CN119242862A - 以内参基因gapdh为质控的bvdv核酸检测荧光定量rt-pcr试剂盒 - Google Patents

以内参基因gapdh为质控的bvdv核酸检测荧光定量rt-pcr试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了以内参基因GAPDH为质控的BVDV核酸检测荧光定量RT‑PCR试剂盒。所述的试剂盒含有如SEQ IDNO.1所示的上游引物BVDV‑F、SEQ IDNO.2所示的下游引物BVDV‑R、SEQ IDNO.5所示的上游引物GAPDH‑F、SEQ IDNO.6所示的下游引物GAPDH‑R。本发明试剂盒引入了一个表达较为稳定的持家基因作为内参基因进行对目的基因检测的校正和标准化，避免现有试剂盒可能出现“假阴性”“假阳性”的技术缺点，以提高试剂盒准确性、灵敏度和重复性，并且可同时检测不同样品中BVDV‑1、BVDV‑2和BVDV‑3核酸。

Description

以内参基因GAPDH为质控的BVDV核酸检测荧光定量RT-PCR试 剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及以内参基因GAPDH为质控的BVDV核酸检测荧光定量RT-PCR试剂盒。
背景技术
牛病毒性腹泻病毒(BVDV)呈全球性分布，有2个基因型，即BVDV-1与BVDV-2，和猪瘟病毒(CSFV)、羊边界病毒同属于黄病毒科瘟病毒属。近年来，有研究新发现不同于BVDV-1、BVDV-2的BVDV毒株，被研究者划分为BVDV-3，由于BVDV与CSFV存在广泛的交叉抗原和血清学交叉反应，临床上很难用血清学方法将其鉴别诊断。
荧光定量RT-PCR方法具有特异性强、敏感度高、检测范围广泛的优点，是一种重要的检测方法。现有检测BVDV核酸的荧光定量RT-PCR方法，可同时检测BVDV-1、BVDV-2核酸，但缺乏可同时检测BVDV-1、BVDV-2和BVDV-3核酸的荧光定量RT-PCR试剂盒，也因无法鉴别CSFV，仅用于牛鼻拭子和粪便样品等牛源性样品检测，存在用于猪源性样品检测时可能出现“假阳性”的技术缺陷。此外，现有同时检测BVDV-1、BVDV-2和BVDV-3核酸的荧光定量RT-PCR试剂盒，缺少内参基因设计，无法监测样品在采集、运输、样品处理、核酸提取、反转录或扩增反应环节中的效果，无法避免“假阴性”的出现，无法监控整个反应过程是否顺利进行。内参基因是一种维持细胞最低限度功能不可缺少的基因，理想的内参基因在不同类型细胞和组织中的表达应无显著差异，且不受试验和临床条件的影响。但由于内参基因的表达具有物种及组织特异性，其表达的稳定性是相对的，所以选择合适的内参基因对核酸定量显得尤为重要。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)是经典的糖酵解酶，由于广泛存在于众多生物体中，几乎在所有组织中都高水平表达。该酶在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，适合作为内参基因进行对目的基因检测的校正和标准化。因此，内参基因对照设置可以避免“假阴性”的出现，监控整个反应过程是否顺利进行。
因此，建立以内参基因GAPDH为质控的BVDV核酸检测荧光定量RT-PCR试剂盒及其制备方法，以避免“假阴性”“假阳性”的出现，检测更多BVDV基因型，不仅有利于准确高效的BVDV监测，而且对于保障动物疫苗质量、保护畜牧业健康发展、促进我国农产品出口等方面均具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供以内参基因GAPDH为质控的BVDV核酸检测荧光定量RT-PCR试剂盒，引入了一个表达较为稳定的持家基因作为内参基因进行对目的基因检测的校正和标准化，避免现有试剂盒可能出现“假阴性”“假阳性”的技术缺点，以提高试剂盒准确性、灵敏度和重复性，并且可同时检测不同样品中BVDV-1、BVDV-2和BVDV-3核酸。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
以内参基因GAPDH为质控的BVDV核酸检测荧光定量RT-PCR引物和探针组合，包括：
1)扩增BVDV 5′-UTR的引物对序列为：
上游引物BVDV-F：5′-CAGTGAGTTCVTTGGATNGCCG-3′(基因组位置150-171nt)；
下游引物BVDV-R：5′-TRGGTTAAGATGTRCYGTGGG-3′(基因组位置255-275nt)；
2)检测BVDV 5′-UTR扩增产物的TaqMan探针序列为：BVDV-P：5′-FAM-TGAGTACAGGGDAGTCGTCAATGGTTCG-BHQ1 -3′(基因组位置178-205nt)；
3)扩增猪内参基因GAPDH的引物对序列为：
上游引物GAPDH-F：5′-CCCCAACGTGTCGGTTGT-3′(基因组位置：488-505nt)；
下游引物GAPDH-R：5′-CTTCACCACCTTCTTGATGTCATC-3′(基因组位置：543-566nt)；
4)检测猪内参基因GAPDH扩增产物的TaqMan探针序列为：
GAPDH-P：5′-VIC-ATCTGACCTGCCGCCTGGAGAAACC-BHQ1 -3′(基因组位置：508-532nt)。
所述的荧光定量RT-PCR试剂盒为两步法TaqMan探针法试剂盒、两步法SYBR GreenI法试剂盒等等。
一种以内参基因GAPDH为质控的BVDV核酸检测荧光定量RT-PCR试剂盒，其包括扩增BVDV 5′-UTR的上游引物BVDV-F和下游引物BVDV-R以及扩增猪内参基因GAPDH的上游引物GAPDH-F和下游引物GAPDH-R。
进一步地，所述的两步法TaqMan探针法试剂盒至少包括以下组分：
试剂盒对照：BVDV病毒液阳性对照或者BVDV重组质粒阳性对照，GAPDH重组质粒，阴性对照；
cDNA合成体系：PrimeScript RT Master Mix和无酶水；
TaqMan荧光PCR反应体系：Premix Ex Taq，上游引物BVDV-F，下游引物BVDV-R，TaqMan探针BVDV-P，上游引物GAPDH-F，下游引物GAPDH-R，TaqMan探针GAPDH-P，ROXReference Dye II，无酶水。
进一步地，所述的两步法SYBR Green I法试剂盒至少包括以下组分：
试剂盒对照：BVDV病毒液阳性对照或者BVDV重组质粒阳性对照，GAPDH重组质粒，阴性对照；
cDNA合成体系：PrimeScript RT Master Mix和无酶水；
SYBR荧光PCR反应体系：TB Green Premix Ex TaqⅡ，上游引物BVDV-F，下游引物BVDV-R，上游引物GAPDH-F，下游引物GAPDH-R，ROX Reference Dye II，无酶水。
进一步地，所述试剂盒中：
BVDV病毒液阳性对照：为BVDV病毒液，经甲醛37℃灭活后分装备用。
BVDV重组质粒阳性对照：为含有BVDV 5′-UTR基因目的片段【基因组位置(1-385nt)】的重组质粒；
GAPDH重组质粒：为含有内参基因GAPDH目的片段【基因组位置(335-719nt)】的重组质粒。非猪源性样品加入GAPDH重组质粒后，再进行核酸提取；猪源性样品不必加入GAPDH重组质粒，直接进行核酸提取。
阴性对照：为无酶水、已知BVDV阴性且GAPDH阴性的细胞培养液、或者已知BVDV阴性且GAPDH阴性的动物组织悬液中的一种。
进一步地，所述试剂盒中：
