CN116679051A - 幽门螺旋杆菌检测试剂条、试剂笔及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及兽用体外诊断技术领域，尤其是涉及幽门螺旋杆菌检测试剂条、试剂笔及其应用。本发明将幽门螺旋杆菌抗体Ⅱ作为检测区的包被抗体，用于制备检测宠物幽门螺杆菌的产品；所述检测宠物幽门螺杆菌产品通过免疫层析法检测宠物幽门螺杆菌，检测过程中待测样品的层析方向为垂直的由下往上。故选择参考本发明原有的笔型外观进行改进，本发明不仅为动物行业对于犬/猫幽门螺杆菌抗原提供一种较新颖的检测方式，同时缩短了样品的处理时间，其优点主要是一步法可检测出在幽门螺杆菌阳性粪便样本含量超出5ng/mL的尿素酶。

Description

幽门螺旋杆菌检测试剂条、试剂笔及其应用
技术领域
本发明涉及兽用体外诊断技术领域，尤其是涉及幽门螺旋杆菌检测试剂条、试剂笔及其应用。
背景技术
幽门螺旋杆菌Helicobacter Pylori(简称HP)是一种螺旋状革兰氏阴性细菌，是常见的消化道致病菌之一，影响全球约50％的人口，其感染是引起胃炎、胃溃疡、腺癌和淋巴增生等疾病的主要原因，被列为I类致癌因子。
人与宠物猫狗存在HP相关的尿素酶菌株包括：H.pylori、H.canis、H.bizzozeronii等，所以在研究制备理想的HP抗体过程中，针对于尿素酶的研究不可或缺。尿素酶是一种存在于人和动物胃肠道及泌尿道细菌感染最常见的酶，Hp尿素酶分子量为550KDa，每个单体由A、B两个亚单位组成，结合成六聚体结构。尿素酶B是HP的主要外膜抗原成分，由569给氨基酸残基编码产生，是主要的保护性蛋白，具有无毒，保守及抗原性强等特点，是该菌疫苗的首选抗原检测表位。
幽门螺杆菌在犬、猫身上于人类的同源率接近100％，传播方式主要通过粪-口传播和口-口传播途径进行传播，在世界的不同种族，不同地区均有感染，可以说是宠物与人之间最广泛的慢性细菌性感染疾病，人一旦感染可能会直接或者间接感染自家宠物，反之宠物感染HP也可能传染给人，患有HP感染的犬猫在临床症状主要表现为呕吐，腹泻，精神萎靡，食欲不振，口臭严重，异嗜现象，严重的会发生精神症状。所以针对此疾病，日常的防范至关重要，如定期的宠物检查以及家庭环境的消毒。
目前检测感染HP的方法主要有：直接检查、尿素酶活性测定、免疫学检测等。
(1)细菌的直接检查：通过钳取组织部位制备组织切片染色及细菌培养来检测HP，该方法具有灵敏度高，特异性强等优点，可以作为验证诊断性试验的“金标准”，但局限性大，需要专业的人员进行操作。
(2)尿素酶检查：因HP在体内能产生大量尿素酶，故可通过检测尿素酶来诊断HP感染，尿素酶分解胃部尿毒生成氨气和二氧化碳，使尿素浓度降低、氨浓度升高，所以可以开展胃活检组织尿毒酶试验；胃液尿素或尿素氮测定；15N-尿素试验；呼气试验。
(3)免疫学检测：目前主要的免疫学方法都是通过测定血清中的HP抗体来诊断HP感染，包括补体结合试验、凝集试验、被动血凝测定、免疫印迹技术和酶联免疫吸附测定(ELISA)等。
和检测人源幽门螺杆菌不同，检测宠物时可方便采集的样品种类有限，而对来源于排泄系统的样本进行方便快捷的检测，相对于采集于口腔的渗透液等天然液态样本相比，检测难度大大提高，从而对抗体的灵敏度和特异性提出了更高的要求。同时检测笔类由下往上层析的形式，需要采集部，层析过程中，采集部的截留效应和重力的影响，都会降低层析效果，因此，也进一步加大了检测难度。目前国内用于检测犬/猫的幽门螺杆菌的试剂较少，而运用笔型检测试剂，采样与检测合二为一的检测方式在目前市面上的产品尚未见到。
鉴于此，开发一种准确、快速、一步法的笔型试剂来检测HP，有利于在宠物医院或居家检测宠物胃幽门螺旋杆菌的推广应用，对宠物幽门螺杆菌导致的相关疾病的防治有重要的临床意义。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种适用于宠物的幽门螺杆菌的检测试剂条和/或试剂笔，为宠物疫病方面研制一种特异性较好，灵敏度高，检测快速，采样简单的临床检测产品，同时为人与宠物健康提供有力的保障。
需要说明的是，抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基端结构域。重链的可变结构域可以被称为“VH”。轻链的可变结构域可以被称为“VL”。这些结构域通常是抗体的最可变的部分，并含有抗原结合位点。轻链或重链可变区由被三个称为“互补决定区”或“CDR”的高变区打断的构架区构成。抗体的构架区，即构成要件轻链和重链的组合的构架区，起到定位和对齐CDR的作用，所述CDR主要负责与抗原的结合。
