CN118600054A - 一种发酵乳中活性益生菌的三重数字pcr定量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种发酵乳中活性益生菌的三重数字PCR定量检测方法，所述活性益生菌为嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、和动物双歧杆菌，所述三重数字PCR定量检测方法使用的引物和探针序列为：嗜酸乳杆菌的引物和探针序列如SEQ ID NO.1‑3所示；鼠李糖乳杆菌的引物和探针序列如SEQ ID NO.4‑6所示；动物双歧杆菌的引物和探针序列如SEQ ID NO.7‑9所示。本发明的三重数字PCR定量检测方法所使用的引物和探针对于这三种活性益生菌具有很好的特异性，相互之间无交叉反应，并且灵敏度高、重复性好。
Description
技术领域
本发明属于益生菌检测技术领域，具体地说，是关于一种发酵乳中活性益生菌的三重数字PCR定量检测方法。
背景技术
随着人们对食品保健的关注逐渐升温，益生菌凭借其优化肠道菌群、调节免疫系统、促进脂质代谢和改善神经系统等多重益处，成为食品创新的推动力。在中国，益生菌乳制品占据着益生菌市场的重要份额，对该产业增长至关重要。然而，为了确保这些产品的质量安全和营养功效，对其中的益生菌菌种进行精确鉴定和计数至关重要，这也是避免健康风险和误导性宣称的关键因素。
嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和动物双歧杆菌是常见的三种益生菌，它们被广泛应用于发酵乳制品中。然而，目前市场监管中的检测方法仍然采用传统的培养方法，如GB4789.35-2023《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》和GB/T 4789.34-2016《食品卫生微生物学检验双歧杆菌检验》，这些方法检测周期长、不能满足高效的种特异性鉴定和计数要求，并且容易漏检活的非培养状态的菌。
随着分子生物学技术的进步，实时荧光定量PCR(real time-quantitative PCR,RT-qPCR)技术被广泛应用于食品中的益生菌定量检测，但仍存在着定量精度受到扩增效率和标准品质量影响的问题。
数字PCR(digital polymerase chain reaction，dPCR)作为一种新兴的定量分析技术，通过将样品分成大量的小反应单元，进行独立的PCR反应，直接计数阳性和阴性单元，从而实现绝对定量。与RT-qPCR相比，dPCR具有更高的灵敏度和更强的抑制剂耐受性，且不依赖于标准曲线。前期的研究表明，利用dPCR方法进行益生菌的定量检测，在饮料中的嗜酸乳杆菌检出限显著低于RT-qPCR。值得注意的是，PCR方法检测的是益生菌的DNA，样品中的死菌DNA也会稳定存在，可能导致检测结果的假阳性，因此，建立一种能够快速准确测量益生菌活菌数的方法显得尤为重要。
叠氮溴化丙锭(PMA)作为一种光敏核酸染料，在强光下能与死菌暴露的DNA发生共价交联反应，抑制其在PCR反应中的扩增，从而排除假阳性干扰，实现对活菌的准确检测。而且，市场上的益生菌发酵乳通常添加复合菌种，一种多重活菌定量检测方法的建立有助于大幅提升监管效率。
发明内容
针对目前对于活性益生菌的鉴定和计数所存在的缺点，本发明致力于开发一种多重活菌定量检测方法，以实现对于活菌的精准检测。
为实现上述目的，本发明的第一个方面，提供了一种发酵乳中活性益生菌的三重数字PCR定量检测方法，所述活性益生菌为嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、和动物双歧杆菌，所述三重数字PCR定量检测方法使用的引物和探针的序列如下：
所述嗜酸乳杆菌的正向引物、反向引物和探针序列分别如SEQ ID NO.1-3所示；
所述鼠李糖乳杆菌的正向引物、反向引物和探针序列分别如SEQ ID NO.4-6所示；
所述动物双歧杆菌的正向引物、反向引物和探针序列分别如SEQ ID NO.7-9所示。
