CN1206346C - 薜荔的培养细胞和使用该细胞进行薜荔的组织培养的方法 - Google Patents

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Abstract

薜荔的一种培养细胞，其分化能力高，通过在含有噻缔阿组龙和苄基腺嘌呤中的至少一种、且其量能有效诱导薜荔的愈伤组织形成的培养基中培养薜荔的一部分组织而获得。

Description

薜荔的培养细胞和使用该细胞进行薜荔的组织培养的方法
技术领域
本发明涉及培养细胞和组织培养方法，具体而言，本发明涉及薜荔的培养细胞以及使用所述培养细胞进行薜荔的组织培养方法。
背景技术
近来，已着重研究了高等植物的组织培养，并且大量培养植物的叶、茎、根等组织的技术也受到公众的关注。当将切下的植物块种植在琼脂上或含有营养素的液体中时，从该植物块的切割边缘长出大量的细胞，称之为愈伤组织。
通常，不同组织(如根和叶)的细胞分别有着不同的形状和功能。这是细胞生长过程中逐渐分化产生的结果。但是，愈伤组织持续生长而不分化。
一般说，必须播种或种植插条以繁殖植物。此外，土壤和环境在很大程度上影响植物的生长。但是，愈伤组织的培养并不受这些因素改变的影响。另外，愈伤组织比普通的植物体生长得快。当将能促进萌芽或生根的激素或化学物质加到愈伤组织时，可以获得完整的植物体。
如同这种愈伤组织培养方法一样，树木如白杨树和桉树的组织培养方法也是周知的。
但是，已建立的组织培养方法仅仅限于如白杨树和桉树这类树木。一个原因是其它种类的植物难于生长或生根，除非使用适当的激素等物质。
近来，由于NOx、SOx、挥发性有机烃类等导致的环境污染继续发展，这使得人们担心会对植物、动物和人类产生有害的影响。另外，已认识到植物对热岛和大气污染的作用，并发明了城市墙壁表面绿化的方法，使建筑物的屋顶和外墙面绿化。具体而言，藤本植物适合用来绿化城市，因为它们能生长、扎根在建筑物的外墙面和屋顶上。因此，有效地繁殖这类藤本植物将能快速地妥善应付城市绿化的要求。
在藤本植物中，薜荔(Ficus stipulata Thunb.)属于尖(mordacious)科，是受人注意的植物(focus plant)，它是一种路边树。薜荔在外墙面产生气生根，并沿着墙生长。由于它的叶子小，长为1-2cm，因此它是一种合适的绿化外墙面的藤本植物。为了保证和快速地提供这种藤本植物，组织培养方法是有效的。但是，迄今还没有建立稳定地大量繁殖薜荔的方法。
                         发明内容
本发明的一个目的是提供培养细胞和组织培养方法，这可建立稳定的大量繁殖和转化薜荔的系统。
为了达到上述目标，本发明者已反复进行了艰苦的研究，以找出适合诱导薜荔愈伤组织的形成和再分化的条件，最终发现了本发明所述的培养细胞和组织培养方法。
本发明的分化能力高的培养细胞是通过在含有噻缔阿组龙(thidiazuron)和苄基腺嘌呤中的至少一种、且其量能有效诱导形成薜荔愈伤组织的培养基中培养该植物的一部分组织而获得。
在本发明较佳的薜荔培养细胞的实施例中，薜荔组织选自根尖、茎、叶、胚胎细胞和根中的至少一种。
在本发明另一较佳的薜荔培养细胞的实施例中，薜荔组织由消毒处理种植的薜荔插条生根长成的植物的组织。
在本发明又一较佳的薜荔培养细胞的实施例中，薜荔的组织是种植插条后6周内获得的组织。
在本发明的又一较佳的薜荔培养细胞的实施例中，培养基是WP培养基或MS培养基。
培养本发明薜荔组织的方法包括：在含有噻缔阿组龙和苄基腺嘌呤中的至少一种、且其量能有效诱导薜荔的愈伤组织形成的培养基中传代培养上述任一种培养细胞，从而获得薜荔的小植株。
在本发明较佳的薜荔组织培养方法的实施例中，培养基是WP培养基或MS培养基。
本发明的培养细胞是薜荔的培养细胞，分化能力高，通过在含有噻缔阿组龙和苄基腺嘌呤中的至少一种、且其量能有效诱导薜荔的愈伤组织形成的培养基中培养该植物的一部分组织而获得所述培养细胞。
通常情况下，依照下面组织培养方法过程形成小植株：(1)愈伤组织的形成；(2)多胚层体的形成；(3)多胚层体的再分化和(4)小植株的形成。本文术语“多胚层体”指大量的其中有细胞分化的枝条。
下面将解释本发明的薜荔培养细胞和组织培养方法。
虽然并不具体限制薜荔的组织，但是可以列举的是叶、根、茎尖、根尖、胚胎细胞等组织。优选是茎尖、茎、叶、胚胎细胞和根。
薜荔组织可以是成熟的薜荔树。较佳的是，该组织是所种植的薜荔插条生根长成的植物体的组织。并不具体限制插条的消毒处理，例如，可通过用乙醇等处理该组织一些时间或数小时、用次氯酸钠处理一些书简或数小时、用无菌水洗涤而实现上述消毒处理。
对于插条，可以使用2cm长的含有切下的根尖的尖端部分。薜荔组织较佳是种植该插条6周内获得的组织。
可在含有噻缔阿组龙和苄基腺嘌呤中的至少一种、且其量能有效诱导薜荔愈伤组织形成的培养基中培养上述组织而获得本发明的培养细胞。噻缔阿组龙的量取决于所使用的培养基和培养条件，较佳是1-104nM，。使用这个范围的理由是为了提高再分化的百分比。苄基腺嘌呤的量取决于所使用的培养基和培养条件，其量较佳是1-100nM，更佳是1-50nM。使用此范围也是为了提高再分化的百分比。
至于培养基，可以列举出WP培养基、MS培养基、白培养基(white culturemedium)和改进培养基。WP培养基是用于杜鹃科宽叶山月桂的茎尖培养和大量培养而改进MS培养基所得到的一种培养基。MS培养基是为了繁殖烟草的髓组织和愈伤组织而开发的一种培养基。从提高愈伤组织的形成速率和再分化百分比的角度看，培养薜荔的优选培养基是WP培养基。
另外，培养基中可含有微量的有机物质、碳源等通常用于培养的物质。对于以微量使用的有机物质，可以使用维生素B1、B6，其它的维生素如烟酸、盐酸硫胺素和盐酸吡哆醇等，氨基酸如甘氨酸、天冬酰胺等，六元醇如肌醇、山梨醇等。
对于碳源，可以列举出糖类如蔗糖、葡萄糖等。
可以将种植在培养基中的组织块放在明亮的条件或黑暗的条件中培养，培养温度为20-30℃，较佳为22-28℃。培养一周后开始形成愈伤组织，两周后完全形成愈伤组织。稳定的愈伤组织得自每10-20天间隔进行一次传代培养的传代培养。