“构架”或“FR”区意味着抗体可变结构域的排除被定义为CDR的那些区域之外的区域。每个抗体可变结构域构架可以被进一步细分成被CDR分隔开的毗邻区域(FR1、FR2、FR3和FR4)。
通常情况下，重链和轻链的可变区VL/VH可由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
在本发明中，CDR1-VH、CDR2-VH和CDR3-VH分别指重链可变区的三个高变区，相应的，CDR1-VL、CDR2-VL和CDR3-VL分别指轻链可变区的三个高变区。
为了解决上述技术问题，实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种鼠源幽门螺旋杆菌抗体Ⅱ在制备检测宠物幽门螺杆菌产品中的应用；所述检测宠物幽门螺杆菌产品通过免疫层析法检测宠物幽门螺杆菌，检测过程中待测样品的层析方向为垂直的由下往上，所述鼠源幽门螺旋杆菌抗体包被于免疫层析法的检测区；
所述鼠源幽门螺旋杆菌抗体Ⅱ的可变区包括：具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的互补决定区CDR1-VH、具有如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的互补决定区CDR2-VH、具有如SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的互补决定区CDR3-VH、具有如SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的互补决定区CDR1-VL、具有如SEQ ID NO.19所示氨基酸序列的互补决定区CDR2-VL和具有如SEQ ID NO.5所示氨基酸序列的互补决定区CDR3-VL。
CDR1-VH：DYTFTNSW(SEQ ID NO.1)；
CDR2-VH：INPSTGST(SEQ ID NO.2)；
CDR3-VH：ASEEYDGFDY(SEQ ID NO.3)；
CDR1-VL：SSIIYM(SEQ ID NO.4)；
CDR2-VL：DTS(SEQ ID NO.19)；
CDR3-VL：QQWSSSPYT(SEQ ID NO.5)。
作为进一步技术方案，所述鼠源幽门螺旋杆菌抗体Ⅱ的重链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示：
PGASVKMSCRASDYTFTNSWMHWVKQRPGQGLEWVGYINPSTGS TDYNQKFRDKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCASEEYDGFDY WGQGTTLTVSS(SEQ ID NO.6)；
所述鼠源幽门螺旋杆菌抗体Ⅱ的轻链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示：
DIVITQSPAIMSASPGEKVTMTCSANSSIIYMHWYQQKSGTSPKRWI YDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSSPYTF GGGTKLEIK(SEQ ID NO.7)。
作为进一步技术方案，所述鼠源幽门螺旋杆菌抗体Ⅱ的重链的可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示：
CCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAGGGCTTCTGACTACACCTTTACTAACTCCTGGATGCACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGGTTGGATACATTAATCCTAGCACTGGTTCTACTGACTACAATCAGAAGTTCAGGGACAAGGCCACTTTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTGAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGCGAGGAGTACGACGGCTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA(SEQ ID NO.8)；
