CN114957392A - 一种羊肚菌呈味肽风味基料的开发制备方法及应用 - Google Patents

一种羊肚菌呈味肽风味基料的开发制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种呈味肽风味基料的开发制备方法，主要步骤包括：S1：对羊肚菌蛋白超声预处理后利用风味蛋白酶和中性蛋白酶对羊肚菌蛋白质进行酶解；S2：利用超滤膜对酶解液进行超滤；S3：通过电子舌智能感官结合人工评价确定最佳呈味肽组分；S4：对呈味肽进行美拉德反应，通过电子鼻和电子舌技术比较反应前后的滋气味变化，进一步明确反应前后产物中游离氨基酸的呈味氨基酸含量；本发明以羊肚菌蛋白为原料，通过响应面法优化呈味肽的酶解制备工艺，采用超滤技术筛选出最佳的呈味肽组分并进行质谱鉴定，结合分子对接技术明确重要的鲜味肽信息，进一步明确呈味肽组分在美拉德反应中的风味增效作用。

Description

一种羊肚菌呈味肽风味基料的开发制备方法及应用
技术领域
本发明属于食品加工技术领域，具体涉及一种羊肚菌呈味肽风味基料的开发制备方法及应用。
背景技术
羊肚菌是一种食用菌品种，因其菌盖表面凹凸不平、状如羊肚而得名，是一种珍贵的食用菌和药用菌；羊肚菌不仅具有抗炎、抗肿瘤、降低胆固醇和免疫调节作用，而且羊肚菌中富含蛋白质、呈味肽、氨基酸等重要的味觉活性成分，在风味利用及产品加工方面具有巨大潜力。
目前对呈味肽制备主要分为化学水解法和生物酶水解法，化学水解法主要包括酸水解法和碱水解法，酸水解法不易控制时间和温度对水解度的影响，而碱水解法则容易产生L型和D型的氨基酸混合物、引起营养成分的损失，这2种制备方式在实际生产中应用较少；生物酶水解法是以蛋白质为底物，通过选择适当的蛋白酶对蛋白质进行酶解来获得大量呈味肽，具有条件温和、过程可控、肽得率高及安全的优势，成为制备呈味肽的常用方法。然而，天然蛋白质组成和结构复杂，用单一酶酶解蛋白质水解不够彻底，不能使游离氨基酸以及多肽充分水解，美拉德反应前体物质得不到较好的释放，所以目前生物酶水解法制备呈味肽存在水解度不高、呈味肽组分生成量较少等问题，成为了呈味肽成分高效制备的技术瓶颈。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种羊肚菌呈味肽风味基料的开发制备方法，以羊肚菌蛋白为原料，通过响应面法优化呈味肽的酶解制备工艺，采用超滤技术筛选出最佳的呈味肽组分并进行质谱鉴定，结合分子对接技术明确重要的鲜味肽信息，进一步探究呈味肽组分在美拉德反应中的风味增效作用；
为了达到上述技术目的，本发明是通过以下技术方案实现的：一种羊肚菌呈味肽风味基料的开发制备方法，包括以下步骤：
S1：羊肚菌呈味肽的酶解：先对羊肚菌蛋白进行超声预处理至蛋白溶液呈均匀透明可溶液体，再利用风味蛋白酶和中性蛋白酶对羊肚菌蛋白质进行分步酶解；其中酶解温度为45～55℃，料液比为1:55g/mL；酶添加量占原料的5％～6％；酶解至蛋白水解度达到25～31％，酶解液呈棕色、无沉淀、且菌香浓厚、并略带鲜和收敛感；
S2：酶解液超滤处理：将S1最优参数下得到的酶解液用＜300Da的透析袋在4℃的条件下处理72h，将酶解制备中的一些无机盐等小分子进行透析处理；透析后的酶解液使用＞10kDa、3kDa～10kDa、＜3kDa的三个规格的超滤膜进行超滤，其中4个超滤组分含量占比分别为11％、35％和54％，且＜3kDa超滤组分占比最高，说明上述酶解处理得到了高含量的小分子肽物质；
S3：鲜味肽确定：通过电子舌智能感官结合人工感官评价筛选出小于3kDa超滤组分为最佳的呈味肽组分，利用LC-MS/MS对该超滤组分进行肽序列鉴定，筛选到4种潜在的呈味肽(肽序列分别为EYPPLGRFA、TVIDAPGHRDFI、VIDNDPRS、GGIGTVPVGRVETG)；进一步结合分子对接技术确定EYPPLGRFA、TVIDAPGHRDFI为重要的鲜味肽，其在小于3kDa超滤组分中占比高，分别达到10％、13％，为该呈味肽组分提供了明显的鲜味、甜味和浓厚的收敛感；再利用活性肽在线活性预测数据库(http://bioware.ucd.ie～compass/biowareweb/Server_pages/
