CN118652345A - 幽门螺旋杆菌b型尿素酶抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及免疫检测技术领域，尤其涉及幽门螺旋杆菌B型尿素酶抗体及其应用。本发明提供了一种靶向识别幽门螺旋杆菌B型尿素酶(ureB)的抗体，该抗体具有高特异性和高亲和力特性，适用于幽门螺旋杆菌的定量或定性检测，尤其是适用于制备侧向流免疫层析快速诊断试剂盒，具有检测限较低，灵敏度较高的特点，降低了幽门螺旋杆菌的检测成本，缩短了检测时间，提高了检测效率，能够实现快速诊断所要求的灵敏、稳定、经济、用户友好和无需设备等通用标准。

Description

幽门螺旋杆菌B型尿素酶抗体及其应用
技术领域
本发明涉及免疫检测技术领域，尤其涉及幽门螺旋杆菌B型尿素酶抗体及其应用。
背景技术
幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)是一种常见的细菌，存在于人类胃部。它被认为是引发胃炎、胃溃疡和胃癌等疾病的主要原因之一。在幽门螺旋杆菌中，尿素酶(urease)被认为是一种关键的酶类，其结构对于这种细菌在胃中生存和繁殖起着至关重要的作用。
幽门螺旋杆菌尿素酶是一种能够将尿素分解为二氧化碳和氨的酶类。这一过程产生的氨能够中和胃酸，帮助细菌在胃酸环境中生存，并为幽门螺旋杆菌提供大量的能量来源。尿素酶在这一过程中的重要性不言而喻，因此理解其结构对于研究幽门螺旋杆菌相关疾病的治疗和预防具有重要意义。幽门螺旋杆菌尿素酶是一种大多由六个亚基组成的三聚体酶。每个亚基都包含有催化活性位点，该位点含有两个重要的镍离子。这两个镍离子分别与亚基中两个谷氨酸残基形成配位键，使尿素酶获得其催化活性。
尿素酶的结构中，还存在着一些其他重要的残基。其中，谷氨酸残基被认为是尿素酶催化中心的关键残基。它能够与尿素结合，并通过一系列的共价和非共价相互作用，使尿素被水解。此外，组氨酸残基也是尿素酶结构中的重要组成部分。它能够与氨结合，形成氨片段，进而被排出体外。幽门螺旋杆菌尿素酶的活性可以通过多种因素来调控。其中，pH值是一个重要的因素。尿素酶在中性或碱性条件下表现出较高的活性，而在酸性环境下则活性显著降低。这种调控机制使幽门螺旋杆菌能够在胃酸环境中生存，并利用尿素作为能源。此外，尿素酶的活性还受到其他分子的影响。例如，一些金属离子和抑制剂可以影响尿素酶的催化活性。通过调控这些因素，幽门螺旋杆菌能够在不同的环境下适应并生存下来。
由于尿素酶在幽门螺旋杆菌中的重要作用，研究和掌握其结构对于研究幽门螺旋杆菌所致疾病的治疗和预防具有重要意义。尿素酶的结构信息能够为设计和开发特定抑制剂提供依据，从而抑制尿素酶的活性，减轻幽门螺旋杆菌感染所导致的疾病。此外，尿素酶还可以作为生物传感器的基础，用于检测和监测幽门螺旋杆菌感染。通过检测尿素酶的特异性活性或结构变化，可以实现幽门螺旋杆菌便携式快速检测的目标。
幽门螺旋杆菌尿素酶的结构是该细菌在胃中存活和繁殖的关键。通过理解尿素酶的结构特点以及其调控机制，能够更好地研究幽门螺旋杆菌相关疾病的治疗和预防。尿素酶的应用前景也非常广泛，包括开发抑制剂和生物传感器等。通过综合应用各种手段，将有助于更好地理解和处理幽门螺旋杆菌相关问题。
综上，幽门螺旋杆菌尿素酶抗体的研制，对诊断幽门螺杆菌，以及发现针对幽门螺杆菌疗效强的抗体药物具有重要意义。
发明内容
本发明提供了一种可用于制备侧向流免疫层析诊断试剂盒的幽门螺旋杆菌B型尿素酶抗体及其应用，基于此提出如下技术方案。
第一方面，本发明提供了一种靶向幽门螺旋杆菌B型尿素酶(ureB)的抗体或其功能性片段，包括如下互补决定区：
CDR-VH1：氨基酸序列为DTAMH；
CDR-VH2：氨基酸序列RIDPASGNTKYDPKFQG；
CDR-VH3：氨基酸序列为ESPNEYYFVY；
CDR-VL1：氨基酸序列为RSDQSILHSYGNTYLE；
CDR-VL2：氨基酸序列为KVSNRFS；
CDR-VL3：氨基酸序列为FQLSHVPAT。
在一些实施方案中，所述抗体的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
在一些实施方案中，所述抗体还包含恒定区；
在一些实施方案中，所述恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD中的任意一者的恒定区；
在一些实施方案中，所述恒定区的种属来源为牛、马、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅或人。