BVDV病毒液阳性对照：为BVDV AV69株MDBK细胞传代产物，其病毒滴度为102.5FAID50/0.1mL至106.5FAID50/0.1mL，经甲醛37℃灭活后分装备用。
BVDV重组质粒阳性对照：为含有BVDV 5′-UTR基因目的片段【基因组位置(1-385nt)】的重组质粒，10 000拷贝数/μL至500 000拷贝数/μL。
GAPDH重组质粒：为含有内参基因GAPDH目的片段【基因组位置(335-719nt)】的重组质粒，10 000拷贝数/uL至500 000拷贝数/uL。
优选地，BVDV重组质粒阳性对照：为含有BVDV-1Oregon C24V株(GenBank登录号：AF091605)5′-UTR基因目的片段的重组质粒，或者含有BVDV-2SH-28株(GenBank登录号：HQ258810.1)5′-UTR基因目的片段的重组质粒，或者含有BVDV-3Th/04_KhonKaen株(GenBank登录号：NC_012812.1)5′-UTR基因目的片段的重组质粒。
本发明具有以下有益效果：
1.本发明建立了以内参基因GAPDH为质控的并且可同时检测不同样品中BVDV-1、BVDV-2和BVDV-3核酸的荧光定量RT-PCR试剂盒。而现有专利主要用于检测BVDV-1、BVDV-2核酸，极少数用于同时检测BVDV-1、BVDV-2和BVDV-3核酸的荧光定量RT-PCR试剂盒，也因无法鉴别CSFV，仅用于牛鼻拭子和粪便样品等牛源性样品检测，存在用于猪源性样品检测时可能出现“假阳性”的技术缺陷，见应用例2。因此，本发明可以检测更多BVDV基因型，见应用例1。
2.本发明提供了以内参基因GAPDH为质控的BVDV核酸检测荧光定量RT-PCR试剂盒，引入了一个表达较为稳定的持家基因GAPDH作为内参基因进行对目的基因检测的校正和标准化，可监测样品在采集、运输、样品处理、核酸提取、反转录或扩增反应的全部过程，如果内参基因对照无扩增曲线，则提示样品在采集、运输、样品处理、核酸提取、反转录或扩增反应环节中存在问题，该样品检测结果无效，避免样品“假阴性”的出现，见应用例3。
现有专利试剂盒按照牛GAPDH的mRNA特异性核苷酸序列，研制了牛GAPDH内标检测引物，其检测组织样品来源于牛，无法扩增猪GAPDH基因，无法了解猪源性组织样本在采集、运输、处理、核酸提取、反转录、扩增反应等多个过程中是否存在“假阴性”，不适用于猪源性组织样本检测，且无法检测BVDV-3，见应用例3。即使极少数可同时检测BVDV-1、BVDV-2和BVDV-3核酸的现有荧光定量RT-PCR试剂盒，因为缺少内参基因设计，导致无法避免样品“假阴性”的出现，无法监控样品在整个反应过程是否顺利进行，见应用例2。
本发明填补了在基于内参基因GAPDH同时进行BVDV-1、BVDV-2和BVDV-3核酸检测的荧光定量RT-PCR试剂盒上的技术空白，对于保障动物疫苗质量、保护畜牧业健康发展、促进我国农产品出口等方面均具有重要意义。
3.本发明试剂盒具有较高的灵敏度，对BVDV-1AV69株、BVDV-2重组质粒模板、BVDV-3重组质粒模板的最低检出限分别为10-0.5FAID50/0.1mL、1拷贝数/uL、10拷贝数/uL。本发明试剂盒的最低检出限低于现有专利，灵敏度高于现有专利，见应用例1-3。并且，本发明试剂盒检测具有良好的线性关系和较高的扩增效率，有利于准确高效的BVDV监测。
4.本发明的引物和探针组可以用于多种荧光定量RT-PCR试剂盒，可根据实际检测需求选择试剂盒，具有检测成本低、实用价值高、应用前景广的优势，见应用例1-3。
附图说明
图1是两步法BVDV核酸TaqMan探针法检测试剂盒检测系列标准样本(a至g)BVDV-1基因的灵敏度结果；
1.BVDV-1病毒液(103.5FAID50/0.1mL)；2.BVDV-1病毒液(102.5FAID50/0.1mL)；3.BVDV-1病毒液(101.5FAID50/0.1mL)；4.BVDV-1病毒液(100.5FAID50/0.1mL)；5.BVDV-1病毒液(10-0.5FAID50/0.1mL)；6.BVDV-1病毒液(10-1.5FAID50/0.1mL)；7.BVDV-1病毒液(10- 2.5FAID50/0.1mL)。
图2是两步法BVDV核酸TaqMan探针法检测试剂盒检测系列标准样本(a至g)GAPDH基因的灵敏度结果；
1.GAPDH重组质粒(100 000拷贝数/uL)；2.GAPDH重组质粒(10 000拷贝数/uL)；3.GAPDH重组质粒(1 000拷贝数/uL)；4.GAPDH重组质粒(100拷贝数/uL)；5.GAPDH重组质粒(10拷贝数/uL)；6.GAPDH重组质粒(1拷贝数/uL)；7.GAPDH重组质粒(0.1拷贝数/uL)。
图3是两步法BVDV核酸TaqMan探针法检测试剂盒检测系列标准样本(h至m)BVDV-2基因的灵敏度结果；
1.BVDV-2重组质粒(100 000拷贝数/uL)；2.BVDV-2重组质粒(10 000拷贝数/uL)；3.BVDV-2重组质粒(1 000拷贝数/uL)；4.BVDV-2重组质粒(100拷贝数/uL)；5.BVDV-2重组质粒(10拷贝数/uL)；6.BVDV-2重组质粒(1拷贝数/uL)。
图4是两步法BVDV核酸TaqMan探针法检测试剂盒检测系列标准样本(h至m)GAPDH的灵敏度结果；
1.GAPDH重组质粒(100 000拷贝数/uL)；2.GAPDH重组质粒(10 000拷贝数/uL)；3.GAPDH重组质粒(1 000拷贝数/uL)；4.GAPDH重组质粒(100拷贝数/uL)；5.GAPDH重组质粒(10拷贝数/uL)；6.GAPDH重组质粒(1拷贝数/uL)。
图5是两步法BVDV核酸TaqMan探针法检测试剂盒检测系列标准样本(n至s)BVDV-3基因的灵敏度结果；
1.BVDV-3重组质粒(100 000拷贝数/uL)；2.BVDV-3重组质粒(10 000拷贝数/uL)；3.BVDV-3重组质粒(1 000拷贝数/uL)；4.BVDV-3重组质粒(100拷贝数/uL)；5.BVDV-3重组质粒(10拷贝数/uL)；6.BVDV-3重组质粒(1拷贝数/uL)。
图6是两步法BVDV核酸TaqMan探针法检测试剂盒检测系列标准样本(n至s)GAPDH基因的灵敏度结果；
1.GAPDH重组质粒(100 000拷贝数/uL)；2.GAPDH重组质粒(10 000拷贝数/uL)；3.GAPDH重组质粒(1 000拷贝数/uL)；4.GAPDH重组质粒(100拷贝数/uL)；5.GAPDH重组质粒(10拷贝数/uL)；6.GAPDH重组质粒(1拷贝数/uL)。
图7为FAM通道(BVDV检测)阴性对照及阳性对照典型的BVDV扩增曲线；其中，(a)两步法TaqMan探针法试剂盒；(b)两步法SYBR Green I法试剂盒。
图8为VIC通道(RPL4检测)阴性及阳性典型的RPL4扩增曲线；其中，(a)两步法TaqMan探针法试剂盒；(b)两步法SYBR Green I法试剂盒。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施方式对本发明进一步详细说明。
