CN118995971A - 一种特异性引物nf1、探针和发菜真伪鉴定实时荧光pcr检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种特异性引物NF1、探针和发菜真伪鉴定实时荧光PCR检测方法，具体属于荧光PCR检测技术领域。该实时荧光PCR检测方法包括如下步骤：S01、模板DNA提取；S02、引物与探针设计；S03、实时荧光PCR扩增检测。其中，设计得到的特异性引物探针组的灵敏度高和特异性强，可准确地将发菜与其他相似形态的藻类区分开来，便于海关、市场监管准确鉴定真假发菜。
Description
技术领域
本发明属于荧光PCR检测技术领域，具体涉及一种特异性引物NF1、探针和发菜真伪鉴定实时荧光PCR检测方法。
背景技术
发菜(Nostoc flagelliforme)是一种陆生藻，又名发状念珠藻，属于蓝藻门(Cyanophyta)念珠藻科(Nostocaceae)念珠藻属(Nostoc)，外形呈黑色细长状，犹如人的发丝，得名发菜。发菜被列入Ⅰ级国家重点保护的野生植物名录。生于我国新疆、宁夏、青海、甘肃等地，被视为山珍之一。发菜具有较高的食用、药用和保健价值，不仅含有多种人体所必需的氨基酸、微量元素和维生素。其生物活性成分既能够在体内外直接清除自由基，又具有特殊的抗肿瘤活性，其作用机制与抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞死亡以及抑制细胞的侵袭迁移有关.此外，发菜还有较强的免疫作用，可以提高患病或正常动物的免疫功能。
但是由于长期以来人类对于野生资源的过度开发利用，加之环境变化等多种因素的影响，发菜面临资源减少、草场退化和沙化等危机，近年来这一现象已引起有关专家和产业部门的重视。
由于发菜价格较贵，市场上常有假发菜出现，如有些商贩用玉米须染色晒干制成假冒发菜，而假冒发菜从形态上已经无法与发菜起到有效区分，不利于海关、市场监管准确执法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种特异性引物NF1、探针和发菜真伪鉴定实时荧光PCR检测方法。该特异性引物探针组的灵敏度高和特异性强，可准确地将发菜与其他相似形态的藻类区分开来，便于海关、市场监管准确鉴定真假发菜。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种特异性引物NF1：
上游引物F的核苷酸序列为：5′-TTGAGAATTCGCCGCTTCA-3′；
下游引物R的核苷酸序列为：5′-CCGACATCGGTGGAAATGA-3′。
一种引物探针组，包括上述特异性引物NF1和探针NF1-P，所述探针NF1-P的核苷酸序列为：5′-FAM-CCCACTGCCCAGCGCCTGTTC-TAMRA-3′。
作为优选，所述探针NF1-P的5′端为FAM荧光报告基团，3′端的淬灭基团为Eclipse。
引物探针组的优点：
通过选取发菜HK基因序列设计开发了引物探针，通过该引物探针可将发菜与沼泽念珠藻、林氏念珠藻等其他11种念珠藻进行区分，表明其具有良好的特异性和灵敏度。
本发明还提供了上述引物探针组的应用为：发菜及其发菜制品的真伪鉴定。
由于发菜相关产品中含有发菜DNA，因此本方法还可以用于发菜制品中发菜成分的检测。
本发明还提供了一种用于发菜真伪鉴定实时荧光PCR检测方法，该方法包括如下步骤：
S01、模板DNA提取
样品研磨打碎，取100mg粉样于1.5mL离心管中，加入CTAB提取液600μL，充分振荡混匀。65℃水浴30min，不时颠倒混匀；10000r/min离心5min，取上清，等体积氯仿(三氯甲烷:异戊醇＝24:1)抽提一次；取上清，再加入2倍体积的CTAB沉淀液，室温沉淀1h，12000r/m离心10min，弃上清；加入350μL NaCl溶液溶解沉淀，再用等体积氯仿抽提一次；取上清，加入等体积异丙醇，4℃放置10min以上，12000r/m离心10min，弃上清；70％乙醇洗涤1～2次，晾干后，加入100μL TE缓冲液溶解核酸，4℃保存备用。也可用相应市售核酸提取试剂盒。
发菜富含胶质物、蛋白质和碳水化合物，其藻丝体外含有很厚的角质鞘，这些特征都增加了发菜基因组DNA的提取难度。本实验采用凯杰的核酸提取试剂DNeasy Plant Minikit(69104)可有效提取到发菜的核酸。组氨酸激酶是由HK基因编码的一个信号传导酶家族，可以利用传感器结构域感知外界环境信号并传递到细胞内，再由应答调节蛋白接受信号并启动调节功能。
S02、引物与探针设计
在GenBank中查找并获得发菜基因序列CP024793.1，比对其同源性，选取同源性序列中的较保守区，采用Primer Express 3.0软件设计发菜的特异性引物和探针；
