CN1197619C - 一种来源于动物中药的生物治疗佐剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种动物中药佐剂,它是以动物的胆囊、胆汁、胆石、或人造胆石或者其混合物为原料制备的提取物,该提取物不含分子量大于10KD的蛋白质,但含有小分子的多肽和氨基酸,并且在紫外扫描图谱中在215nm处和280nm具有明显的吸收峰。该佐剂可安全有效地激发和增强免疫应答,可用于治疗或辅助治疗病毒感染、病毒性感冒、免疫缺陷性疾病、肿瘤。
Description
本发明涉及免疫学和医学领域。更具体地,涉及一种来源于动物中药的生物治疗佐剂。
佐剂(adjuvant),又叫免疫佐剂,是非特异性的免疫增强剂,佐剂单独,与抗原一起或先注射入体内时,能增强机体对该抗原的免疫应答或改变免疫应答的类型。广义的佐剂概念包括肿瘤瘤苗,微生物疫苗等,因此,佐剂也可以理解为生物治疗制剂或生物应答修饰剂。佐剂的种类包括:(1)无机佐剂,如氢氧化铝、明矾; 有机佐剂,常用的如分杆菌、短小棒杆菌、百日咳杆菌、革兰式阳性杆菌的脂多糖等微生物及其产物,从细菌中提取的胞壁酰二肽(MDP)亦属此类;(2)合成佐剂,人工合成的佐剂如胞壁酰二肽、双链多聚肌苷酸:胞苷酸(poly I:C)、双链多聚腺苷酸:尿苷酸(Poly A:U)、脂质体、异丙肌苷和左旋咪唑等。(3)混合油脂类佐剂,又分为弗式完全佐剂(CFA)或弗式不完全佐剂(IFA)。CFA由油剂(石蜡油或植物油)和乳化剂(羊毛脂或Tween 80),再加上卡介苗(或死的分枝杆菌),与抗原溶液一起制成油包水乳剂。IFA比CFA少卡介苗(或分枝杆菌)成分。(4)新型的佐剂,包括细胞因子如白细胞介素12等生物治疗制剂。
佐剂的作用机理主要包括3个方面,首先是对抗原的作用,佐剂吸附抗原后,增加抗原的有效面积,改变抗原的物理性状,增加抗原在体内的滞留时间,维持注射部位抗原的浓度,使抗原与免疫系统能充分接触。其次是对免疫细胞的作用,包括:刺激局部炎症反应,使更多单核-巨噬细胞被激活,增强其摄取、处理和递呈抗原的能力。 佐剂能刺激机体释放大量的细胞因子、增强机体的免疫功能。促进T、B细胞增殖,增强细胞免疫和抗体生产,产生或增强迟发型过敏反应。再次,佐剂可以改变抗体产生的类型,如用鸡卵白蛋白免疫豚鼠一般诱导IgG抗体,与佐剂一起免疫则诱导产生IgM抗体。再次,直接激活机体的免疫细胞,包括抗原提呈细胞,淋巴细胞等,非特异性地增强机体的免疫力。
近年来,佐剂的研究进展很快,佐剂研究的新发展之一是佐剂给药系统的发展。脂质体、免疫刺激复合物(ISCOMs)缓释制剂等给药系统都可以取得与佐剂相似的免疫增殖作用,但是其毒性较小,应用方便。另一进展是细胞因子佐剂作用白细胞介素(interleukin,IL)类的IL-2、IL-1、干扰素g(IFNg)、IL-12、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)都可作为非常好的佐剂,细胞因子与抗原合用,可以更有效的激发机体的免疫功能,现在细胞因子佐剂已经用于疟原虫、肿瘤疫苗等研究中。单独用利什曼原虫的抗原免疫小鼠,小鼠不能产生有效的保护性免疫,如果将IL-12与利什曼原虫的抗原一起免疫BALB/c小鼠,结果小鼠可以产生显著的保护性细胞免疫。细胞因子的佐剂作用还被广泛用于肿瘤的基因治疗中,将IL-2、GM-CSF、IFN等基因转入肿瘤细胞中,可以大大提高肿瘤细胞的免疫原性,更有效地激发机体的抗肿瘤免疫,因此,细胞因子将会成为一类新型的、广泛应用的佐剂。
主动免疫一般发生在自然状态下机体被感染复原之后,也可以利用人工的方法通过接种、食入、吸入经改造的微生物或其他免疫原成分,使机体自己更生产生免疫力,称为主动免疫。那些经过改造减毒的微生物或其他具有免疫原性、能诱导机体发生免疫应答的成分称为疫苗。随着人们对抗原、表位的本质及作用的深入研究,人们可以制备疫苗用于各种感染性疾病、肿瘤的预防和治疗中。机体在正常情况下细胞的分化、增殖和凋亡都在非常精细的调控和免疫监督之下进行,一旦某些细胞逃逸这种调控和监督,就可能生长为肿瘤细胞。此时的肿瘤细胞虽然有许多形态、理化性质的改变,但机体的免疫系统仍然不能识别为″非我″。