在一些实施方案中，所述恒定区的轻链恒定区序列如SEQ ID NO.3所示，所述恒定区的重链恒定区序列如SEQ ID NO.4所示。
在一些实施方案中，所述抗体的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
在一些实施方案中，所述功能性片段选自所述抗体的F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、Fd、dAb、scFv中的任意一种。
上述抗体的功能性片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本发明记载的内容容易理解到，上述抗体的功能性片段可以通过比如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得。在本发明公开了完整抗体的结构基础上，本领域技术人员容易获得上述的功能性片段。
上述抗体的功能性片段还可以通过本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，比如Applied BioSystems等销售的自动肽合成仪合成获得。
在一些实施方案中，将编码所述抗体或其功能性片段的核酸分子导入宿主细胞中，得到重组细胞，培养重组细胞，经分离、纯化得到所述抗体或其功能性片段。
第二方面，本发明提供了编码所述抗体或其功能性片段的核酸。
根据以上所述的抗体或其功能性片段的氨基酸序列和密码子规则，本领域技术人员能够获得编码上述抗体或其功能性片段的核酸分子的核苷酸序列。由于密码子的简并性，编码上述抗体或其功能性片段的核酸分子的核苷酸序列并不唯一，所有能够编码产生上述抗体或其功能性片段的核酸分子均在本发明的保护范围内。
在一些实施方案中，所述核酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。SEQ IDNO.7所示序列编码所述抗体的轻链，SEQ ID NO.8所示序列编码所述抗体的重链。
第三方面，本发明提供了一种产品，其中含有所述的抗体或其功能性片段、或所述的核酸。
在一些实施方案中，所述产品为抗体偶联物、生物材料、药品、检测试剂或试剂盒、检测试纸条中的任意一种。
在一些实施方案中，所述产品中，所述抗体或其功能性片段标记有可被检测的标记物。
在一些实施方案中，所述产品用于检测幽门螺旋杆菌(B型尿素酶)。
在一些实施方案中，所述抗体偶联物是将所述抗体或其功能性片段与可被检测的标记物偶联得到。
在一些实施方案中，所述药品用于幽门螺旋杆菌所致疾病的治疗。
将本发明的所述抗体应用于幽门螺旋杆菌治疗靶点设计时，可以设计出针对幽门螺旋杆菌的治疗药品，所述治疗靶点设计包括但不限于治疗性抗体的靶点设计。
在一些实施方案中，所述检测试剂或试剂盒为幽门螺旋杆菌的定量或定性检测试剂或试剂盒。
在一些实施方案中，所述检测试剂或试剂盒用于ELISA检测、免疫化学发光法检测或免疫荧光法检测。
在一些实施方案中，所述检测试剂盒为侧向流免疫层析诊断试剂盒。
在一些实施方案中，所述检测试纸条为胶体金免疫层析检测试纸条。
在一些实施方案中，所述检测试纸条为侧向流免疫层析检测试纸条。
在一些实施方案中，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或非可再生的细胞或组织。
在一些实施方案中，所述可被检测的标记物是指具有能够被肉眼直接观察或被仪器检测或探测到的特性例如发光、显色、放射性等特性的一类物质，通过该特性可以实现对相应目标物的定性或定量检测。
在一些实施方案中，所述可被检测的标记物包括但不限于荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物。
在实际的使用过程中，本领域技术人员可以根据检测条件或实际需要选择合适的标记物，无论使用何种标记物，其均属于本发明的保护范围。
在一些实施方案中，所述荧光染料包括但不限于荧光素类染料及其衍生物(例如包括但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)羟基光素(FAM)、四氯光素(TET)等或其类似物)、罗丹明类染料及其衍生物(例如包括但不限于红色罗丹明(RBITC)、四甲基罗丹明(TAMRA)、罗丹明B(TRITC)等或其类似物)、Cy系列染料及其衍生物(例如包括但不限于Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy3等或其类似物)、Alexa系列染料及其衍生物(例如包括但不限于AlexaFluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、33、647、680、700、750等或其类似物)和蛋白类染料及其衍生物(例如包括但不限于藻红蛋白(PE)、藻蓝蛋白(PC)、别藻蓝蛋白(APC)、多甲藻黄素-叶绿素蛋白(preCP)等)。