S03、实时荧光PCR扩增条件
Real-time PCR反应体系：Probe qPCR Master Mix(2×)10μL；
上游引物(10μmol/L)0.40μL；
下游引物(10μmol/L)0.40μL；
探针(10μmol/L)0.80μL；
ROX 0.4μL；
DNA模板4.0μL；
补水至20μL；
Real-time PCR的反应程序为：50℃2min；95℃10min；95℃15s，60℃30s，运行40个循环。
作为优选，步骤S03后还包括步骤S04；
S04、分别提取发菜、沼泽念珠藻、林氏念珠藻、海绵状念珠藻、点形念珠藻、灰色念珠藻、喜钙念珠藻、胶团念珠藻、池生念珠藻、叶状念珠藻、普通念珠藻、拟球状念珠藻样本的DNA，并对其进行Real-time PCR扩增检测，检测其反应体系的特异性；其中，反应条件与步骤S03相同。
作为优选，步骤S04后还包括步骤S05；
S05、取发菜的DNA，测定其DNA浓度，采用紫外分光光度法进行测量，对其DNA进行10倍梯度稀释，取不同浓度的DNA模板分别进行实时荧光PCR检测，得到对应浓度下的扩增曲线。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)、组氨酸激酶是由HK基因编码的一个信号传导酶家族，可以利用传感器结构域感知外界环境信号并传递到细胞内，再由应答调节蛋白接受信号并启动调节功能。在生物体中，HK作为信号感受机制的重要组成部分，可以使生物体在一定程度上适应及响应各种胁迫。研究表明发菜HK基因与响应干旱胁迫有光。通过BLAST比较分析，发菜组氨酸激酶基因序列与念珠藻属其他种类无相关性。本研究选取发菜HK基因序列设计开发了引物探针，通过该引物探针可将发菜与沼泽念珠藻、林氏念珠藻等其他11种念珠藻进行区分，表明其具有良好的特异性。
(2)同时，利用该方法对发菜真伪进行检测限量为5.3×10-4ng/μL，具有很好的灵敏度。本方法的建立有助于规范进出口发菜的监管，并可鉴定发菜的真伪，提高其鉴定准确率，为口岸精准、快速的鉴定提供了标准依据。
附图说明
图1为实施例1中发菜的实时荧光PCR特异性扩增结果图；
图2为实施例1中实时荧光PCR法检测发菜的灵敏度图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种用于发菜真伪鉴定实时荧光PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
S01、模板DNA提取
样品研磨打碎，取100mg粉样于1.5mL离心管中，加入CTAB提取液600μL，充分振荡混匀。65℃水浴30min，不时颠倒混匀；10000r/min离心5min，取上清，等体积氯仿(三氯甲烷:异戊醇＝24:1)抽提一次；取上清，再加入2倍体积的CTAB沉淀液，室温沉淀1h，12000r/m离心10min，弃上清；加入350μL NaCl溶液溶解沉淀，再用等体积氯仿抽提一次；取上清，加入等体积异丙醇，4℃放置10min以上，12000r/m离心10min，弃上清；70％乙醇洗涤1～2次，晾干后，加入100μL TE缓冲液溶解核酸，4℃保存备用。也可用相应市售核酸提取试剂盒。
其中：TransStart Probe qPCRSuperMix(北京全式金生物公司)；DNA提取试剂DNeasy Plant Mini kit(69104)(凯杰公司)；荧光定量PCR仪为ABI stepone plus。
S02、引物与探针设计
在GenBank中查找并获得发菜基因序列CP024793.1，比对其同源性，选取同源性序列中的较保守区，采用Primer Express 3.0软件设计发菜的特异性引物和探针。
S03、实时荧光PCR扩增条件
Real-time PCR反应体系：Probe qPCR Master Mix(2×)10μL；
上游引物(10μmol/L)0.40μL；
下游引物(10μmol/L)0.40μL；
探针(10μmol/L)0.80μL；
ROX 0.4μL；
DNA模板4.0μL；
补水至20μL；
Real-time PCR的反应程序为：50℃2min；95℃10min；95℃15s，60℃30s，运行40个循环。
S04、分别提取发菜、沼泽念珠藻、林氏念珠藻、海绵状念珠藻、点形念珠藻、灰色念珠藻、喜钙念珠藻、胶团念珠藻、池生念珠藻、叶状念珠藻、普通念珠藻、拟球状念珠藻样本的DNA，并对其进行Real-time PCR扩增检测，检测其反应体系的特异性；其中，反应条件与步骤S03相同。
本实验所采用的生物材料大部分购自中国科学院淡水藻种库。1份发菜由掖县老乡赠送。
实验材料
Table 1Samples
