CN118512465A

CN118512465A - 用于治疗小儿肺炎的药物组合物及其应用

Info

Publication number: CN118512465A
Application number: CN202410746171.2A
Authority: CN
Inventors: 赵嘉丽; 张福利; 郑春泽
Original assignee: Harbin Traditional Chinese Medicine Hospital; Heilongjiang University of Chinese Medicine
Current assignee: Harbin Traditional Chinese Medicine Hospital; Heilongjiang University of Chinese Medicine
Priority date: 2024-06-11
Filing date: 2024-06-11
Publication date: 2024-08-20

Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种用于治疗肺炎的药物组合物及其应用，尤其是小儿肺炎的药物组合物。该药物组合物包含活性成分牛蒡子苷和栝楼萜二醇，所述牛蒡子苷、栝楼萜二醇的重量比为2.5‑7.5：1；该药物组合物还可包含活性成分苦杏仁苷。药理学实验表明，本发明药物组合物均能够显著降低IL‑6和IL‑1β炎症因子的表达水平，大幅提升小儿肺炎的治疗效果，效果显著优于同等剂量的牛蒡子苷、栝楼萜二醇、苦杏仁苷单独用药。这表明将牛蒡子苷和栝楼萜二醇联用后，或者将牛蒡子苷、栝楼萜二醇和苦杏仁苷联用后，具有显著的协同增效作用。

Description

用于治疗小儿肺炎的药物组合物及其应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种用于治疗肺炎的药物组合物及其应用，尤其是用于治疗小儿肺炎的药物组合物。

背景技术

小儿肺炎是小儿时期最常见的一种呼吸系统疾病，以发热、咳嗽、气促、呼吸困难和肺部固定湿啰音为共同临床表现，是儿科常见疾病中能威胁生命的疾病之一。肺炎是指不同病原体或其他因素所致的肺部炎症，其中TLR4/NF-kB信号通路与抗炎免疫机制紧密相关，在炎症发生发展中起致关重要的作用。TLR4是机体介导天然免疫转向获得免疫的桥梁，广泛分布于巨噬细胞、中性粒细胞、内皮细胞、平滑肌细胞等细胞中，它们参与组成抗击入侵病原体的第一道防线，在炎症、免疫细胞调节、存活和增殖中发挥显著作用。核转录因子-kB(NF-kB)位于TLR4信号通路的下游的枢纽点，通常与细胞液中的抑制性蛋白(如IkBα)结合而形成无活性的复合物，当这些抑制性蛋白被磷酸化，NF-kB被活化从细胞质转运到细胞核，调节炎症基因的转录，引起IL-6、IL-1β等炎症细胞因子的表达，被认为是炎症级联反应的重要始动因素。

临床上常用的治疗小儿肺炎的药物包括西药抗病毒药和中成药，西药抗病毒药在发挥抗病毒作用的同时，也存在诸多不良反应，例如，可使患者出现头痛、乏力、白细胞和血小板水平降低、转氨酶升高等副作用。并且临床中可见部分肺炎患儿在经过对症治疗后，肺炎恢复期仍然存在咳嗽、咳痰等症状，且短期内极易反复肺炎或患其他呼吸道感染性疾病。病原微生物清除、上皮修复通常需要长期过程，气道、肺泡组织由急性炎症损伤易转变为慢性肺损伤，其哮喘、肺纤维化和闭塞性细支气管炎等疾病的风险增加，引起患儿反复呼吸道感染，频繁住院，运动耐力降低，严重影响其生命健康，造成巨大的经济和社会负担。因此，开发新的有效用于治疗小儿肺炎的药物，仍然是本领域技术人员亟待解决的技术问题。

牛蒡子苷(Arctiin，Arc)是从菊科两年生草本植物牛蒡属牛蒡的干燥成熟果实牛蒡子中提取分离而来的木脂素类化合物，分子式为C₂₇H₃₄O₁₁，分子量为534.5523，其含量在牛蒡子中达8.4％左右，牛蒡叶中也有少量存在。现代药理学研究表明，牛蒡子苷具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、增强免疫等生理活性，已引起人们的广泛重视，未来市场应用前景良好。