peptideranker.php)进行生物活性预测，其中肽EYPPLGRFA和TVIDAPGHRDFI具有潜在的抗氧化、降糖和降压活性，肽VIDNDPRS和GGIGTVPVGRVETG具有潜在的抗氧化、抑菌、降糖和降压活性，并通过人工合成4种肽验证其主要生物活性为肽EYPPLGRFA的DPPH自由基清除率75％和血管紧张素转化酶(ACE)抑制率IC50值2.12mg/mL，肽TVIDAPGHRDFI的DPPH自由基清除率71％和α-葡萄糖苷酶抑制率IC50值0.34mg/mL，肽VIDNDPRS的DPPH自由基清除率65％、对金黄色葡萄球菌抑制率83％和血管紧张素转化酶(ACE)抑制率IC50值3.31mg/mL，肽VIDNDPRS的血管紧张素转化酶(ACE)抑制率和α-葡萄糖苷酶抑制率IC50值分别为3.59mg/mL、0.52mg/mL；
S4：羊肚菌呈味肽组分进行美拉德反应：对筛选的＜3kDa呈味肽组分进行美拉德反应，通过电子鼻和电子舌技术比较反应前后的滋气味变化，其鲜味滋味响应值明显提升，进一步明确反应前后产物中总游离氨基酸含量由402.541μg/mL增加至3765.394μg/mL，且呈味氨基酸含量由292.123μg/mL增加至3375.673μg/mL，呈味氨基酸含量达90％。
优选的，所述S1中超声预处理的超声功率为300～500w，处理时间为10～15min；
优选的，所述S1中分步酶解中风味蛋白酶先水解2.5h，中性蛋白酶再水解3.5h；
优选的，所述S1中最佳酶解温度为50℃，酶添加量占原料的5.5％；采用分步酶解：将羊肚菌蛋白与水混匀，加入风味蛋白酶，水浴酶解后在90℃下灭活10min；再加入中性蛋白酶，水浴酶解后在90℃下灭活10min；冷却后在4000r/min离心15min，取上清液得酶解液，备用；
优选的，所述EYPPLGRFA占到＜3kDa呈味肽组分含量的10％，其中鲜味氨基酸占比77.74％、甜味氨基酸占比46.4％；TVIDAPGHRDFI占到＜3kDa呈味肽组分含量的13％，其中鲜味氨基酸占比52.9％，亲水性氨基酸占比63.4％。
本发明的有益效果是：
通过对羊肚菌蛋白进行超声预处理，结合分步酶解工艺，大大提高了酶解液的水解度(25～31％)，同时酶解液中＜3kDa呈味肽组分占到整个酶解夜含量的54％，显著提高了小分子肽物质含量，且＜3kDa呈味肽组分具有明显的鲜味、甜味和浓厚的收敛感，其中2种重要的鲜味肽成分EYPPLGRFA(占到＜3kDa呈味肽组分含量的10％)、TVIDAPGHRDFI(占到＜3kDa呈味肽组分含量的13％)为该呈味肽组分鲜味提供最为重要的贡献；且所含4种肽EYPPLGRFA、TVIDAPGHRDFI、VIDNDPRS和GGIGTVPVGRVETG兼具了抗氧化、抑菌、降糖和降压活性；另外，＜3kDa呈味肽组分经美拉德反应后的产物中总游离氨基酸含量高达3765.394μg/mL，且呈味氨基酸含量占到总游离氨基酸含量的90％，促使该美拉德反应反应产物的滋气味显著提升。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明的3个超滤组分感官评价雷达图；
图2是本发明的超滤组分电子舌主成分分析图；
图3是鉴定到的4种潜在呈味肽二级质谱图；
图4是本发明的超滤组分Ⅰ美拉德反应液电子鼻主成分分析图；
图5是本发明的＜3kDa组分美拉德反应前后挥发性物质雷达指纹图谱；
图6是本发明的超滤组分Ⅰ美拉德反应液电子舌主成分分析图；
图7是本发明的超滤组分Ⅰ美拉德反应液电子舌滋味分析图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种羊肚菌呈味肽风味基料的开发制备方法，包括以下步骤：