根据本发明，所述方法包括提取活性益生菌的核酸作为模板进行数字PCR扩增，PCR反应体系为：
10×PCR Buffer 2μL，上游引物(10μmol/L)1μL，下游引物(10μmol/L)1μL，探针(5μmol/L)0.5μL，DNA模板2μL，去离子水13.5μL。
进一步的，所述数字PCR扩增的反应程序为：第一阶段95℃5min；第二阶段95℃30sec，58℃45sec，共40个循环。
根据本发明的优选实施例，在数字PCR扩增前还包括使用叠氮溴化丙锭对三种活性益生菌进行处理。
优选的，所述叠氮溴化丙锭的20μg/mL。
本发明的第二个方面，提供了一组用于发酵乳中活性益生菌的三重数字PCR定量检测的引物探针组，所述活性益生菌为嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、和动物双歧杆菌，所述引物探针组的序列如下：
所述嗜酸乳杆菌的正向引物、反向引物和探针序列分别如SEQ ID NO.1-3所示；
所述鼠李糖乳杆菌的正向引物、反向引物和探针序列分别如SEQ ID NO.4-6所示；
所述动物双歧杆菌的正向引物、反向引物和探针序列分别如SEQ ID NO.7-9所示。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明通过优选针对三种活性益生菌，嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和动物双歧杆菌的polA、CDS17，dnaA特异性基因设计的引物和探针序列，对于这三种菌具有很好的特异性，且相互之间无交叉反应。
2、本发明所建立的三重数字PCR定量检测方法对于嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和动物双歧杆菌的检测灵敏度高，分别达到1.65copies/μL，2.20copies/μL和2.16copies/μL。
3、本发明所建立的三重数字PCR定量检测方法对于嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和动物双歧杆菌的重复性较好，RSD值在1.52％～8.69％之间。
附图说明
图1为单重cdPCR扩增温度检测的一维图，图中FAM通道是嗜酸乳杆菌在54℃～60℃的扩增结果，HEX通道是鼠李糖乳杆菌在54℃～60℃的扩增结果，CY5通道是动物双歧杆菌在54℃～60℃的扩增结果。
图2为单重cdPCR特异性检测的一维图，图中12个样品从左至右依次是：嗜酸乳杆菌La-14，嗜酸乳杆菌ATCC 4356，鼠李糖乳杆菌ATCC 8530，鼠李糖乳杆菌ATCC 11443，动物双歧杆菌BB12，动物双歧杆菌DSMZ 10140，德氏乳杆菌CICC 6097，干酪乳杆菌ATCC 334，植物乳杆菌ATCC 8014，嗜热链球菌ATCC 19258，副干酪乳杆菌CICC 6107，空白对照，其中，a表示嗜酸乳杆菌引物探针扩增结果，b表示鼠李糖乳杆菌引物探针扩增结果，c表示动物双歧杆菌引物探针扩增结果。
图3为PMA浓度优化的结果，图中，a、b、c分别对应嗜酸乳杆菌ATCC 4356、鼠李糖乳杆菌ATCC 11443、动物双歧杆菌BB12。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
材料与试剂：
MRS肉汤，MRS培养基，北京陆桥技术股份有限公司；
叠氮溴化丙锭，美国Biotium公司；
溶菌酶，生工生物工程(上海)股份有限公司；
细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)，天根生化科技(北京)有限公司；
二甲基亚砜，国药集团化学试剂有限公司；
10×PCR Buffer，臻准生物科技(上海)有限公司。
仪器与设备：
Eppendorf 5417R型高速台式离心机，德国Eppendorf公司；
DeNovix DS-11型微量分光光度计，美国DeNovix公司；