近百年来,不断有学者试图打破机体免疫系统对肿瘤细胞的耐受状态,开始是卡介苗(BCG)的作用,BCG具有典型的佐剂作用,曾经在一些膀胱癌、黑色素瘤病人身上发挥过一定的治疗作用。后来,人们开始制备肿瘤疫苗,简称瘤苗,瘤苗是指能够有效地诱导机体产生抗肿瘤免疫反应,从而发挥治疗(非预防)效果的免疫原,不包括一般的生物应答修饰剂(BRM)、治疗性抗体或抗体靶向的生物导弹。很久以前人们就发现有些病人如黑色素瘤或肾癌病人,其肿瘤会由于免疫功能的增强而自然消失,因此人们开始意识到机体的免疫系统可以产生抗肿瘤作用。至今,瘤苗研究的发展十分迅速,有多种瘤苗都产生了非常明显的临床疗效。人们对瘤苗的作用机理也有了更深入的研究[Pardoll DM.Cancer vaccines.ImmunolToday.1993;14:310-5 Cohen J.Vaccines get a new twist.Science,1994;264:503-510]。
瘤苗主要作为治疗性疫苗应用,作为治疗性疫苗,进入机体后必须激活免疫系统,特别是细胞免疫[Rabinovich NR,Mclnnes P,Klein DL,Hall BF.Vaccine technologies:View to the future.Science,1994;265:1401-1404]。激活的抗肿瘤成分包括:(1)、杀伤性T细胞(CTL):CTL细胞可以直接杀伤肿瘤细胞,肿瘤细胞必须借助MHC-I类分子将肿瘤抗原加工提呈给CTL细胞,因为主要组织相容性复合体(MHC)的限制性,从一个体内肿瘤细胞制备的瘤苗不能用于另一个人。(2)、辅助T细胞(Th细胞):单单将肿瘤抗原表位通过MHC-I类分子提呈给CTL细胞还不足以杀伤肿瘤细胞,还需要IL-2的刺激。只有抗原提呈细胞(APC)将抗原表位提呈给辅助T细胞,T细胞才能被激活,释放IL-2等细胞因子。T辅助细胞极易对肿瘤抗原耐受,因此,还要提呈共刺激分子。Th细胞除了分泌细胞因子,参与肿瘤细胞的杀伤过程之外,本身也可以直接杀伤肿瘤细胞。(3)、细胞因子:激活CTL细胞的细胞因子除了Th细胞分泌之外,也可以通过给予外源性细胞因子而达到激活CTL的目的。但是前者的作用是局部的,而全身应用细胞因子除了能达到激活CTL的效果外,还可引起不良反应,随着基因治疗的研究不断发展,可以通过靶向释放细胞因子的方法解决这个问题。(4)、NK细胞:NK细胞具有明显的抗肿瘤作用,体内外可直接杀伤肿瘤细胞,在疫苗诱导机体产生的抗肿瘤免疫应答中,NK细胞具有十分重要的作用。(5)、免疫记忆:要使机体在很长的时间内对肿瘤保持免疫应答、防止肿瘤的复发,记忆T细胞具有十分重要的作用。研究表明,只有反复经免疫原如瘤苗刺激的T细胞才具有免疫记忆和杀伤作用。任何疫苗,要充分激活上述的5大成分几乎是不可能,因为作为疫苗的抗原通常其抗原性特别弱,因此,需要佐剂的辅助。
目前治疗肿瘤的疫苗(简称瘤苗)的主要类型有:
(1)、自体灭活瘤苗
自体瘤苗一般取自肿瘤病人手术后切除的肿瘤组织,制成单细胞悬液后经放射线或药物处理,使其失去增殖能力保留免疫原性。自体瘤苗的优点是其MHC与机体完全一致,可十分有效地诱导机体免疫应答;但是其缺点也十分明显,要为每个病人制备一份瘤苗,费时、费力,有时等体外把瘤苗制备好,病人早已病死或严重恶化。
(2)、用细胞株制备的瘤苗
体外将一些肿瘤细胞株制成瘤苗,可以象药物一样直接注射到病人体内,但是由于瘤苗作为一种异体异物,进入体内可能会被机体排斥,抗肿瘤效果也没有自体瘤苗好。
(3)、分子瘤苗
所谓分子瘤苗,包括:将提取的肿瘤抗原、合成的肿瘤抗原或重组的肿瘤抗原作为亚单位瘤苗与佐剂一起免疫机体;将编码肿瘤抗原的DNA直接注射到体内,使其在体内表达并发挥免疫作用;体外将肿瘤细胞进行基因修饰,将细胞因子、共刺激分子B7、MHC分子等基因转入肿瘤细胞,使其致瘤性下降,免疫原性增加,成为新一代的瘤苗,其效果似有待于临床进一步证明[Colombo MP,ForniG.Immunotherapy.I:Cytokine gene transfer strategies.Cancer Metastasis Rev1997;16:421-432]。
(4)抗独特抗体瘤苗
对于B细胞淋巴瘤来说,瘤细胞表达的独特型可被认为是其特异性肿瘤抗原,用此独特型抗原作为瘤苗可以诱导机体产生保护性免疫。象大多数亚单位抗原或合成多肽一样,独特型瘤苗必须与有强烈免疫原性的载体蛋白偶合、与免疫佐剂混合后方能诱导免疫反应。将B细胞淋巴瘤独特型与IL-2、IL-4、GM-CSF制成融合蛋白,结果发现使该瘤苗的免疫原性显著增强,该融合蛋白在不需要任何载体蛋白或佐剂的情况下就能诱导出具有抗肿瘤作用的抗体。以此独特型抗体可变区(V region)基因为目地基因,构建了表达质粒,采用DNA直接注射的方法将此质粒DNA经肌肉注射免疫小鼠,小鼠体内可检测到抗IgM轻链V区的抗独特型抗体[Watanabe A,Raz E,Kohsaka H,et al.Induction of antibodies to a V regionby gene immunization.J Immunol.1993;151:2871-6]。与此相似,TCR独特型的基因也可以作为疫苗,用来预防或治疗T细胞淋巴瘤。
(5)、抗原提呈细胞制备的瘤苗
抗原提呈细胞包括树突状细胞、巨噬细胞、郎罕氏细胞、B细胞等,在免疫应答的诱导中具有十分重要的作用,其中树突状细胞可以直接刺激处女型T细胞增殖活化。近年来应用抗原提呈细胞特别是树突状细胞和巨噬细胞制备的瘤苗研究发展迅速,主要有:
1).肿瘤抗原多肽或肿瘤提取物冲击致敏的抗原提呈细胞回输或接种到荷瘤宿主,以诱导机体产生肿瘤抗原特异性的CTL,用于肿瘤治疗。如果将抗原提呈细胞中预先转入GM-CSF、淋巴细胞趋化因子(Ltn)等细胞因子基因,可以使此种瘤苗的治疗效果大大提高[Hsu FJ,Benike C,Fagnoni F,et al.Vaccination ofpatients with B-cell lymphoma using antilogous antigen-pulsed dendritic cells.NatMed 1996;2:52-58]。
2).肿瘤抗原基因转染的抗原提呈细胞作为瘤苗。因为抗原提呈细胞转染了肿瘤抗原基因,可以省去抗原直接刺激的操作[Gong J,Chen L,Chen D et al.Induction of antigen-specific antitumor immunity with adenovirus-transduceddendritic cells.Gene Ther 1997;4:1023-1028]。
3).白血病细胞衍生的树突状细胞瘤苗。慢性粒细胞白血病细胞和急性早幼粒白血病细胞分别表达BCR-ABL和pml/RARα融合蛋白抗原,白血病细胞经过GM-CSF、IL-4和TNFa培养后可以分化成为携带白血病抗原的树突状细胞,以此细胞作为瘤苗可以用于肿瘤的免疫治疗中[Choudhury A,Gajewski JL,Liang JC,et al.Use of leukemic dendritic cells for the generation of antileukemic cellularcytotoxicity against Philadelphia chromosome-positive chronic myelogenous leukemia.Blood 1997;89:1133-1142 Nieda M,Nicol A,Kikuchi A,et al.Dendritic cellsstimulate the expansion of bcr-abl specific CD8+T cells with cytotoxic activityagainst leukemic cells from patients with chronic myeloid leukemia.Blood1998;91:977-983]。