根据GenBank已发表的BVDV-1(AF091605、AF220247、AF526381、JN400273、KC695814、KJ541471、M31182、MN188074)、BVDV-2(AF502399、FJ527854、HQ258810、JF714967、KJ000672、MN527354、OP792028、NC_039237)、BVDV-3(KY762287、KY767958、MH410814、NC_012812、OP210314、HQ231763、JX469119、JX985409)和CSFV(AF091507、AF531433、AY568569、DQ127910、EU490425)基因序列，应用DNAStar 7.1软件对序列进行比对分析，选取5′-UTR基因保守区段为检测靶基因，根据TaqMan探针设计原则，应用BioEdit7.2.6.1和Primer Express 3.0.1软件，设计1对BVDV 5′-UTR引物对和1条特异性TaqMan探针，命名为：上游引物BVDV-F、下游引物BVDV-R、TaqMan探针BVDV-P，并通过BLAST对其特异性进行鉴定。此外，根据GenBank中猪的GAPDH(DQ845173.1)内参基因序列，按照TaqMan探针设计原则，应用Primer Express 3.0.1软件，设计1对内参基因GAPDH引物对和1条特异性TaqMan探针，分别命名为：上游引物GAPDH-F、下游引物GAPDH-R、TaqMan探针GAPDH-P，并通过BLAST对其特异性进行鉴定。
本发明以内参基因GAPDH为质控的BVDV核酸检测荧光定量RT-PCR试剂盒，包括：
1)扩增BVDV 5′-UTR的引物对序列为：
上游引物BVDV-F：5′-CAGTGAGTTCVTTGGATNGCCG-3′(基因组位置150-171nt)；
下游引物BVDV-R：5′-TRGGTTAAGATGTRCYGTGGG-3′(基因组位置255-275nt)；
2)检测BVDV 5′-UTR扩增产物的TaqMan探针序列为：BVDV-P：5′-FAM-TGAGTACAGGGDAGTCGTCAATGGTTCG-BHQ1 -3′(基因组位置178-205nt)；
上述1)和2)引物探针基因组位置参考毒株BVDV strain XJ-04(GenBank登录号：FJ527854)；
3)扩增猪内参基因GAPDH的引物对序列为：
上游引物GAPDH-F：5′-CCCCAACGTGTCGGTTGT-3′(基因组位置：488-505nt)；
下游引物GAPDH-R：5′-CTTCACCACCTTCTTGATGTCATC-3′(基因组位置：543-566nt)；
4)检测猪内参基因GAPDH扩增产物的TaqMan探针序列为：
GAPDH-P：5′-VIC-ATCTGACCTGCCGCCTGGAGAAACC-BHQ1 -3′(基因组位置：508-532nt)；
上述3)和4)中，引物和探针的基因组位置参考内参基因GAPDH(GenBank登录号：DQ845173.1)。
一种以内参基因GAPDH为质控的BVDV核酸检测荧光定量RT-PCR试剂盒，其包括扩增BVDV 5′-UTR的上游引物BVDV-F和下游引物BVDV-R以及扩增猪内参基因GAPDH的上游引物GAPDH-F和下游引物GAPDH-R。
所述的荧光定量RT-PCR试剂盒为两步法TaqMan探针法试剂盒、两步法SYBR GreenI法试剂盒等等。
进一步地，所述的两步法TaqMan探针法试剂盒至少包括以下组分：
试剂盒对照：BVDV病毒液阳性对照或者BVDV重组质粒阳性对照，GAPDH重组质粒，阴性对照；
cDNA合成体系：PrimeScript RT Master Mix和无酶水；
TaqMan荧光PCR反应体系：Premix Ex Taq，上游引物BVDV-F，下游引物BVDV-R，TaqMan探针BVDV-P，上游引物GAPDH-F，下游引物GAPDH-R，TaqMan探针GAPDH-P，ROXReference Dye II，无酶水。
参考核酸提取或纯化试剂盒说明书进行操作，每个非猪源性样品(200-400uL)在核酸提取时均需加入5-20uL GAPDH重组质粒后，再进行核酸提取；猪源性样品不必加入GAPDH重组质粒，直接进行核酸提取。
按照表1进行cDNA合成反应体系配制。
表1两步法TaqMan探针法试剂盒cDNA合成反应体系
组分 体系
PrimeScript RT Master Mix 2μL
RNA ≤6μL
无酶水 补齐至10μL
反应条件为：37℃15min(反转录反应)；85℃5sec(反转录酶的失活反应)；4℃。
注意：得到的RT反应液加入到下一步的Real Time PCR反应体系中，其加入量不超过Real Time PCR反应体积的1/10(V/V)量。
按照表2进行反应体系配制。
表2两步法TaqMan探针法试剂盒反应体系
组分 体系
Premix Ex Taq 10×(N+1)μL
上游引物BVDV-F(10μM) 0.4至2.4×(N+1)μL
下游引物BVDV-R(10μM) 0.4至2.4×(N+1)μL
TaqMan探针BVDV-P(10μM) 0.4至0.8×(N+1)μL
上游引物GAPDH-F(10μM) 0.4至2.4×(N+1)μL
下游引物GAPDH-R(10μM) 0.4至2.4×(N+1)μL
TaqMan探针GAPDH-P(10μM) 0.2至0.8×(N+1)μL
ROX Reference Dye II 0.05至0.2×(N+1)μL
DNA ≤2×(N+1)μL
无酶水 补齐至20×(N+1)μL
总体系 20μL
经过优化后的反应条件为：
第一阶段：预变性95℃30sec；
第二阶段：PCR反应95℃5sec，60℃34sec，45个循环，在每次循环第二阶段(60℃34sec)收集荧光信号(BVDV报告基团“FAM”，淬灭基团“BHQ1”，GAPDH报告基团“VIC”，淬灭基团“BHQ1”)。
试验检测结束后，根据采集的动态荧光信号曲线和CT值综合判定结果。
结果判定：
(1)结果分析条件设定：根据仪器噪声情况对阈值设定进行调整，以阈值线刚好超过阴性对照扩增线的最高点为准。
(2)质控标准同时满足以下三个条件，试验有效。否则，实验视为无效：
①FAM通道(BVDV检测)阴性对照应无Ct值并且无BVDV扩增曲线(参见附录A)；
②FAM通道(BVDV检测)阳性对照的Ct值应≤35，并出现典型的BVDV扩增曲线(参见附录A)；
③VIC通道(GAPDH检测)阴性对照应无Ct值并且无GAPDH扩增曲线(参见附录B)。
(3)根据FAM通道(BVDV检测)和VIC通道(GAPDH检测)Ct值对试验结果进行判定，判定分为：
(3-1)VIC通道(GAPDH检测)样品无Ct值并且无GAPDH扩增曲线时，或VIC通道(GAPDH检测)样品Ct值>35并且出现典型的GAPDH扩增曲线(参见附录B)时，表明反应体系中有抑制成分或核酸丢失，需要重新采样、提取或进一步纯化核酸后复检。
(3-2)VIC通道(GAPDH检测)样品的Ct值≤35并且出现典型的GAPDH扩增曲线时，根据FAM通道(BVDV检测)Ct值，对试验结果进行判定：
①FAM通道(BVDV检测)样品无Ct值，且无BVDV扩增曲线，表示样品中无BVDV核酸，判为阴性；
②FAM通道(BVDV检测)样品Ct值≤42，且出现典型的BVDV扩增曲线，表示样品中存在BVDV核酸，判为阳性；
③FAM通道(BVDV检测)样品Ct值>42，且出现典型的BVDV扩增曲线的样品需复检。复检仍出现上述结果的，判为阳性，否则判为阴性。
进一步地，所述的两步法SYBR Green I法试剂盒至少包括以下组分：
试剂盒对照：BVDV病毒液阳性对照或者BVDV重组质粒阳性对照，GAPDH重组质粒，阴性对照；
cDNA合成体系：PrimeScript RT Master Mix和无酶水；
SYBR荧光PCR反应体系：TB Green Premix Ex TaqⅡ，上游引物BVDV-F，下游引物BVDV-R，上游引物GAPDH-F，下游引物GAPDH-R，ROX Reference Dye II，无酶水。