在一些实施方案中，所述催化底物显色的酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶以及6-磷酸葡萄糖脱氧酶。
在一些实施方案中，所述化学发光试剂包括但不限于鲁米诺及其衍生物、光泽精、甲壳动物荧光素及其衍生物、联吡啶钌及其衍生物、吖啶酯及其衍生物、二氧环乙烷及其衍生物、洛粉碱及其衍生物和过氧草酸盐及其衍生物。
在一些实施方案中，所述纳米颗粒类标记物包括但不限于纳米颗粒、胶体、有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒。
在一些实施方案中，所述胶体包括但不限于胶体金属、分散型染料、染料标记的微球和乳胶。
在一些实施方案中，所述胶体金属包括但不限于胶体金、胶体银和胶体硒。
第四方面，本发明提供了所述的抗体或其功能性片段、或所述的核酸、或所述的所述的产品、或所述的幽门螺旋杆菌胶体金免疫层析检测试纸条在以下至少一方面中的应用：
(1)制备检测幽门螺旋杆菌产品中的应用；
(2)制备诊断幽门螺旋杆菌感染导致的疾病的产品中的应用；
(3)在非诊断和治疗目的的检测幽门螺旋杆菌中的应用；
(4)在检测幽门螺旋杆菌疫苗抗原含量中的应用；
(5)在幽门螺旋杆菌疫苗的质量控制中的应用。
在一些实施方案中，所述产品为抗体偶联物、生物材料、药品、检测试剂或试剂盒、检测试纸条中的任意一种。
所述应用中，所述样品可以是来自有生命的人或动物的样品(包括血液、排泄物、口鼻分泌物等)，也可以是体外培养的细胞或细胞培养液等并非来自有生命的人或动物的样品。
所述应用中，疫苗的质量控制包括检测疫苗中抗原质量、含量、稳定性等是否合格。
所述应用可以使用酶联免疫吸附(ELISA)、化学发光免疫检测、放射免疫检测、荧光免疫检测、免疫色谱法等实现。
第五方面，本发明提供了一种幽门螺旋杆菌(B型尿素酶)胶体金免疫层析检测试纸条，包括样品垫、胶体金结合垫、反应膜、吸水垫和底板；所述反应膜上设有检测线和质控线，所述样品垫、胶体金结合垫、反应膜和吸水垫依次粘贴在底板上；所述胶体金结合垫或检测线上含有所述抗体或其功能性片段。
在一些实施方案中，所述胶体金结合垫上包被有胶体金标记的靶向幽门螺旋杆菌B型尿素酶的抗体4F8。
在一些实施方案中，所述检测线上包被有抗体2D7；所述抗体2D7的轻链和重链的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。
在一些实施方案中，所述质控线上包被有羊抗鼠多抗。
在一些实施方案中，所述胶体金结合垫上包被的抗体的浓度为10-15μg/mL。
在一些实施方案中，所述检测线上包被的抗体的浓度为1-2mg/mL。
本发明的幽门螺旋杆菌胶体金免疫层析检测试纸条属于侧向流免疫层析检测试纸条，一般为窄条形，通常宽度为4-6毫米，长度为6-7厘米以内。
优选地，样品垫的材质为纤维素；胶体金结合垫的材质为玻璃纤维；反应膜的材质为硝酸纤维素膜(NC膜)；吸水垫的材质为纤维素。
当侧向流免疫层析检测试纸条插入待测溶液时，溶液会从样品垫区流入结合垫区。当溶液中含有被检测物质时，被检测物质将会和结合垫区的胶体金(偶联)抗原或胶体金(偶联)抗体相结合。通过溶液再次水化的胶体金(偶联)抗体或胶体金(偶联)抗原或与待测样品所形成的复合物，将会在毛细作用力的作用下依次经过检测区(反应膜)和吸水垫区。此时，侧向流免疫层析检测试纸条将会有两种结果显示模型，分别是标准模型(图1a)和竞争模型(图1b)。
图1a当侧向流免疫层析试纸采用的是标准模型(检测幽门螺旋杆菌的B型尿素酶抗原)时，检测线(包含靶向幽门螺旋杆菌的B型尿素酶抗原的特异性抗体)只能捕获被待测抗原和胶体金(偶联)一抗的复合物：如果溶液中存在待测抗原，此时检测线便能捕获到待测抗原和胶体金(偶联)一抗所形成的复合物，而由于胶体金(偶联)一抗本身始终会被质控线(包含相应的二抗)捕获，因此此时检测线和质控线均出现颜色变化，结果判定为阳性反应。如果溶液中不存在待测抗原，则只有质控线(包含相应的二抗)能够捕获胶体金(偶联)一抗并发生颜色变化，此时质控线显色而检测线不显色，结果判定为阴性反应。
