CN1193767C - 神经节苷脂和灯盏花提取物组成的药物和保健品及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种神经节苷脂和灯盏花提取物组成的药物和保健品及其在治疗和预防老年性痴呆、治疗和预防脑梗塞的应用。由毒理试验以及与其单一成分多种功效比较的动物和临床试验证明：神经节苷脂和灯盏花提取物制成的药物和保健品，具有协同增效作用，比其任何单一成分的具有更明显的延缓衰老、增强学习记忆的功能，对急性低压缺血引起的缺氧性脑损伤有一定的早期防治作用，对治疗和预防老年性痴呆有十分明显的功效，对防治脑梗塞等缺血性脑血管病功效上更为显著。

Description

神经节苷脂和灯盏花提取物组成的药物和保健品及其应用

技术领域

本发明涉及一种治疗神经系统疾病的药物和保健品，具体地说涉及神经节苷脂(英文名称Ganglioside)和灯盏花提取物灯盏花素(英文名：Breviscapini)的复方药物和保健品。

背景技术

神经节苷脂是一种含唾液酸的糖鞘脂，主要存在于哺乳动物脑灰质，是中枢神经系统某些神经元膜的特征性脂成分，其理化性质如下：

神经节苷脂分子由一个亲水基团(唾液酸低聚糖)和一个亲脂基团(酰基鞘氨醇)组成。亲脂性基团嵌入神经细胞膜的双脂质层，亲水性基团突出于细胞外液，有助于最大程度上维持细胞表面负电荷。这种物理上的不对称性和化学结构，使神经节苷脂类物质与细胞外各种信息相互作用，并能导致部分细胞膜结构的改变。所以，目前认为细胞膜上的神经节苷脂类物质的变化对调节神经元和细胞内外信息传递有重要意义。

在体内主要有，单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM₁)、一唾液酸四己糖神经节苷脂(GD_1a)、二唾液酸四己糖神经节苷脂(GD_1b)、三唾液酸四己糖神经节苷脂(GT_1b)以及GM₃、GD₃、GQ_1b等形式。熔点：190℃；溶解度：易溶解于水、乙醇。

神经节苷脂的生理学功能有：1.经离体神经细胞培养和外科神经去势的动物模型证实，外源性神经节苷脂与细胞膜结合后能增加神经生长因子的功能，促进神经生长，加速神经支配功能的恢复。增加感觉神经、交感神经和中枢胆碱能神经元轴索生长的营养作用；2.经在体动物实验，发现神经节苷脂促进神经生长，加速受损神经恢复；3.离体和在体实验均显示，外源神经节苷脂能平稳进入细胞膜，同时激活细胞膜上的钠-钾-ATP酶的活性，该酶的活化是信息传递的基础；4.动物实验显示，神经节苷脂具有周围神经镇痛作用。

神经节苷脂的临床药用价值有：1.由于各种原因引起的中枢神经系统结构损伤的功能恢复；2.对脑血管意外及创伤后的中枢神经系统后遗症有治疗作用；3.对缺血性和出血性的脑病变有治疗作用。

目前已有成熟的从动物组织中提取神经节苷脂的技术和进一步分离纯化的技术，其中的GM₁作为药品已有市售产品，其商品名为：施捷因，单唾液酸四已糖神经节苷脂钠盐注射液，进口注册证号x19990444，x19990445，生产商：阿根廷TRB药厂trb pharma s.a.；专利申请号93112578报道了一种含神经节苷脂为主的脑保健品，中国专利95111569公开了一种含神经节苷脂为主的糖脂类物质的生产方法。

灯盏花(又称灯盏细辛)菊科短葶飞蓬属植物(Erigron(vaniot)breviscapus HandMazz)，具有散寒解表、舒络止痛、活血治瘫之功效。其提取物灯盏花素(Breviscapini)中主要有效成分有总黄酮和灯盏乙素(Scutellarin)等，化学名为4′、5、6-三羟基黄铜-7-O-葡萄糖醛酸甙；分子式C₁₂H₁₈O₁₂，分子量为462.21，结构式如下：

灯盏花主要药理作用如下：

抗血栓形成作用：能抑制机体凝血功能；促进纤溶活性；减少血小板数及抑制血小板聚集功能。

对脑血管的作用：灯盏花素对脑血管有选择地产生扩张作用，在维持脑动脉血压的状态下显著增加脑血流量(血流量增加13％)。

对微循环障碍的作用：灯盏花素对家兔大脑、豚鼠软脑膜、大鼠脑膜的微循环障碍均具有较好的防治作用。

对心血管的作用：用灯盏花素给小鼠灌胃后测定其心肌流量，发现血流量明显增加，并与剂量呈相关关系。

抗缺氧作用：灯盏花素能增强小鼠常压耐缺氧作用，减少心肌耗氧量，并对心肌细胞膜有良好的保护作用。

很多专利公开了以灯盏花提取物为主要原料或添加剂制成的中药药品或保健品及其制备技术。如：《一种灯盏花乙素速溶片的制备方法》申请号：99122243；《灯盏花素软胶囊及其生产方法》申请号：98106599；《灯盏花大输液系列制剂》申请号：97101663；《灯盏花口服液及其制备方法》申请号：95115130；《注射用灯盏花素冻干粉剂及制备工艺》申请号：95104038；《复方三七制剂》申请号：95101731；《灯盏花注射液》申请号：93104701；《灯盏花片剂原料药的提取工艺》申请号：90100451等。