参考核酸提取或纯化试剂盒说明书进行操作，每个非猪源性样品(200-400uL)在核酸提取时均需加入5-20uL GAPDH重组质粒后，再进行核酸提取；猪源性样品不必加入GAPDH重组质粒，直接进行核酸提取。
按照表3进行cDNA合成反应体系配制。
表3两步法SYBR Green I法试剂盒cDNA合成反应体系
组分 体系
PrimeScript RT Master Mix 2μL
RNA ≤6μL
无酶水 补齐至10μL
反应条件为：37℃15min(反转录反应)；85℃5sec(反转录酶的失活反应)；4℃。
注意：得到的RT反应液加入到下一步的Real Time PCR反应体系中，其加入量不要超过Real Time PCR反应体积的1/10(V/V)量。
按照表4进行反应体系配制。
表4两步法SYBR Green I法试剂盒反应体系
经过优化后的反应条件为：
第一阶段：预变性95℃30sec；
第二阶段：PCR反应95℃5sec，60℃34sec，45个循环，在每次循环第二阶段(60℃34sec)收集荧光信号(报告基团“SYBR”，淬灭基团“None”)；
第三阶段：溶解曲线采集程序，不同PCR仪的溶解曲线采集程序有所区别，一般使用仪器默认溶解曲线采集程序。BVDV的熔解温度为86.35±0.30℃，GAPDH的熔解温度为82.42±0.30℃。
试验检测结束后，根据采集的动态荧光信号曲线和CT值综合判定结果。
结果判定：
(1)质控标准同时满足以下四个条件，试验有效。否则，此次实验视为无效：
①阴性对照应无BVDV目的熔解曲线；
②阳性对照出现典型的BVDV目的熔解曲线(BVDV熔解温度为86.35±0.30℃)；
③阳性对照出现典型的GAPDH目的熔解曲线(GAPDH熔解温度为82.42±0.30℃)；
④阴性对照应无GAPDH目的熔解曲线。
(2)根据有无出现典型的BVDV目的熔解曲线、典型的GAPDH目的熔解曲线对试验结果进行判定，判定分为：
(2-1)样品无GAPDH目的熔解曲线时，表明反应体系中有抑制成分或核酸丢失，需要重新采样、提取或进一步纯化核酸后复检。
(2-2)样品出现典型的GAPDH目的熔解曲线(GAPDH熔解温度为82.42±0.30℃)(参见附录B)时，根据有无出现典型的BVDV目的熔解曲线，对试验结果进行判定：
①无BVDV目的熔解曲线，表示样品中无BVDV核酸，判为阴性；
②出现典型的BVDV目的熔解曲线(参见附录A)，表示样品中存在BVDV核酸，判为阳性。
进一步地，所述试剂盒中：
BVDV病毒液阳性对照：为BVDV病毒液，经甲醛37℃灭活后分装备用。BVDV重组质粒阳性对照：为含有BVDV 5′-UTR基因目的片段【基因组位置(1-385nt)】的重组质粒；
GAPDH重组质粒：为含有内参基因GAPDH目的片段【基因组位置(335-719nt)】的重组质粒。非猪源性样品加入GAPDH重组质粒后，再进行核酸提取；猪源性样品不必加入GAPDH重组质粒，直接进行核酸提取。
阴性对照：无酶水、已知BVDV阴性且GAPDH阴性的细胞培养液、或者已知BVDV阴性且GAPDH阴性的动物组织悬液。
无酶水：将焦碳酸二乙酯(DEPC)加入去离子水中至终浓度为0.1％(体积分数)，充分混合均匀后作用12h，分装，121℃±2℃高压灭菌30min，冷却后冷藏备用；
PrimeScript RT Master Mix、Premix Ex Taq、TB Green Premix Ex TaqⅡ、ROXReference Dye II、均为大连宝生物公司产品。
进一步地，所述试剂盒中：
BVDV病毒液阳性对照：为BVDV AV69株MDBK细胞传代产物，其病毒滴度为102.5FAID50/0.1mL至106.5FAID50/0.1mL，经甲醛37℃灭活后分装备用。
BVDV重组质粒阳性对照：为含有BVDV 5′-UTR基因目的片段【基因组位置(1-385nt)】的重组质粒，10 000拷贝数/μL至500 000拷贝数/μL。
GAPDH重组质粒：为含有内参基因GAPDH目的片段【基因组位置(335-719nt)】的重组质粒，10 000拷贝数/uL至500 000拷贝数/uL。
优选地，BVDV重组质粒阳性对照：为含有BVDV-1Oregon C24V株(GenBank登录号：AF091605)5′-UTR基因目的片段的重组质粒，或者含有BVDV-2SH-28株(GenBank登录号：HQ258810.1)5′-UTR基因目的片段的重组质粒，或者含有BVDV-3Th/04_KhonKaen株(GenBank登录号：NC_012812.1)5′-UTR基因目的片段的重组质粒。
实施例1
用于BVDV核酸检测的两步法TaqMan探针法试剂盒，包括：
(1)试剂盒对照
BVDV重组质粒阳性对照：为含有BVDV-3Th/04_KhonKaen株(GenBank登录号：NC_012812.1)5′-UTR基因目的片段的重组质粒，500000拷贝数/uL。
GAPDH重组质粒：为含有GAPDH内参基因目的片段的重组质粒，500000拷贝数/uL。
阴性对照：已知BVDV阴性且GAPDH阴性的动物脾脏组织悬液。
(2)cDNA合成体系
PrimeScript RT Master Mix为大连宝生物公司产品。
无酶水：将焦碳酸二乙酯(DEPC)加入去离子水中至终浓度为0.1％(体积分数)，充分混合均匀后作用12h，分装，121℃高压灭菌30min，冷却后冷藏备用。
(3)TaqMan荧光PCR反应体系
Premix Ex Taq、ROX Reference Dye II均为大连宝生物公司产品。
无酶水：将焦碳酸二乙酯(DEPC)加入去离子水中至终浓度为0.1％(体积分数)，充分混合均匀后作用12h，分装，121℃高压灭菌30min，冷却后冷藏备用。
上游引物BVDV-F：5′-CAGTGAGTTCVTTGGATNGCCG-3′。
下游引物BVDV-R：5′-TRGGTTAAGATGTRCYGTGGG-3′。
TaqMan探针BVDV-P：5′-FAM-TGAGTACAGGGDAGTCGTCAATGGTTCG-BHQ1-3′。
上游引物GAPDH-F：5′-CCCCAACGTGTCGGTTGT-3′。
下游引物GAPDH-R：5′-CTTCACCACCTTCTTGATGTCATC-3′。
TaqMan探针GAPDH-P：5′-VIC-ATCTGACCTGCCGCCTGGAGAAACC-BHQ1-3′。
参考核酸提取或纯化试剂盒说明书进行操作，每个非猪源性样品(400uL)在核酸提取时均需加入10uL GAPDH重组质粒后，再进行核酸提取；猪源性样品不必加入GAPDH重组质粒，直接进行核酸提取。
按照表5进行cDNA合成反应体系配制。
表5两步法TaqMan探针法试剂盒cDNA合成反应体系
组分 体积(μL)
PrimeScript RT Master Mix 2
DNA/RNA 2
无酶水 6
反应条件为：37℃15min(反转录反应)；85℃5sec(反转录酶的失活反应)；4℃。
注意：得到的RT反应液加入到下一步的Real Time PCR反应体系中，其加入量不要超过Real Time PCR反应体积的1/10(V/V)量。
按照表6进行TaqMan荧光PCR反应体系配制。
表6BVDV核酸检测TaqMan探针法试剂盒(两步法)反应体系
组分 体积(μL)
Premix Ex Taq 10
上游引物BVDV-F(10μM) 1.6
下游引物BVDV-R(10μM) 1.6
TaqMan探针BVDV-P(10μM) 0.8
上游引物GAPDH-F(10μM) 0.4
下游引物GAPDH-R(10μM) 0.4