图1b当侧向层析试纸采取的是竞争模型(检测靶向幽门螺旋杆菌的B型尿素酶抗原的IgM/IgG抗体)时，待测抗体与结合垫区包被的胶体金(偶联)B型尿素酶抗原发生结合，并且待测抗体和胶体金(偶联)B型尿素酶抗原各自都可以被检测线(包含抗IgG/IgM的抗体)所捕获。当待测抗体存在时，其能够被检测线所捕获而胶体金(偶联)抗原将无法被检测线捕获(因为待测抗体的竞争性封闭)，进而无法发生颜色变化，但质控线(包含B型尿素酶抗原配对抗体)依然能够捕获胶体金(偶联)抗原，此时检测线不显色而质控线显色，结果判定为阳性反应；如果溶液中不存在待测抗体，则检测线和质控线均能捕获胶体金(偶联)抗原，此时检测线和质控线均会发生颜色变化，结果判定为阴性反应。
本发明提供的幽门螺旋杆菌胶体金免疫层析检测试纸条能够实现快速诊断所要求的灵敏、稳定、经济、用户友好和无需设备等通用标准，对于缺乏专业设备和未受过良好训练的技术人员的单位或地区具有重要意义。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种靶向识别幽门螺旋杆菌B型尿素酶(ureB)的抗体，该抗体具有高特异性和高亲和力特性，适用于幽门螺旋杆菌的定量或定性检测，尤其是适用于制备侧向流免疫层析快速诊断试剂盒，具有检测限较低，灵敏度较高的特点，降低了幽门螺旋杆菌的检测成本，缩短了检测时间，提高了检测效率，能够实现快速诊断所要求的灵敏、稳定、经济、用户友好和无需设备等通用标准。
附图说明
图1是侧向流免疫层析试纸条的检测原理示意图；其中，a：标准模型；b：竞争模型。
图2是幽门螺旋杆菌B型尿素酶抗原表位和功能定位的相关信息。
图3是重组幽门螺旋杆菌B型尿素酶的SDS-PAGE鉴定结果。
图4是本发明的抗体在梯度浓度下分别与重组幽门螺旋杆菌B型尿素酶抗原结合曲线图；其中，0.5-g为每孔包被抗原50ng(100-L每孔)的结合曲线，1-g为每孔包被抗原100ng(100-L每孔)的结合曲线。
图5是幽门螺旋杆菌胶体金免疫层析检测试纸条检测不同浓度重组幽门螺旋杆菌B型尿素酶的检测结果图。
图6是幽门螺旋杆菌胶体金免疫层析检测试纸条检测重组幽门螺旋杆菌B型尿素酶灵敏度的检测结果图。
图7是幽门螺旋杆菌胶体金免疫层析检测试纸条检测正常人粪便样本的检测结果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中未注明具体技术或条件者，均为常规方法或者按照本领域的文献所描述的技术或条件进行，或者按照产品说明书进行。所用试剂和仪器等未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
实施例1产单克隆抗体的杂交瘤制备
1、幽门螺旋杆菌B型尿素酶抗原的设计
根据GenBank上的幽门螺旋杆菌B型尿素酶基因(GenBank:M60398.1)(SEQ IDNO.11；优化后的基因序列如SEQ ID NO.12所示)翻译得到的氨基酸序列进行分析，选择幽门螺旋杆菌(ATCC 700392/26695)的B型尿素酶氨基酸序列进行序列比对，发现作为该段序列与其他幽门螺旋杆菌B型尿素酶的同源性很高。经过免疫原性、亲疏水性及表面可及性分析，最终筛选幽门螺旋杆菌(ATCC 700392/26695)的B型尿素酶CDS区全长569个氨基酸作为后续重组蛋白，即抗原的序列(SEQ ID NO.13)。
幽门螺旋杆菌B型尿素酶抗原表位和功能定位的相关信息如图2所示(IEDB分析软件)。
2、重组幽门螺旋杆菌B型尿素酶的制备
经过基因合成以及分子克隆设计，最终在E.coli系统中进行表达，得到重组幽门螺旋杆菌B型尿素酶，该蛋白即抗原，SDS-PAGE鉴定结果如图3所示。
3、免疫小鼠
将1mg/mL重组幽门螺旋杆菌B型尿素酶与弗氏完全佐剂按1:1混匀500μL乳化后，皮下多点注射6-8周龄雌性Balb/c小鼠，每只小鼠接种重组幽门螺旋杆菌B型尿素酶(抗原)100μg。三周后将1mg/mL抗原与弗氏不完全佐剂按1:1混匀500μL乳化后皮下多点注射，每只小鼠抗原接种剂量为50μg，以此作为加强免疫。间隔三周、六周以及九周后按照前述加强免疫的流程再次免疫，总共进行4次加强免疫。
4、免疫血清效价测定