栝楼萜二醇(Karoμnidiol，Kar)是从葫芦科多年生攀缘草质藤本植物栝楼属栝楼的种子中提取分离而来的三萜类化合物，分子式为C₃₀H₄₈O₂，分子量为440.70。栝楼有很高的药用价值，其果实、果皮和种子为传统的中药“天花粉、栝楼、栝楼皮和栝楼子”，其根有清热生津、解毒消肿功效，而且根中天花粉蛋白有引产作用，是良好的避孕药。果实、种子和果皮具有清热化痰、润肺止咳、滑肠功效。

苦杏仁苷(Amygdalin，Amy)是传统中药苦杏仁的有效成分，广泛存在于苦杏、苦扁桃、桃、油桃、枇杷、李子、苹果、黑樱桃等多种蔷薇科植物的果仁和叶子中，尤其在苦杏仁中含量较多，大约在2％-3％。苦杏仁苷是一种含氰基的糖苷化合物，分子式为C₂₀H₂₇NO₁₁，分子量为457.428，具有止咳平喘、润肠通便、抗炎、镇痛、抗肿瘤、降血糖、降血脂等药理作用，具有较高的药用价值。

本发明人通过深入研究，意外地发现了通过将牛蒡子苷和栝楼萜二醇联用，或者将牛蒡子苷、栝楼萜二醇与苦杏仁苷联用，都能够显著增强治疗小儿肺炎的疗效，且毒副作用小，服用方便。

发明内容

本发明的目的是提供了一种具有协同增效作用的疗效好、毒副作用小、服用方便的用于治疗小儿肺炎的药物组合物及其应用。

具体地，通过以下几个方面的技术方案实现了本发明：

在第一个方面中，本发明提供了一种用于治疗肺炎的药物组合物，所述药物组合物包含活性成分牛蒡子苷和栝楼萜二醇，所述牛蒡子苷、栝楼萜二醇的重量比为2.5-7.5：1。

在一个优选的实施方案中，所述牛蒡子苷、栝楼萜二醇的重量比为3-7：1；优选为4-6：1；特别优选为5：1。本发明通过将牛蒡子苷、栝楼萜二醇的重量比控制在本发明的优选范围内，有助于提高所述药物组合物对小儿肺炎的治疗效果。

在一个优选的实施方案中，所述药物组合物由活性成分牛蒡子苷和栝楼萜二醇组成，所述牛蒡子苷、栝楼萜二醇的重量比为2.5-7.5：1。

在一个优选的实施方案中，所述药物组合物中，通过将牛蒡子苷和栝楼萜二醇联合使用，能够显著增强其对小儿肺炎的治疗效果。

在一个优选的实施方案中，所述药物组合物还可包含活性成分苦杏仁苷。

在一个优选的实施方案中，所述药物组合物中牛蒡子苷、栝楼萜二醇和苦杏仁苷的重量比为2.5-7.5：1：25-75。

在一个优选的实施方案中，所述牛蒡子苷、栝楼萜二醇和苦杏仁苷的重量比为3-7：1：30-70；优选为4-6：1：40-60；特别优选为5：1：50。本发明通过将牛蒡子苷、栝楼萜二醇和苦杏仁苷的重量比控制在本发明的优选范围内，有助于提高所述药物组合物对小儿肺炎的治疗效果。

在一个优选的实施方案中，所述药物组合物由活性成分牛蒡子苷、栝楼萜二醇和苦杏仁苷组成，所述牛蒡子苷、栝楼萜二醇和苦杏仁苷的重量比为2.5-7.5：1：25-75。

在一个优选的实施方案中，所述药物组合物中，通过将牛蒡子苷、栝楼萜二醇和苦杏仁苷联合使用，能够显著增强其对小儿肺炎的治疗效果。

本发明的牛蒡子苷的结构式如下：

本发明的栝楼萜二醇的结构式如下：

本发明的苦杏仁苷的结构式如下：

在第二个方面中，本发明提供了一种药物制剂，所述药物制剂包含上述第一个方面所述的药物组合物，以及药学上可接受的载体。

在一个优选的实施方案中，所述药物制剂的剂型为口服剂型。

在一个优选的实施方案中，所述口服剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂或糖浆剂。

优选地，所述口服剂型为糖浆剂。本发明通过将药物制剂制作成糖浆剂，更有利于小儿患者接受，能够提高患者的依从性。

在第三个方面中，本发明提供了上述第一个方面所述的药物组合物或者上述第二个方面所述的药物制剂在制备治疗肺炎的药物中的应用。

在第四个方面中，本发明提供了上述第一个方面所述的药物组合物或者上述第二个方面所述的药物制剂在制备治疗小儿肺炎的药物中的应用。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一赘述。