根据本发明的组织培养方法，可通过在含有噻缔阿组龙(TDZ)和苄基腺嘌呤(BA)中的至少一种、且其量能有效诱导薜荔的愈伤组织形成的培养基中传代培养具有高分化能力的培养细胞而获得该植物的小植株。至于噻缔阿组龙(TDZ)和苄基腺嘌呤的量，可使用上述用来培养培养细胞的条件。
对于具有高分化能力的薜荔培养细胞，可使用本发明上述的培养细胞。
可通过切下多胚层体并在其切割边缘涂上例如吲哚乙酸，来促进小植株的生长。
对于培养基的添加物，可以列举出珠光体、蛭石、Gellan Gum、琼脂、琼脂糖等。
                         具体实施方式
下面，本发明将在实验的基础上进行更详细的描述，但不能解释为本发明被下面这些实施例所限制。
实施例1
使用以MS培养基或WP培养基作为基础培养基、加入1％蔗糖和0.3％GellanGum分别作为碳源和胶凝剂的培养基。
切片长0.5-1mm，从消毒培养的薜荔的叶、枝条和根组织制备。将如此制备的薜荔的叶、枝条和根组织的切片种植在含有作为植物激素的噻缔阿组龙和/或苄基腺嘌呤的培养基上，从而培养薜荔。培养一个月后，观察到切片形成多胚层体。切下这些多胚层体，在切割边缘涂上吲哚乙酸，将切下来的多胚层体种植到上述培养基或含有珠光体和蛭石的培养基中，使其生根。表1给出了观察到形成多胚层体的切片的比例和枝条/切片的数量。
                       表1
 BA(nM) TDZ(nM) 切片的数量* 枝条/切片的数量
 0  0  100  1.5±1.0
 0  1  100  2.5±1.0
 0  1×102  100  2.5±0.6
 0  1×104  100  1.5±1.0
 9  0  50  1.8±2.4
 9  1  100  2.5±0.6
 9  1×102  100  2.5±1.0
 9  1×104  75  1.5±1.3
 22  0  100  3.5±0.6
 22  1  100  3.0±1.4
 22  1×102  100  4.3±1.9
 22  1×104  75  2.5±1.7
 36  0  100  2.5±1.0
 36  1  100  3.8±1.3
 36  1×102  100  3.5±1.3
 36  1×104  100  2.3±1.0
 44  0  100  3.8±0.5
 44  1  100  4.0±1.2
 44  1×102  75  2.0±1.4
 44  1×104  100  2.8±1.3
*(观察到形成多胚层体的切片的数量)×100/切片
从表1可以清楚地看出，当在含有噻缔阿组龙(TDZ)和/苄基腺嘌呤(BA)中的至少一种的培养基中进行培养时，可以高概率地诱导薜荔的愈伤组织。此外，这阐明了可通过传代培养以高概率诱导薜荔的再分化。
实施例2
检测了最适合将一基因导入薜荔的再分化条件，并设法将该基因导入薜荔的(基因组)中。
首先，检测了再分化的条件。使用经消毒和无菌传代培养的薜荔。使用无菌生长的薜荔(切片种植4-6周后)，从茎尖、节和茎部分获得该切片，并将其种植在培养基中。6周后，观测芽的数量和形状。在培养薜荔时，将1/3的Florialite块(蛭石和纤维素的混合物)加到试管(30×200mm)中，将15ml的MS培养基或WP培养基加到该试管中。用聚丙烯塞子封闭该试管，将其放到高压灭菌锅中。
从在Agripot(一种塑料容器)中消毒传代培养的薜荔上切下2-3cm长的幼苗(braird)，将它的切下部分浸到1g/l的4-(3-吲哚基)丁酸溶液(1g/l)中，然后将其作为种植的切片，培养4-8周。
培养的条件是：大气温度为25℃，光照强度为30-40μEm-2s-1，15小时30-40μEm-2s-1的明亮条件和9小时1-2μEm-2s-1的黑暗条件。
用MS培养基或WP培养基作为基础培养基。在各培养基中加入2％蔗糖，从而将MS培养基和WP培养基的pH值分别调到5.6和5.2。此外，在培养基中加入3％Gellan Gum，将该培养基置于高压灭菌锅中120℃灭菌15分钟，从而制得固体培养基。可以使用萘磺酸(NAA)、苄基氨基嘌呤(BA)、噻缔阿组龙(TDZ)、脱落酸(ABA)和硝酸银(AgNO3)作为植物激素。
结果，在使用BA和TDZ作为植物激素、使用明亮条件作为光照状态、使用WP培养基的情况下显示出良好的再分化状态。
表2给出了在茎尖形成了多胚层体的切片的数量和产生的芽的数量。
                          表2
 BA(nM)  TDZ(nM)  切片总数  切片的数量*  形成的芽的数量
 0  0  4  4  1.5±1.0
 0  1  4  4  2.5±1.0
 0  102  4  4  2.5±0.6
 0  104  4  4  1.5±1.0
 8.9  0  4  2  1.8±2.4
 8.9  1  4  4  2.5±0.6
 8.9  102  4  4  2.5±1.0
 8.9  104  4  3  1.5±1.3
 22.2  0  4  4  3.5±0.6
 22.2  1  4  4  3.0±1.4
 22.2  102  4  4  4.3±1.9
 22.2  104  4  3  2.5±1.7
 35.5  0  4  4  2.5±1.0
 35.5  1  4  4  3.8±1.3
 35.5  102  4  4  3.5±1.3
35.5 104 4 4 2.3±1.0
 44.4  0  4  4  3.8±0.5
 44.4  1  4  4  4.0±1.2
 44.4  102  4  3  2.0±1.4
 44.4  104  4  4  2.8±1.3
*在茎尖形成了多胚层体的切片的数量。
实施例3
接着，设法制备薜荔的转化体。采用基因枪的方法将基因导入。首先，将含有GFP(绿荧光蛋白)基因的表达载体pTH-2导入某植物的高效基因表达盒中。至于该植物，使用了在上述培养条件中培养3-14天的外植体来形成多胚层体。将该基因导入2天后观察到大量的GFP信号。这证明GFP已确实导入到薜荔中。
本发明的培养细胞显示了其优点使得它们能用于薜荔转化。
此外，本发明的组织培养方法显示了其使薜荔能大量繁殖并用作绿化外墙面的材料的优点。