第四次加强免疫后10天小鼠尾静脉采血，采用间接ELISA法测定免疫血清效价。取50μg合成抗原重组幽门螺旋杆菌B型尿素酶溶解于10mL 0.05M pH9.6磷酸盐缓冲液，包被聚苯乙烯96孔板，100μL/孔，4℃过夜。使用PBST(0.02M PBS含有0.05％v/v Tween-20)洗板三次，用10mM PBS含1％BSA封闭液100μl/孔，37℃封闭2h，用PBST(0.02M PBS含有0.05％v/v Tween-20)洗板三次，准备待用。鼠免疫血清用含1％BSA的10mM PBS进行102～106倍稀释，加入96孔板，100μL/孔，随后在37℃条件下孵育1h，后采用PBST(0.02MPBS含有0.05％v/vTween-20)洗板三次后，加入1:10000倍稀释辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG(Sigma，INC.)，100μL/孔，随后在37℃条件下孵育30min，同上洗板。随后每孔加入TMB显色100μL/孔，于37℃下室温避光10min，后按照50μL/孔的量加入2M H2SO4终止反应。测450nm吸收值，以免疫前小鼠血清作为阴性对照，以测定值与对照值之比≥2：1为阳性判断值来确定免疫血清效价，结果如表1所示。
表1
稀释倍数 免疫小鼠1 免疫小鼠2 免疫小鼠3 免疫小鼠4
10000 3.22 3.12 3.16 3.3
50000 2.31 2.25 2.3 2.35
100000 1.40 1.34 1.44 1.43
500000 0.76 0.72 0.79 0.78
免疫前小鼠血清 0.11 0.08 0.12 0.15
5、杂交瘤的制备
取血清效价大于1：105的小鼠，融合前3天，取合成的抗原幽门螺旋杆菌B型尿素酶与等体积的PBS混匀后，以每只50μg/500μL的量腹腔注射BALB/c待融合小鼠进行加强免疫。饲喂层细胞制备流程：Balb/c(4周左右)小鼠眼眶静脉放血处死，75％乙醇浸泡3分钟，腹侧面向上；打开胸腔分离出胸腺，使用细胞筛研磨，使用预热好的基础培养基冲悬细胞。腹腔巨噬细胞的制备：融合当天，选择健康小鼠1只(1个脾脏取一只)，摘其眼球放血，待血滴不出为止。颈椎脱臼致死，75％酒精浸泡消毒5分钟，移入超净工作台，腹部朝上固定于解剖板上。用镊子提起小鼠腹部皮肤，用剪刀剪一小口(注意不可损伤腹膜、以免腹腔液外流)，经钝性剥离使腹膜充分暴露，并用酒精擦拭消毒。用一次性无菌注射器吸取基础培养液5～10mL注入小鼠腹腔，右手固定注射器保持不动，左手用镊子夹取酒精棉球轻轻揉动小鼠腹部1～2分钟，促使巨噬细胞游出。再用注射器吸出腹腔内的培养液转移至15mL离心管中。将腹腔巨噬细胞与胸腺细胞混匀后，1200r/min离心10分钟，弃上清。使用预热好含20％FBS 1×HAT培养基(次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)(HAT，Sigma))重悬，于37℃备用。
细胞融合当日上午，脾细胞的制备流程：取已经加强免疫后3～4天的小鼠，摘除眼球采血，并收集分离血清作为抗检测时的阳性对照血清。同时通过颈脱位致死小鼠，浸泡于75％酒精中5分钟消毒，并立即放超净台内。于解剖台板上固定小鼠，无菌开腹，后掀开右侧腹部皮肤，可看到脾脏，换眼科剪，用无菌手术剪剪开腹膜，镊子取出脾脏，生理盐水冲洗脾脏后，使用剪刀将脾脏剪碎，放置在一次性细胞筛内，用注射器内芯轻轻挤压脾脏，并用生理盐水反复冲洗细胞筛，至细胞筛中只剩结缔组织，后再次使用一次性细胞筛过滤细胞悬液。收获脾细胞悬液，1200r/min离心10分钟，用30-40mL的重悬离心洗涤1次(尽量去除红细胞团)。将脾细胞重悬加入含10％FBS的基础培养液后，放入T75细胞瓶于37℃、5％CO2培养箱中培养2-3小时，使细胞悬液中的巨噬细胞贴壁。
融合细胞当日下午，骨髓瘤细胞的制备流程：将3瓶T75骨髓瘤细胞，弃上清，使用50mL预热的生理盐水吹下，与脾细胞共同离心，1200r/min离心10分钟。将脾细胞与3瓶T75骨髓瘤细胞充分混匀，弃上清，使用40mL预热的生理盐水重悬，1200r/min离心10分钟。
细胞融合过程：弃上清液，将上清液尽量弃尽，用滴管吸净残留液体，以免影响细胞融合剂的浓度，尽量去除红细胞。用手指轻轻弹击离心管底混匀使沉淀细胞松散均匀成糊状。在室温下融合：细胞融合剂、及含有饲喂层的培养基在准备脾脏细胞的时候需放入培养箱保温。用巴氏吸管吸取分装好的1mL细胞融合剂溶液(尽量接近细胞处离心管壁一圈旋加入)。60s-90s内轻轻混匀。计时完成后一次性加入30mL预热37℃基础培养基，使细胞融合剂稀释而失去促融作用，37℃静置5min。800r/min离心6分钟，弃去上清液。加入预热好的20％ FBS1×HAT培养基轻轻吹吸沉淀的细胞，使其悬浮并混匀(充分混匀，减少细胞团)，动作轻柔。此次试验按照制备10块96孔细胞培养板，每孔200μL，需要200mL 20％FBS1×HAT培养基。