中药是中华民族的一大宝库,是中国人民几千年与疾病斗争中获得的巨大资产,随着科学技术的进步,人们对中药的认识越来越深刻,越来越科学。其中牛黄在我国应用已有二千年的历史,早在《神宵本草径》中就视为上品,是著名中草药如安宫牛黄丸,牛黄清心丸……等的主要原料。牛黄为牛胆囊、胆管或肝管中的结石,具有清心、化痰、开窍、镇痛息风、解毒等功能。主治:热病头痛,中风痰迷,惊痫抽搐,癫痫发狂,咽喉肿痛等症,牛黄是一种稀珍而贵重的中药材,比黄金更为昂贵,李时珍在《本草纲目》中记载:牛黄″能安魂定魄,辟邪魅,卒中恶。″″凡中风入脏者,风中腑及血脉者必用之。″牛黄能″入骨髓,透肌肤,以引风出″,″还能治心及肝胆之病″。″久服轻身延年,令人不忘″。《神农本草经》就记述过″牛黄是百草之精华,为世神物,诸药莫及。″可见对牛黄的神奇药用功效的发现可以追溯到夏商远古。牛黄即牛的干燥胆结石。天然牛黄的产量极小,其价格也颇为昂贵,于宰牛时如发现牛黄,应立即滤去胆汁,取出牛黄。除净外部薄膜,先裹以灯芯草或通草丝,外面再包以白布或毛边纸,置阴凉处阴干。取自胆囊的习称″蛋黄″;取自胆管及肝管的习称″管黄″。我们平时所说的牛黄是按牛黄的已知成份,用猪、牛、羊的苦胆提取的胆红素、胆酸加淀粉配制而成的,即人工合成牛黄。
蛇胆历来被认为是中医中的上品,具有强大的抗炎症作用,被用来止咳、抗炎等。如蛇胆川贝液就是典型的利用蛇胆的中药。
目前在佐剂研究领域,还只有氢氧化铝可以用于人体,其他是佐剂例如弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂等因具有明显的毒性,因此不能用于人体,而细胞因子类的佐剂例如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子,白细胞介素12等可以作为佐剂使用,但他们本身有更加重要的生物学活性,如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子可以刺激机体粒细胞和巨噬细胞的大量产生,因此,目前特别缺乏安全有效的佐剂。另一方面,佐剂又是目前各种疫苗,肿瘤主动免疫治疗和感染免疫治疗所急需的辅助成分,从中药中寻求安全有效的佐剂无疑具有极其重要的意义,既解决了佐剂研究和需要的困难,同时促进了中药现代化,科学化的进程,同时为了解中药的治病机理提供了依据。
因此,本领域迫切需要开发新型的疫苗,尤其是可用于人体的安全有效的佐剂。
本发明的目的就是提供一种可用于人体的安全有效的佐剂及其制备方法。
在本发明的第一方面,提供了一种佐剂,它是以动物的胆囊、胆汁、胆石、或人造胆石或者其混合物为原料制备的提取物,
该提取物不含分子量大于10KD的蛋白质,但含有小分子的多肽和氨基酸,并且在紫外扫描图谱中在215nm处和280nm具有明显的吸收峰。
较佳地,所述提取物原液用Pierce/硫酸铜试剂盒测定多肽和氨基酸的浓度在300-3000ug/ml。
在本发明的第二方面,提供了一种制备佐剂的方法,其特征在于,包括步骤:
(1)将粉碎的、粉末状的或液体的原料与醇溶剂在60-90℃(较佳地75-85℃)下混合,其中原料选自下组:动物的胆囊、胆汁、胆石、或人造胆石或者其组合,使混合物中醇溶剂终浓度为10-80%(较佳地20-70%),并放置12小时-14天(较佳地1-7天);
(2)对步骤(1)中所述混合物进行离心,去除固体残渣,并获得上清液;
(3)对步骤(2)中所述的上清液进行脱色、脱脂处理,经萃取回收水相;
(4)从步骤(3)中的所述水相去除有毒溶剂成分,从而获得作为佐剂的提取物。
较佳地,该方法还包括步骤:
(5)在提取物中加入缓冲液。
在一优选例中,所述的醇溶剂选自:乙二醇、乙醇、丙三醇、或其组合。
在本发明的第三方面,提供了本发明佐剂的用途,它被用于制造用于治疗病毒感染、病毒性感冒、免疫缺陷性疾病、肿瘤的药物。
在本发明的第四方面,提供了含有一种药物组合物,它包括本发明提取物和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
图1是对原料和提取物的SDS-PAGE电泳图。各泳道是1:分子量标准;2:羊胆囊、胆汁,离心前(1∶1);3;牛胆汁,离心前(1∶1);4:羊胆囊、胆汁,离心前(1∶2稀释);5:牛胆汁,离心前(1∶2稀释);6:实施例1的提取物;7:实施例2的提取物;8:实施例3的提取物(牛胆汁);9:实施例3的提取物(羊胆汁)。
图2是实施例1提取物的紫外扫描图谱。
图3是实施例2提取物的紫外扫描图谱。
图4是实施例3提取物的紫外扫描图谱。
本发明人经过广泛而深入的研究,从动物中药中寻求到一种安全有效的佐剂,可用于各种疫苗预防、肿瘤或病毒感染的治疗或者辅助治疗等。不仅解决了佐剂研究和需要的困难,同时促进了中药现代化,科学化的进程,并为了解中药的治病机理提供了依据。