TaqMan探针GAPDH-P(10μM) 0.2
ROX Reference Dye II 0.2
cDNA 2
无酶水 2.8
总体系 20
经过优化后的反应条件为：
第一阶段：预变性95℃30sec；
第二阶段：PCR反应95℃5sec，60℃34sec，45个循环，在每次循环第二阶段(60℃34sec)收集荧光信号(报告基团“FAM”，淬灭基团“BHQ1”)。
试验检测结束后，根据采集的动态荧光信号曲线和CT值综合判定结果。
结果判定：
(1)结果分析条件设定：根据仪器噪声情况对阈值设定进行调整，以阈值线刚好超过阴性对照扩增线的最高点为准。
(2)质控标准同时满足以下三个条件，试验有效。否则，实验视为无效：
①FAM通道(BVDV检测)阴性对照应无Ct值并且无BVDV扩增曲线(参见附录A)；
②FAM通道(BVDV检测)阳性对照的Ct值应≤35，并出现典型的BVDV扩增曲线(参见附录A)；
③VIC通道(GAPDH检测)阴性对照应无Ct值并且无GAPDH扩增曲线(参见附录B)。
(3)根据FAM通道(BVDV检测)和VIC通道(GAPDH检测)Ct值对试验结果进行判定，判定分为：
(3-1)VIC通道(GAPDH检测)样品无Ct值并且无GAPDH扩增曲线时，或VIC通道(GAPDH检测)样品Ct值>35并且出现典型的GAPDH扩增曲线(参见附录B)时，表明反应体系中有抑制成分或核酸丢失，需要重新采样、提取或进一步纯化核酸后复检。
(3-2)VIC通道(GAPDH检测)样品的Ct值≤35并且出现典型的GAPDH扩增曲线时，根据FAM通道(BVDV检测)Ct值，对试验结果进行判定：
①FAM通道(BVDV检测)样品无Ct值，且无BVDV扩增曲线，表示样品中无BVDV核酸，判为阴性；
②FAM通道(BVDV检测)样品Ct值≤42，且出现典型的BVDV扩增曲线，表示样品中存在BVDV核酸，判为阳性；
③FAM通道(BVDV检测)样品Ct值>42，且出现典型的BVDV扩增曲线的样品需复检。复检仍出现上述结果的，判为阳性，否则判为阴性。
实施例2
用于BVDV核酸检测的两步法SYBR Green I法试剂盒，包括：
(1)试剂盒对照
BVDV重组质粒阳性对照：为含有BVDV-3Th/04_KhonKaen株(GenBank登录号：NC_012812.1)5′-UTR基因目的片段的重组质粒，500 000拷贝数/uL。
GAPDH重组质粒：为含有GAPDH内参基因目的片段的重组质粒，500000拷贝数/uL。
阴性对照：已知BVDV阴性且GAPDH阴性的细胞培养液。
(2)cDNA合成体系
PrimeScript RT Master Mix为大连宝生物公司产品。
无酶水：将焦碳酸二乙酯(DEPC)加入去离子水中至终浓度为0.1％(体积分数)，充分混合均匀后作用12h，分装，121℃高压灭菌30min，冷却后冷藏备用。
(3)SYBR荧光PCR反应体系
TB Green Premix Ex TaqⅡ、ROX Reference Dye II均为大连宝生物公司产品。
无酶水：将焦碳酸二乙酯(DEPC)加入去离子水中至终浓度为0.1％(体积分数)，充分混匀后作用12h，分装，121℃高压灭菌30min，冷却后冷藏备用。
上游引物BVDV-F：5′-CAGTGAGTTCVTTGGATNGCCG-3′。
下游引物BVDV-R：5′-TRGGTTAAGATGTRCYGTGGG-3′。
上游引物GAPDH-F：5′-CCCCAACGTGTCGGTTGT-3′。
下游引物GAPDH-R：5′-CTTCACCACCTTCTTGATGTCATC-3′。
参考核酸提取或纯化试剂盒说明书进行操作，每个非猪源性样品(400uL)在核酸提取时均需加入10uL GAPDH重组质粒后，再进行核酸提取；猪源性样品不必加入GAPDH重组质粒，直接进行核酸提取。
按照表7进行cDNA合成反应体系配制。
表7两步法SYBR Green I法试剂盒cDNA合成反应体系
组分 体积(μL)
PrimeScript RT Master Mix 2
RNA 2
无酶水 6
反应条件为：37℃15min(反转录反应)；85℃5sec(反转录酶的失活反应)；4℃。
注意：得到的RT反应液加入到下一步的Real Time PCR反应体系中，其加入量不要超过Real Time PCR反应体积的1/10(V/V)量。
按照表8进行SYBR荧光PCR反应体系配制。
表8两步法SYBR Green I法试剂盒反应体系
组分 体积(μL)
TB Green Premix Ex TaqⅡ 10
上游引物BVDV-F(10μM) 1
下游引物BVDV-R(10μM) 1
上游引物GAPDH-F(10μM) 0.4
下游引物GAPDH-R(10μM) 0.4
ROX Reference Dye II 0.2
cDNA 2
无酶水 5
总体系 20
经过优化后的反应条件为：
第一阶段：预变性95℃30sec；
第二阶段：PCR反应95℃5sec，60℃34sec，45个循环，在每次循环第二阶段(60℃34sec)收集荧光信号(报告基团“SYBR”，淬灭基团“None”)。
第三阶段：溶解曲线采集程序，不同PCR仪的溶解曲线采集程序有所区别，一般使用仪器默认溶解曲线采集程序。
试验检测结束后，根据采集的动态荧光信号曲线和CT值综合判定结果。
结果判定：
(1)质控标准同时满足以下四个条件，试验有效。否则，此次实验视为无效：
①阴性对照应无BVDV目的熔解曲线；
②阳性对照出现典型的BVDV目的熔解曲线(BVDV熔解温度为86.35±0.30℃)；
③阳性对照出现典型的GAPDH目的熔解曲线(GAPDH熔解温度为82.42±0.30℃)；
④阴性对照应无GAPDH目的熔解曲线。
(2)根据有无出现典型的BVDV目的熔解曲线、典型的GAPDH目的熔解曲线对试验结果进行判定，判定分为：
(2-1)样品无GAPDH目的熔解曲线时，表明反应体系中有抑制成分或核酸丢失，需要重新采样、提取或进一步纯化核酸后复检。
(2-2)样品出现典型的GAPDH目的熔解曲线(GAPDH熔解温度为82.42±0.30℃)，根据有无出现典型的BVDV目的熔解曲线，对试验结果进行判定：
①无BVDV目的熔解曲线，表示样品中无BVDV核酸，判为阴性；
②出现典型的BVDV目的熔解曲线，表示样品中存在BVDV核酸，判为阳性。
应用例1
本发明试剂盒检测“BVDV-1和GAPDH基因”、“BVDV-2和GAPDH基因”、“BVDV-3和GAPDH基因”的敏感性、线性关系和扩增效率。
1系列标准样本制备
1.1“BVDV-1和GAPDH基因”的敏感性、线性关系和扩增效率相关的系列标准样本
将BVDV-1AV69株MDBK细胞传代产物经甲醛37℃灭活后，与GAPDH重组质粒混合制备成系列标准样本(a至g)，如表9。
表9系列标准样本(BVDV-1病毒液和GAPDH基因)
标准样本a BVDV-1AV69株103.5FAID50/0.1mL和GAPDH重组质粒100 000拷贝数/uL混合液
标准样本b BVDV-1AV69株102.5FAID50/0.1mL和GAPDH重组质粒10 000拷贝数/uL混合液
标准样本c BVDV-1AV69株101.5FAID50/0.1mL和GAPDH重组质粒1 000拷贝数/uL混合液
标准样本d BVDV-1AV69株100.5FAID50/0.1mL和GAPDH重组质粒100拷贝数/uL混合液
标准样本e BVDV-1AV69株10-0.5FAID50/0.1mL和GAPDH重组质粒10拷贝数/uL混合液
标准样本f BVDV-1AV69株10-1.5FAID50/0.1mL和GAPDH重组质粒1拷贝数/uL混合液