上述专利和文献所披露的分别以神经节苷脂和灯盏花提取物为主要成分的药物和保健品均忽略了这两种成分联用后，在各自用量减少的情况下，呈现的相辅相依的协同作用，其功效未能充分发挥。因此提供一种能够发挥协同效应的神经节苷脂和灯盏花提取物的组合物是十分必要的。

发明内容

本发明需要解决的技术问题之一是提供一种含神经节苷脂和灯盏花提取物配制的药物和保健品，以克服现有技术作用单一的缺陷，使其功效比其任何单一成分的保健品，具有更显著的抗衰老和增强学习和记忆功能；

本发明需要解决的技术问题之二是公开上述的药物和保健品在制备预防和治疗脑缺氧缺血引起的神经元调亡所致的脑损伤药物中的应用；

本发明需要解决的技术问题之三是公开上述的药物和保健品在制备治疗和预防老年痴呆药物中的应用；

本发明需要解决的技术问题之四是公开上述的药物和保健品在制备泊疗和预防脑梗塞药物中的应用。

神经系统包括中枢神经系统(脑和脊髓)和周围神经系统(脑神经、脊神经和植物神经)。人体各系统及其功能均受神经系统影响和支配，因此神经系统是人体最重要的系统。神经系统疾病是指脑、脊髓、周围神经及骨骼肌由于感染、血管病变、外伤、肿瘤、中毒、免疫障碍、变性、遗传、营养缺陷、代谢障碍等原因引起的疾病。

临床最常见的症状和疾病有：由于脑供血不足引起的注意力和短期记忆力下降、疲劳、头晕、耳鸣等；由于脑血管系统病损引起的缺血性脑血管病(Ischeniccerebrovascular diease，ICVD)，常见有脑动脉硬化症、脑血栓(Cerebral thrombosis)形成和脑栓塞(Cerebral embolism)；由于神经细胞进行性退化、变性引起的Parkinson病(PD，帕金森综合症)和老年痴呆症；由于疾病、外伤或中毒引起的诸如糖尿病性周围神经炎、癫痫、脑中风、脑部麻痹和小儿脑水肿等。

脑血管疾病是人群的重要的致死因素之一，其中缺血性脑疾病约占56％～80％，随着人口增加和老龄化程度加重，老年痴呆症的发病也呈上升趋势。因而对脑缺血疾病和老年痴呆进行有效的脑保护(在发生脑损伤前采取保护性措施)和脑复苏(指脑受缺血缺氧性损伤后，减轻中枢神经功能障碍的措施)有着非常重要的意义。在临床上和人们的日常生活中急需一种有防治功效且可长期应用、副作用小的药物或保健品。本发明配方中的神经节苷脂和灯盏花提取物具有协同作用，一方面，灯盏花提取物性味温辛，具有活血化瘀、解表止痛、散寒除湿及消积解毒等功效。能促进侧枝循环、并能扩张脑血管、增加脑血流量、降低血液粘度、改善微循环障碍，使外源性神经节苷脂更易于细胞膜结合，从而增加神经生长因子的功能；另一方面，外源神经节苷脂可激活细胞膜上的钠-钾-ATP酶的活性(该酶的活化是信息传递的基础)，灯盏花提取物可抑制蛋白激酶C(该物质如果被激活，可使神经元的调亡增加)，这两种功效相互协同可防治脑部在缺血时导致的神经元的调亡；此外，有报道灯盏花制剂在治疗剂量使用过程中已产生过敏和快速房颤等不良反应(中国医院药学杂志，1997V17N7 330和药物流行病杂志，2001V10N1 49)，一些有出血倾向或脑出血急性期患者被列为禁用范围。神经节苷脂作为生化提取物质其制备工艺和技术难度大、成本高。将这两种物质配伍后可减少二者剂量，可明显提高疗效以减轻毒副作用同时扩大适用范围。

本发明的药物和保健品的组分和重量百分含量以神经节苷脂和灯盏花提取物的总量计为：

                 神经节苷脂                    2～20％

                 灯盏花提取物                  80～98％。

优选的含量为：

                 神经节苷脂                    2～8％

                 灯盏花提取物                  92～98％。

较优选的含量为：

                 神经节苷脂                    8.5～15％

                 灯盏花提取物                  95～91.5％。

较优选的含量为：

                 神经节苷脂                    15.5～20％

                 灯盏花提取物                  80～84.5％。

最优选的含量为：

                 神经节苷脂                    2～5％

                 灯盏花提取物                  95～98％。

上述配比中不含添加剂，在实际使用时可添加食品或药品制剂上可以接受的任何载体，如淀粉、蒸馏水和注射用5％或10％的葡萄糖注射液稀释液等，采用公知的方法制备成任何一种保健食品和药剂学上的剂型，如口服液、胶囊和注射剂等。

上述的神经节苷脂可采用专利：《一种分离纯化制备神经节脂工艺》申请号：85102590，公开的技术进行制备，或采用市售产品，如宝智生物制品有限公司生产的规格为10公斤的型号为Y/G2001-5的神经节苷脂粗产品，经纯化后使用；

