果检测到的蛋白质谱带，硬粒小麦和普通小麦均有40条，比较清晰的有17条，如：115kD、75kD、32kD、16kD，其中两种小麦的蛋白质图谱在47kD、35kD出现不同。从总体看两种小麦蛋白质指纹图谱都比较稳定，个体间在谱带数、谱型、谱带着色性上完全一致，说明种子纯度高。

Claims (2)

1、一种检测作物种子纯度的方法，其特征在于采用微量蛋白电泳和超敏感银染技术鉴定种子纯度，该方法包括作物种子处理、SDS-PAGE微量蛋白电泳、超敏感银染，结果分析步骤；
作物种子处理是将禾本科作物或蔬菜豆类种子，用10％安替福民消毒10min，蒸馏水彻底冲洗后，在27℃下浸种24h，转入培养皿中，在24±1℃下避光培养2-3d，取黄化幼苗子叶、根、胚轴为实验材料。
2、按照权利要求1所述的检测作物种子纯度的方法，其特征在于蛋白质样品制备与SDS-PAGE微量蛋白电泳是通过分析单株幼苗间蛋白质指纹图谱可能存在的差异鉴别作物种子的真伪与纯度，具体是取作物幼苗鲜嫩组织0.1g，剪碎，加1ml0.1M/L pH7.0磷酸缓冲液，匀浆后置冷冻离心机内5000r/min离心5min，取上清0.2ml，加等体积蛋白变性液，沸水浴中变性3min后，冷却，取10μl，进行微量蛋白SDS-PAGE分析，分离胶浓度12.5％，浓缩胶浓度2.5％，首先灌分离胶，待分离胶凝固后，插入塑料梳，然后再灌浓缩胶，在120mA条件下电泳7h，凝胶配方如下：
分离胶配方：蒸馏水                        8.3ml
            30％丙烯酰胺                  10.0ml
            1.5mol/lTris                  0.3ml
            10％SDS                       0.25ml
            10％AP                        0.25ml
            TEMED                         0.01ml
浓缩胶配方：
            蒸馏水                        2.54ml
            30％丙烯酰胺                  1.0ml
            A液                           1.25ml
            10％SDS                       0.10ml
            TEMED                         0.005ml
            10％AP                        0.10ml
超敏感银染与结果分析是将凝胶置20％三氯乙酸中浸泡过夜，以除去SDS，ddH2O冲洗3次，每次20min，去三氯乙酸，然后置1％戊二醛中摇动4h以上，弃去戊二醛，加ddH2O冲洗3次，每次10min，弃去ddH2O，备染、显色；
染液配方：NaOH          0.1mmol\L       20ml
       浓氨水                           1.4ml
       硝酸银        15％               4ml
把4ml硝酸银溶液慢慢滴入混合液中，边滴加边摇动，全部滴完后用无离子水定溶至200ml；
在洗净的蛋白质电泳凝胶中加染液100ml，摇动染色10-30min，弃去氨银染液，加ddH2O100ml，冲洗3-5min，加显色液100ml，不断摇动10-30min至显色条带清晰为止，弃去显色液，加ddH2O100ml冲洗3-5min；
显色液配方：甲醛：40％               50ul
            柠檬酸：1％              0.5ml
            无离子水定溶至100ml。
CN 03101887 2003-01-29 2003-01-29 一种检测作物种子纯度的方法 Expired - Fee Related CN1207566C (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 03101887 CN1207566C (zh) 2003-01-29 2003-01-29 一种检测作物种子纯度的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 03101887 CN1207566C (zh) 2003-01-29 2003-01-29 一种检测作物种子纯度的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1430058A CN1430058A (zh) 2003-07-16
CN1207566C true CN1207566C (zh) 2005-06-22

Family

ID=4789959

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN 03101887 Expired - Fee Related CN1207566C (zh) 2003-01-29 2003-01-29 一种检测作物种子纯度的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN1207566C (zh)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100337113C (zh) * 2004-04-30 2007-09-12 首都师范大学 小麦高分子量谷蛋白亚基的酸性毛细管电泳鉴定方法
CN1307418C (zh) * 2005-04-22 2007-03-28 江汉大学 基于盐溶蛋白图谱技术的豇豆品种分析鉴定方法
CN101201334B (zh) * 2006-12-15 2011-11-16 首都师范大学 通过小麦水溶性蛋白鉴定小麦品种的高效毛细管电泳方法
CN103105427B (zh) * 2013-01-18 2015-04-22 中南大学 一种蛋白酶谱的活性电泳检测方法
CN103048373B (zh) * 2013-01-18 2015-11-18 成都中医药大学 一种正品半夏的检测方法
CN103439391B (zh) * 2013-07-12 2015-05-13 聊城大学 快速鉴定工艺葫芦种子真实性和/或品种纯度的方法
CN105021686A (zh) * 2015-07-07 2015-11-04 青岛农业大学 一种同时检测高分子量和低分子量谷蛋白亚基的电泳方法
CN106872551B (zh) * 2015-12-11 2020-06-02 天士力生物医药股份有限公司 一种注射用重组人尿激酶原的电泳纯度测定方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN1430058A (zh) 2003-07-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Jayawardena et al. One stop shop IV: taxonomic update with molecular phylogeny for important phytopathogenic genera: 76–100 (2020)
CN102220315B (zh) 基于西瓜全基因组序列信息开发分析的ssr核心引物组及其应用
Les et al. Phylogeny and systematics of Lemnaceae, the duckweed family
CN1207566C (zh) 一种检测作物种子纯度的方法
CN101430273B (zh) 甘蓝型油菜杂交种种子纯度快速鉴定方法
CN1908007A (zh) 一种植物总蛋白的提取方法及其专用提取液
CN102766627B (zh) 一种与油菜含油量性状紧密连锁的分子标记及应用
Gump et al. Comparison of analytical methods for prediction of prefermentation nutritional status of grape juice
CN106755328A (zh) 一种蚕豆ssr指纹图谱的构建方法
CN107228924A (zh) 一种适宜蛋白加工用花生原料品质测定及其评价方法
CN101921866A (zh) 一种利用ssr核心引物鉴定棉花品种的方法
Degani et al. Identifying lychee cultivars by isozyme analysis
CN103278453A (zh) 利用双向电泳和maldi-tof-ms技术获得小麦根相关抗旱蛋白的方法
MATSUYAMA et al. Grouping Rhizoctonia solani Kühn with non-specific esterase zymogram
CN1944649A (zh) 一种菜用大豆dna指纹图谱及其构建方法和应用
Söylemezoğlu et al. Ampelographic characteristics and isozymic analysis of Vitis vinifera spp. sylvestris Gmel. in southwestern Turkey
Freudenstein Systematics of Corallorhiza and the Corallorhizinae (Orchidaceae)
CN1800812A (zh) 一种鉴定小麦低分子量谷蛋白亚基的质谱方法
McAlpin An Aspergillus flavus mutant producing stipitate sclerotia and synnemata
Wild et al. Chlorophyll-protein complexes of Chlorella fusca
CN1113593C (zh) 一种快速准确鉴定杂交水稻不育系和杂交种子纯度的方法
Rajkumar et al. Assessment of genetic diversity among Sri Lankan rice varieties by AFLP markers
CN1721433A (zh) 一种新的稻瘟病菌糖蛋白激发子及其纯化方法
CN112730571B (zh) 一种蜂毒真伪快速鉴别及其掺伪量测定的方法
CN115820900B (zh) 一种川芍2号ssr分子标记及其引物和应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C19 Lapse of patent right due to non-payment of the annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee