CN112730571B - 一种蜂毒真伪快速鉴别及其掺伪量测定的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蜂毒真伪快速鉴别及其掺伪量测定的方法，包括以下步骤：蜂毒真伪的快速鉴别和蜂毒掺伪量的测定，其中，所述蜂毒真伪的快速鉴别包括样品预处理；电泳；水浴、染色、脱色；根据样品的条带数、位置以及其深浅判断蜂毒真伪；所述蜂毒掺伪量的测定包括建立掺伪量模型和测定掺伪量。本发明能够简单、准确、直接地鉴别蜂毒真伪，只需微量的用量即可检测，并且灵敏度高，稳定性好；通过利用回归分析方法，建立掺伪蜂毒的最佳检测函数，弥补了本发明的真伪判定方法中无法判断是否以糖掺伪，以多肽掺伪的短板，且具有很好线性关系，能准确反映出其掺伪量。本发明提供的模型可以反复利用，利于下一次的快速检测。
Description
技术领域
本发明涉及蜂毒鉴别及测定方法，尤其涉及一种蜂毒真伪快速鉴别及其掺伪量测定的方法。
背景技术
在众多蜂产品中，蜂毒是最具开发价值的产品之一。从古至今，有许多蜂毒治疗疾病的典例，蜂毒早己成为传统中医治疗的部分内容。蜜蜂蜂毒成分及其生物活性的研究已有大量的报道，其具有抗癌及抗癌等药理作用而被广泛应用，而胡蜂蜂毒也作为一种传统的药物，具有抗辐射、抗炎、抑制肿瘤的形成等药理学作用。
近年来，随着人类对征服疑难杂症的需求增大，使得人们对胡蜂蜂毒功能研究越来越多，但是蜂毒的真伪及其质量判断，在业内仍是研究较少。目前已知全世界胡蜂共有5000多种，黑盾胡蜂在国内被大规模养殖用于生物防治，且黑盾胡蜂蜂毒被研究表明了具有抗菌、抗凝血等活性，黑盾胡蜂蜂毒资源丰富，且具有巨大的市场应用前景。
现有技术的缺陷和不足：1、业内关于黑盾胡蜂蜂毒质量研究及其质量标准仍是一片空白。2、市场上判断胡蜂蜂毒干粉品质的方法，一般用肉眼看(有无尘土、是否受潮发黑)，闻气味(芳香味刺激性气味)，缺乏科学的判断方法，必定造成了蜂毒利用率低，资源浪费等现象。因此，研发一种蜂毒真伪快速鉴别及其掺伪量测定的方法，成为本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
本发明是为了解决上述不足，应用了SDS-PAGE凝胶电泳结合紫外分光光度技术，提供了一种蜂毒真伪快速鉴别及其掺伪量测定的方法。
本发明的上述目的通过以下的技术方案来实现：一种蜂毒真伪快速鉴别及其掺伪量测定的方法，包括以下步骤：
S1.蜂毒真伪的快速鉴别：
S11.样品预处理：将收集到的各批供试品蜂毒及伪品蜂毒样品，用超纯水配制为浓度4mg/ml的溶液，并与SDS-PAGE蛋白上样缓冲液以4:1体积比混合，于沸水中水浴5min，备用；
S12.电泳：取S11所得样品5ul，点样于浓缩胶浓度5％-分离胶浓度15％的SDS-PAGE凝胶上电泳，浓缩胶恒压80V电泳25min，分离胶恒压150V电泳50min；
S13.水浴、染色、脱色：取出凝胶，置凝胶于100ml超纯水中沸水水浴5min，重复三次，晾干凝胶表面水分，加入25ml考马斯亮蓝染液，染色30min，弃去染液，加入100mL超纯水摇床上脱色，每5-15min更换超纯水，脱色30-120min至凝胶背景色较浅或无背景色后，置凝胶在凝胶成像仪下拍照；
S14.根据样品的条带数、位置以及其深浅判断蜂毒真伪，Marker为标准分子量蛋白，显示正品蜂毒只有六条条带且无拖尾，在45-25kD之间有4条清晰条带编号1-4，且条带3颜色最深，在18.4-14.4kD间有两条模糊条带，编号5、6，其他伪品在该位置区域均无该特征；对于条带数、位置及其深浅不相符的样品定义为伪品，对于条带数、位置及其深浅相符的样品进行蜂毒掺伪量测定；
S2.蜂毒掺伪量的测定：
S21.建立掺伪量模型：将蜂毒与S1中不干扰蜂毒真伪判断的掺伪样品(如大豆肽、小麦肽、花生肽、鱼胶原蛋白、骨胶原蛋白、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖)分别以超纯水配制成1mg/ml溶液，并蜂毒溶液与伪品溶液以7:3、5:5、3:7、1:9体积比混合，得到蜂毒掺伪量30％、50％、70％、90％的混合蜂毒溶液，进行紫外全波长扫描，确定其特征吸收波长276nm，及其在218nm处有稳定强吸收，以276nm和A218nm吸光度的比值Y(A276nm/A218nm)与蜂毒掺伪量X建立函数关系，并以回归分析方法确定最佳检测函数，如图7所示，掺杂大豆肽、小麦肽、花生肽、鱼胶原蛋白、骨胶原蛋白、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖的蜂毒溶液的掺杂量X与Y(A276nm/A218nm)有较好的线性回归关系，回归方程为Y＝-0.6868X+0.7847，方程的决定系数R2为0.9947；
S22.测定掺伪量：将待检测掺伪样品溶于超纯水中并配置成1mg/ml样品，根据测定的A276nm/A218nm的比值，来和掺伪量模型进行对比，确定待检测掺伪样品中掺伪量。
本发明与现有技术相比的优点是：
1、本发明能够简单、准确、直接地鉴别蜂毒真伪，只需微量的用量即可检测，并且灵敏度高，稳定性好，适用性广，防止用价格低廉的蛋白冒充高价格的蜂毒，能够实际应用于蜂毒掺伪检测工作。
2、通过利用回归分析方法，建立掺伪蜂毒的最佳检测函数，弥补了本发明的真伪判定方法中无法判断是否以糖掺伪，以多肽掺伪的短板，且具有很好线性关系，能准确反映出其掺伪量。
3、本发明提供的模型可以反复利用，利于下一次的快速检测。
附图说明
图1是27批黑盾胡蜂蜂毒及21批伪品凝胶电泳图。
图2是27批黑盾胡蜂蜂毒及21批伪品凝胶电泳图。
图3是27批黑盾胡蜂蜂毒及21批伪品凝胶电泳图。
图4是27批黑盾胡蜂蜂毒及21批伪品凝胶电泳图。
图5是9批蜂毒真伪判断凝胶电泳图。
图6是3批蜂毒真伪判断凝胶电泳图。
图7是以276nm和A218nm吸光度的比值Y(A276nm/A218nm)与蜂毒掺伪量X建立的函数关系图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明进一步详述。
本发明的一种蜂毒真伪快速鉴别及其掺伪量测定的方法，包括以下步骤：
S1.蜂毒真伪的快速鉴别：
S11.样品预处理：将收集到的各批供试品蜂毒及伪品蜂毒样品(如下表1所示)，用超纯水配制为浓度4mg/ml的溶液，并与SDS-PAGE蛋白上样缓冲液以4:1体积比混合，于沸水中水浴5min，备用；
S12.电泳：取S11所得样品5ul，点样于浓缩胶浓度5％-分离胶浓度15％的SDS-PAGE凝胶上电泳，浓缩胶恒压80V电泳25min，分离胶恒压150V电泳50min；
S13.水浴、染色、脱色：取出凝胶，置凝胶于100ml超纯水中沸水水浴5min,重复三次，晾干凝胶表面水分，加入25ml考马斯亮蓝染液，染色30min，弃去染液，加入100mL超纯水摇床上脱色，每5-15min更换超纯水，脱色30-120min至凝胶背景色较浅或无背景色后，置凝胶在凝胶成像仪下拍照；
S14.根据样品的条带数、位置以及其深浅判断蜂毒真伪：如附图1-4所示，Marker为标准分子量蛋白，显示正品蜂毒只有六条条带且无拖尾，在45-25kD之间有4条清晰条带编号1-4，且条带3颜色最深，在18.4-14.4kD间有两条模糊条带，编号5、6.，其他伪品在该位置区域均无该特征。对于条带数、位置及其深浅不相符的样品定义为伪品，对于条带数、位置及其深浅相符的样品进行蜂毒掺伪量测定。
表1：各批供试品蜂毒及伪品蜂毒样品。
S2.蜂毒掺伪量的测定：
S21.建立掺伪量模型：将蜂毒与S1中不干扰蜂毒真伪判断的掺伪样品(如大豆肽、小麦肽、花生肽、鱼胶原蛋白、骨胶原蛋白、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖)分别以超纯水配制成1mg/ml溶液，并蜂毒溶液与伪品溶液以7:3、5:5、3:7、1:9体积比混合，得到蜂毒掺伪量30％、50％、70％、90％的混合蜂毒溶液，进行紫外全波长扫描，确定其特征吸收波长276nm，及其在218nm处有稳定强吸收，以276nm和A218nm吸光度的比值Y(A276nm/A218nm)与蜂毒掺伪量X建立函数关系，并以回归分析方法确定最佳检测函数，如图7所示，掺杂大豆肽、小麦肽、花生肽、鱼胶原蛋白、骨胶原蛋白、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖的蜂毒溶液的掺杂量X与Y(A276nm/A218nm)有较好的线性回归关系，回归方程为Y＝-0.6868X+0.7847，方程的决定系数R2为0.9947，如附图7所示。
S22.测定掺伪量：将待检测掺伪样品溶于超纯水中并配置成1mg/ml样品，根据测定的A276nm/A218nm的比值，来和掺伪量模型进行对比，确定待检测掺伪样品中掺伪量。
实施例1：
1)随机选取掺杂不同比例大豆肽、小麦肽、花生肽、鱼胶原蛋白、骨胶原蛋白、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖的样品(如下表2所示)，利用SDS凝胶电泳，根据电泳条带数判断其真伪，其电泳结果如附图5所示。
表2：九批不同比例的掺伪样品
| 编号 | 样品名称 | 编号 | 样品名称 |
| 1 | 90％大豆肽+10％蜂毒 | 6 | 50％葡萄糖+50％蜂毒 |
| 2 | 85％小麦肽+15％蜂毒 | 7 | 35％蔗糖+65％蜂毒 |
| 3 | 80％花生肽+20％蜂毒 | 8 | 25％乳糖+75％蜂毒 |
| 4 | 75％鱼胶原蛋白+25％蜂蜂毒 | 9 | 15％麦芽糖+85％蜂毒 |
| 5 | 65％骨胶原蛋白+35％蜂毒 |
由附图5可以看出，九批样品均在25-45kD间有四条条带且条带3颜色最深，判断其没有掺伪杂蛋白，进行下一步掺伪量测定。
测定九批样品在276nm和218nm的吸光度比值(A276nm/A218nm)，利用模型y＝-0.6868x+0.7847预测其掺伪量，并与实际掺伪量比较分析，结果见下表3.
表3：九批掺伪蜂毒掺伪量的测定及相对偏差比较。
由表3可以看出，9批样品均有掺伪，预测掺伪量与实际掺伪量的相对偏差在10％以内，没有显著性差异，说明，利用紫外分光光度技术对蜂毒掺伪量检测是理想的和效果稳定的。
实施例2：
本实施例为对实施例1的方法进行再验证，收集除上述掺伪品外的其它掺伪品，包括I型胶原蛋白、乳清蛋白、D-半乳糖。随机掺伪不同比例的I型胶原蛋白、乳清蛋白、D-半乳糖，如下表4所示，利用SDS凝胶电泳，根据电泳条带数判断其真伪，其电泳结果如附图6。
表4：三批不同比例掺伪样品。
由附图6可以看出，样品2有较多杂蛋白，直接判断其为伪品，样品1，3，在25-45kD处有四条条带，且条带3颜色最深，进行下一步掺伪量检测。
测定3批样品在276nm和218nm的吸光度比值(A276nm/A218nm)，利用模型y＝-0.6868x+0.7847预测其掺伪量，并与实际掺伪量比较分析，结果见表5.