本发明佐剂的原料可以来源于任何动物,例如羊、蛇、马、猪、牛、狗等。可以是动物的新鲜胆囊,胆汁,胆石或其混合物, 也可以是经过粗制的、晒干的胆囊,胆汁粉,人造胆石(如人工牛黄)或其混合物。
如本文所用,“提取物”指对上述原料经与醇溶剂混合、离心除去固体残渣,并经脱色、脱脂处理后的物质。其主要成分是多肽、氨基酸、糖类和少量无机盐。
在本发明的另一方面,提供了一种制备本发明佐剂的方法。该方法通常是:对于上述原料,全部匀浆或打磨粉碎,加入适量的水,然后加入终浓度10%-80%(较佳地20-70%)的醇溶剂(如乙二醇、乙醇、丙三醇或其组合),充分混合,离心收集上清液,弃沉淀。 然后加入脱色剂脱色。同时可减压回收醇以便重复利用。向水相加入脱脂溶剂(例如乙醚、乙酸乙脂、三氯甲烷或其他的非极性溶剂)进行脱脂处理,经过萃取后收集水相。如果需要,可进一步纯化,例如除去有毒的溶剂。为了便于保存,还可在在提取物中加入缓冲液,例如PBS缓冲液。
对提取物进行的理化性质分析表明,提取物的主要成分是多肽,不含分子量大于10KD的蛋白质,但含有小分子的多肽和氨基酸。此外,紫外扫描图谱中在215nm处和280nm具有明显的吸收峰。
此外,对于提取物原液用Pierce/硫酸铜试剂盒测定多肽和氨基酸的浓度通常在300-3000ug/ml。
对于获得的提取物,进一步用常规方法与药学上可接受的辅料或载体混合后,就制备成为口含片或注射剂等各种剂型。
在一优选例中,因为本发明的提取物,内含多肽,多糖等生物活性物质,所以可以制成口含片(如舌下含片),充分激活口腔局部粘膜的免疫组织,进而激活机体免疫系统,发挥抗病毒和抗肿瘤活性。
对于给药途径,没有特别限制,例如皮下、肌肉、静脉注射(对于注射剂)、或局部给药、口腔给药等。
本发明的提取物不仅可以理解为增加抗原作用的佐剂,更广义地也可以理解为生物治疗制剂或生物应答修饰剂,它具有以下应用:
(1)用于乙型肝炎、丙型肝炎等病毒性感染及肿瘤的治疗或防止复发的生物治疗佐剂。
(2)用于病毒如各种肝炎病毒感染、病毒性感冒的的单一疗法或者辅助治疗或预防。
(3)用来治疗免疫缺陷性疾病,增强免疫力。
(4)用于治疗各种肿瘤,特别是恶性肿瘤,治疗肿瘤可以作为单一疗法,也可以与放疗、化疗、生物治疗联合应用。
(5)在生物治疗中,作为各种瘤苗的佐剂,增强抗肿瘤作用,诱导特异性和非特异性的抗肿瘤免疫力。
(6)作为各种疫苗,菌苗的佐剂,增加免疫力的诱导。
下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明。
实施例1
新鲜的胆囊,先用绞肉机和组织匀浆器将胆囊打碎,加入终浓度20%-70%的、乙二醇、乙醇、丙三醇等,在温度摄氏80度以下充分混合,然后放置1-7天,然后将胆汁与醇的混合液充分混合震荡,离心15000转/分,0.5-3小时,温度4-25℃,收集上清液,弃沉淀。然后加入脱色剂脱色,减压回收醇,水相加入0.5-2倍体积的乙醚、乙酸乙脂、三氯甲烷活其他的非极性溶剂进行脱脂处理,经过萃取后收集水相,进一步除去有毒性的溶剂成分,加入缓冲液得到提取物。
对所述提取物进行紫外扫描,图谱如图2所示,在215nm处和280nm具有明显的吸收峰。
实施例2
胆结石如牛黄、晒干的胆囊,胆汁粉,先磨成粉状,加水,加入终浓度20%-70%的乙二醇、乙醇、丙三醇等,在温度70度以下充分混合,然后放置1-7天,然后将胆汁与醇的混合液充分混合震荡,离心20,000转/分,2-5小时,温度25℃,收集上清液,弃沉淀。 然后加入脱色剂脱色,减压回收醇,水相加入0.5-2倍体积的乙醚、乙酸乙脂、三氯甲烷活其他的非极性溶剂进行脱脂处理,经过萃取后收集水相,进一步除去有毒性的溶剂成分,加入缓冲液得到提取物。
对所述提取物进行紫外扫描,图谱如图3所示,在215nm处和280nm具有明显的吸收峰。
实施例3
新鲜的羊、马、蛇或牛胆汁,可以直接加入终浓度30%-60%的乙二醇、乙醇、丙三醇等,在温度82度以下充分混合,然后放置1-7天,然后将胆汁与醇的混合液充分混合震荡,离心12000转/分,0.5-3小时,温度4-25℃,收集上清液,弃沉淀。 然后加入脱色剂脱色,减压回收醇,水相加入0.5-2倍体积的乙醚、乙酸乙脂、三氯甲烷活其他的非极性溶剂进行脱脂处理,经过萃取后收集水相,加入缓冲液得到提取物。