S1：羊肚菌呈味肽的酶解：先对羊肚菌蛋白进行超声预处理，超声功率400W，预处理15min；至蛋白溶液呈均匀透明可溶液体，再利用风味蛋白酶和中性蛋白酶对羊肚菌蛋白质进行分步酶解，风味蛋白酶先水解2.5h，中性蛋白酶再水解3.5h；其中酶解温度为50℃，料液比为1:55g/mL；酶添加量占原料的5.5％；酶解至蛋白水解度达到25～31％，酶解液呈棕色、无沉淀、且菌香浓厚、并略带鲜和收敛感；
S2：酶解液超滤处理：将S1最优参数下得到的酶解液用＜300Da的透析袋在4℃的条件下处理72h，将酶解制备中的一些无机盐等小分子进行透析处理；透析后的酶解液使用＞10kDa、3kDa～10kDa、＜3kDa的三个规格的超滤膜进行超滤，其中4个超滤组分含量占比分别为11％、35％和54％，且＜3kDa超滤组分占比最高，说明上述酶解处理得到了高含量的小分子肽物质；
S3：鲜味肽确定：通过电子舌智能感官结合人工感官评价筛选出小于3kDa超滤组分为最佳的呈味肽组分，利用LC-MS/MS对该超滤组分进行肽序列鉴定，筛选到4种潜在的呈味肽(肽序列分别为EYPPLGRFA、TVIDAPGHRDFI、EYPPLGR、TVIDAPGHRD)；进一步结合分子对接技术确定EYPPLGRFA、TVIDAPGHRDFI为重要的鲜味肽，其在小于3kDa超滤组分中占比高，分别达到10％、13％，为该呈味肽组分提供了明显的鲜味、甜味和浓厚的收敛感；再利用活性肽在线活性预测数据库(http://bioware.ucd.ie～compass/biowareweb/Server_pages/
peptideranker.php)进行生物活性预测，其中肽EYPPLGRFA和TVIDAPGHRDFI具有潜在的抗氧化、降糖和降压活性，肽VIDNDPRS和GGIGTVPVGRVETG具有潜在的抗氧化、抑菌、降糖和降压活性，并通过人工合成4种肽验证其主要生物活性为肽EYPPLGRFA的DPPH自由基清除率75％和血管紧张素转化酶(ACE)抑制率IC50值2.12mg/mL，肽TVIDAPGHRDFI的DPPH自由基清除率71％和α-葡萄糖苷酶抑制率IC50值0.34mg/mL，肽VIDNDPRS的DPPH自由基清除率65％、对金黄色葡萄球菌抑制率83％和血管紧张素转化酶(ACE)抑制率IC50值3.31mg/mL，肽VIDNDPRS的血管紧张素转化酶(ACE)抑制率和α-葡萄糖苷酶抑制率IC50值分别为3.59mg/mL、0.52mg/mL；
S4：羊肚菌呈味肽组分进行美拉德反应：对筛选的＜3kDa呈味肽组分进行美拉德反应，通过电子鼻和电子舌技术比较反应前后的滋气味变化，其鲜味滋味响应值明显提升，进一步明确反应前后产物中总游离氨基酸含量由402.541μg/mL增加至3765.394μg/mL，且呈味氨基酸含量由292.123μg/mL增加至3375.673μg/mL，可见呈味氨基酸含量高达90％，这是美拉德反应产物作为呈味基料的最重要依据。
优选的，所述S1中将羊肚菌蛋白与水混匀，加入风味蛋白酶，水浴酶解后在90℃下灭活10min；再加入中性蛋白酶，水浴酶解后在90℃下灭活10min；冷却后在4000r/min离心15min，取上清液得酶解液，备用；
优选的，所述EYPPLGRFA占到＜3kDa呈味肽组分含量的10％，其中鲜味氨基酸占比77.74％、甜味氨基酸占比46.4％；TVIDAPGHRDFI占到＜3kDa呈味肽组分含量的13％，其中鲜味氨基酸占比52.9％，亲水性氨基酸占比63.4％。
实施例2
超滤组分感官评价
感官评价小组由无疾病、不抽烟的四名男性四名女性组成，严格按照ISO标准进行筛选。实验前培训小组成员熟悉五种基本味觉；使用质量分数为0.35％的氯化钠、1％的蔗糖、0.08％的柠檬酸、0.08％的奎宁及0.35％的味精作为咸、甜、酸、苦、鲜味的标准对照液；将待测液配置为1％质量分数浓度，感官小组成员通过比较待测液与标准对照液的味觉感官，对待测液给出0～8分的评分，无味道记为0分，味道强烈记为8分。
超滤组分电子舌分析筛选最佳呈味肽组分
本实验使用SA402B型电子舌智能感官系统筛选(＜3kDa)、(3kDa＜10kDa)、(＞10kDa)最佳呈鲜味组分，设备加载多种传感器电极，分别检测鲜、咸、苦、涩、酸5种味道及其回味，每个样品检测3次，运用系统自带数据库对测试数据进行味觉特征分析。参比溶液为KCL和酒石酸混合溶液，用来模拟人工唾液；负极清洗液为水、乙醇和盐酸混合溶液；正极清洗液为水、KCL、乙醇和KOH混合溶液，样品浓度为1.5mg/mL进行分析。
＜3kDa组分呈味肽序列鉴定
本实验利用Easy-nLC 1200超高效液相串联Q Exactive高分辨质谱仪组成的液质联用系统鉴定肽序列。色谱条件：Trap column，100μm×20mm(RP-C18,thermo Inc)色谱柱，柱温：30℃；流速：300nL/min；进样量：2μL：流动相A：0.1％甲酸-水溶液，流动相B：0.1％甲酸-乙腈溶液。洗脱梯度：0～50min(5％A)，50～52(38％A)，52～60(95％A)。质谱条件：母离子扫描范围：300～1500m/z，质谱扫描方式为信息依赖的采集工作模式下，每次全扫后采集最强的20个碎片图谱(MS2 scan)；碎裂方式：高能碰撞解离(HCD，high energycollisiondissociation)，NCE能量28,动态排除时间：25s；MS1在M/Z 200时分辨率为70000，AGCtarget设置为3e6，最大注射时间100ms，MS2分辨率设置为17500，AGC target设置为1e5，最大注射时间50ms。
＜3kDa组分美拉德反应
美拉德反应是指羰基化合物(醛、酮以及还原糖类)和氨基化合物(氨基酸、多肽和蛋白质等含氮化合物)之间的反应。能产生多种芳香化合物。按照样品0.5g、木糖0.2g、半胱氨酸0.15g、和10mL蒸馏水组成，在120℃条件下油浴搅拌2h(800rpm)后续对美拉德反应液进行电子鼻、游离氨基酸、电子舌分析。
＜3kDa呈味肽组分美拉德反应前后电子鼻分析
准确称取样品1.5g置于25mL顶空瓶中，加盖密封，26℃下静置平衡30min后检测。电子鼻测定参数：清洗时间120s；归零时间5s；预进样时间8s；测定时间60s，载气流速400mL/min。每个样品测定3次，分别以超滤所得液和酶解原液对照组，美拉德反应液为试验组，每个样品测3个平行，每个电子鼻传感器所对应的特征气味物质如表1；
表1电子鼻传感器性能描述
Figure BDA0003684653100000071
Figure BDA0003684653100000081
＜3kDa呈味肽组分美拉德反应前后电子舌分析
将浓度为1.5mg/mL的超滤组分液与美拉德反应液准确移取50mL测试液加入电子舌专用的样品杯中。测量前对电子舌进行自检、活化、校准和诊断等步骤，以确保采集所得数据的可靠性和稳定性；再用30mmol/L的KCl溶液与0.3mmol/L的酒石酸溶液配成Ref Sol参比溶液将传感器置于参比溶液中归零30s，随后开始进行鲜味测定；测试时间为30s，测试完毕后用参比溶液清洗3s，再次进行回味测定，测试时间30s。每个样品重复4次，取后3次做为测试结果。
＜3kDa呈味肽组分美拉德反应前后游离氨基酸测定
本实验使用日立L8900全自动氨基酸分析仪检测。色谱柱：Na+型阳离子交换柱(4.6mm ID×60mm，3μm颗粒)；离子交换树脂2622，检测器为紫外可见光检测器；显色剂为茚三酮/醋酸钠缓冲液；缓冲液系统为柠檬酸缓冲液B1(pH 3.2)，B2(pH 3.0)，B3(pH 4.0)，B4(pH 4.9)；缓冲液流速0.4ml/min；柱温55℃，反应室温135℃。用外标法测定样品溶液中游离氨基酸含量其中脯氨酸检测波长为440nm和其它氨基酸检测波长570nm，每个样品重复三次平行测定。
响应面酶解验证试验
通过模型优化确定最佳工艺条件为：温度为50℃、料液比1：55、酶添加量5.5％理论上得到水解度为18.72％，感官得分为6.81。以上预测最优的工艺条件重复三次试验，得到实际的水解度为18.69％，感官得分为6.7与理论预测值靠近且无显著差异，可见该模型能较好地预测和模拟试验中各个因素对酶解效果的影响。
实施例3
呈味肽组分的筛选
对三个超滤组分＜3kDa、3kDa～10kDa、＞10kDa进行感官评价和电子舌测定，超滤组分电子舌筛选结果如表2所示，
表2超滤组分电子舌筛选结果
Figure BDA0003684653100000091
实验中，对三个超滤组分：＜3kDa组分、3kDa～10kDa组分、＞10kDa组分进行感官评价和电子舌智能感官仪器分析，筛选出最佳的呈鲜味组分，由图1感官评价结果表明，＜3kDa超滤组分鲜味最强，感官得分为3.5分，且该组分中其他味道较鲜味较低；电子舌分析结果：由图2PCA主成分分析图可以看出第一主成分贡献率为98.97％，第二主成分贡献率为0.9％，当两个主成分之和大于80％，就认为此主成分二维得图可以很好的表示出被测样品的整体信息，且由图得三个组分组间差异显著，且组内差异较小；结合表2，＜3kDa组分3kDa＜10kDa组分、＞10kDa组分对应的鲜味值分别为14.85、11.8、和6.76，得知最佳呈鲜味为＜3kDa组分。研究表明鲜味肽是一类分子量小于3000Da的寡肽类物质，通常分子质量在150～3000Da之间；1978年,日本科学家Yamasaki首次从牛肉的水解液中提取鉴定得到氨基酸序列为Lys-Gly-Asp-GluGlu-Ser-Leu-Ala的肽,其分子量为963.12Da，命名为鲜味肽，2020年，刘源等人从暗纹东方鲀中分离、纯化、鉴定得到氨基酸序列为GYSFTTTAER、DAGVIAGLNVLR的两条鲜味肽，其分子质量分别为1131.5197Da和1196.6877Da，其分子质量均小于3000Da。因此，本研究选择＜3kDa组分进行后续肽序列鉴定。
实施例4
呈味肽组分的LC-MS/MS肽序列鉴定
将超滤得到的小于3kDa呈味肽组分用HPLC-MS/MS鉴定。组分经毛细管高效液相色谱分离后用Q-Exactive质谱仪(ThermoScientific)进行质谱分析。从＜3kDa呈味肽组分中鉴定出40条肽段，其肽序列信息如表3所示，通过计算氨亲水性氨基酸比例、氨基酸组成、以及鲜味肽的相关性质从40条肽序列中筛选出四条鲜味多肽，其氨基酸序列分别
Glu-Tyr-Pro-Pro-Leu-Gly-Arg-Phe-Ala(EYPPLGRFA)
Gly-Gly-Ile-Gly-Gly-Thr-Val-Pro-Val-Gly-Arg-Val-Glu-Thr-Gly(GGIGTVPVGRVETG)
Thr-Val-Ile-Asp-Ala-Pro-Gly-His-Arg-Asp-Phe-Ile(TVIDAPGHRDFI)
Val-Ile-Asp-Asn-Asp-Pro-Aly-Ser(VIDNDPRS)
其分子量分别为849.46175Da、1184.66336Da、1126.56398Da和729.35259Da。
表3呈味肽组分肽序列信息表
Figure BDA0003684653100000101
Figure BDA0003684653100000111
实施例5
羊肚菌呈味肽组分美拉德反应前后的电子鼻分析
对超滤所得液与美拉德反应液进行电子鼻分析，探究呈味肽在进行美拉德反应后的气味变化情况；