ANOXOMAT MARK II型厌氧培养系统，荷兰Mart Microbiology B.V公司；
电热恒温培养箱，美国Shellab公司；
ESCO LA2-4A1型生物安全柜，新加坡ESCO公司；
Mettle toledo AL204型分析天平，梅特勒-托利多(常州)称重设备系统有限公司；
500W卤钨灯，荷兰飞利浦公司；
微量移液器(2μL，10μL，100μL，1000μL)，法国Gilson公司；
生物芯片，AccuONE Amplifier扩增仪，AccuONE Reader阅读仪，臻准生物科技(上海)有限公司。
益生菌菌种：
本发明所涉及的试验益生菌菌株包括2株嗜酸乳杆菌、2株鼠李糖乳杆菌、2株动物双歧杆菌及5株其他发酵乳中常见菌株，详情见表1。
表1：实验所用益生菌菌株
实施例1、引物与探针的设计
1.1、特异性基因的选择
为实现对嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和动物双歧杆菌的特异性检测和绝对定量分析，本申请的发明人分别选取了嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和动物双歧杆菌的具有种内保守属间特异的染色体单拷贝区域序列作为靶序列，其中嗜酸乳杆菌为polA，鼠李糖乳杆菌为未知功能的蛋白编码序列CDS17和CDS18，动物双歧杆菌为dnaA及未知功能的蛋白编码序列CDS48。
1.2、引物和探针的设计
根据1.1的结果，分别利用嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、动物双歧杆菌的polA，CDS17和CDS18，dnaA和CDS48特异性基因设计引物探针，每一种乳酸菌设计2～3组引物和探针序列，具体序列分别如表2、表3和表4所示。引物和探针由上海生物工程技术服务有限公司合成。
表2：嗜酸乳杆菌的引物和探针序列
表3：鼠李糖乳杆菌的引物和探针序列
表4：动物双歧杆菌的引物和探针序列
根据引物探针的特异性和荧光强度进行筛选，最终选择以下三组引物探针序列用于后续嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和动物双歧杆菌的PCR定量检测。
表5：三重PCR引物和探针序列
实施例2、核酸提取
按照细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)中厂商提供的说明书，对实验菌株，嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、以及动物双歧杆菌进行核酸提取。用DeNovix DS-11微量分光光度计测定DNA样品的浓度、260/280比值和260/230比值后，存放于-20℃冰箱备用。
实施例3、单重芯片法数字PCR(cdPCR)扩增温度优化
利用实施例2提取的嗜酸乳杆菌ATCC 4356、鼠李糖乳杆菌ATCC 11443和动物双歧杆菌BB12的核酸作为模板进行cdPCR扩增。
PCR反应体系为：10×PCR Buffer 2μL，上游引物(10μmol/L)1μL，下游引物(10μmol/L)1μL，探针(5μmol/L)0.5μL，DNA模板2μL，去离子水13.5μL。
反应程序为：第一阶段95℃5min；第二阶段95℃30sec，54℃～60℃45sec，共40个循环。
嗜酸乳杆菌ATCC 4356、鼠李糖乳杆菌ATCC 11443和动物双歧杆菌BB12在54℃～60℃的温度下进行扩增的结果如图1所示。
由图的结果可知，三组引物探针在60℃时扩增的荧光强度有所下降，而在58℃时的阳性微滴数最多，因此选择58℃作为后续多重cdPCR的扩增温度。
实施例4、单重cdPCR特异性试验
分别选用2株嗜酸乳杆菌、2株鼠李糖乳杆菌、2株动物双歧杆菌的核酸作为阳性对照，5株其他发酵乳中常见菌株的核酸作为阴性对照(表1)，以无菌水作为空白对照，按照以下反应程序进行cdPCR扩增：
第一阶段95℃5min；第二阶段95℃30sec，58℃45sec，共40个循环。