标准样本g BVDV-1AV69株10-2.5FAID50/0.1mL和GAPDH重组质粒0.1拷贝数/uL混合液
1.2“BVDV-2和GAPDH基因”的敏感性、线性关系和扩增效率相关的系列标准样本
将BVDV-2SH-28株重组质粒、GAPDH重组质粒混合制备成系列标准样本(h至m)，如表10。
表10系列标准样本(BVDV-2和GAPDH基因)
标准样本h BVDV-2重组质粒100 000拷贝数/uL和GAPDH重组质粒100 000拷贝数/uL混合液
标准样本i BVDV-2重组质粒10 000拷贝数/uL和GAPDH重组质粒10 000拷贝数/uL混合液
标准样本j BVDV-2重组质粒1 000拷贝数/uL和GAPDH重组质粒1 000拷贝数/uL混合液
标准样本k BVDV-2重组质粒100拷贝数/uL和GAPDH重组质粒100拷贝数/uL混合液
标准样本l BVDV-2重组质粒10拷贝数/uL和GAPDH重组质粒10拷贝数/uL混合液
标准样本m BVDV-2重组质粒1拷贝数/uL和GAPDH重组质粒1拷贝数/uL混合液
1.3本发明引物对、探针组检测“BVDV-3和GAPDH基因”的敏感性、线性关系和扩增效率相关的系列标准样本
将BVDV-3Th/04_KhonKaen株重组质粒、GAPDH重组质粒混合制备成系列标准样本(n至s)，如表11。
表11系列标准样本(BVDV-3和GAPDH基因)
标准样本n BVDV-3重组质粒100 000拷贝数/uL和GAPDH重组质粒100 000拷贝数/uL混合液
标准样本o BVDV-3重组质粒10 000拷贝数/uL和GAPDH重组质粒10 000拷贝数/uL混合液
标准样本p BVDV-3重组质粒1 000拷贝数/uL和GAPDH重组质粒1 000拷贝数/uL混合液
标准样本q BVDV-3重组质粒100拷贝数/uL和GAPDH重组质粒100拷贝数/uL混合液
标准样本r BVDV-3重组质粒10拷贝数/uL和GAPDH重组质粒10拷贝数/uL混合液
标准样本s BVDV-3重组质粒1拷贝数/uL和GAPDH重组质粒1拷贝数/uL混合液
2病毒核酸提取
将实施例1中的阳性对照400μL、阴性对照取400μL；
另取病毒滴度为102.5FAID50/0.1mL的CSFV Thiverval株400μL，为病毒对照(在核酸提取时加入GAPDH重组质粒)；
采用动物病毒DNA/RNA快速提取试剂盒(西安天隆科技有限公司)，经NP968-S型全自动核酸提取仪(西安天隆科技有限公司)进行核酸提取。
3RT-PCR扩增
3.1“BVDV-1和GAPDH基因”的敏感性、线性关系和扩增效率
将获得的系列标准样本(a至g)核酸，按照实施例1中两步法TaqMan探针法试剂盒进行RT-PCR扩增，并分别设立阳性对照、阴性对照和病毒对照。
3.2“BVDV-2和GAPDH基因”的敏感性、线性关系和扩增效率
将获得的系列标准样本(h至m)核酸，按照实施例1中两步法TaqMan探针法试剂盒进行RT-PCR扩增，并设立阳性对照、阴性对照和病毒对照。
3.3“BVDV-3和GAPDH基因”的敏感性、线性关系和扩增效率
将获得的系列标准样本(n至s)核酸，按照实施例1中两步法TaqMan探针法试剂盒进行RT-PCR扩增，并设立阳性对照、阴性对照和病毒对照。
4结果
试验中质控标准同时满足实施例1所述的三个条件，试验有效。病毒对照检测结果显示，VIC通道(GAPDH检测)病毒对照的Ct值≤35并且出现典型的GAPDH扩增曲线，表明病毒对照核酸提取、反转录和扩增效果良好；FAM通道(BVDV检测)病毒对照无Ct值并且无BVDV扩增曲线，表明本发明实施例1试剂盒可区别BVDV核酸和CSFV核酸，特异性强。
4.1“BVDV-1和GAPDH基因”的敏感性、线性关系和扩增效率结果
通过对系列稀释的BVDV-1病毒液和GAPDH重组质粒模板(a至g)进行检测。敏感性结果显示，本发明两步法TaqMan探针法试剂盒对BVDV-1病毒液的最低检出限为10- 0.5FAID50/0.1mL，对GAPDH重组质粒模板的最低检出限为0.1拷贝数/uL，见图1和图2。线性关系和扩增效率结果显示，本发明BVDV核酸检测TaqMan探针法试剂盒(两步法)在10- 0.5FAID50/0.1mL～103.5FAID50/0.1mL病毒滴度呈现良好的线性关系，其相关系数(R2)为0.986，扩增效率为113.465，标准曲线为：y＝-3.036x+46.601；在在0.1拷贝数/uL～100000拷贝数/uL GAPDH模板拷贝数呈现良好的线性关系，其相关系数(R2)为0.998，扩增效率为105.547，标准曲线为：y＝-3.196x+40.935。这些说明，本发明TaqMan探针法试剂盒(两步法)检测“BVDV-1和GAPDH基因”的标准曲线线性度好，可信度高。
4.2检测“BVDV-2和GAPDH基因”的敏感性、线性关系和扩增效率结果
通过对系列稀释的BVDV-2和GAPDH重组质粒模板(h至m)进行检测。敏感性结果显示，本发明TaqMan探针法试剂盒(两步法)对BVDV-2重组质粒模板的最低检出限为1拷贝数/uL，对GAPDH重组质粒模板的最低检出限为1拷贝数/uL，见图3和图4。线性关系和扩增效率结果显示，本发明BVDV核酸检测TaqMan探针法试剂盒(两步法)在1拷贝数/uL～100 000拷贝数/uL BVDV-2模板拷贝数呈现良好的线性关系，其相关系数(R2)为0.999，扩增效率为97.724，标准曲线为：y＝-3.378x+41.564；在1拷贝数/uL～100 000拷贝数/uL GAPDH模板拷贝数呈现良好的线性关系，其相关系数(R2)为0.999，扩增效率为101.034，标准曲线为：y＝-3.297x+40.722。这些说明，本发明BVDV核酸检测TaqMan探针法试剂盒(两步法)检测“BVDV-2和GAPDH基因”的标准曲线线性度好，可信度高。
4.3检测“BVDV-3和GAPDH基因”的敏感性、线性关系和扩增效率结果
通过对系列稀释的BVDV-3和GAPDH重组质粒模板(n至s)进行检测。敏感性结果显示，本两步法TaqMan探针法试剂盒对BVDV-3重组质粒模板的最低检出限为10拷贝数/uL，对GAPDH重组质粒模板的最低检出限为1拷贝数/uL，见图5和图6。线性关系和扩增效率结果显示，本发明BVDV核酸检测TaqMan探针法试剂盒(两步法)在10拷贝数/uL～100 000拷贝数/uL BVDV-3模板拷贝数呈现良好的线性关系，其相关系数(R2)为0.999，扩增效率为95.222，标准曲线为：y＝-3.442x+46.026；在1拷贝数/uL～100 000拷贝数/uL GAPDH模板拷贝数呈现良好的线性关系，其相关系数(R2)为0.999，扩增效率为109.218，标准曲线为：y＝-3.181x+39.696。这些说明，本发明BVDV核酸检测TaqMan探针法试剂盒(两步法)检测“BVDV-3和GAPDH基因”的标准曲线线性度好，可信度高。
应用例2
将实施例1所制备两步法TaqMan探针法试剂盒，与现有检测BVDV核酸的荧光定量RT-PCR试剂盒(专利申请号为202011330477.8)进行对比试验。
1 样品
1.1 猪源性样品
取哺乳仔猪肾脏(a1)、脾脏(b1)、肠系膜淋巴结(C1)、腹股沟淋巴结(d1)、肺脏(e1)各300mg，另取保育猪肾脏(a2)、脾脏(b2)、肠系膜淋巴结(C2)、腹股沟淋巴结(d2)、肺脏(e2)各300mg，分别制成10％组织匀浆，反复冻融3次后离心取上清液备用。
1.2非猪源性样品