由图4所示为电子鼻主成分分析图，超滤组分Ⅰ美拉德反应前后第一主成分贡献率为90.681％，第二主成分贡献率为9.038％，当两个主成分之和大于80％，此主成分二维得图可以很好的表示出被测样品的整体信息。两个主成分累计贡献率为100％，远大于80％，说明该模型能够很好的反应原始数据，图中美拉德反应前后的样品落在不同的区域，说明各样品之间区分度较好，香气差异明显。用电子鼻对组分Ⅰ美拉德反应前后两组样品的香气轮廓进行分析，得到如图5所示的挥发性物质响应强度值变化情况。由图5可知，两种样品的气味强度存在一定的差异。传感器W1W、W3S、W2W、W1C、W5C、W3C对美拉德反应后的样品有较高的响应值，而W1W、W3S、W1C、W5C、W3C对美拉德反应前的样品响应值较高。根据不同传感器对不同香气的灵敏度，传感器W1W对硫化物敏感，传感器W3S对长链烷烃敏感，W2W对有机硫化物敏感，W1C对芳香化合物苯类敏感，W5C对锻炼烷烃芳香成分敏感，W3C对芳香成分氨类敏感。结果表明美拉德反应可以产生更多的含硫、有机含硫化合物，这一结果与现有研究发现蛋白酶水解液经过美拉德反应后含氮含硫以及有机含硫化合物增加结果一致，此外，刘源等人对肉中得风味物质进行检测，发现含硫化合物是产品肉香得主要化合物，可呈现出肉香味。结果显示样品经过美拉德反应后，整体气味提升。
实施例6
＜3kDa呈味肽组分美拉德反应前后的电子舌分析
对超滤所得液与美拉德反应液进行电子舌分析，探究呈味肽在进行美拉德反应后的滋味变化情况，PCA主成分分析见图6，美拉德反应前后超滤组分Ⅰ滋味变化分析结果见图7；
由图6所示为电子舌主成分分析图，超滤组分Ⅰ美拉德反应前后第一主成分贡献率为99.98％，第二主成分贡献率为0.02％，当两个主成分之和大于80％，此主成分二维得图可以很好的表示出被测样品的整体信息。两个主成分累计贡献率为100％，远大于80％，说明该模型能够很好的反应原始数据，图中美拉德反应前后的样品落在不同的区域，说明各样品之间区分度较好，滋味差异大。图7统计出了美拉德反应前后的组分Ⅰ滋味变化情况，由图可知，经过美拉德反应后，鲜味较美拉德反应前大幅度增加，其滋味响应值由5.35分上升到了9.75分，其次滋味依次增加的有酸味和苦味。Yu等人的研究结果表明，豆粕蛋白水解物中1000～3000Da的肽在进行美拉德反应前，可呈现出低苦味、低酸味和高收敛性，在经过美拉德反应后，明显改善了鲜味和浓厚感，相同的，kang等人对牛肉酶解液中＜1000Da的肽段进行美拉德反应，发现具有强烈的美拉德反应活性，并且在美拉德反应后，产物中表现出了高鲜味、高浓厚干和肉香味，由此推测，美拉德产物中的低分子量美拉德肽和寡肽可能导致了产物中鲜味和浓厚感的增加。此外，据报道，美拉德反应产物所含的0.3～3kDa的前体肽、5’-鸟苷酸其他鲜味氨基酸贡献强烈的肉味、鲜味、及回味。这些呈味物质的生成一方面直观增加了鲜味，另一方面，通过味觉相互作用掩盖了苦、涩等异味。本实验中，经过美拉德反应后，鲜味增加明显，可能与＜3kDa组分所含有的鲜味氨基酸等有关系，与前人的研究结一致。
实施例7
＜3kDa呈味肽组分美拉德反应前后的游离氨基酸分析
对＜3kDa组分进行美拉德反应前后游离氨基酸分析，结果如下表4所示
表4美拉德反应前后游离氨基酸含量分析
Figure BDA0003684653100000131
Figure BDA0003684653100000141
根据美拉德反应前后样品中氨基酸的含量统计游总游离氨基酸的含量(TFAA)和呈味氨基酸的含量(DAA)，结果如表4所示。游离氨基酸不仅是重要的滋味物质，而且与香味前提物质的形成有重要的关系，能参与美拉德反应中多种化合物的降解，从而影响产品的整体风味。美拉德反应是一种非酶促褐变，主要是醛、酮、还原糖的羰基与蛋白质和肽中的氨基酸之间的反应，可以生成种类繁多的产物，进而提升产物的整体风味，产生特征香气物质。美拉德反应中游离氨基酸的含量取决于Strecker降解、氨基酸与糖的交联以及肽的降解反应。如表5所示，＜3kDa呈味肽组分经过美拉德反应后，与美拉德反应前相比，总游离氨基酸的含量显著增加，呈味氨基酸的含量也明显增加，表明在加热过程中依然以肽的降解为主。此外，样品在经过美拉德反应后，甜味氨基酸的总含量由50.815ug/mL上升到了3193.044ug/mL，含量大幅度增加，这与脯氨酸的含量增加有关系，研究表明脯氨酸在产物中可使得产品增加甜味，并且对产品的鲜味具有提升作用。