上述的灯盏花提取物可采用文献：《灯展花素注射液生产处方及工艺的确定》(钟桂芳，黑龙江医药1999V12N1 6-7)报道的技术进行制备，或采用市售产品，如昆明雅阁臣药业有限公司，产品执行标准为：滇Q/Ws696-1985。

为了更好地理解本发明的实质，以下将用该保健品的配制、食品安全性毒理试验、不同配比的功效试验以及与其单一成分的多种功效临床比较试验及结果来说明本发明的内容。

本发明采用的神经节苷脂是由宝智生物制品有限公司提供粗产品，并采用下述的纯化方法得到高纯度的神经节苷脂。具体工艺如下：

粗产品用2倍量的含氯化钾的68％乙醇溶解(氯化钾含量为2克/公斤粗产品)，作为上柱液；

柱层析：(1)树脂的处理：将经过碱乙醇和酸乙醇处理过的树脂，用水洗至中性，再以68％的乙醇溶胀后待用。树脂用量，1100～1200ml树脂/Kg粗产品。(2)柱吸附：将制备好的上柱液用4N盐酸酸化至pH2～2.5上柱；吸附柱尺寸：2.7cm×9cm，流速：50ml柱体积流速为80ml/h。(3)淋洗：用68％的乙醇洗去未被吸附的杂质；流速和温度与吸附条件相同。(4)洗脱：经过淋洗后的吸附柱再以1.5～1.8倍柱体积的石油醚和食用乙醇混合液(1/5，体积比)洗脱。洗脱速度是吸附速度的0.62(如：吸附速度是80ml/h，洗脱速度为50ml/h)；收集洗脱液，进行浓缩和干燥，收集的洗脱液在低于60℃温度下减压浓缩去除有机溶剂。根据需要将减压浓缩后的产品进行冷冻干燥。

本发明采用的灯盏花提取物购自昆明雅阁臣药业有限公司，产品规格Q/Ws696。

采用常规方法将上述两种原料配比制成混悬口服液、胶囊剂和混悬注射剂，其中混悬口服液型其中含神经节苷脂5mg/10ml/支，灯盏花提取物20mg/10ml/支；胶囊剂型神经节苷脂含量5mg/囊，灯盏花提取物含量20mg/囊；混悬注射剂中含神经节苷脂5mg/10ml/支，灯盏花提取物10mg/10ml/支。

实验和临床结果分述如下；

一、动物实验

一)食品安全性毒理实验

40只22月龄雄性Wistar大鼠(军事医学科学院动物中心提供)，体重(455±30)g，平均分成4组，按90ml/kg(其中神经节苷脂约含24.8mg，灯盏花提取物约含99mg)、60ml/kg(神经节苷脂约含13.65mg，灯盏花提取物约含54.6mg)、30ml/kg(神经节苷脂约含6.8mg，灯盏花提取物约含27.3mg)口服液剂型分三组，连续喂养60天。

结果：服用该成分口服液组大鼠无死亡，另一组用蒸馏水作对照；比较各组体重情况、血液学和生化检测、脏器重量和组织学检查均正常，结果显示服用组与对照组无显著差异。脏器组织学病理切片检查由上海第二医科大学病理教研组完成。

上述结果说明，含神经节苷脂和灯盏花叶提取物的保健食品无毒性，临床服用安全。

二)与单一成分在延缓衰老、增强学习和记忆功效方面的比较

1.材料

1)实验动物

衰老模型小鼠60只，采用ICR品系小鼠，雌雄各半，体重为20±2g；用于改善学习和记忆的大白鼠60只，体重272±62克。均由中国医科院动物繁殖中心提供。

2)验试剂及药物：

D-半乳糖，由上海试剂二厂生产；本发明的药物：含神经节苷脂5mg和灯盏花提取物20mg/10ml；神经节苷脂口服液：含神经节苷脂10mg/10ml；灯盏花提取物口服液：含灯盏花提取物30mg/10ml；

2.方法与给药剂量

1)衰老模型小鼠的制备

D-半乳糖用0.9％生理盐水稀释成10mg/ml浓度，然后按每天每公斤体重80mg剂量，给小鼠颈部皮下注射，连续1个月。

2)实验分组和给药剂量

随机分为正常对照组(8只)、模型组(13只)、不同配方预防实验组各3组(分别13只)，共5组。正常对照组给小鼠每天颈部皮下注射0.9％生理盐水0.2ml，连续1个月。模型组造模方法同前。预防实验组从造模之日开始灌药，直至造模时间结束。分别用本配方1支/天；神经节苷脂口服液2支/天；灯盏花提取物口服液2支/天连续服用30天，对照组以蒸馏水代替。测定血清中超氧化物歧化酶(SOD)活力和血清过氧化脂质(LPO)含量。

3)改善学习和记忆的大白鼠

60只随机平均分成4组，分别用本发明配方口服液1支/天；神经节苷脂口服液2支/天；灯盏花提取物口服液2支/天先连续服用60天，对照组以蒸馏水代替，在小鼠穿梭箱内进行主动回避条件性反射训练，10次测定中有9次出现条件性反应定为学会标准。达到学会后，停止训练1个月后再进行记忆保持检查。

3.结果

1)实验组衰老模型血清SOD活力升高、血清LPO数值下降，与对照组数值进行统计分析P＜0.01；服用本发明配方实验组血清SOD活力升高、血清LPO数值下降最为明显，与服用单组分保健品实验组数值进行统计分析P＜0.01，单组分保健品实验组之间数值无显著差异。结果见表1。

                          表1.SOD活性和LPO含量测定

组别	动物数	SOD活性U/ml血浆	LPO含量mg/100ml血浆
				对照组	8	389.63±46.40	22.67±1.80
衰老模型	13	350.63±48.40	37.08±2.73
				本发明*	13	399.42±90.74	20.67±1.67
神经节苷脂*	13	359.60±51.21	22.99±1.98
				灯盏花提取物*	13	364.22±59.23	23.91±2.87

P^*＜0.01(与对照组比较)；本发明P＜0.01(与单组分实验组比较)；单组分实验组P＞0.5

2)小鼠穿梭箱内进行主动回避条件性反射训练(1)学习情况：对照组小鼠达到学会标准所需的训练次数为33.1±3.9，各实验组所需次数均少于该数值，统计分析P＜0.01；服用本发明的实验组学会所需次数明显少于其它各组，与服用单组分的实验组数值进行统计分析P＜0.01，单组分的实验组之间数值无显著差异。结果见表3。(2)记忆保持情况：停止训练1个月后，对照组小鼠正确反应的百分数为34.1±8.3；实验组正确反应的百分数均高于对照组，统计分析P＜0.01；服用本发明的实验组正确反应的百分数明显高于其它各组，与服用单组分的实验组数值进行统计分析P＜0.01，单组分的实验组之间数值无显著差异。结果见表2。

                   表2    学会次数和正确反应百分数

组别	动物数	学会次数(次)	正确反应百分数(％)
				对照组	15	33.1±3.9	34.1±8.3
本发明*	15	18.9±2.4	60.1±2.5
				神经节苷脂*	15	26.6±3.3	48.8±3.0
灯盏花提取物*	15	25.0±3.6	47.7±5.2

P^*＜0.01(与对照组比较)；本发明P＜0.01(与单组分实验组比较)；单组分实验组P＞0.5

4)结论

神经节苷脂和灯盏花提取物制成的药物和保健品，具有协同增效作用，比其任何单一成分的具有更明显的延缓小鼠衰老、增强小鼠学习和记忆的功能。

三)本发明成分不同配比对老龄大鼠急性低压缺氧脑损害的防治作用

1.材料

1)实验动物

40只22月龄Wistar大鼠

2)本发明的药物和保健品

将不同配比的神经节苷脂和灯盏花提取物用10％的葡萄糖注射液稀释成混悬注射液。

3)测定试剂

内皮素(endothelin，ET)放射免疫试剂盒和一氧化氮(nitric oxide，NO)亚硝酸盐试剂盒购自解放军总医院东亚免疫技术研究所。

2.方法与给药剂量

1)40只22月龄Wistar大鼠随机分成④10％的葡萄糖对照组5只；⑤10％的葡萄糖缺氧组5只和不同配比给药实验组分别10只，共5组。实验前禁食12h，自由饮水。

2)缺氧模型的建立：将缺氧组大鼠放入低压舱内，以30m/s速度上升至8000m高度，停留30min，造成大鼠体内重度缺氧，然后以30m/s速度下降至地面。对照组同时放入另一实验条件完全相同的低压舱内，停留在地面而不上升。急性低压缺氧(8000m，30min)前4h各组均腹腔注射相同体积的10％的葡萄糖或本发明产品，测定各组大脑皮质和丘脑匀浆中内皮素(endothelin，ET)和一氧化氮(nitricoxide.NO)的含量。

3)不同配比给药实验组：

①组含神经节苷脂2mg和灯盏花提取物20mg/10ml；②组含神经节苷脂5mg和灯盏花提取物10mg/10ml；③组含神经节苷脂20mg和灯盏花提取物30mg/10ml。

4)标本处理：各组大鼠均在出舱后立即开颅，1min内取出适量的大脑皮质和丘脑组织。按试剂盒说明书处理标本并测定ET、NO含量。ET含量用放射免疫法直接测定，结果以pg/100mg组织湿重表示；NO含量用亚硝酸盐比色法间接测定，结果以nmol/100mg组织湿重表示。

3.结果

1)急性缺氧对大鼠大脑皮质和丘脑中ET含量的影响及给药组疗效。急性低压缺氧30min后，大鼠大脑皮质和丘脑中ET含量较10％的葡萄糖对照组明显升高(t丘脑＝2.869，P＜0.01；t大脑＝2.511，P＜0.05)；各给药缺氧组大脑皮质和丘脑ET含量较10％的葡萄糖缺氧组明显下降(t大脑＝2.301，P＜0.05；t丘脑＝2.600，P＜0.05)，与10％的葡萄糖对照组相比无明显差异(t大脑＝1.132，P＞0.05；t丘脑＝1.265，P＞0.05)；不同配比各给药缺氧组之间大脑皮质和丘脑ET含量无明显差异，见表3。

               表3    大鼠大脑皮质和丘脑中ET含量(x±s，pg/100mg)

组别	组数	大脑皮质	丘脑
				①组	10	35.01±9.95	35.10±16.19
②组	10	34.90±10.88	69.66±39.23
				③组	10	34.08±19.24	64.63±40.60
④10％的葡萄糖对照组	5	33.02±15.33	60.99±20.94
				⑤10％的葡萄糖缺氧组	5	45.94±16.01	9.74±21.86

与第④组数据比较，ET含量明显升高，⑤P＜0.01；①组～③组与第④组数据比较P＞0.05。

2)急性缺氧对大鼠大脑皮质和丘脑中NO含量的影响及给药组疗效。急性低压缺氧30min后，大鼠大脑皮质和丘脑中NO含量较10％的葡萄糖对照组也明显升高(t大脑＝5.399，P＜0.01；t丘脑＝5.401，P＜0.01)；各给药缺氧组大脑皮质和丘脑NO含量较10％的葡萄糖缺氧组明显下降(t大脑＝2.142，P＜0.05；t丘脑＝2.111，P＜0.05)，与10％的葡萄糖对照组比较(t大脑＝脑＝1.260，P＞0.05；t丘脑＝1.278，P＞0.05)无明显差异；不同配比各给药缺氧组之间大脑皮质和丘脑NO含量无明显差异，见表4。

     表4  对缺氧大鼠大脑皮质和丘脑中NO含量的影响(x±s，nmol/100mg)

组别	组数	大脑皮质	丘脑
				①组	10	1.30±0.14	1.90±0.40
②组	10	1.32±0.20	1.84±0.49
				③组	10	1.31±0.12	1.85±0.41
④10％的葡萄糖对照组	5	1.30±0.17	1.83±0.60
				⑤10％的葡萄糖缺氧组	5	1.95±0.39	2.30±0.42

与第④组数据比较，ET含量明显升高，⑤P＜0.01；①组～③组与第④组数据比较P＞0.05。

4.结论

1)急性低压缺氧可引起老龄大鼠大脑皮质和丘脑中ET、NO含量明显升高(ET、NO可能参与了缺氧性脑损害的病理过程)。本发明产品对老龄大鼠缺氧性脑损害有一定的早期防治作用。

2)神经节苷脂和灯盏花提取物制成的药物和保健品，其不同配比均对老龄大鼠缺氧性脑损害有一定的早期防治作用，其中①组含神经节苷脂2mg和灯盏花提取物20mg已经达到很好疗效；由于低浓度配比已经使受损恢复，因此本实验中高浓度的配比无优势。

三)对沙土鼠脑缺血神经元调亡的保护作用

本实验被广泛用于脑缺血疾病(中风)病理机制研究。

近来研究表明，在脑缺血再灌注后数日，会出现严重的继发性神经损伤，称之为迟发性神经元坏死(DNN)。因此，积极防治脑缺血后DNN为其重要的治疗措施。已有研究表明，一氧化氮(NO)和一氧化氮合酶(NOS)等与缺血性脑损伤的发生发展具有密切的关系，而有关该方对此影响的研究报道甚少。为此，本研究采用沙土鼠脑缺血再灌注损伤模型，研究本发明配方的协同作用。报告如下。

1.材料

1)实验动物

体重60～80g清洁级蒙古沙土鼠，60只，雌雄各半，卫生部上海生物制品研究所动物中心提供。

2)物与给药剂量

本发明混悬注射剂(含神经节苷脂5mg/10ml/支，灯盏花提取物10mg/10ml/支)；神经节苷脂注射剂(本实验室配置)20mg/10ml/支；灯盏花提取物注射剂(本实验室配置)20mg/10ml/支。

2.方法

沙土鼠随机分为假手术对照组(假手术组8只)、模型对照组(模型组)和各给药实验组(分别13只)，共5组。实验前12小时，给药实验组腹腔注射各组注射液，假手术组和模型组腹腔注射等量5％葡萄糖注射液，实验前15分钟再同前方法注射药物1次。于给药后15分钟，腹腔注射盐酸氯胺酮1.2ml/kg(60mg/kg)麻醉，分离两侧颈总动脉。除假手术组外，其余各组均以小动脉夹夹闭双侧颈总动脉造成脑缺血，缺血20分钟后松开动脉夹进行再灌注。假手术组不结扎双侧颈总动脉，其它操作与以上各组相同。缝合手术切口，继续饲养。再分别于再灌注后12、24和36小时同前腹腔注射药物1次。于再灌注后48小时将沙土鼠颈椎脱臼致死，迅速取脑置冰台上，在冰台上迅速分离双侧前脑皮质，以冰生理盐水冲洗去除残余后称重，加冰生理盐水在冰溶下制成10％脑匀浆液，于4℃离心(3500r/min)15分钟，分离上清液供测试。

3.观察指标

脑匀浆液NO含量按重氮化反应法测定；NOS活性以分光光度法测定。药盒均由南京建成生物工程研究所提供。

4.结果

1)对脑组织NO含量的影响；模型组脑组织NO含量明显低于假手术组；除本发明实验组，其它NO含量也较假手术组降低，但显著高于模型组(P均＜0.01)；本发明实验组NO含量较假手术组之间无显著性意义(P＞0.05)。

2)对脑组织NOS活性的影响；模型组NOS活性显著低于假手术组；各给药实验组NOS活性升高，与其它各单组分实验组比较本配方实验组NOS活性升高明显(P均＜0.05)；假手术组之间差异无显著性意义(P＞0.05)。见表5。

                  表5.各组NO和NOS的比较(±s)μmol/g

组别	动物数(只)	NO	NOS
				假手术组	8	2.60±2.02	16.71±2.21
模型组	13	0.79±0.40	11.61±1.64
				本发明*	13	0.81＝0.51	10.47±1.95
神经节苷脂*	13	1.33±0.77	15.29±1.89
				灯盏花提取物*	13	1.36±0.79	16.29±1.89