本发明相对于现有技术，具有以下有益效果：

本发明结合我国在天然化合物研究方面的优势，首次发现将特定用量比例的牛蒡子苷和栝楼萜二醇联用，或者将牛蒡子苷、栝楼萜二醇和苦杏仁苷联用，均能够显著降低IL-6和IL-1β炎症因子的表达水平，大幅提升肺炎的治疗效果，效果显著优于同等剂量的牛蒡子苷、栝楼萜二醇、苦杏仁苷单独用药。这表明将牛蒡子苷和栝楼萜二醇联用后，或者将牛蒡子苷、栝楼萜二醇和苦杏仁苷联用后，具有显著的协同增效作用。本发明的药物组合物还具有较少的毒副作用，且服用方便，具有开发成治疗肺炎尤其是小儿肺炎药物的前景，具有重要的社会效益和经济效益。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为不同浓度牛蒡子苷、栝楼萜二醇、苦杏仁苷的细胞毒性；

图2为牛蒡子苷、栝楼萜二醇、苦杏仁苷联合用药的细胞毒性；

图3为牛蒡子苷、栝楼萜二醇、苦杏仁苷联合用药对LPS诱导的肺细胞损伤保护作用的影响；

图4为牛蒡子苷、栝楼萜二醇、苦杏仁苷联合用药对LPS诱导的肺细胞损伤导致细胞凋亡的影响；

图5为牛蒡子苷、栝楼萜二醇、苦杏仁苷及其联合用药对IL-6、IL-1β炎症因子表达水平的影响；

图6为牛蒡子苷、栝楼萜二醇、苦杏仁苷及其联合用药对NF-kB、TLR4的mRNA表达水平的影响；

图7为牛蒡子苷、栝楼萜二醇、苦杏仁苷及其联合用药对磷酸化NF-kB、TLR4的蛋白相对表达量的影响。

具体实施方式

本发明人通过大量筛选，首次发现通过将牛蒡子苷和栝楼萜二醇联合使用，或者将牛蒡子苷、栝楼萜二醇和苦杏仁苷联合使用，能够显著增强小儿肺炎的治疗效果。在此基础上完成了本发明。

如本文所用，“药学上可接受的载体”是指可以是任何可与牛蒡子苷、栝楼萜二醇、苦杏仁苷制备成药物制剂，并用于临床治疗的辅料，选自润滑剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、助悬剂、溶剂、表面活性剂、润湿剂、色素、矫味剂等中的一种或几种。

上述各种剂型可以根据药物制剂领域的常规工艺制备而成。

在上文所述的医药用途中，对于本发明药物组合物的给药时间、给药次数和给药频率等，需要根据病情的具体诊断结果而定，这在本领域技术人员掌握的技术范围之内。

下面参照具体的实施例对本发明做进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明的范围。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。

下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售产品。

除非另外说明，否则本发明中涉及的百分比和份数均为重量百分比和重量份数。

实施例：本发明药物组合物治疗小儿肺炎的体外肺炎细胞模型的建立及相关研究

1.实验目的

构建体外炎症细胞模型并研究样品在细胞模型中生物影响及机制。

2.实验材料与仪器

牛蒡子苷的品牌货号为：MCE(HY-N0034)；栝楼萜二醇的品牌货号为：麦克林(K963182)；苦杏仁苷的品牌货号为：MCE(HY-N0190)；A549细胞的品牌货号为：ATCC(XY-XB-1411)；人IL-6ELISAKIT的品牌货号为：Solarbio(SEKH-0013)；人IL-1βELISA KIT的品牌货号为：Solarbio(SEKH-0002)；p-NF-kB的品牌货号为：Affinity(AF2006)；TLR4的品牌货号为：Affinity(AF7017)。

3.实验方法

3.1细胞复苏

(1)液氮中取出离心管，注意检查离心管密闭性，迅速放入37℃水浴中摇晃解冻；

(2)即将解冻完全时，停止水浴，移入事先准备好的含有9mL培养基的15mL离心管中，1000rpm离心5分钟，离心完吸出上清，加5mL细胞培养基，转移至细胞培养瓶中使用透气瓶盖进行培养；

