CN1200405A - 生产l－天冬酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了通过具有天冬酶活性的微生物的作用由富马酸和氨生产L－天冬酸的方法,其中微生物是一种红球菌属的微生物。通过使用红球菌属细菌衍生的天冬酶,可以由富马酸和氨生产L－天冬酸。

Description

生产L-天冬酸的方法
本发明涉及高效地由富马酸和氨使用一种微生物生产L-天冬酸的方法，这种微生物为红球菌属(Rhodococcus)并且具有天冬酶活性。
L-天冬酸一直用作为药物、食品添加剂或类似物。近来L-天冬酸作为表面活性剂和生物可降解螯合物的材料也引起了注意。
L-天冬酸主要通过由富马酸和氨使用天冬酶的酶催化方法生产。例如，公知的使用大肠杆菌(Escherichia coli)(日本未审查专利申请60-133 883)的方法、使用沙雷氏菌属(Serratia)的细菌的方法(日本未审查专利申请59-113887)和使用短杆菌属(Brevibacterium)的细菌的方法(日本未审查专利申请56-26196)。
本发明的目的是进一步寻找那些具有天冬酶活性的微生物并使用这些微生物高效地生产L-天冬酸。
作为为了达到上述目的深入细致和广泛研究的结果，本发明人已经找到了一些具有天冬酶活性和能够高效生产天冬酸的红球菌属的微生物。这样，本发明已经完成了。在红球菌属细菌里天冬酶活性的存在一直不为人所知。迄今为止，没有关于在红球菌属里天冬酶活性的报告。
本发明涉及通过具有天冬酶活性的微生物的作用由富马酸和氨生产L-天冬酸的方法，其特征在于这种微生物是红球菌属微生物。
作为本发明的红球菌属微生物，例如可以列举Rhodococcus sp.EA4(FERMBP-6231)，Rhodococcus rhodochrous ATCC 17041、Rhodococcus rhodochrousATCC 17895、Rhodococcus rhodochrous ATCC 19140和Rhodococcusrhodochrous ATCC 33258。
在这些微生物中，EA4菌种以上述入藏号在日本the National Institute ofBioscience and Human-Technology，Agency of Industrial Science and Technology存放。这一菌种的细菌学特性在日本未审查专利公开号4-304 892里有描述。ATCC 17041、ATCC 17895、ATCC 19140和ATCC 33258菌种可以容易地从American Type Culture Collection(ATCC)获得。
本发明使用的微生物在含有可吸收碳源(例如甘油、葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖)、氮源(例如肉膏、酵母膏、麦芽膏、玉米浆、多蛋白胨(polypeptone))和对于每一种微生物生长必须的无机盐(例如氯化镁、硫酸钠、氯化钙、硫酸锰、氯化铁、硫酸锌)的传统培养基里培育。在上述培养基里。L-天冬酸可以用作为碳和氮源，富马酸可以用作为碳源。这些物质的加入量应该分别是0.1～5％。
培养液的pH值在4～10的范围内。培养在5～50℃的温度下，在需氧条件下进行1～7天。培养一直进行到天冬酶活性达到最大值为止。
反应按以下的方式实施。从如上述培养的微生物的培养液里分离的细胞或通过处理这类细胞得到的物质(例如干细胞、分裂细胞、分离的粗或纯酶、固定化细胞或酶)在一种诸如水或缓冲液之类的含水介质中悬浮。然后将该悬浮液与一种酶作用物接触。
富马酸和氨—它们是这个反应的酶作用物—可以以各种形式加入到反应体系里。例如，可以使用富马酸铵或富马酸或其盐与一种无机铵盐的混合物。作为富马酸盐，富马酸钠或富马酸钾是适用的。作为无机铵盐，可以使用氯化铵、硫酸铵、磷酸铵或它们的混合物。
富马酸或其盐与无机铵盐的摩尔比优选在1∶1.5～1∶2的范围内。
反应温度为0～60℃，优选20～50℃。反应进行0.1～100小时。
在反应期间。ph值调整到6～10，优选8～10。
通常，将一种二价金属离子，例如钙或镁离子以0.1～100mM，优选1～10mM加入到反应溶液里。
下面将参考下列的实施例更详细地描述本发明。不过，本发明并不被这个实施例所限定。
实施例1
将Rhodococcus sp.EA4，Rhodococcus rhodochrous ATCC 17041、Rhodococcus rhodochrous ATCC 17895、Rhodococcus rhodochrous ATCC 19410和Rhodococcus rhodochrous ATCC 33258分别接种到10mlMYK培养基(0.5％多蛋白胨、0.3％细菌-酵母膏、0.3％细菌-麦芽膏、0.2％K2HPO4、0.2％KH2PO4)里，并且在30℃培育3天。然后，将0.5ml的这种培养溶液接种到50ml的ASP培养基(1％L-天冬酸、1％多蛋白胨、1％细菌-酵母膏、0.5％K2HPO，pH 7.0)里，并且在30℃培育96小时。此后，它们的细胞通过离心分离获得、用100mM磷酸缓冲液(pH8.0)洗涤并且最后在少量的缓冲液里悬浮。生成的细胞缓冲液用超声波法在冰冷却下破碎，随后通过离心分离得到一种粗酶溶液。测定这种酶溶液的天冬酶活性。
通过将粗酶溶液与1M富马酸铵(pH8.8，含有1mM氯化镁)接触进行天冬酶活性测定，并且在30℃使用ODS柱通过HPLC定量测定生成的L-天冬酸20小时。结果列于表1中。
                      表1
品系   L-天冬酸(mM)
Rhodococcus sp.EA4Rhodococcus rhodochrous ATCC1704Rhodococcus rhodochrous ATCC17895Rhodococcus rhodochrous ATCC19140Rhodococcus rhodochrous ATCC33258     21014050170100
通过使用Rhodococcus细菌衍生的天冬酶，可以由富马酸和氨生产L-天冬酸。

Claims (2)

1、通过具有天冬酶活性的微生物的作用由富马酸和氨生产L-天冬酸的方法，其特征在于该微生物是一种红球菌属的微生物。
2、权利要求1的方法，其中红球菌属的微生物是Rhodococcus sp.EA4、Rhodococcus rhodochrous ATCC 17041、Rhodococcus rhodochrous ATCC17895、Rhodococcus rhodochrous ATCC 19140或Rhodococcus rhodochrousATCC 33258。
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