表5：3批掺伪蜂毒掺伪量的测定及相对偏差比较
| 编号 | 预测值 | 实际值 | 相对偏差 |
| 1 | 88％ | 90％ | 2.0％ |
| 2 | 54％ | 50％ | 7.4％ |
由表5可以看出，样品1和样品3均有掺伪，预测掺伪量与实际掺伪量的相对偏差在10％以内，没有显著性差异，说明，利用紫外分光光度技术对蜂毒掺伪量检测是理想的和效果稳定的，且适用性广，可鉴别大部分黑盾胡蜂蜂毒伪品。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (1)
1.一种蜂毒真伪快速鉴别及其掺伪量测定的方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1.蜂毒真伪的快速鉴别：
S11.样品预处理：将收集到的各批供试品蜂毒及伪品蜂毒样品，用超纯水配制为浓度4mg/ml的溶液，并与SDS-PAGE蛋白上样缓冲液以4:1体积比混合，于沸水中水浴5min，备用；
S12.电泳：取S11所得样品5ul，点样于浓缩胶浓度5％-分离胶浓度15％的SDS-PAGE凝胶上电泳，浓缩胶恒压80V电泳25min，分离胶恒压150V电泳50min；
S13.水浴、染色、脱色：取出凝胶，置凝胶于100ml超纯水中沸水水浴5min，重复三次，晾干凝胶表面水分，加入25ml考马斯亮蓝染液，染色30min，弃去染液，加入100mL超纯水摇床上脱色，每5-15min更换超纯水，脱色30-120min至凝胶背景色较浅或无背景色后，置凝胶在凝胶成像仪下拍照；
S14.根据样品的条带数、位置以及其深浅判断蜂毒真伪：Marker为标准分子量蛋白，显示正品蜂毒只有六条条带且无拖尾，在45-25kD之间有4条清晰条带编号1-4，且条带3颜色最深，在18.4-14.4kD间有两条模糊条带，编号5、6，其他伪品在该位置区域均无该特征；对于条带数、位置及其深浅不相符的样品定义为伪品，对于条带数、位置及其深浅相符的样品进行蜂毒掺伪量测定；
S2.蜂毒掺伪量的测定：
S21.建立掺伪量模型：将蜂毒与S1中不干扰蜂毒真伪判断的掺伪样品分别以超纯水配制成1mg/ml溶液，所述不干扰蜂毒真伪判断的掺伪样品为如大豆肽、小麦肽、花生肽、鱼胶原蛋白、骨胶原蛋白、葡萄糖、蔗糖、乳糖或麦芽糖，并蜂毒溶液与伪品溶液以7:3、5:5、3:7、1:9体积比混合，得到蜂毒掺伪量30％、50％、70％、90％的混合蜂毒溶液，进行紫外全波长扫描，确定其特征吸收波长276nm，及其在218nm处有稳定强吸收，以276nm和A218nm吸光度的比值Y(A276nm/A218nm)与蜂毒掺伪量X建立函数关系，并以回归分析方法确定最佳检测函数，掺杂大豆肽、小麦肽、花生肽、鱼胶原蛋白、骨胶原蛋白、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖的蜂毒溶液的掺杂量X与Y(A276nm/A218nm)有较好的线性回归关系，回归方程为Y＝-0.6868X+0.7847，方程的决定系数R2为0.9947；
S22.测定掺伪量：将待检测掺伪样品溶于超纯水中并配置成1mg/ml样品，根据测定的A276nm/A218nm的比值，来和掺伪量模型进行对比，确定待检测掺伪样品中掺伪量。
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| CN107894408A (zh) * | 2017-11-24 | 2018-04-10 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 一种基于近红外光谱仪的食用油多元掺伪鉴别方法 |
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2020
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