所述鼠源幽门螺旋杆菌抗体Ⅱ的轻链的可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示：
GATATTGTGATAACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAACTCAAGTATAATTTACATGCATTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACGTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGTTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTAGCCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA(SEQ ID NO.9)。
第二方面，本发明提供了一种幽门螺旋杆菌检测试剂条，所述试剂条由上往下依次包括质控区、检测区、含乳胶标记物Ⅰ聚酯膜、样本垫和吸水纸；所述检测区包被有鼠源幽门螺旋杆菌抗体Ⅱ；
所述鼠源幽门螺旋杆菌抗体Ⅱ的可变区包括：具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的互补决定区CDR1-VH、具有如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的互补决定区CDR2-VH、具有如SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的互补决定区CDR3-VH、具有如SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的互补决定区CDR1-VL、具有如SEQ ID NO.19所示氨基酸序列的互补决定区CDR2-VL和具有如SEQ ID NO.5所示氨基酸序列的互补决定区CDR3-VL；
优选地，所述试剂条的基底材料为硝酸纤维素膜。
作为进一步技术方案，所述乳胶标记物Ⅰ为偶联幽门螺旋杆菌抗体Ⅰ的乳胶微球；
所述幽门螺旋杆菌抗体Ⅰ的可变区包括：具有如SEQ ID NO.10所示氨基酸序列的互补决定区CDR1-VH、具有如SEQ ID NO.11所示氨基酸序列的互补决定区CDR2-VH、具有如SEQ ID NO.12所示氨基酸序列的互补决定区CDR3-VH、具有如SEQ ID NO.13所示氨基酸序列的互补决定区CDR1-VL、具有如SEQ ID NO.20所示氨基酸序列的互补决定区CDR2-VL和具有如SEQ ID NO.14所示氨基酸序列的互补决定区CDR3-VL；
CDR1-VH：GYTFTKYG(SEQ ID NO.10)；
CDR2-VH：INTYTGEP(SEQ ID NO.11)；
CDR3-VH：ASPFGY(SEQ ID NO.12)；
CDR1-VL：QTIVYSNGKTY(SEQ ID NO.13)；
CDR2-VL：KVS(SEQ ID NO.20)；
CDR3-VL：FQGSHVPWT(SEQ ID NO.14)。
作为进一步技术方案，所述幽门螺旋杆菌抗体Ⅰ的重链的可变区氨基酸序列如SEQID NO.15所示：
VQVQESGPELKKPGETVKISCKASGYTFTKYGMNWVKQAPGKDLK WMGWINTYTGEPTYADDFKGRFAFSLETFASTAYLQINNLKNEDTATYF CASPFGYWGQGTLVTVS(SEQ ID NO.15)；
所述幽门螺旋杆菌抗体Ⅰ的轻链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示：
DVLMTQTPPSLPVSLGDQASISCRSSQTIVYSNGKTYLDWYLQKPG QSPNLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQG SHVPWTFGGGTKLKSK(SEQ ID NO.16)。
作为进一步技术方案，所述幽门螺旋杆菌抗体Ⅰ的重链的可变区核苷酸序列如SEQID NO.17所示：
GTGCAGGTGCAGGAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGGTATACCTTCACAAAATATGGAATGAACTGGGTGAAGCAGGCTCCAGGAAAGGATTTAAAGTGGATGGGCTGGATAAACACCTACACTGGAGAGCCAACATATGCTGATGACTTCAAGGGACGGTTTGCCTTCTCTTTGGAAACCTTTGCCAGCACTGCCTATTTGCAGATCAACAACCTCAAAAATGAGGACACGGCTACATATTTCTGTGCAAGCCCGTTTGGTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACAGTCTCT(SEQ ID NO17)；
所述幽门螺旋杆菌抗体Ⅰ的轻链的可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示：
GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACCCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGACCATTGTATATAGTAATGGAAAAACCTATTTAGACTGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAATCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGAAATCAAAA(SEQ ID NO.18)。
优选地，所述乳胶为C乳胶，选自C-Latex1、C-Latex2或C-Latex3；进一步优选为C-Latex3。
作为进一步技术方案，所述乳胶标记物Ⅰ的制备方法包括，羧基活化后的乳胶微球，在催化剂作用下，通过偶联剂与幽门螺旋杆菌抗体Ⅰ偶联；
优选地，所述催化剂为N-羟基丁二酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐组合催化剂；
优选地，所述乳胶微球的粒径为范围为50nm～250nm；
作为进一步技术方案，所述含乳胶标记物Ⅰ聚酯膜的制备方法包括，将稀释后的所述的乳胶标记物Ⅰ喷涂于聚酯膜上；
优选地，稀释使用的稀释液的组分包括，牛血清白蛋白、三(羟甲基)氨基甲烷和叠氮钠；
优选地，采用喷金机喷涂，喷涂的速度进一步优选为0.5～1.5μL/cm，更优选为1.0μL/cm；
优选地，在喷涂前，所述聚酯膜经过处理液处理，所述处理液的成分包括，磷酸氢二钠、牛血清白蛋白、聚乙烯醇和曲拉通X-100。
作为进一步技术方案，所述质控区涂有质控线，所述质控线的制备方法包括，将缓冲液稀释后的抗体Ⅲ在质控区划线，所述抗体Ⅲ为羊抗鼠多克隆抗体；
所述检测区涂有检测线，所述检测线的制备方法包括，将缓冲液稀释后的鼠源幽门螺旋杆菌抗体Ⅱ在检测区划线；
优选地，所述缓冲液包括PBS缓冲液；
优选地，所述PBS缓冲液的成分包括，氯化钠、无水磷酸氢二钠、无水磷酸二氢钠和叠氮钠，所述PBS缓冲液的pH为7.4±0.1；
优选地，硝酸纤维素膜上包被的抗体Ⅲ和鼠源幽门螺杆菌抗体Ⅱ，包被质量与试剂条长度的比分别为0.5～1μg/cm和0.1～0.5μg/cm，优选为1μg/cm和0.5μg/cm。
优选地，缓冲液稀释后，抗体Ⅲ或鼠源幽门螺杆菌抗体Ⅱ的终浓度为0.5～1g/L，优选为1g/L。
作为进一步技术方案，所述样本垫涂覆有样本垫处理液，所述样本垫处理液的成分包括，缓冲盐、聚乙烯吡咯烷酮、酪蛋白和表面活性剂；
优选地，所述样本垫处理液的成分包括，0.1mol缓冲盐，0.8％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮，0.5％(w/v)酪蛋白和1％(w/v)表面活性剂；
优选地，所述样本垫处理液的pH为7.4±0.1。
作为进一步技术方案，所述检测区中的检测线与所述质控区中的质控线相距为5～10mm，优选为7mm。
第三方面，本发明提供了一种幽门螺旋杆菌检测试剂笔，所述试剂笔包括所述的试剂条，和套设在试剂条外的试剂笔壳，所述试剂笔壳一端设有采集部。
作为进一步技术方案，所述采集部和试剂条之间设有吸水材料，所述吸水材料分别与采集部和试剂条接触连接；
优选地，所述吸水材料包括吸水海绵。