实验结果如图2所示。图中，12个样品从左至右依次是：嗜酸乳杆菌La-14，嗜酸乳杆菌ATCC 4356，鼠李糖乳杆菌ATCC 8530，鼠李糖乳杆菌ATCC 11443，动物双歧杆菌BB12，动物双歧杆菌DSMZ 10140，德氏乳杆菌CICC 6097，干酪乳杆菌ATCC 334，植物乳杆菌ATCC8014，嗜热链球菌ATCC 19258，副干酪乳杆菌CICC 6107，空白对照。a表示嗜酸乳杆菌的引物探针的扩增结果，b表示鼠李糖乳杆菌的引物探针的扩增结果，c表示动物双歧杆菌的引物探针的扩增结果。
由图2的结果可知，每组引物探针均能对相应的目标菌种进行扩增，且对于非目标菌种和空白对照无扩增。说明每组引物探针都具有很好的特异性，且相互之间无交叉反应。
实施例5、三重cdPCR体系的建立
将3组目标菌株的引物与探针组合，使得每种引物和探针的终浓度与单重cdPCR一致。按照实施例4的反应条件进行扩增，比较三重cdPCR与单重cdPCR的检测结果，结果如表6所示。
表6：单重及三重cdPCR检测样本拷贝数结果
由表6的结果可知，三重cdPCR与单重cdPCR的扩增结果一致性较强，两者拷贝数较为接近，说明该三重扩增体系可用于后续样品检测。
实施例6、死菌液的制备
分别吸取0.5mL 107CFU/mL的嗜酸乳杆菌ATCC 4356、鼠李糖乳杆菌ATCC 11443和动物双歧杆菌BB12菌悬液于2mL离心管中，沸水浴6min。按照《GB 4789.35-2023食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》的方法验证，确保无菌落长出。
实施例7、叠氮溴化丙锭(PMA)浓度的条件优化
7.1、PMA试剂配制：
将1mg PMA染料溶于1mL 20％的二甲基亚砜中，制成1mg/mL的PMA储存液，置于-20℃避光保存。
7.2、PMA作用的最适浓度
分别吸取0.5mL 107CFU/mL的嗜酸乳杆菌ATCC 4356、鼠李糖乳杆菌ATCC 11443和动物双歧杆菌BB12的活菌液和死菌液各5份于2mL离心管中，分别加入PMA使其终浓度分别为0、10、20、40、60μg/mL，充分混匀，暗反应孵育10min。
将离心管置于500W卤钨灯下20cm处曝光15min(管口朝上，置于冰上)进行光反应。随后用试剂盒提取基因组DNA，分别进行qPCR和cdPCR检测，通过分析PMA抑制死细胞DNA扩增的最小浓度和不影响活菌DNA扩增的最大浓度，来确定该方法PMA浓度。
利用不同浓度的PMA对嗜酸乳杆菌ATCC 4356、鼠李糖乳杆菌ATCC 11443和动物双歧杆菌BB12的活菌和死菌进行染色后，再进行核酸提取和qPCR扩增，结果如图3所示，图中a、b、c分别对应嗜酸乳杆菌ATCC 4356、鼠李糖乳杆菌ATCC 11443、动物双歧杆菌BB12。
由图3的结果可知，20μg/mL的PMA可以有效抑制嗜酸乳杆菌ATCC 4356、鼠李糖乳杆菌ATCC 11443和动物双歧杆菌BB12死菌DNA的扩增，ΔCt值分别为9.72，5.41和7.06。cdPCR的结果也显示，20μg/mL的PMA处理后，减少了约99％的阳性孔数。因此，采用20μg/mL的PMA作为后续实际样品活菌染色浓度。
实施例8、三重PMA-cdPCR灵敏度试验
用20μg/mL的PMA分别处理嗜酸乳杆菌ATCC 4356、鼠李糖乳杆菌ATCC 11443和动物双歧杆菌BB12后，进行核酸提取。在此基础上，将3种益生菌的基因组DNA进行等体积混合，进行不同程度稀释(DNA，DNA-5×，DNA-10×，DNA-20×，DNA-100×，DNA-1000×，DNA-5000×)，使用7个稀释样本进行三重PMA-cdPCR灵敏度试验，每个样本重复第三次，以确定其检出限，结果如表7～表9所示。
表7：三重PMA-cdPCR嗜酸乳杆菌灵敏度检测结果
表8：三重PMA-cdPCR鼠李糖乳杆菌灵敏度检测结果
表9：三重PMA-cdPCR动物双歧杆菌灵敏度检测结果