对所述提取物进行紫外扫描,图谱如图4所示,在215nm处和280nm具有明显的吸收峰。
实施例4
口含片的制备
口含片制备方法有多种:可以采用将有效成分先冻干后与空白颗粒混合的方法,先将有效成分与甘露醇(上海长征制药厂)混合后冻干,将糊精、硬脂酸镁、淀粉(上海亚东药业公司)按一定的比例混合,制成空白颗粒,于50-80℃烘箱中烘干,采用倍比混合方法与有效成分冻干粉充分混合后直接压片。另一种方法是将甘露醇、白蛋白、糊精、硬脂酸镁、淀粉等按一定的比例混合,制成空白颗粒,于50-80℃烘箱中烘干,然后将液态有效成分以喷雾方式混入(喷雾机器为德国克利安公司产品),烘干后压片(压片机为德国克利安公司产品)。也可以采用其他的方法例如用提取物作为溶剂制备颗粒,烘干压片,可以将提取物加热浓缩,然后进行下一步的处理。
实施例5
按下列配方制备一种本发明的提取物含片:
羊胆囊提取物 500ml
甘露醇 100g
淀粉 400g
硬脂酸镁 100g
糊精 100g
共制成1000片
此含片每天三次,每次一片,舌下含服,可用于治疗慢性乙肝、丙肝等病毒感染,恶性肿瘤的辅助治疗。
实施例6
按下列配方,制备本发明的注射液:
猪、牛或羊胆汁提取物原液 30-70%
甘露醇 1%
SDS 0.01%
磷酸缓冲液(pH7.0) 50mM
注射用水配制到2000ml,分装成2ml/支,皮下注射,可用于治疗慢性乙肝、丙肝等病毒感染,恶性肿瘤的辅助治疗。
实施例7
按下列配方,制备本发明的注射液:
牛胆汁提取物原液 30-70%
磷酸盐缓冲液(pH7.0) 50mM
注射用水配制到,分装成5ml/支,皮下注射,可用于治疗慢性乙肝、丙肝等病毒感染,恶性肿瘤的辅助治疗。
实施例7
对利用羊胆囊,胆汁混合物为原料制备的提取物,进行质量检测。质量检测结果如下:
OD600:0.01
pH值:7.4
茚三铜鉴别试验:阳性
多肽与氨基酸含量:Pierce/CuSO4法测定,1546ug/ml。
无菌试验:阴性(中国生物制品规程2000版)
内毒素:0.2EU(中国药典2000版)
热原性:合格(中国药典2000版)
安全试验:合格(中国生物制品规程2000版)
毒力试验:合格(中国生物制品规程2000版)
澄明度:合格(中国药典2000版)
实施例8
安全试验
1.小鼠急性毒性试验
方法及材料:用体重18-20克的小白鼠,分组:尾静脉给药组、肌肉给药组及静脉、肌肉阴性对照组各20只,每组雌雄各半,每只肌肉注射羊胆汁粉提取物0.5ml(多肽800ug)或生理盐水0.5ml,在给药后连续观察7天,所有存活动物在观察期结束后用脱颈椎法处死,进行解剖检查。
试验结果:给药后动物反应未见异常,在观察期间未见死亡,小鼠被毛浓密而有光泽,食量和粪便均正常、动物精神状况良好,活动自如、未出现毒性反应,解剖后主要脏器未见异常变化。给小鼠以最大浓度最大容量提取物,7天中动物无一死亡,小鼠尾静脉注射、肌肉提取物的LD50均大于25ml/kg。相当于推荐临床剂量的250倍(临床推荐剂量为0.1ml/kg)。
2.豚鼠安全实验
用体重300-400克的豚鼠2只,每只腹侧皮下注射猪胆汁与胆囊提取物0.5ml(多肽800ug),观察7天,动物健存,每只体重增加,故豚鼠试验合格
实施例9
体内抗肿瘤疗效
试验动物:C57BL/6及ICR小鼠(中英合资上海西普尔-必凯(SIPPR-BK)试验动物有限公司),性别:雌性,体重:18-22g
试验方法:ICR小鼠右后腿外侧按每只2×105/0.1ml接种处于对数生长期的S180肉瘤细胞。C57BL/6小鼠右后腿外侧按每只2×105/0.1ml接种处于对数生长期的B16F10黑色素瘤细胞。荷瘤后24小时将小鼠随机分为6组,每组10只,分别注射生理盐水、注射用环磷酰胺100mg/kg、猪胆囊与胆汁提取物0.1/kg,0.3ml/kg,1ml/kg。除环磷酰胺为单次冲击量治疗外,其余4组治疗连续10天,每天一次。给药途径为肌肉注射,给药体积为0.1ml(用生理盐水配制)。试验前测定小鼠体重,荷瘤后14天处死小鼠,测体重及其瘤重。