模型组脑组织NO含量明显低于假手术组(P＜0.01)；除本发明实验组，其它NO含量也较假手术组降低，但显著高于模型组(P＜0.01)；本发明实验组NO含量较假手术组之间无显著性意义(P＞0.05)。

NOS值与假手术组比较(P＞0.05)，本发明NOS值与单一成分比较(P＜0.05)；

5.结论

在再灌注48小时后，脑组织NO含量降低，NOS活性降低，表明此时脑组织内NO合成受抑。含神经节苷脂和灯盏花成分的混悬注射剂比其任何单一成分的注射剂更能有效对抗再灌注后期NO含量和NOS活性的降低。但该方作用的具体环节还有待于进一步研究。

二、临床试验

一)对老年性痴呆的防治效果

采用美国精神病学会第三版《精神病的诊断和统计手册》(DSM-III)中的诊断标准，同时采用长谷川痴呆量表(HDS)、精神状态速检表(MMSE)精神认知能力筛选表(CCSE)、社会活动调查表(FAQ)等量表协助诊断。

1.病例：

符合这些标准，且程度相当的患者共60例，其中男40例，女20例；年龄44～85岁；随机分成治疗组(3组，各16人)和对照组(1组，12人)。

2.实验方法

治疗组分别给予本发明口服液3支/天，含神经节苷脂15mg和灯盏花提取物60mg；神经节苷脂口服液，含神经节苷脂30mg/天；灯盏花提取物口服液，含有效成分180mg/天和安慰剂，连续服用26周。

3.观察指标

1)症状疗效

根据老年临床评定量表(SCAG)的测定。显效：治疗后积分降低2分或以上；有效：治疗后积分降低1分；无效：治疗后积分无变化；恶化：治疗后积分上升。

2)认知功能疗效

根据HDS、MMSE、CCSE和FAQ分别进行评定。显效：治疗后积分提高6分或6分以上；有效：治疗后积分提高2～5分；无效：治疗前后积分相差少于2分；恶化：治疗前后积分上升2或以上。

4.结果

治疗各组与对照组比较，有效率有显著差异P＜0.01；用本发明配方组81.25％患者得以改善，比其它单组分组有显著改善P＜0.01；单组分组P＞0.5。安慰剂对照组此数据显示明显恶化。结果见表6。

                    表6  老年痴呆患者症状总体印象疗效

组别	人数	显效	有效	无效	恶化	有效率(％)
							对照组	12	0	0	3	9	0.00
本发明*	16	9	4	3	0	81.25
							神经节苷脂*	16	1	5	8	5	37.50
灯盏花提取物*	16	3	4	5	4	43.75

P^*＜0.01(与对照组比较)；本发明配方P＜0.01(与单组分实验组比较)；单组分实验组P＞0.5

5.结论

神经节苷脂和灯盏花提取物制成的药物和保健品，具有协同增效作用，应用治疗剂量26周后，比任何单一成分的在治疗和预防老年性痴呆的功效上更显著。

二)对脑梗塞的疗效比较

治疗及对照组病例均参照中华医学会学术会议第三次修订的《各类脑血管疾病诊断要点》选择并都经颅部CT检查确诊，排除短暂性脑缺血发作和因脑部肿瘤、外伤及各种心脏病合并房颤引起的脑梗塞。脑梗塞中医主症：半身不遂、口眼歪斜、舌强语塞、失语或偏身麻木。

1.病例：

疾病程度相当的90例患者，治疗组72例(平均24人1组)，其中男48例，女24例，年龄45～76岁，平均62.45±5.60岁；对照组18例，其中男11例，女7例，年龄40～71岁，平均60.45±5.78岁；

2.试验方法

治疗组分别给予本发明胶囊3囊/天，共含神经节苷脂15mg和灯盏花提取物60mg；神经节苷脂胶囊，含神经节苷脂30mg/天；灯盏花提取物胶囊，含有效成分180mg/天，连续服用26周。对照组给以安慰剂。

治疗期间除部分病例因颅内高压和感染而短期使用脱水剂和抗生素外，治疗组和对照组其它的临床治疗相同。

3.观察指标

参照《第二次脑血管学术会议修订的脑血管疾病诊断标准》，治愈：意识恢复正常，肌力达到4～5级，生活能自理；显效；语言恢复，肌力增进2级，生活部分自理；有效：意识、语言有进步，肌力增进1级；无效：治疗前后症状和体症无明显变化，肌力增进不到1级；恶化：治疗过程中病情继续恶化或死亡。

4.结果

1)疗效比较，治疗各组与对照组比较，有效率有显著差异P＜0.01；用本发明配方组81.25％患者得以改善，比其它单组分组有显著改善P＜0.01；单组分组P＞0.5。结果见表7。

                          表7  脑梗塞的疗效比较

组别	人数	痊愈	显效	有效	无效	恶化	有效率％
								对照组	18	0	0	1	17	0	5.56
本发明*	24	2	6	15	1	0	95.83.
								神经节苷脂*	24	1	2	6	15	0	37.50
灯盏花提取物*	24	1	3	8	12	0	50.00