研究表明，游离氨酸的呈味与侧链集团R基团的亲疏水性有重要的联系，当氨基酸是亲水性氨基酸时，主要呈现出甜味，如脯氨酸、丙氨酸、丝氨酸等氨基酸，当氨基酸为疏水性氨基酸时，主要呈现出苦味，如苯丙氨酸、异亮氨酸、缬氨酸等氨基酸，其中，天冬氨酸和谷氨酸是形成鲜味的重要基础物质，本实验中，样品经过美拉德反应后，天冬氨酸的含量由5.731ug/mL增加到了7.263ug/mL，对产物整体鲜味的提升具有重要作用，此外，在美拉德反应后，产物的总游离氨基酸和呈味氨基酸的含量都明显增加，总氨基酸由402.541ug/mL增加至3765.394ug/mL，呈味氨基酸含量由292.123ug/mL增加至3375.673ug/mL，样品经过美拉德反应后整体滋味得到提升，可为后续羊肚菌系列调味品的开发提供一定的研究基础。
表5呈味肽组分美拉德反应前后游离氨基酸含量分析
Figure BDA0003684653100000151
Figure BDA0003684653100000161

Claims (5)

1.一种羊肚菌呈味肽风味基料的开发制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：羊肚菌呈味肽的酶解：先对羊肚菌蛋白进行超声预处理至蛋白溶液呈均匀透明可溶液体，再利用风味蛋白酶和中性蛋白酶对羊肚菌蛋白质进行分步酶解；其中酶解温度为45～55℃，料液比为1:55g/mL；酶添加量占原料的5％～6％；酶解至蛋白水解度达到25～31％，酶解液呈棕色、无沉淀、且菌香浓厚、并略带鲜和收敛感；
S2：酶解液超滤处理：将S1最优参数下得到的酶解液用＜300Da的透析袋在4℃的条件下处理72h，将酶解制备中的一些无机盐等小分子进行透析处理；透析后的酶解液使用＞10kDa、3kDa～10kDa、＜3kDa的三个规格的超滤膜进行超滤，其中4个超滤组分含量占比分别为11％、35％和54％，且＜3kDa超滤组分占比最高，说明上述酶解处理得到了高含量的小分子肽物质；
S3：鲜味肽确定：通过电子舌智能感官结合人工感官评价筛选出小于3kDa超滤组分为最佳的呈味肽组分，利用LC-MS/MS对该超滤组分进行肽序列鉴定，筛选到4种潜在的呈味肽(肽序列分别为EYPPLGRFA、TVIDAPGHRDFI、VIDNDPRS、GGIGTVPVGRVETG)；进一步结合分子对接技术确定EYPPLGRFA、TVIDAPGHRDFI为重要的鲜味肽，其在小于3kDa超滤组分中占比高，分别达到10％、13％，为该呈味肽组分提供了明显的鲜味、甜味和浓厚的收敛感；再利用活性肽在线活性预测数据库进行生物活性预测，其中肽EYPPLGRFA和TVIDAPGHRDFI具有潜在的抗氧化、降糖和降压活性，肽VIDNDPRS和GGIGTVPVGRVETG具有潜在的抗氧化、抑菌、降糖和降压活性，并通过人工合成4种肽验证其主要生物活性为肽EYPPLGRFA的DPPH自由基清除率75％和血管紧张素转化酶(ACE)抑制率IC50值2.12mg/mL，肽TVIDAPGHRDFI的DPPH自由基清除率71％和α-葡萄糖苷酶抑制率IC50值0.34mg/mL，肽VIDNDPRS的DPPH自由基清除率65％、对金黄色葡萄球菌抑制率83％和血管紧张素转化酶(ACE)抑制率IC50值3.31mg/mL，肽VIDNDPRS的血管紧张素转化酶(ACE)抑制率和α-葡萄糖苷酶抑制率IC50值分别为3.59mg/mL、0.52mg/mL；
S4：羊肚菌呈味肽组分进行美拉德反应：对筛选的＜3kDa呈味肽组分进行美拉德反应，通过电子鼻和电子舌技术比较反应前后的滋气味变化，其鲜味滋味响应值明显提升，进一步明确反应前后产物中总游离氨基酸含量由402.541μg/mL增加至3765.394μg/mL，且呈味氨基酸含量由292.123μg/mL增加至3375.673μg/mL，呈味氨基酸含量达90％。