S05、取发菜的DNA，测定其DNA浓度，采用紫外分光光度法进行测量，对其DNA进行10倍梯度稀释，取不同浓度的DNA模板分别进行实时荧光PCR检测，得到对应浓度下的扩增曲线。
测试例1
分别提取发菜、沼泽念珠藻、林氏念珠藻等13个样本的核酸(参见实施例1实验材料)，并对其进行Real-time PCR扩增检测，观察其反应体系的特异性。反应条件为实施例S03相同。检测结果如图1所示。
测试结果分析：
发菜引物与荧光探针特异性研究表明，N1、N2的发菜样品出现典型的扩增曲线，而其他的样品均未出现典型的扩增曲线，如图2所示。结合前文BLAST的特异性与同源性比较的结果，这对引物与荧光探针在检测发菜方面具有十分良好的特异性。
测试例2
取发菜的DNA，测定其DNA浓度，采用紫外分光光度法进行测量，对其DNA进行10倍梯度稀释，取不同浓度的DNA模板分别进行实时荧光PCR的检测。检测结果如图2所示。
测试结果分析：
将发菜核酸提取出来后，测定其浓度为5.3ng/μL。将发菜的DNA基因组进行10倍系列稀释，用以检测灵敏度。此处采用Real-time PCR方法检测。扩增结果表明在核酸原液以及10-1～10-4倍的稀释液样本中均出现典型的扩增曲线，其Ct值分别为16.71、20.37、24.79、29.25、35.64。而在10-5和10-8DNA稀释液样本中未出现典型扩增曲线，其试验结果为阴性。如图2所示，检测限量取5.3×10-4ng/μL。
Claims (7)
1.一种特异性引物NF1，其特征在于：
上游引物F的核苷酸序列为：5′-TTGAGAATTCGCCGCTTCA-3′；
下游引物R的核苷酸序列为：5′-CCGACATCGGTGGAAATGA-3′。
2.一种引物探针组，其特征在于包括权利要求1所述的特异性引物NF1和探针NF1-P，所述探针NF1-P的核苷酸序列为：5′-FAM -CCCACTGCCCAGCGCCTGTTC-TAMRA-3′。
3.根据权利要求2所述引物探针组，其特征在于所述探针NF1-P的5′端为FAM荧光报告基团，3′端的淬灭基团为Eclipse。
4.根据权利要求1所述特异引物或权利要求2或3所述引物探针组的应用为：发菜及其发菜制品的真伪鉴定。
5.一种用于发菜真伪鉴定实时荧光PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
S01、模板DNA提取
样品研磨打碎，取100 mg粉样于1.5 mL离心管中，加入CTAB提取液600 µL，充分振荡混匀。65℃水浴30 min，不时颠倒混匀；10000 r/min离心5 min，取上清，等体积氯仿（三氯甲烷:异戊醇=24:1）抽提一次；取上清，再加入2倍体积的CTAB沉淀液，室温沉淀1 h，12000 r/m离心10 min，弃上清；加入350 µL NaCl溶液溶解沉淀，再用等体积氯仿抽提一次；取上清，加入等体积异丙醇，4℃放置10 min以上， 12000 r/m离心10 min，弃上清；70%乙醇洗涤1~2次，晾干后，加入100 µL TE缓冲液溶解核酸，4℃保存备用。也可用相应市售核酸提取试剂盒；
S02、引物与探针设计
在GenBank中查找并获得发菜基因序列CP024793.1，比对其同源性，选取同源性序列中的较保守区，采用Primer Express 3.0软件设计发菜的特异性引物和探针；
S03、实时荧光PCR扩增条件
Real-time PCR反应体系：Probe qPCR Master Mix（2×）10mL；
上游引物 (10 mmol/L ) 0.40mL；
下游引物 (10 mmol/L) 0.40 mL；
探针(10 mmol/L) 0.80 mL；
ROX 0.4 mL；
DNA模板4.0 mL；
补水至20 mL；
Real-time PCR的反应程序为：50℃ 2 min；95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，运行40个循环。
6.一种用于发菜真伪鉴定实时荧光PCR检测方法，其特征在于，步骤S03后还包括步骤S04；
S04、分别提取发菜、沼泽念珠藻、林氏念珠藻、海绵状念珠藻、点形念珠藻、灰色念珠藻、喜钙念珠藻、胶团念珠藻、池生念珠藻、叶状念珠藻、普通念珠藻、拟球状念珠藻样本的DNA，并对其进行Real-time PCR扩增检测，检测其反应体系的特异性；其中，反应条件与步骤S03相同。
7.一种用于发菜真伪鉴定实时荧光PCR检测方法，其特征在于，步骤S04后还包括步骤S05；
S05、取发菜的DNA，测定其DNA浓度，采用紫外分光光度法进行测量，对其DNA进行10倍梯度稀释，取不同浓度的DNA模板分别进行实时荧光 PCR检测，得到对应浓度下的扩增曲线。
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