3.2细胞传代

(1)T25瓶细胞汇合度至80％，吸出原培养液；

(2)加入2mL左右PBS，轻轻晃动培养瓶润洗细胞,吸出PBS丢弃；

(3)加入1mL左右0.25％胰蛋白酶溶液(含EDTA)，轻轻晃动培养瓶使之浸润所有细胞；

(4)放入培养箱消化1-2min，显微镜下看到细胞块中间的细胞明显变圆变亮有间隙时可终止；

(5)加入3mL含血清的培养基终止消化，吹打细胞使之脱壁并在液体里反复吹打使细胞尽量呈单颗细胞的悬浮液；

(6)收集细胞悬液离心，1000rpm离心5分钟，离心完吸出上清；

(7)细胞沉淀加入新鲜培养基，吹打几下混匀细胞即可，按推荐比例接种到新培养瓶或多孔板；

3.3CCK8预实验1(牛蒡子苷、栝楼萜二醇和苦杏仁苷的细胞毒性浓度摸索实验)

(1)细胞接种：用完全培养基(89％DMEM/F12+10％FBS+1％P/S)重悬生长对数期的A549细胞悬液，根据计数结果调整细胞密度为3*10^4个细胞/mL，接种于96孔板中，每孔100ul培养基，每组三复孔，另设无细胞的完全培养基孔为空白孔(Blank)；其余孔添加无菌PBS缓冲液，继续培养24h；

(2)分组处理：吸出原孔内培养基，空白孔和正常对照组每孔更换正常培养基，处理组更换不同浓度的含药培养基，具有为：0.1ug/mL、0.2ug/mL、0.5ug/mL、1ug/mL、10ug/mL、20ug/mL、50ug/mL、100ug/mL、200ug/mL、500ug/mL的牛蒡子苷，0.1ug/mL、0.2ug/mL、0.5ug/mL、1ug/mL、10ug/mL、20ug/mL、50ug/mL、100ug/mL的栝楼萜二醇，10ug/mL、20ug/mL、50ug/mL、100ug/mL、200ug/mL、500ug/mL、1000ug/mL、2000ug/mL、5000ug/mL的苦杏仁苷，继续孵育48h；

(3)吸光值测定：在每个时间点孵育结束后，吸去原培养基，添加100uL的CCK8工作液(90％DMEM/F12+10％CCK8检测液)，不含细胞的孔作为空白孔，孵育适当时间后，于酶标仪上测定450nm处吸光值；

(4)数据分析：根据吸光值数据，计算每组细胞存活率及组间差异；计算公式如下：

细胞存活率(％)＝100％*(OD_给药-OD_空白)/(OD_正常-OD_空白)

3.4CCK8预实验2(牛蒡子苷、栝楼萜二醇和苦杏仁苷联合用药的细胞毒性检测)

(2)分组处理：吸出原孔内培养基，空白孔和正常对照组每孔更换正常培养基，处理组更换不同浓度的含药培养基，具体为50μg/mLArc牛蒡子苷、10μg/mLKar栝楼萜二醇、500μg/mLAmy苦杏仁苷、50μg/mLArc牛蒡子苷+10μg/mL Kar栝楼萜二醇、50μg/mLArc牛蒡子苷+10μg/mLKar栝楼萜二醇+500μg/mLAmy苦杏仁苷，继续孵育48h；

细胞存活率(％)＝100％*(OD_给药-OD_空白)/(OD_正常-OD_空白)

3.5CCK8

(2)分组处理：吸出原孔内培养基，空白孔和正常对照组每孔更换正常培养基，治疗组更换不同浓度的含药培养基预处理，具体为50μg/mLArc牛蒡子苷、10μg/mLKar栝楼萜二醇、500μg/mL Amy苦杏仁苷、560μg/mLArc牛蒡子苷、560μg/mL Kar栝楼萜二醇、560μg/mLAmy苦杏仁苷、50μg/mLArc牛蒡子苷+10μg/mL Kar栝楼萜二醇、50μg/mLArc牛蒡子苷+10μg/mLKar栝楼萜二醇+500μg/mLAmy苦杏仁苷，预处理2h，预处理结束后除对照组外，Model和治疗组每孔添加LPS母液至终浓度10μg/mL，继续孵育48h；