Claims (8)

1.薜荔的一种培养细胞，其特征在于，该培养细胞分化能力高，它通过在含有噻缔阿组龙和苄基腺嘌呤中的至少一种、且其量能有效诱导薜荔愈伤组织形成的培养基中培养薜荔组织或其胚胎细胞而获得，其中，噻缔阿组龙的量为1-104nM，苄基腺嘌呤的量为1-100nM。
2.如权利要求1所述的培养细胞，其特征在于，所述薜荔组织取自茎、叶或根。
3.如权利要求2所述的培养细胞，其特征在于，所述薜荔组织取自根尖。
4.如权利要求1、2或3所述的培养细胞，其特征在于，所述薜荔组织是由所种植的薜荔插条生根长成的植物体的组织。
5.如权利要求4所述的培养细胞，其特征在于，所述薜荔组织是种植插条后6周内所获得的组织。
6.如权利要求1、2、3和5中任一项所述的培养细胞，其特征在于，所述培养基是WP培养基或MS培养基。
7.一种培养薜荔组织以获得其小植株的方法，该方法包括如下步骤：在含有噻缔阿组龙和苄基腺嘌呤中的至少一种、且其量能有效诱导薜荔愈伤组织形成的培养基中传代培养权利要求1-6中任一项所述的培养细胞，从而获得薜荔的小植株，其中，噻缔阿组龙的量为1-104nM，苄基腺嘌呤的量为1-100nM。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述培养基是WP培养基或MS培养基。
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