本发明的技术效果在于：本发明将幽门螺旋杆菌抗体Ⅱ作为检测区的包被抗体，用于制备检测宠物幽门螺杆菌的产品；所述检测宠物幽门螺杆菌产品通过免疫层析法检测宠物幽门螺杆菌，检测过程中待测样品的层析方向为垂直的由下往上。故选择参考本发明原有的笔型外观进行改进，同时在试剂条的成分配制上进行优化，筛选出性能最优的试剂配方，通过将检测试剂板与检测试剂笔进行对比，以达到相接近的效果，满足灵敏度等指标的要求。本发明不仅为动物行业对于犬/猫幽门螺杆菌抗原检测试剂，提供一种较新颖的检测方式，同时在检测过程中，缩短了样品的处理时间，其优点主要有可在幽门螺杆菌阳性粪便样本中检测出大约5ng/mL的尿素酶。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的犬/猫的幽门螺杆菌检测试剂笔的结构示意图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，以下实施方案中，鼠源幽门螺旋杆菌抗体Ⅱ的重链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，轻链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；幽门螺旋杆菌抗体Ⅰ的重链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示：轻链的可变区氨基酸序列如SEQID NO.16所示：
在某次具体实施方式中，本发明提供了犬/猫幽门螺杆菌检测试剂笔的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)乳胶标记物Ⅰ制备：乳胶微球购自Magsphere公司，用电镜进行检测，观察乳胶颗粒平均为200nm，使用羧基活化缓冲液清洗微球，离心弃去上清液，反复清洗2～3次，后重新加入羧基活化缓冲液后进行超声，加入N-羟基丁二酰亚胺，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐溶液孵浴20min，离心弃去上清，使用偶联剂进行偶联，将配备好的幽门螺旋杆菌抗体Ⅰ(杭州旭科生物技术有限公司，R0176)加入微球中形成HP抗体-乳胶标记物Ⅰ，震荡2h后，用PBS/BSA洗涤2～3次，后加入保存液进行保存。
(2)聚酯膜的制备：将步骤(1)获得的HP抗体-乳胶标记物Ⅰ用乳胶稀释缓冲液进行稀释(稀释液主要成分包括：牛血清白蛋白，三(羟甲基)氨基甲烷，叠氮钠)，通过喷金机选取一定的喷量，均匀喷布在处理好的聚酯膜上(聚酯膜经聚酯膜处理液先进行处理，主要成分包括：磷酸氢二钠，牛血清白蛋白，聚乙烯醇，曲拉通X-100)。
(3)猫/犬幽门螺杆菌检测试剂抗体包被：将质控线(C线)和检测线(T线)原料用PBS缓冲液(主要成分包括氯化钠，无水磷酸氢二钠，无水磷酸二氢钠，叠氮钠，pH调整至7.4±0.1)稀释至1.0mg/mL，将抗犬/猫鼠源幽门螺杆菌抗体Ⅱ(杭州旭科生物技术有限公司，RM0023)和羊抗鼠多克隆抗体分别划线在处理好的硝酸纤维素膜(购自赛多利斯Sartorius的CN140)的PVC板材上，烘干24h备用，制得免疫硝酸纤维素膜；
(4)样本垫处理制备：从奥斯创公司采购(8964#)玻璃纤维膜，按比例配制溶液主要的化学成分为(0.1mol缓冲盐，0.8％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，0.5％酪蛋白和1％表面活性剂)，调节合适的pH，将配制的溶液涂布在纤维膜上，后放入37℃烘箱干燥过夜，备用。
(5)将上述制备的聚酯膜、免疫硝酸纤维素膜，样本垫，吸水纸按顺序，将试剂条和试剂笔进行组装，盖好，得到的试剂笔的结构示意图如图1所示，其中1为吸水纸，2为质控区，3为检测区，4为含乳胶标记物Ⅰ聚酯膜，5为样本垫，6为采集区。
1、样本的采集处理：
取出试剂笔，取下检测笔保护套，将试剂笔取样头伸入采集部位或/粪便样本中旋转3～5圈。采集完毕后，将试剂笔取样头缓慢垂直插入样本稀释液中。
2、样本的检测及结果判读：
阴性结果：仅质控区(C线)出现一条带，在检测区(T线)内无条带显现。阴性结果表明：样本中未检出幽门螺旋杆菌。
阳性结果：两条条带均出现。一条位于检测区(T线)内，另一条位于质控区(C线)。阳性结果表明：样本中含有幽门螺旋杆菌。
无效：质控区(C线)未出现紫红色条带，表明不正确的操作过程或试剂已经变质损坏，在此情况下，应再次仔细阅读说明书，并用新的试剂重新测试。
实施例1犬/猫幽门螺杆菌检测试剂条的不同抗体浓度配比筛选
参考上述具体实施方式制备试剂条的方法，在猫/犬幽门螺杆菌检测试剂抗体包被制备过程中，选择了三种不同的稀释浓度稀释检测线(T线)原料，分别稀释至0.5mg/mL，1.0mg/mL，1.5mg/mL，其余制备过程保持一致，最终组装成试剂笔进行检测。
试验方法：
1、准备试剂：取犬/猫幽门螺杆菌检测试剂笔，将试剂笔放置水平桌面上静置恢复至室温(15℃～25℃)，取犬/猫幽门螺杆菌检测试剂板，放置桌面静置至室温(15℃～25℃)。