(3)吸光值测定：孵育结束后，吸去原培养基，添加100ul的CCK8工作液(90％DMEM/F12+10％CCK8检测液)，不含细胞的孔作为空白孔，孵育适当时间后，于酶标仪上测定450nm处吸光值；

细胞存活率(％)＝100％*(OD_给药-OD_空白)/(OD_正常-OD_空白)

3.6Tunel

(1)细胞接种：用完全培养基(89％DMEM/F12+10％FBS+1％P/S)重悬生长对数期的A549细胞悬液，根据计数结果调整细胞密度为6*10^4个细胞/mL，接种于48孔板中，每孔200uL培养基，继续培养24h；

(2)分组处理：吸出原孔内培养基，空白孔和正常对照组每孔更换正常培养基，治疗组更换不同浓度的含药培养基预处理，具体为50μg/mLArc牛蒡子苷、10μg/mLKar栝楼萜二醇、500μg/mLAmy苦杏仁苷、50μg/mLArc牛蒡子苷+10μg/mLKar栝楼萜二醇、50μg/mL Arc牛蒡子苷+10μg/mL Kar栝楼萜二醇+500μg/mLAmy苦杏仁苷，预处理2h，预处理结束后除对照组外，Model和治疗组每孔添加LPS母液至终浓度10μg/mL，继续孵育48h；

(3)Tunel测定：PBS或HBSS洗涤一次，如果细胞贴得不牢，可以干燥样品使细胞贴得更牢，用4％多聚甲醛固定细胞30分钟，用PBS或HBSS洗涤一次，加0.3％Triton X-100的PBS，室温孵育5分钟；配制TUNEL检测液并充分混匀：TdT酶5μL+荧光标记液45μL；用PBS或HBSS洗涤2次，在样品上加50μL TUNEL检测液，37℃避光孵育60分钟，PBS或HBSS洗涤3次；DAPI复染细胞核后，可以使用的激发波长范围为450-500nm，发射波长范围为515-565nm(绿色荧光)。

3.7ELISA

(1)处理结束后的细胞培养基移至无菌离心管，在4℃条件下1000×g离心10min，于-20℃以下保存待测；

(2)试剂回温：在实验前30min将试剂盒、待测样本放置于室温下，浓缩洗涤液如出现结晶，放入37℃温浴直到结晶全部溶解；

(3)配制洗涤液：用双蒸水或去离子水将20×浓缩洗涤液稀释成1×应用液；

(4)标准品梯度稀释：开盖前确保标准品所有的冻干标准品位于容器底部，加入SR1标准品/样本稀释液1mL至冻干标准品中(浓度为2000pg/mL)，静置10～30min待其完全溶解后轻轻混匀稀释前充分混匀，按照以下浓度进行2倍稀释：IL-1β标准品：1000、500、250、125、62.5、31.25、15.62pg/mL进行稀释；IL-6标准品：250、125、62.5、31.25、15.62、7.81、3.9pg/mL进行稀释；

(5)用SR2生物素化抗体稀释液将100×抗体浓缩液稀释成1×应用工作液；

(6)用SR2生物素化抗体稀释液将100×抗体浓缩液稀释成1×应用工作液；

(7)用SR3酶结合物稀释液将40×浓缩酶结合物稀释成1×应用工作液；

(8)浸泡酶标板：加入300μL 1×洗涤液静置浸泡30秒，弃掉洗涤液之后，在吸水纸上将微孔板拍干，重复2次；

(9)加标准品：标准品孔加入100μL的2倍倍比稀释的标准品，0孔加入100μL标准品/样本稀释液；

(10)加样本：样本孔加入100μL的待测样本，保证步骤4、5连续加样，不间断；加样过程在10min内完成；

(11)孵育：使用新的封板膜封板，37℃静置孵育90min；

(12)洗涤：弃掉液体，每孔加入300μL洗液洗板，洗涤4次。每次洗板，在吸水纸上拍干；

(13)加生物素化检测抗体：加入100μL生物素化抗体工作液至反应孔中；

(14)孵育：使用新的封板膜封板，37℃静置孵育60min；

(15)洗涤：弃掉液体，每孔加入300μL洗液洗板，洗涤4次；每次洗板，在吸水纸上拍干

(16)孵育：使用新的封板膜封板，封板后于37℃静置孵育30min；

(17)洗涤：弃掉液体，每孔加入300μL洗液洗板，洗涤5次；每次洗板，在吸水纸上拍干；

(18)加底物显色：每孔加入100μL显色底物TMB，避光，37℃避光显色15min-25min；当标准孔颜色出现明显梯度时(标准孔的前4孔出现明显的蓝色梯度，后3～4孔不明显)，即可终止；