由表7～表9的结果可知，根据平行试验RSD小于20％的要求，此三重PMA-cdPCR对于嗜酸乳杆菌ATCC 4356、鼠李糖乳杆菌ATCC 11443和动物双歧杆菌BB12的灵敏度分别为1.65copies/μL，2.20copies/μL和2.16copies/μL。
实施例9、三重PMA-cdPCR重复性试验
本实施例通过短时间内重复实验(两次实验间隔一周)来验证所建立方法的重复性。分别在3种不同稀释倍数的混合DNA浓度(DNA-2×，DNA-10×，DNA-100×)水平下进行重复性测试，结果如表10所示。
表10：三重PMA-cdPCR重复性检测结果
由表10的结果可知，本发明的三重PMA-cdPCR方法重复性较好，RSD值在1.52％～8.69％之间。
实施例10、三重PMA-cdPCR实际样本检测
将上述建立的三重活菌定量检测方法应用于9份含有复合菌种的发酵乳样品的检测，每种样品含有嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和动物双歧杆菌中的一种至三种，结果如表11所示。
表11：市售样品检测结果
由表11的结果可知，标签标示添加嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和动物双歧杆菌中的1种至3种的样品均有阳性扩增，计算样品中菌的含量为5.8×104～5.3×107copies/g，菌种含量多少与样品标签菌种先后顺序信息基本一致。因此，本发明所建立的三重PMA-cdPCR方法可用于实际样品中嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和动物双歧杆菌的活性菌种的定量检测。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
Claims (6)
1.一种发酵乳中活性益生菌的三重数字PCR定量检测方法，其特征在于，所述活性益生菌为嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、和动物双歧杆菌，所述三重数字PCR定量检测方法使用的引物和探针的序列如下：
所述嗜酸乳杆菌的正向引物、反向引物和探针序列分别如SEQ ID NO.1-3所示；
所述鼠李糖乳杆菌的正向引物、反向引物和探针序列分别如SEQ ID NO.4-6所示；
所述动物双歧杆菌的正向引物、反向引物和探针序列分别如SEQ ID NO.7-9所示。
2.根据权利要求1所述的三重数字PCR定量检测方法，其特征在于，所述方法包括提取活性益生菌的核酸作为模板进行数字PCR扩增，PCR反应体系为：
10×PCR Buffer 2μL，上游引物(10μmol/L)1μL，下游引物(10μmol/L)1μL，探针(5μmol/L)0.5μL，DNA模板2μL，去离子水13.5μL。
3.根据权利要求1所述的三重数字PCR定量检测方法，其特征在于，所述数字PCR扩增的反应程序为：
第一阶段95℃5min；第二阶段95℃30sec，58℃45sec，共40个循环。
4.根据权利要求2所述的三重数字PCR定量检测方法，其特征在于，在数字PCR扩增前还包括使用叠氮溴化丙锭对三种活性益生菌进行处理。
5.根据权利要求4所述的三重数字PCR定量检测方法，其特征在于，所述叠氮溴化丙锭的20μg/mL。
6.用于发酵乳中活性益生菌的三重数字PCR定量检测的引物探针组，其特征在于，所述活性益生菌为嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、和动物双歧杆菌，所述引物探针组的序列如下：
所述嗜酸乳杆菌的正向引物、反向引物和探针序列分别如SEQ ID NO.1-3所示；
所述鼠李糖乳杆菌的正向引物、反向引物和探针序列分别如SEQ ID NO.4-6所示；
所述动物双歧杆菌的正向引物、反向引物和探针序列分别如SEQ ID NO.7-9所示。
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