实验结果:
1、提取物对小鼠肉瘤B16生长的体内抑制作用
分组 | 试验前体重(g) | 试验后体重(g) | 瘤重(g) | 抑瘤率(%) |
生理盐水对照组 | 19.2±1.2 | 21.9±1.3 | 1.29±0.21 | |
环磷酰胺(100mg/kg) | 19.9±1.9 | 17.3±0.4 | 0.38±0.25 | 70.5 |
提取物0.1ml/kg | 19.1±1.3 | 22.3±2.2 | 0.82±0.23*** | 36.4 |
提取物0.5ml/kg | 20.2±1.4 | 22.5±1.6 | 0.61±0.27*** | 52.7 |
提取物2.5ml/kg | 19.9±0.3 | 21.8±0.4 | 0.43±0.21*** | 66.7 |
***与生理盐水对照组比较P<0.01
2、提取物对小鼠肉瘤S180生长的体内抑制作用
分组 | 试验前体重(g) | 试验后体重(g) | 瘤重(g) | 抑瘤率(%) |
生理盐水对照组 | 20.4±1.2 | 21.8±1.9 | 1.38±0.46 | |
环磷酰胺(100mg/kg) | 19.5±1.3 | 16.5±0.8 | 0.41±0.17*** | 70.3 |
提取物0.1ml/kg | 18.6±1.1 | 21.3±1.8 | 0.68±0.35*** | 51.3 |
提取物0.5ml/kg | 19.7±1.8 | 22.3±1.9 | 0.50±0.23*** | 63.7 |
提取物2.5ml/kg | 20.3±0.7 | 21.0±0.7 | 0.42±0.18*** | 69.6 |
***与生理盐水对照组比较P<0.01
实施例10
提取物对数突状细胞和巨噬细胞的激活作用
树突状细胞(dendritic cells,DC)是已知的机体内功能最强的抗原提呈细胞,APC),DC是目前发现的唯一一种能直接激活初始型T细胞
的抗原提呈细胞。DC在激活、启动机体免疫应答尤其是细胞免疫应答反应中起重要作用。近年来,以DC为基础的肿瘤特异性免疫治疗在恶性肿瘤的临床试用中取得了明显的疗效,但是其抗肿瘤疗效,特别是在免疫功能低下的肿瘤患者体内的抗肿瘤疗效仍然受到限制,我们经过研究发现,从动物胆囊来源的提取物在体外可以明显的刺激DC产生细胞因子IL-12和肿瘤坏死因子a(TNF-a)
材料与方法:C57BL/6小鼠,6-8周龄,无菌条件下处死,制备脾细胞悬液,加入0.83%的NH4Cl溶解红细胞,按照常规方法加入IL-4和GM-CSF培养DC,DC培养至第8天,收集细胞,离心,计数,配成50万/ml,然后加入含有新鲜IL-4和GM-CSF的等体积RPMI-1640培养基,按照每孔200ul加至96孔培养板,然后加入不同稀释度的牛胆汁提取物溶液或者/和LPS,48小时后收集上清,用ELISA(Endogen公司,美国)的IL-12(p70)和TNF-a检测试剂盒测定IL-12和TNF-a的含量。
实验结果:提取物对树突状细胞产生IL-12的刺激作用
组别 | 稀释度 | IL-12(P70)产生pg/ml | IL-12(P70)产生pg/ml(与LPS 10ug/ml联合诱导) |
培养基对照 | 0 | 15.3±1.9 | |
提取物 | 1∶320 | 2.1±0.3 | 14.6±2.5 |
1∶160 | 6.9±0.7 | 15.9±2.5 | |
1∶80 | 8.6±0.9 | 16.0±2.3 | |
1∶40 | 10.3±0.6 | 24.2±3.2 | |
LPS 10ug/ml | 15.3±1.9 |
提取物对树突状细胞产生TNF-a的刺激作用
组别 | 稀释度 | TNF pg/ml | TNF pg/ml产生(与LPS 10ug/ml联合诱导) |
培养基对照 | 0 | 372±53 | |
提取物 | 1∶320 | 18±6 | 510±66 |
1∶160 | 56±4 | 653±89 | |
1∶80 | 87±11 | 887±68 | |
1∶40 | 113±24 | 1023±201 | |
LPS 10ug/ml | 372±53 |
提取物对巨噬细胞产生TNF-a的刺激作用