(19)提前15min打开酶标仪预热，加终止液：每孔加入50μL终止液，终止液加入的顺序应尽量与显色底物加入的顺序相同

(20)检测读数：在5min之内，使用酶标仪测定450nm最大吸收波长；

3.8PCR

3.8.1RNA提取

(1)将6孔板内处理后的细胞样品迅速加入适量液氮，研磨至粉末状，收集于1.5mL无RNA酶的EP管；

(2)加入1mL的Trizol，剧烈震荡5min；

(3)加入氯仿200μL，盖紧离心管盖，用力震荡，直至乳化，溶液呈乳白色状后，再室温静置5min。12000g，4℃离心15min，从离心机中取出离心管，吸取无色上清液转移至另一新的1.5mL离心管中；

(4)向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在室温静置10min。

12000g，4℃离心10min；

(5)小心彻底弃去上清，加入70％的乙醇1mL，轻轻上下颠倒洗涤离心管，至沉淀块漂浮后，12000g，4℃离心5min，小心弃去乙醇；

(6)室温晾干沉淀2min，加入适量RNA溶解液溶解沉淀；

(7)分光光度计测浓度。

3.8.2cDNA第一链合成

(1)cDNA第一条链的合成反转录反应：

表1

(2)使用Oligo(dT)18作为引物在42℃孵育60分钟，反转录产物-20℃冻存以备以后使用。

3.8.3RT-PCR

(1)Real-time PCR：采用两步法。

体系：

表2

程序：

溶解曲线步骤：

表3

3.9Western Blot

(1)样本处理：

1)收集后各孔细胞，吸去培养基，用PBS洗一遍，用细胞刮子刮下细胞，离心收集细胞沉淀；

2)加200μl添加了PMSF和Triton X-100的细胞裂解液，混匀冰浴40-60min；4℃下12000rpm离心15min，吸取上清；

3)采用BCA蛋白浓度测定试剂盒，根据浓度测定结果用裂解液对蛋白浓度进行调整至不同组别间总蛋白浓度一致；

4)用样品将6X loadingbμffer稀释成1X loadingbμffer，煮沸5min，然后放于-80℃保存；

(2)电泳胶的制备

1)将玻璃板洗净擦干后，固定在制胶器上后，开始配分离胶，将12％或8％分离胶灌入玻璃板空隙内到适当的高度(β-actin、Bax配置12％分离胶，p-gp配置8％分离胶)，用无水乙醇覆盖分离胶，直至胶完全聚合；

2)倒出无水乙醇，用双蒸水轻轻冲洗后用滤纸吸干。然后加入浓缩胶到合适的高度，插入梳齿。浓缩胶完全聚合后取出梳齿；

3)各种浓度分离胶的配制：

表4

(3)上样电泳

1)每孔上样30μg蛋白，以80V电压电泳30min后，100V电压电泳；

2)根据预染Marker和目的蛋白的分子量大小的相对位置判断目的蛋白位置，当目的蛋白处于分离胶面下约1/3或最佳分辩位置时停止电泳分离；

(4)转膜

1)将剪切好的PVDF膜放到甲醇中浸泡2min；

2)取出凝胶根据Marker切下分离胶，用蒸馏水冲洗，剪与PAGE凝胶相同大小的PVDF膜，PVDF膜和滤纸一同浸泡于电转缓冲液中；

3)按照黑色板-纤维垫-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-纤维垫-白色板依次放好，夹紧板后放入转膜仪内，黑色板的一面对照黑色负极。在转膜槽中加满电转液开始转膜；转膜过程在4℃进行，转膜条件为100V/400mA；

(5)免疫印迹显色

1)用含3％BSA(封闭液)浸泡PVDF膜，室温摇床封闭2h；

2)用封闭液稀释相应的一抗(GAPDH：1：3000，目的蛋白1：1000)，使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4℃孵育过夜；TBST充分洗涤PVDF膜5-6次，5min/次；

3)用封闭液稀释对应种属的HRP标记二抗1:1000稀释，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，37℃摇床孵育2h，TBST充分洗涤PVDF膜5-6次，5min/次；