P^*＜0.01(与对照组比较)；本发明组P＜0.01(与单组分实验组比较)；单组分实验组P＞0.5

2)治疗各组起效时间比较

起效时间指开始用药至肌力增进1级开始所需的时间；用本发明配方组73.91％患者在治疗的16周后得以改善，比其它单组分组有显著改善P＜0.01；单组分组P＞0.5。结果见表8。

                          表8  起效时间比较

组别	人数	1～10周	11～16周	17～26周	16周起效率％
						本发明*	23	2	15	6	73.91
神经节苷脂	9	0	2	7	22.22
						灯盏花提取物	12	0	3	9	25.00

P^*＜0.01与单组分实验组比较；单组分各组P＞0.5

5.结论

神经节苷脂和灯盏花提取物制成的药物和保健品，具有协同增效作用，能在教短的治疗周期后，比其任何单一成分的在防治脑梗塞的功效上更显著。

由上述公开的食品安全性毒理试验以及与其单一成分多种功效比较的动物和临床试验可见：

1)神经节苷脂和灯盏花提取物制成的药物和保健品，具有协同增效作用，比其任何单一成分的具有更明显的延缓小鼠衰老、增强小鼠抗疲劳和学习记忆的功能。

2)神经节苷脂和灯盏花提取物制成的药物和保健品，其不同配比浓度对急性低压缺氧引起的老龄大鼠缺氧性脑损害(大脑皮质和丘脑中ET、NO含量升高)有一定的早期防治作用；其中低浓度的含神经节苷脂2mg和灯盏花提取物20mg已经达到很好疗效。

3)神经节苷脂和灯盏花提取物制成的药物和保健品，具有协同增效作用，对沙土鼠脑缺血神经元调亡的保护作用，比其任何单一成分具有更明显效果。

4)神经节苷脂和灯盏花提取物制成的药物和保健品，具有协同增效作用，应用治疗剂量26周后，比其任何单一成分的在治疗和预防老年性痴呆的功效上更显著。

5)神经节苷脂和灯盏花提取物制成的药物和保健品，具有协同增效作用，应用治疗剂量26周后，比其任何单一成分的在治疗和预防脑梗塞的功效上更显著；且起效时间短。

6)神经节苷脂和灯盏花提取物的药物和保健品无毒性，临床服用安全。

附：本发明配方中各主要功效成分的测定方法：

一、神经节苷脂的测定

神经节苷脂的测定方法参照Biochim Biophys Acta 1957 Vol.24 p604的方法和国际上同行实验室的分析方法加以改良而制定，经实践证明完全适用于在科研分析和商品检验中对神经节苷脂含量的正确测定，经上海技术监督局审核批准，已列入“企业标准”。

1.材料

(1)间苯二酚储液：2克间苯二酚溶于100毫升蒸馏水中，冰箱放置。

(2)对照工作液(A液)：80毫升盐酸、0.25毫升0.1M CuSO4溶液、19.75毫升蒸馏水。

(3)间苯二酚工作液(B液)：10毫升间苯二酚储液、80毫升盐酸、0.25毫升0.1M CuSO4溶液、9.75毫升蒸馏水。此工作液至少在使用前的4小时配制，冰箱放置。

(4)正戊醇(C液)。

(5)标准品：唾液酸(Sigma产品)

(6)紫外分光光度计：SPD-1型，日本产(Spectrophotometric Detector SPD-1，Shimadzu，Japan)

2.方法

电子天平精确称取5毫克标准样品溶于5毫升蒸馏水中，即为毫克/毫升标准溶液储液，由上述标准溶液储液配成10微克，20微克，30微克，40微克，50微克(系500微升中的浓度)储液，冰箱放置。

标准曲线的制作：

a.取具塞试管5支，分别准确加入500微升已配制的5种浓度标样，然后加入蒸馏水1.5毫升。

b.边振荡，边加入2毫升B液；空白对照：加500微升上述任意一种浓度的标样，加1.5毫升水后，加2毫升A液。

c.100℃度水浴加热15分钟，然后在冷流动水中冷却10分钟。

d.边振荡，边加入4毫升C液，冰浴中冷却15分钟。

e.离心5分钟(3000转/分)，吸取上清液，在OD580测定吸收值，作出标准曲线(在OD580读数为纵轴，浓度为横轴)。

样品的测定：样品(胶囊20囊)溶于5毫升蒸馏水中，稍离心后，取三支具塞试管，分别加入摇匀样品200微升混悬液。以下操作方法均按照标准曲线的制作方法进行。样品中神经节苷脂含量的计算：

斜率：斜率从标准曲线中求得。稀释倍数：指测定是标准溶液总体积500微升与加入的被测样品体积比。5.82系校正因子。

二、灯盏花提取物有效成分的测定

采用紫外分光光度法测定总黄酮甙。

1.材料

(1)试剂：乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠(上海生化试剂公司)

(2)标准品：芦丁(均由成都迪澳植化实业有限公司提供)

2.方法

a.标准品(芦丁20毫克)，溶于60％乙醇(加热溶解后冷却)，用蒸馏水稀释至刻度，使芦丁含量为0.1mg/ml。

b.标准曲线的制备：精确量取对照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0ml，置10ml量杯中，各加30％乙醇至5.0ml；加亚硝酸钠溶液0.3ml，摇匀后放置6分钟：加硝酸铝溶液0.3ml，摇匀后放置6分钟，加氢氧化纳4ml，分别用蒸馏水稀释至刻度，放置15分钟：测OD510。

c.样品胶囊20囊，置100ml量筒中，溶于60％7醇(加热溶解后冷却)，用蒸馏水稀释至刻度，取4ml置10ml量筒中，用30％乙醇稀释至刻度；参照标准曲线计算含量。