取育成牛粪便样品(f1)300mg制成10％匀浆液，反复冻融3次后离心取上清液备用。采集育成牛血液分离牛外周血白细胞(g1)2.0mL，并取育成牛鼻拭子(h1)放入盛有2.0mL PBS，反复冻融3次后离心取上清液备用。
另取成年牛粪便样品(f2)300mg制成10％匀浆液，反复冻融3次后离心取上清液备用。采集成年牛血液分离牛外周血白细胞(g2)2.0mL，并取成年牛鼻拭子(h2)放入盛有2.0mL PBS，反复冻融3次后离心取上清液备用。
取育成羊粪便样品(I1)300mg制成10％匀浆液，反复冻融3次后离心取上清液备用。采集育成羊血液分离牛外周血白细胞(J1)2.0mL，并取育成羊鼻拭子(K1)放入盛有2.0mL PBS，反复冻融3次后离心取上清液备用。
另取成年羊粪便样品(I2)300mg制成10％匀浆液，反复冻融3次后离心取上清液备用。采集成年羊血液分离牛外周血白细胞(J2)2.0mL，并取成年羊鼻拭子(K2)放入盛有2.0mL PBS，反复冻融3次后离心取上清液备用。
2病毒核酸提取
将实施例1中的阳性对照400μL、阴性对照取400μL；
取现有专利试剂盒中的BVDV-1、BVDV-2、BVDV-3相同浓度的混合质粒阳性对照400μL、阴性对照400μL；
另取病毒滴度为102.5FAID50/0.1mL的CSFV Thiverval株400μL，为病毒对照(采用实施例1试剂盒在核酸提取时非猪源性样品需加入GAPDH重组质粒)；
猪源性样品a1、b1、C1、d1、e1、a2、b2、C2、d2、e2；
非猪源性样品f1、g1、h1、f2、g2、h2、I1、J1、K1、I2、J2、K2(采用实施例1试剂盒在核酸提取时非猪源性样品需加入GAPDH重组质粒)；
采用动物病毒DNA/RNA快速提取试剂盒(西安天隆科技有限公司)，经NP968-S型全自动核酸提取仪(西安天隆科技有限公司)进行核酸提取。
3cDNA合成
将提取的核酸，分别按照实施例1试剂盒和现有专利试剂盒所述的cDNA合成体系进行反转录。
4RT-PCR扩增
分别按照实施例1试剂盒和现有专利试剂盒所述方法进行RT-PCR扩增。其中，按照实施例1试剂盒所述方法设立阳性对照、阴性对照；按照现有专利试剂盒所述方法设立BVDV-1、BVDV-2、BVDV-3相同浓度的混合质粒阳性对照、阴性对照。
5结果
5.1质控标准检测结果
本发明实施例1所制备两步法TaqMan探针法试剂盒质控标准同时满足实施1所述的三个条件，所以实施例1试剂盒试验有效。
现有专利试剂盒质控标准检测结果显示，BVDV-1、BVDV-2、BVDV-3相同浓度的混合质粒阳性对照扩增结果均为阳性，阴性对照未见扩增曲线，所以现有专利试剂盒试验有效。
5.2样品检测结果
本发明实施例1所制备试剂盒检测样品结果显示，(1)VIC通道(GAPDH检测)猪源性样品a1、b1、C1、d1、e1的Ct值≤35并且出现典型的GAPDH扩增曲线，表明猪源性样品a1、b1、C1、d1、e1采样、运输、样品处理、核酸提取、反转录和扩增效果良好；VIC通道(GAPDH检测)非猪源性样品(f1、g1、h1、f2、g2、h2、I1、J1、K1、I2、J2、K2)的Ct值≤35并且出现典型的GAPDH扩增曲线，表明非猪源性样品核酸提取、反转录和扩增效果良好；FAM通道(BVDV检测)样品a1、b1、C1、d1、e1、f1、g1、h1、f2、g2、h2、I1、J1、K1、I2、J2、K2无Ct值，且无BVDV扩增曲线，表示样品a1、b1、C1、d1、e1、f1、g1、h1、f2、g2、h2、I1、J1、K1、I2、J2、K2中无BVDV核酸，判为阴性。(2)VIC通道(GAPDH检测)猪源性样品a2、b2、C2、d2、e2无Ct值并且无GAPDH扩增曲线，表明反应体系中猪源性样品a2、b2、C2、d2、e2有抑制成分或核酸丢失，存在“假阴性”的风险；FAM通道(BVDV检测)猪源性样品a2、b2、C2、d2、e2无Ct值且无BVDV扩增曲线，但是因为VIC通道(GAPDH检测)无Ct值并且无GAPDH扩增曲线，因此猪源性样品a2、b2、C2、d2、e2需要重新采样、提取或进一步纯化核酸后复检。(3)VIC通道(GAPDH检测)病毒对照的Ct值≤35并且出现典型的GAPDH扩增曲线，表明病毒对照核酸提取、反转录和扩增效果良好；FAM通道(BVDV检测)病毒对照无Ct值，且无BVDV扩增曲线，表示病毒对照中无BVDV核酸，判为BVDV阴性。
现有专利试剂盒检测样品结果显示，(1)猪源性样品a1、b1、C1、d1、e1、a2、b2、C2、d2、e2以及非猪源性样品f1、g1、h1、f2、g2、h2、I1、J1、K1、I2、J2、K2，均未见扩增曲线，判为阴性。(2)ROX通道(BVDV-3检测)病毒对照产生了扩增曲线，扩增结果为阳性，表明现有专利试剂盒会误检CSFV，在对猪源样品检测时可能出现“假阳性”。
6讨论
因为样品在采集、运输、处理、核酸提取、反转录、扩增反应等多个过程都有存在“假阴性”的可能，为了避免“假阴性”出现，本发明实施例1具有扩增内参基因GAPDH的引物对、检测GAPDH扩增产物的TaqMan探针序列、GAPDH重组质粒。因此，
(1)在猪源性样品检测时，本发明实施例1可以监测采样、运输、样品处理、核酸提取、反转录和扩增效果，如：监测是否采集到了上皮细胞，监测是否采集到足够量的样本细胞，监测采样、提取、扩增检测等整个实验操作过程的准确性。本试验中，VIC通道(GAPDH检测)猪源性样品a2、b2、C2、d2、e2无Ct值并且无GAPDH扩增曲线，表明猪源性样品a2、b2、C2、d2、e2存在导致“假阴性”的风险，需要重新采样、提取或进一步纯化核酸后复检，而现有专利试剂盒则无法对采样、运输、样品处理过程进行监测。
(2)本发明实施例1在非猪源性样品检测时，可以监测每个样品核酸提取、反转录和扩增效果，而现有专利试剂盒则无法进行监测。
此外，现有专利试剂盒检测待测样品为牛鼻拭子和粪便样品，若检测猪源样品时，猪源样品中可能存在的CSFV，会引起现有专利试剂盒误检，可能出现“假阳性”。本发明实施例1所制备试剂盒检测病毒对照CSFV核酸为阴性，具有更好的特异性。
应用例3
将实施例2所制备两步法SYBR Green I法试剂盒，与现有BVDV核酸检测试剂盒(专利申请号为201310516849.X)进行对比试验。
1样品
取哺乳仔猪肾脏(A1)、脾脏(B1)、肠系膜淋巴结(C1)、腹股沟淋巴结(D1)、肺脏(E1)各300mg，另取保育猪肾脏(A2)、脾脏(B2)、肠系膜淋巴结(C2)、腹股沟淋巴结(D2)、肺脏(E2)各300mg，分别制成10％组织匀浆，反复冻融3次后离心取上清液备用。
2病毒核酸提取
将实施例2中的阳性对照400μL、阴性对照取400μL；
将样品A1、B1、C1、D1、E1、A2、B2、C2、D2、E2；
采用动物病毒DNA/RNA快速提取试剂盒(西安天隆科技有限公司)，经NP968-S型全自动核酸提取仪(西安天隆科技有限公司)进行核酸提取。
3cDNA合成
将提取的核酸，分别按照实施例2试剂盒和现有专利试剂盒所述的cDNA合成体系进行反转录。
4RT-PCR扩增
分别按照实施例2试剂盒和现有专利试剂盒所述方法进行RT-PCR扩增。其中，按照实施例2试剂盒所述方法设立阳性对照和阴性对照；按照现有专利试剂盒所述方法设立BVDVI阳性质粒、BVDVII阳性质粒、GAPDH阳性质粒和阴性对照。
5结果
5.1质控标准检测结果
本发明实施例2所制备试剂盒质控标准同时满足实施例2所述的四个条件，所以实施例2试剂盒试验有效。
现有专利试剂盒质控标准检测结果显示，BVDVI阳性质粒、BVDVII阳性质粒和GAPDH阳性质粒均能得到目的溶解曲线，阴性对照无扩增溶解曲线，所以现有专利试剂盒试验有效。