2、配制待测样品：配制幽门螺旋杆菌尿素酶浓度分别为2.5ng/mL，5ng/mL，20ng/mL，50ng/mL，100ng/mL，200ng/mL的企业质控参考品作为标准品。
3、检测样品及结果观察：取吸管取样品稀释液2～3滴，滴入海绵头上，后将笔头竖直插入装有样品稀释液的裂解管中，静置于桌面等待10～15分钟，进行结果判读。
表1犬/猫幽门螺杆菌检测试剂笔不同抗体浓度T线显色对比
通过对比不同抗体浓度配比可以看出，使用T线浓度为1.0mg/mL和1.5mg/mL的幽门螺旋杆菌抗体配比时，试剂的灵敏度较好，而0.5mg/mL的抗体浓度灵敏度较差，梯度显色强度较弱。为节省使用成本，选择使用1.0mg/mL的浓度抗体，以达到用较少的浓度达到最好的效果，效价最高。
实施例2犬/猫幽门螺杆菌检测试剂笔的乳胶微球筛选
1、试验方法：
参考上述具体实施方式制备试剂条的方法，在乳胶微球标记制备过程中，选择了三种不同的C乳胶，分别为C-Latex1，C-Latex2，C-Latex3。其中C-Latex1为黑色，C-Latex2为淡红色，C-Latex3红色。将乳胶微球标记完毕后，其余制备过程保持一致，最终组装成试剂笔进行检测，通过对比验证，三种不同乳胶微球的显色强度，以及试剂的灵敏度。
2、配制待测样品：配制幽门螺旋杆菌尿素酶浓度分别为5ng/mL，20ng/mL，50ng/mL的企业质控参考品，以临床阴性粪便样本和空白稀释液为对照。
表2犬/猫幽门螺杆菌检测试剂笔不同乳胶颗粒C/T线显色对比
注：从L2至L10，显色逐渐增强。
通过对比检测试剂条上配方的乳胶颗粒使用类别，可以发现C-Latex3乳胶颗粒使用的显色强度比C-Latex1，C-Latex2更强，同时性能最佳。
实施例3犬/猫幽门螺杆菌检测试剂笔的样本垫处理pH筛选
1、试验方法：
参考上述具体实施方式中提供的试剂条的制备方法，对样本垫制备过程进行优化。选取8964#玻璃纤维膜，按比例配制溶液主要的化学成分为(0.1mol/L缓冲盐，0.8％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，0.5％酪蛋白和1％表面活性剂)，分别配制三份溶液，调节pH分别为pH＝6.0，pH＝7.4，pH＝9.0，将配制的溶液涂布在纤维膜上，后放入37℃烘箱干燥过夜，其余制备过程保持一致。
2、配制待测样品：配制幽门螺旋杆菌尿素酶浓度分别为2.5ng/mL，5ng/mL，20ng/mL，50ng/mL，100ng/mL，200ng/mL的企业质控参考品，以临床阴性粪便样本和空白稀释液为对照。
3、检测样品及结果观察：取吸管取样品稀释液2～3滴，滴入海绵头上，后将笔头竖直插入装有样品稀释液的裂解管中，静置于桌面等待10～15分钟，后进行结果判读。
表3犬/猫幽门螺杆菌检测试剂笔不同pH样本垫对比
结果表明：将三种pH的样本垫进行对比，模拟对应的缓冲反应环境。在经偏酸性处理后的样本垫，对比试验灵敏度效果减弱，显色梯度不强，显色结果较差，同时经偏弱碱性处理后的样本垫，在显色过程中，阴性对照会出现假阳性情况，同时试剂条显色结果偏红，整体移动速度较慢，对显色结果产生较大的影响。所以对比分析选择使用pH＝7.4的样本垫。
实施例4犬/猫幽门螺杆菌检测试剂笔与检测板的跑板速度对比实验检测方法：
1、准备试剂：分别取三份犬/猫幽门螺杆菌检测试剂笔，将试剂笔放置水平桌面上静置恢复至室温(15℃～25℃)，取三份犬/猫幽门螺杆菌检测试剂板，放置桌面静置至室温(15℃～25℃)。
2、配制待测样品：配制企业质控参考品50ng/mL
3、检测样品及结果观察：
移行速率＝L/t(L为C线到样本垫底端的距离，t为C线出现的时间)，将试剂笔取样头缓慢垂直插入样本稀释液中，从加入样本后开始用秒表计时，直至液体达到C线时停止计时，所用的时间记为(t)，用游标卡尺测量C线到样本垫底端的长度，记为(L)。
表4犬/猫幽门螺杆菌检测试剂笔与试剂板的跑板速度对比结果
结果表明，经过犬/猫幽门螺杆菌检测试剂笔与试剂板的跑板速度对比，可以看出样本检测笔检测移行速率在11.4mm/min检测板检测移动速率在12.3mm/min，两种产品样本跑板速度基本一致，无明显差别。
实施例5犬/猫幽门螺杆菌检测试剂笔与试剂板的灵敏度对比实验
检测方法：
1、准备试剂：取犬/猫幽门螺杆菌检测试剂笔，将试剂笔放置水平桌面上静置恢复至室温(15℃～25℃)，取犬/猫幽门螺杆菌检测试剂板，放置桌面静置至室温(15℃～25℃)。
2、配制待测样品：配制幽门螺旋杆菌尿素酶浓度分别为2.5ng/mL，5ng/mL，20ng/mL，50ng/mL，100ng/mL，200ng/mL的企业质控参考品。