37℃、5％CO2孵箱培养，细胞融合后7天显微镜观察，计数96孔细胞培养板中出现明显细胞克隆的培养孔，计算融合率，融合率＝(融合的细胞数/总细胞数)×100％。
6、筛选分泌抗幽门螺旋杆菌B型尿素酶单克隆抗体的杂交瘤细胞
间接ELISA法筛选细胞培养上清，选择效价较高的阳性克隆杂交瘤细胞进行亚克隆化，并用有限稀释法连续克隆化2-3次，直至到100％细胞阳性率。对于最终得到的20株效价较高的杂交瘤细胞株培养上清进行间接ELISA方法检测，同时采用0.02M PBS进行稀释检测，测得结果如表2所示。
表2
从表2可以看出，通过比较杂交瘤细胞株培养上清进行的ELISA方法的检测数据，可以从中进一步挑选出稳定分泌抗幽门螺旋杆菌B型尿素酶单克隆抗体且抗体效价较高细胞株，标记为4F8。将克隆化后阳性率达100％的细胞扩增培养后液氮冻存。
7、腹水的制备和纯化
将杂交瘤细胞株4F8以1×106/只的量注入液体石蜡预处理的8-10周龄的BALB/c雌性小鼠腹腔，饲养观察10-14天后小鼠腹部膨大时抽取腹水。采用亲和色谱法ProteinGSepharose Fast Flow纯化单克隆抗体，以SDS-PAGE测定单克隆抗体的纯度，纯度达到90％以上。
实施例2单克隆抗体的特性鉴定
1、抗体浓度的测定：经杂交瘤细胞4F8制备的腹水经纯化后获得抗幽门螺旋杆菌B型尿素酶的单克隆抗体，使用Thermofisher公司生产的Nanodrop核酸蛋白测定仪测定，其浓度为>1mg/mL。
2、抗体亚型鉴定：采用Thermofisher的鼠单抗亚型鉴定试剂盒鉴定杂交瘤细胞株的亚型，4F8分泌抗体的亚型为IgG1型，轻链为κ链。
3、纯化抗体的效价鉴定：50μg合成幽门螺旋杆菌B型尿素酶溶于10mL pH9.6的0.05M碳酸盐包被缓冲液中，加入96孔板，每孔100μL，4℃过夜。PBS(含有0.05％v/vTween-20)洗板三次，用10mM PBS含1％BSA封闭液150μL/孔，37℃封闭2h，使用PBS(含有0.05％v/vTween-20)洗板三次，每孔加入100μL纯化抗体，37℃孵育1h，PBS(含有0.05％v/v Tween-20)洗板三次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体为二抗，37℃孵育30min，PBS(含有0.05％v/v Tween-20)洗板三次，每孔加入100μL，TMB显色，37℃孵育15min后，加入2M H2SO4溶液终止反应，酶标仪在吸光度值450nm处检测。
4、抗体结合力测试：
用1×CB将幽门螺旋杆菌B型尿素酶分别稀释到0.5μg/mL、1μg/mL，以100μL/孔的量加入酶标板孔中，并做复孔，置于4℃过夜或37℃吸附2小时。将包被好的微孔板甩干，按照洗板机设定的操作程序(AFP程序)清洗一遍，按200μL/孔的量加入封闭液，置于37℃温箱中2h，之后置于4℃过夜。临用前，将封闭好的微孔板从4℃取出，甩干，加入清洗液(1×PBS-T)使酶标版湿润；将本发明所述单克隆抗体用1×PBS预稀释至30μg/mL，并记录预稀释的倍数m，在稀释10倍即3μg/mL作为(S1)最高浓度然后再以1:3梯度稀释(在96深孔板中稀释)，一共8个稀释梯度(S1-S8)。
将100μL稀释好的抗体，加入在吸水纸上拍干净的96孔微孔板，37℃孵育30min；孵育后将酶标板甩干，在吸水纸上拍干，用洗板机清洗酶标板3次，1-4列每孔加入100μL的1×PBS；5列与6列每孔，加入200μL尿素处理液，37℃孵育30min；孵育后将酶标板甩干，在吸水纸上拍干，用洗板机清洗酶标板3次，每孔加入100μL预先用二抗稀释液稀释10000倍的GAM-HRP酶标二抗，37℃孵育30min；孵育后将酶标板甩干，在吸水纸上拍干，用洗板机清洗酶标板3次，取TMB显色液，每孔加入100μL显色液，37℃孵育5-10min；显色后每孔加入50μL终止液。在酶标仪上设置进行450nm/630nm读值。