5.2样品检测结果
本发明实施例2所制备BVDV核酸检测SYBR Green I法试剂盒(两步法)检测样品结果显示，(1)GAPDH检测，样品A1、B1、C1、D1、E1、A2、B2、C2、D2、E2的熔解曲线熔解温度为82.42±0.30℃并且出现典型的GAPDH扩增曲线，表明样品A1、B1、C1、D1、E1、A2、B2、C2、D2、E2采样、运输、样品处理、核酸提取、反转录和扩增效果良好；(2)BVDV检测，样品A1、B1、C1、D1、E1、A2、B2、C2、D2、E2无熔解曲线，且无BVDV扩增曲线，表示样品A1、B1、C1、D1、E1、A2、B2、C2、D2、E2中无BVDV核酸，判为阴性。
现有专利试剂盒检测样品结果显示，样品A1、B1、C1、D1、E1、A2、B2、C2、D2、E2的目标模板和内标模板检测均无扩增溶解曲线。
6讨论
现有专利试剂盒按照牛GAPDH的mRNA特异性核苷酸序列，研制了牛GAPDH内标检测引物，其检测组织样品来源于牛，无法扩增猪GAPDH基因，所以样品A1、B1、C1、D1、E1、A2、B2、C2、D2、E2的内标模板检测无扩增溶解曲线，无法了解猪源性组织样本在采集、运输、处理、核酸提取、反转录、扩增反应等多个过程中是否存在“假阴性”。现有专利试剂盒不适用于猪源性组织样本检测，且无法检测BVDV-3。本发明实施例2所制备试剂盒不仅适用于猪源性组织样本检测，避免“假阴性”“假阳性”出现，而且可同时检测样品中BVDV-1、BVDV-2和BVDV-3核酸。
附录A BVDV核酸阴性及阳性典型扩增曲线
FAM通道(BVDV检测)阴性对照及阳性对照典型的BVDV扩增曲线见图7：(a)两步法TaqMan探针法试剂盒；(b)两步法SYBR Green I法试剂盒。附录B GAPDH核酸阴性及阳性典型扩增曲线
VIC通道(GAPDH检测)阴性及阳性典型的GAPDH扩增曲线见图8：(a)两步法TaqMan探针法试剂盒；(b)两步法SYBR Green I法试剂盒。

Claims (8)

1.以内参基因GAPDH为质控的BVDV核酸检测荧光定量RT-PCR引物和探针组合，其特征在于，包括：
1）扩增BVDV 5´-UTR的引物对
上游引物BVDV-F：5´- CAGTGAGTTCVTTGGATNGCCG -3´；
下游引物BVDV-R：5´- TRGGTTAAGATGTRCYGTGGG -3´；
2）检测BVDV 5´-UTR扩增产物的TaqMan探针
BVDV-P：5´- FAM-TGAGTACAGGGDAGTCGTCAATGGTTCG-BHQ1 -3´；
3）扩增猪内参基因GAPDH的引物对
上游引物GAPDH-F：5´- CCCCAACGTGTCGGTTGT -3´；
下游引物GAPDH-R：5´- CTTCACCACCTTCTTGATGTCATC -3´；
4）检测猪内参基因GAPDH扩增产物的TaqMan探针：
GAPDH-P：5´- VIC- ATCTGACCTGCCGCCTGGAGAAACC-BHQ1 -3´。
2. 一种以内参基因GAPDH为质控的BVDV核酸检测荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于，其包括扩增BVDV 5´-UTR的上游引物BVDV-F和下游引物BVDV-R以及扩增猪内参基因GAPDH的上游引物GAPDH-F和下游引物GAPDH-R，序列如下：
上游引物BVDV-F：5´-CAGTGAGTTCVTTGGATNGCCG-3´；
下游引物BVDV-R：5´-TRGGTTAAGATGTRCYGTGGG-3´；
上游引物GAPDH-F：5´-CCCCAACGTGTCGGTTGT-3´；
下游引物GAPDH-R：5´-CTTCACCACCTTCTTGATGTCATC-3´。
3. 根据权利要求2所述的一种以内参基因GAPDH为质控的BVDV核酸检测荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述的荧光定量RT-PCR试剂盒为两步法TaqMan探针法试剂盒或两步法SYBR Green I法试剂盒。
4.根据权利要求3所述的一种以内参基因GAPDH为质控的BVDV核酸检测荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述的两步法TaqMan探针法试剂盒至少包括以下组分：
试剂盒对照：BVDV病毒液阳性对照或者BVDV重组质粒阳性对照，GAPDH重组质粒，阴性对照；
cDNA合成体系：PrimeScript RT Master Mix和无酶水；
TaqMan荧光PCR反应体系：Premix Ex Taq，上游引物BVDV-F，下游引物BVDV-R，TaqMan探针BVDV-P，上游引物GAPDH-F，下游引物GAPDH-R，TaqMan探针GAPDH-P，ROX ReferenceDye II，无酶水。
5. 根据权利要求3所述的一种以内参基因GAPDH为质控的BVDV核酸检测荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述的两步法SYBR Green I法试剂盒至少包括以下组分：
试剂盒对照：BVDV病毒液阳性对照或者BVDV重组质粒阳性对照，GAPDH重组质粒，阴性对照；
cDNA合成体系：PrimeScript RT Master Mix和无酶水；
SYBR荧光PCR反应体系：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ，上游引物BVDV-F，下游引物BVDV-R，上游引物GAPDH-F，下游引物GAPDH-R，ROX Reference Dye II，无酶水。
6.根据权利要求3所述的一种以内参基因GAPDH为质控的BVDV核酸检测荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中，所述的BVDV病毒液阳性对照：为BVDV病毒液；
所述的BVDV重组质粒阳性对照为含有BVDV 5´-UTR基因目的片段的重组质粒；
所述的GAPDH重组质粒为含有内参基因GAPDH目的片段的重组质粒；
所述的阴性对照为无酶水、已知BVDV阴性且GAPDH阴性的细胞培养液、或者已知BVDV阴性且GAPDH阴性的动物组织悬液中的一种。
7. 根据权利要求6所述的一种以内参基因GAPDH为质控的BVDV核酸检测荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述的BVDV病毒液阳性对照为BVDV AV69株MDBK细胞传代产物，其病毒滴度为102.5 FAID50/0.1mL至106.5 FAID50/0.1mL；
所述的BVDV重组质粒阳性对照的浓度为10000拷贝数/mL至500000拷贝数/mL；
所述的GAPDH重组质粒的浓度为10000拷贝数/uL至500000拷贝数/uL。
8. 根据权利要求6所述的一种以内参基因GAPDH为质控的BVDV核酸检测荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述的BVDV重组质粒阳性对照：为含有BVDV-1 Oregon C24V株5´-UTR基因目的片段的重组质粒、含有BVDV-2 SH-28株5´-UTR基因目的片段的重组质粒、含有BVDV-3 Th/04_KhonKaen株5´-UTR基因目的片段的重组质粒中的一种。
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