3、检测样品及结果观察：取吸管取样品稀释液2～3滴，滴入海绵头上，后将笔头竖直插入装有样品稀释液的裂解管中，静置于桌面等待10～15分钟，后进行结果判读。
表5犬/猫幽门螺杆菌检测试剂笔与试剂板灵敏度对比结果验证
结果可以证明，通过对犬/猫幽门螺杆菌检测试剂笔与试剂板检测结果对比验证，犬/猫幽门螺杆菌检测试剂笔的灵敏度与试剂板相接近，同时本发明所制得的犬/猫幽门螺杆菌检测试剂笔灵敏度为5ng/mL，符合检测要求。
实施例6犬/猫幽门螺杆菌检测试剂笔的重复性及稳定性实验
1、试验方法：
制备三批次的犬/猫幽门螺杆菌检测试剂笔分别记为A1，B1，C1，每个试剂笔分别检测幽门螺旋杆菌尿素酶企业质控参考品浓度为5ng/mL，20ng/mL，50ng/mL每个浓度重复5次，分别包装在放有干燥剂的铝箔袋中，置于55℃的烘箱中，分别在0天，3天，7天，14天，30天取出其中5支检测笔，用幽门螺旋杆菌尿素酶质控参考品分别检测5ng/mL，20ng/mL，50ng/mL，一方面进行加速稳定性的研究，同时检测试剂笔的重复性，灵敏度等指标。
2、实验结果：
表6犬/猫幽门螺杆菌检测试剂笔稳定性结果
结果证明，可以看出犬/猫幽门螺杆菌检测试剂笔的批内与批间差异不大，重复性为100％，同时也不存在假阳性与假阴性。研发的三批样品可以在55℃保持稳定至少30天，根据阿伦尼乌斯公式(Arrhenius equation)，试剂能在正常室温下保持2年稳定，同时其灵敏度重复性均稳定，未发生较大变化。
实施例7犬/猫幽门螺杆菌检测试剂笔的临床试验
在浙江地区随机选取八家宠物医院，根据临床初步诊断为可能携带幽门螺杆菌的病原体，共采集160份临床粪便样本，其中猫样本共79份，犬样本共81份，使用本发明的犬/猫幽门螺杆菌检测试剂笔分别对以上临床样本进行检测，拔出塑料帽，用笔头(海绵头)在样本处轻轻旋绕3～5周，后将笔头竖直插入装有样本稀释液的裂解管中，静置桌面等待10～15分钟进行结果判读。结果显示，160份样本中，猫样本中，有63份粪便样本呈阳性，犬样本中，有27份粪便样本呈阳性，其余的均为阴性，未发生两条线均无法显色的检测笔。
根据以八家宠物医院临床检测结果为参照，对以上160份临床粪便检测试验结果进行统计，如表7所示：
表7临床检测试验与试剂笔检测结果
表8结果汇总表
根据与临床检测试验结果相比，本发明的犬/猫幽门螺杆菌检测试剂笔检测结果的灵敏度为＝90/(90+1)×100％＝98.9％。特异度(specificity，SPE)，即＝69/69×100％＝100％，真阳性率(PPV)，即＝90/90×100％＝100％，同时符合率为＝(90+68)/160*100％＝98.7％。
从上述相应的试验实例可以发现，本发明制备的犬/猫幽门螺杆菌检测试剂笔与现有的宠物医院检验结果相符合，产品的灵敏度与特异度都表现较好，同时具备采样方便，操作过程简单，造型新颖，判定结果直观快速，适用于宠物医院，宠物救助站，养宠人群用于诊断宠物是否感染幽门螺杆菌。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.鼠源幽门螺旋杆菌抗体Ⅱ在制备检测宠物幽门螺杆菌产品中的应用；所述检测宠物幽门螺杆菌产品通过免疫层析法检测宠物幽门螺杆菌，检测过程中待测样品的层析方向为垂直的由下往上，所述鼠源幽门螺旋杆菌抗体Ⅱ包被于免疫层析法的检测区；
所述鼠源幽门螺旋杆菌抗体Ⅱ的可变区包括：具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的互补决定区CDR1-VH、具有如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的互补决定区CDR2-VH、具有如SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的互补决定区CDR3-VH、具有如SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的互补决定区CDR1-VL、具有如SEQ ID NO.19所示氨基酸序列的互补决定区CDR2-VL和具有如SEQ ID NO.5所示氨基酸序列的互补决定区CDR3-VL。
2.幽门螺旋杆菌检测试剂条，其特征在于，所述试剂条由上往下依次包括质控区、检测区、含乳胶标记物Ⅰ聚酯膜、样本垫和吸水纸；所述检测区包被有鼠源幽门螺旋杆菌抗体Ⅱ；