组别 | 稀释度 | TNF产生pg/ml | TNF产生pg/ml(与LPS 10ug/ml联合诱导) |
培养基对照 | 0 | 112±32 | |
提取物 | 1∶320 | 12±7 | 134±23 |
1∶160 | 28±11 | 102±9 | |
1∶80 | 40±5 | 156±32 | |
1∶40 | 53±6 | 201±135 | |
LPS 10ug/ml | 112±32 |
实施例11
提取物体外抑制肿瘤的生长。
处于对数生长期的小鼠黑色素瘤细胞B16,人胚肾细胞293,配成10万/ml,按照每孔100ul加入至96孔板中,每孔1万个细胞,同时加入含有不同浓度的提取物,培养72小时,加入MTT(Fluka公司,法国),继续培养6小时,取出96孔培养板,弃上清,保留紫色沉淀,然后每孔加入二甲基亚砜100ul,等沉淀全部溶解后用紫外分光光度计于570nm处检测吸收度。
组别 | 稀释度 | B16 | 生长抑制率% | 有无细胞毒作用 |
培养基对照 | 1.88±0.15 | |||
提取物 | 1∶128 | 1.79±0.33 | 0.48% | 无 |
1∶64 | 1.89±0.25 | 0 | 无 | |
1∶32 | 1.25±0.11 | 33.5% | 无 | |
1∶16 | 0.26±0.02 | 86.2% | 无 | |
1∶8 | 0.14±0.01 | 一定的细胞毒作用 | ||
1∶4 | 0.13±0.01 | 一定的细胞毒作用 | ||
1∶2 | 0.12±0.01 | 一定的细胞毒作用 |
实施例12
提取物的理化性质
SDS-PAGE凝胶分析实施例1-3中的提取物的蛋白质成分,浓缩胶用5%,分离胶用20%,利用Bio-Rad公司的MINI-PROTEIN II电泳仪,上样30ul,200伏电压电泳1小时,结果如图1所示,原始胆囊、胆汁中含有大量的分子量在14左右的蛋白质,而提取物中没有分子量大于10KD的蛋白质,但提取物中含有小分子的多肽和氨基酸。
提取物原液用Pierce/硫酸铜试剂盒(PIERCE公司,法国)测定多肽和氨基酸的浓度在200-5000ug/ml,连续3批的多肽和氨基酸浓度测定结果为,1837ug/ml,1220ug/ml,2189ug/ml。
Claims (10)
1 一种佐剂,其特征在于,它是以动物的胆囊、胆石、或人造胆石或者其混合物为原料制备的提取物,该提取物不含分子量大于10KD的蛋白质,但含有小分子的多肽和氨基酸,并且在紫外扫描图谱中在215nm处和280nm具有明显的吸收峰,并且所述的提取物在体外刺激树突状细胞产生细胞因子IL-12和肿瘤坏死因子a。
2.如权利要求1所述的佐剂,其特征在于,提取物原液用Pierce/硫酸铜试剂盒测定多肽和氨基酸的浓度在300-3000ug/ml。
3如权利要求1所述的佐剂,其特征在于,所述的动物选自:羊、蛇、马、猪、牛、狗。
4如权利要求1所述的佐剂,其特征在于,原料选自下组:动物的新鲜胆囊、胆石或其混合物。
5如权利要求1所述的佐剂,其特征在于,原料选自下组:粗制的、晒干的胆囊,人造胆石。
6.如权利要求1所述的佐剂,其特征在于,它具有选自下组的形式:口含片、注射剂。
7.一种制备佐剂的方法,其特征在于,包括步骤:
(1)将粉碎的、粉末状的或液体的原料与醇溶剂在60-90℃下混合,其中原料选自下组:动物的胆囊、胆汁、胆石、或人造胆石或者其组合,使混合物中醇溶剂终浓度为10-80%,并放置12小时-14天;
(2)对步骤(1)中所述混合物进行离心,去除固体残渣,并获得上清液;
(3)对步骤(2)中所述的上清液进行脱色、脱脂处理,经萃取回收水相;
(4)从步骤(3)中的所述水相去除有毒溶剂成分,从而获得作为佐剂的提取物。
8.如权利要求7所述的方法,其特征在于,还包括步骤:
(5)在提取物中加入缓冲液。
9.如权利要求7所述的方法,其特征在于,所述的醇溶剂选自:乙二醇、乙醇、丙三醇、或其组合。
10.如权利要求1所述佐剂的用途,其特征在于,它被用于制造用于治疗病毒感染、病毒性感冒、免疫缺陷性疾病、肿瘤的药物。
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