分别在0.5μg/mL和1μg/mL抗原包被的条件下，测试了ELISA抗原抗体结合力实验，通过测试吸光值OD得到数据(图4)，并拟合得到对应的多项式曲线，相应的结合随着抗体稀释倍比的变化可以看到明显的梯度性，同时，在0.5μg/mL和1μg/mL抗原包被的条件下两条曲线反映出的亲和性结合，体现了结合的特异性，并且反映抗体结合力所对应浓度分别达到3.87E-10mol/L(0.5μg/mL抗原包被条件下，最高的OD读的50％，即抗原-抗体复合物的浓度占总浓度的一半时，抗体对应的浓度值K0.5)和5.24E-10mol/L(1μg/mL抗原包被条件下，最高OD读值的50％，即抗原-抗体复合物的浓度占总浓度的一半时，抗体对应的浓度值K1)。
结合力计算：分别计算在0.5μg/mL和1μg/mL抗原包被条件下，尿素处理前后S1-S8抗体浓度的复孔平均值OD读值。将读值代入结合力计算公式：
5、特异性检测：类似于ELISA抗体效价检测，使用正交设计幽门螺旋杆菌的B型尿素酶抗体检测，结果如表3～表12所示，结果表明本发明获得的抗体的特异性良好。
表3
表4
表5
表6
表7
表8
表9
表10
表11
表12
可以看出，通过比较抗体配对实验的实验数据，表明除了和包被抗体一样的酶标抗体对应的检测孔会被屏蔽掉之外，其他酶标抗体均能在包被抗体存在的情况下依然能结合幽门螺旋杆菌B型尿素酶抗原，其结合效应随着加入抗原的浓度增加而发生读值增加，因此体现了4F8抗体结合的特异性，且与2D7抗体搭配形成免疫夹心反应时对于幽门螺旋杆菌抗原灵敏度的表现最优。
6、单抗测序
取纯化后的杂交瘤细胞4F8制备的幽门螺旋杆菌B型尿素酶的单克隆抗体约34mg(批号V20210426；3.08mg/mL)。对轻链可变区与重链可变区进行测序可知，4F8抗体的互补决定区如下：
CDR-VH1：氨基酸序列为DTAMH；
CDR-VH2：氨基酸序列RIDPASGNTKYDPKFQG；
CDR-VH3：氨基酸序列为ESPNEYYFVY；
CDR-VL1：氨基酸序列为RSDQSILHSYGNTYLE；
CDR-VL2：氨基酸序列为KVSNRFS；
CDR-VL3：氨基酸序列为FQLSHVPAT。
抗体的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示。抗体的轻链恒定区序列如SEQ ID NO.3所示，抗体的的重链恒定区序列如SEQ IDNO.4所示。抗体的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，抗体的重链的氨基酸序列如SEQID NO.6所示。
实施例3利用幽门螺旋杆菌B型尿素酶单克隆抗体开发侧向流免疫层析检测试纸条
1、胶体金的制备
采用还原法制备，制金条件为2％氯金酸5mL+10mL 0.01％柠檬酸三钠。
2、胶体金标记小鼠抗幽门螺旋杆菌B型尿素酶单抗
物理吸附法，通过调节pH值使胶体金与抗体(靶向幽门螺旋杆菌B型尿素酶抗体4F8，轻链、重链的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示)结合起来。
具体标记条件为：每毫升胶体金加入0.1M碳酸钾溶液10μL，小鼠抗幽门螺旋杆菌B型尿素酶单抗4F8的标记浓度为10μg/mL。
3、检测线及质控线
检测线：取适当浓度(1.0mg/mL)的小鼠抗幽门螺旋杆菌B型尿素酶单克隆抗体2D7(轻链和重链的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示)包被在硝酸纤维素膜上制备检测线，37℃干燥，喷点量为1.0μL/cm。
质控线：取1.0mg/mL山羊抗小鼠IgG多克隆抗体，在纤维膜上制备质控线，37℃干燥，喷点量为1.0μL/cm。
将纤维素样品垫、玻璃纤维的胶体金结合垫(含有上述胶体金标记小鼠抗幽门螺旋杆菌B型尿素酶单抗)、NC反应膜(含有上述检测线和质控线)和纤维素吸水垫依次粘贴在底板上，按照图1a制成检测试纸条。
4、检验方法
将检测试纸条、样本稀释液和样本恢复至18～30℃。检测试纸条的检测方法如下：
a.从铝箔袋中取出检测试纸条，做好样本标记，放在水平工作台面上平置；
b.取已处理样本液(本实施例中采用200，100，50，20，10，5，2，1，0ng/mL的重组幽门螺旋杆菌B型尿素酶)或质控品直接加入到样品垫处；
c.再加入100μL(2～3滴)样本稀释液(粪便基质，配制方法为：配制0.01M Tris-HCI缓冲液，pH8.5；加入1％浓度BSA和10％蔗糖)；
d.15～20分钟内判读结果，20分钟后检验结果无效。
5、检验结果的解释
结果如图5所示。
a.阳性：检测线和质控线均显色，提示样本检出幽门螺旋杆菌的B型尿素酶抗原，可能处于早期感染或现症感染，需结合临床症状进行最终的确认。
b.阴性：检测窗仅出现一条红色质控线，表示样本未检出幽门螺旋杆菌的B型尿素酶抗原。