所述鼠源幽门螺旋杆菌抗体Ⅱ的可变区包括：具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的互补决定区CDR1-VH、具有如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的互补决定区CDR2-VH、具有如SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的互补决定区CDR3-VH、具有如SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的互补决定区CDR1-VL、具有如SEQ ID NO.19所示氨基酸序列的互补决定区CDR2-VL和具有如SEQ ID NO.5所示氨基酸序列的互补决定区CDR3-VL；
优选地，所述试剂条的基底材料为硝酸纤维素膜。
3.根据权利要求2所述的试剂条，其特征在于，所述乳胶标记物Ⅰ为偶联幽门螺旋杆菌抗体Ⅰ的乳胶微球；
所述幽门螺旋杆菌抗体Ⅰ的可变区包括：具有如SEQ ID NO.10所示氨基酸序列的互补决定区CDR1-VH、具有如SEQ ID NO.11所示氨基酸序列的互补决定区CDR2-VH、具有如SEQID NO.12所示氨基酸序列的互补决定区CDR3-VH、具有如SEQ ID NO.13所示氨基酸序列的互补决定区CDR1-VL、具有如SEQ ID NO.20所示氨基酸序列的互补决定区CDR2-VL和具有如SEQ ID NO.14所示氨基酸序列的互补决定区CDR3-VL；
优选地，所述乳胶为C乳胶，选自C-Latex1、C-Latex2或C-Latex3；进一步优选为C-Latex3。
4.根据权利要求3所述的试剂条，其特征在于，所述乳胶标记物Ⅰ的制备方法包括，羧基活化后的乳胶微球，在催化剂作用下，通过偶联剂与幽门螺旋杆菌抗体Ⅰ偶联；
优选地，所述催化剂为N-羟基丁二酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐组合催化剂；
优选地，所述乳胶微球的粒径为范围为50nm～250nm。
5.根据权利要求2所述的试剂条，其特征在于，所述含乳胶标记物Ⅰ聚酯膜的制备方法包括，将稀释后的权利要求3所述的乳胶标记物Ⅰ喷涂于聚酯膜上；
优选地，稀释使用的稀释液的组分包括，牛血清白蛋白、三(羟甲基)氨基甲烷和叠氮钠；
优选地，采用喷金机喷涂，喷涂的速度进一步优选为0.5～1.5μL/cm，更优选为1.0μL/cm；
优选地，在喷涂前，所述聚酯膜经过处理液处理，所述处理液的成分包括，磷酸氢二钠、牛血清白蛋白、聚乙烯醇和曲拉通X-100。
6.根据权利要求2所述的试剂条，其特征在于，所述质控区涂有质控线，所述质控线的制备方法包括，将缓冲液稀释后的抗体Ⅲ在质控区划线，所述抗体Ⅲ为羊抗鼠多克隆抗体；
所述检测区涂有检测线，所述检测线的制备方法包括，将缓冲液稀释后的鼠源幽门螺旋杆菌抗体Ⅱ在检测区划线；
优选地，所述缓冲液包括PBS缓冲液；
优选地，所述PBS缓冲液的成分包括，氯化钠、无水磷酸氢二钠、无水磷酸二氢钠和叠氮钠，所述PBS缓冲液的pH为7.4±0.1；
优选地，硝酸纤维素膜上包被的抗体Ⅲ和鼠源幽门螺杆菌抗体Ⅱ，包被质量与试剂条长度的比分别为0.5～1μg/cm和0.1～0.5μg/cm，优选为1μg/cm和0.5μg/cm；
优选地，缓冲液稀释后，抗体Ⅲ或鼠源幽门螺杆菌抗体Ⅱ的终浓度为0.5～1g/L，优选为1g/L。
7.根据权利要求2所述的试剂条，其特征在于，所述样本垫涂覆有样本垫处理液，所述样本垫处理液的成分包括，缓冲盐、聚乙烯吡咯烷酮、酪蛋白和表面活性剂；
优选地，所述样本垫处理液的成分包括，0.1mol缓冲盐，0.8％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮，0.5％(w/v)酪蛋白和1％(w/v)表面活性剂；
优选地，所述样本垫处理液的pH为7.4±0.1。
8.根据权利要求2～7任一项所述的试剂条，其特征在于，所述检测区中的检测线与所述质控区中的质控线相距为5～10mm，优选为7mm。
9.幽门螺旋杆菌检测试剂笔，其特征在于，所述试剂笔包括权利要求2～8任一项所述的试剂条，和套设在试剂条外的试剂笔壳，所述试剂笔壳一端设有采集部。
10.根据权利要求9所述的试剂笔，其特征在于，所述采集部和试剂条之间设有吸水材料，所述吸水材料分别与采集部和试剂条接触连接；
优选地，所述吸水材料包括吸水海绵。
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