2.根据权利要求1所述一种羊肚菌呈味肽风味基料的开发制备方法，其特征在于，所述S1中超声预处理的超声功率为300-500w，处理时间为10-15min。
3.根据权利要求1所述一种羊肚菌呈味肽风味基料的开发制备方法，其特征在于，所述S1中分步酶解中风味蛋白酶先水解2.5h，中性蛋白酶再水解3.5h。
4.根据权利要求1所述一种羊肚菌呈味肽风味基料的开发制备方法，其特征在于，所述S1中最佳酶解温度为50℃，酶添加量占原料的5.5％；采用分步酶解：将羊肚菌蛋白与水混匀，加入风味蛋白酶，水浴酶解后在90℃下灭活10min；再加入中性蛋白酶，水浴酶解后在90℃下灭活10min；冷却后在4000r/min离心15min，取上清液得酶解液，备用。
5.根据权利要求1所述一种羊肚菌呈味肽风味基料的开发制备方法，其特征在于，所述EYPPLGRFA占到＜3kDa呈味肽组分含量的10％，其中鲜味氨基酸占比77.74％、甜味氨基酸占比46.4％；
TVIDAPGHRDFI占到＜3kDa呈味肽组分含量的13％，其中鲜味氨基酸占比52.9％，亲水性氨基酸占比63.4％。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115508493A (zh) * 2022-09-16 2022-12-23 江中药业股份有限公司 基于电子鼻的食源性动物肽分子量的快速评价方法
CN115508493B (zh) * 2022-09-16 2024-05-28 江中药业股份有限公司 基于电子鼻的食源性动物肽分子量的快速评价方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104223045A (zh) * 2014-09-16 2014-12-24 广东东阳光药业有限公司 一种食用菌鲜味物质的提取方法
CN111011818A (zh) * 2019-12-10 2020-04-17 南京农业大学 一种羊肚菌调味基料及其制备方法与羊肚菌调味品

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104223045A (zh) * 2014-09-16 2014-12-24 广东东阳光药业有限公司 一种食用菌鲜味物质的提取方法
CN111011818A (zh) * 2019-12-10 2020-04-17 南京农业大学 一种羊肚菌调味基料及其制备方法与羊肚菌调味品

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JUAN GAO等: "Analysis of umami taste substances of morel mushroom (Morchella sextelata) hydrolysates derived from different enzymatic systems", FOOD CHEMISTRY, vol. 362, no. 130192, 25 May 2021 (2021-05-25), pages 1 - 11 *
范三红等: "羊肚菌抗氧化肽的制备、纯化和鉴定", 山西农业科学, vol. 48, no. 1, 31 December 2020 (2020-12-31), pages 45 - 51 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115508493A (zh) * 2022-09-16 2022-12-23 江中药业股份有限公司 基于电子鼻的食源性动物肽分子量的快速评价方法
CN115508493B (zh) * 2022-09-16 2024-05-28 江中药业股份有限公司 基于电子鼻的食源性动物肽分子量的快速评价方法

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