c.无效：检测窗无红色质控线出现。
实施例4幽门螺旋杆菌胶体金免疫层析检测试纸条的性能测试
1、灵敏度测试
采用重组幽门螺旋杆菌B型尿素酶溶液对实施例3制备的幽门螺旋杆菌胶体金免疫层析检测试纸条进行检测。如图6所示，可检出最低达10ng/mL(肉眼可见10ng/mL组出现淡淡的检测线)重组幽门螺旋杆菌B型尿素酶。
2、特异性测试(临床样本测试)
使用实施例3制备的幽门螺旋杆菌胶体金免疫层析检测试纸条检测20例正常人的粪便样本，检测结果如图7所示。可以看出，检测结果清晰可见，背景干净，表明该产品的特异性良好。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.靶向幽门螺旋杆菌B型尿素酶的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述抗体或其功能性片段包括如下互补决定区：
CDR-VH1：氨基酸序列为DTAMH；
CDR-VH2：氨基酸序列RIDPASGNTKYDPKFQG；
CDR-VH3：氨基酸序列为ESPNEYYFVY；
CDR-VL1：氨基酸序列为RSDQSILHSYGNTYLE；
CDR-VL2：氨基酸序列为KVSNRFS；
CDR-VL3：氨基酸序列为FQLSHVPAT。
2.根据权利要求1所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述抗体的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求1或2所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述抗体还包含恒定区；优选地，所述恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD中的任意一者的恒定区；
优选地，所述恒定区的种属来源为牛、马、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅或人。
4.根据权利要求3所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述恒定区的轻链恒定区序列如SEQ ID NO.3所示，所述恒定区的重链恒定区序列如SEQ ID NO.4所示。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述抗体的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
6.根据权利要求1所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述功能性片段选自所述抗体的F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、Fd、dAb、scFv中的任意一种。
7.编码权利要求1～6中任一项所述抗体或其功能性片段的核酸；
优选地，所述核酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
8.一种产品，其特征在于，其中含有权利要求1～6中任一项所述的抗体或其功能性片段、或权利要求7所述的核酸；
优选地，所述产品为抗体偶联物、生物材料、药品、检测试剂或试剂盒、检测试纸条中的任意一种；
优选地，所述产品中，所述抗体或其功能性片段标记有可被检测的标记物；
优选地，所述产品用于检测幽门螺旋杆菌。
9.一种幽门螺旋杆菌胶体金免疫层析检测试纸条，其特征在于，包括样品垫、胶体金结合垫、反应膜、吸水垫和底板；所述反应膜上设有检测线和质控线，所述样品垫、胶体金结合垫、反应膜和吸水垫依次粘贴在底板上；所述胶体金结合垫或检测线上含有权利要求1～6中任一项所述的抗体或其功能性片段。
10.权利要求1～6中任一项所述的抗体或其功能性片段、权利要求7所述的核酸、权利要求8所述的产品或权利要求9所述的幽门螺旋杆菌胶体金免疫层析检测试纸条在以下至少一方面中的应用：
(1)制备检测幽门螺旋杆菌产品中的应用；
(2)制备诊断幽门螺旋杆菌感染导致的疾病的产品中的应用；
(3)在非诊断和治疗目的的检测幽门螺旋杆菌中的应用；
(4)在检测幽门螺旋杆菌疫苗抗原含量中的应用；
(5)在幽门螺旋杆菌疫苗的质量控制中的应用。
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