具体实施方式

以下将通过实施例对本发明的具体实施方式作说明。

                           实施例1

采用含神经节苷脂的动物脏器粗提取物(由宝智生物制品有限公司提供)，-18℃保存，粗产品用2倍量的含氯化钾(含量为2克/公斤脑)的68％乙醇溶解，作为上柱液，再应用柱层析的方法提纯具体工艺如下：

(1)树脂的处理：将经过碱乙醇和酸乙醇处理过的树脂，用水洗至中性，再以68％的乙醇溶胀后待用。树脂用量，1150ml树脂/Kg粗产品。

(2)柱吸附：将制备好的上柱液用4N盐酸酸化至pH2.5上柱；流速：吸附柱：2.7cm×9cm，50ml柱体积流速为80ml/h。

(3)淋洗：用68％的乙醇洗去未被吸附的杂质；流速和温度与吸附条件相同。

(4)洗脱：经过淋洗后的吸附柱再以1.65倍柱体积的石油醚～食用乙醇混合液(1/5，体积比)洗脱。洗脱速度是吸附速度的0.62(如：吸附速度是80ml/h，洗脱速度为50ml/h)；收集洗脱液。

(5)最后进行浓缩和干燥，收集的洗脱液在低于60℃温度下减压浓缩去除有机溶剂。

用上海市食品监督检验所提供的间苯二酚法测定含神经节苷脂的原料中神经节苷脂的含量。用上述方法测定购自昆明雅阁臣药业有限公司，产品规格Q/Ws696的灯盏花提取物中总黄酮和灯盏乙素。

                           实施例2

按本技术领域人员公知的方法将实施例1的神经节苷脂和灯盏花提取物制备胶囊，以淀粉为填充剂，8％淀粉浆为黏合剂，制成颗粒，然后装胶囊。制成胶囊的规格为100mg/囊。其中含神经节苷脂含量5mg/囊，灯盏花提取物含量20mg/囊。各原料用量为：神经节苷脂原料：5克，灯盏花提取物原料：20克，淀粉：67克，8％淀粉浆：8克。

                           实施例3

按本技术领域人员公知的方法将实施例1的神经节苷脂和灯盏花提取物制备混悬口服液，以柠檬酸和甘露糖作为添加剂制成口服液。制成口服液规格为10ml/支。其中含神经节苷脂含量5mg/支，灯盏花提取物含量20mg/支。

神经节苷脂液体原料：  5克    纯净水：    10升

灯盏花提取物原料：    20克   甘露糖：    5克

柠檬酸：              10克。

                           实施例4

按本技术领域人员公知的方法将实施例1的神经节苷脂和灯盏花提取物制备胶囊，以淀粉为填充剂，8％淀粉浆为黏合剂，制成颗粒，然后装胶囊。制成胶囊的规格为100mg/囊。其中含神经节苷脂含量6mg/囊，灯盏花提取物含量80mg/囊。

神经节苷脂原料：6克，灯盏花提取物原料：80克，淀粉：6克，8％淀粉浆：8克。

                           实施例5

按本技术领域人员公知的方法将神经节苷脂和灯盏花提取物制备混悬注射剂，以注射用5％或10％的葡萄糖注射液作稀释液。制成规格为10ml/支。其中含神经节苷脂含量5mg/10ml/支，灯盏花提取物含量20mg/10ml/支。

神经节苷脂原料：5克，灯盏花提取物原料：20克，5％或10％的葡萄糖注射液：1000毫升。

Claims (10)

1.一种神经节苷脂和灯盏花提取物组成的药物和保健品，其特征在于，该药物和保健品的组分和重量百分含量以神经节苷脂和灯盏花提取物的总量计为：

神经节苷脂                2～20％

灯盏花提取物              80～98％。

2.如权利要求1所述的药物和保健品，其特征在于，含量为：

神经节苷脂                2～8％

灯盏花提取物              92～98％。

3.如权利要求1所述的药物和保健品，其特征在于，含量为：

神经节苷脂                8.5～15％

灯盏花提取物              95～91.5％。

4.如权利要求1所述的药物和保健品，其特征在于，含量为：

神经节苷脂                15.5～20％

灯盏花提取物              80～84.5％。

5.如权利要求2所述的药物和保健品，其特征在于，含量为：

神经节苷脂                2～5％

灯盏花提取物              95～98％。

6.如权利要求要求1～5任一所述的药物和保健品在制备治疗和预防老年性痴呆药物中的应用。

7.如权利要求要求1～5任一所述的药物和保健品在制备治疗和预防脑梗塞药物中的应用。

8.如权利要求要求1～5任一所述的药物和保健品在制备治疗和预防缺血性脑血管病药物中的应用。

9.一种用于治疗和预防老年性痴呆、治疗和预防脑梗塞的药物和保健品，其特征在于，其中含有治疗有效量的权利要求1～5任一所述的药物和保健品以及医学上可以接受的载体。

10.如权利要求9所述的药物和保健品，其特征在于，所述的载体包括淀粉、蒸馏水或葡萄糖。