4)显色曝光：将ECL试剂中增强液与稳定的过氧化物酶溶液按1:1比例混匀，将膜浸泡在工作液中，待荧光带明显后，用滤纸吸去多余的底物液，用化学发光系统曝光显影；4实验结果与分析

4.1CCK8预实验1：牛蒡子苷、栝楼萜二醇、苦杏仁苷的细胞毒性浓度摸索

CCK8结果如图1所示，50μg/ml以下的牛蒡子苷、10μg/ml以下的栝楼萜二醇和500μg/ml以下的苦杏仁苷无明显细胞毒性，后续实验拟选用50μg/ml的牛蒡子苷、10μg/ml的栝楼萜二醇和500μg/ml的苦杏仁苷及其复合药物进行复合药物的细胞毒性检测。

4.2CCK8预实验2：牛蒡子苷、栝楼萜二醇和苦杏仁苷联合用药的细胞毒性检测

CCK8结果如图2所示，50μg/mlArc牛蒡子苷、10μg/ml Kar栝楼萜二醇、500μg/mlAmy苦杏仁苷、50μg/mlArc牛蒡子苷+10μg/ml Kar栝楼萜二醇、50μg/mlArc牛蒡子苷+10μg/ml Kar栝楼萜二醇+500μg/mlAmy苦杏仁苷各组与正常对照组相比，细胞存活率没有明显差异，各组无明显细胞毒性，后续实验拟选用50μg/mlArc牛蒡子苷、10μg/ml Kar栝楼萜二醇、500μg/mlAmy苦杏仁苷、50μg/mlArc牛蒡子苷+10μg/ml Kar栝楼萜二醇、50μg/mlArc牛蒡子苷+10μg/ml Kar栝楼萜二醇+500μg/mlAmy苦杏仁苷的复合药物组进行细胞模型的正式实验。

4.3CCK8

CCK8结果如图3所示，模型组与正常对照组相比，细胞存活率明显下降，差异具有显著性；合适浓度的牛蒡子苷、栝楼萜二醇、苦杏仁苷及其复合药物组的预处理对LPS处理的A549细胞具有保护作用。其中牛蒡子苷+栝楼萜二醇组明显表明了两味药在保护炎症损伤的肺细胞方面产生了明显的协同作用；牛蒡子苷+栝楼萜二醇+苦杏仁苷组与等剂量的单味药组相比保护效果明显更优，这种效果差异存在统计学差异。

4.4Tunel

Tunel结果如图4所示，模型组与正常对照组相比，TUNEL染色阳性细胞增多，细胞发生明显凋亡；牛蒡子苷、栝楼萜二醇、苦杏仁苷及其复合药物组的A549细胞相较Model组细胞凋亡减少，结果具有差异性；牛蒡子苷、栝楼萜二醇、苦杏仁苷及其复合药物预处理对LPS处理的A549细胞具有保护作用。

4.5Elisa

ELISA结果如图5所示，从图5可以看出，模型组与正常对照组相比，IL-6和IL-1β炎症因子表达水平显著升高。而牛蒡子苷组、栝楼萜二醇组、苦杏仁苷组、牛蒡子苷+栝楼萜二醇组、牛蒡子苷+栝楼萜二醇+苦杏仁苷组分别与模型组相比，IL-6和IL-1β炎症因子表达水平下降。并且牛蒡子苷+栝楼萜二醇组、牛蒡子苷+栝楼萜二醇+苦杏仁苷组对IL-6和IL-1β炎症因子表达水平的降低作用显著优于牛蒡子苷、栝楼萜二醇、苦杏仁苷单用组。由此表明，当将牛蒡子苷和栝楼萜二醇联用时，或者将牛蒡子苷、栝楼萜二醇和苦杏仁苷联用时，联用组对小儿肺炎的治疗作用显著优于同等剂量的牛蒡子苷、栝楼萜二醇、苦杏仁苷单用组。这说明将牛蒡子苷和栝楼萜二醇联用后，或者将牛蒡子苷、栝楼萜二醇和苦杏仁苷联用后，对小儿肺炎的治疗效果具有显著的协同增效作用。

4.6PCR

结果如图6所示，模型组与正常对照组相比，NF-kB、TLR4的mRNA表达升高，差异具有显著性；牛蒡子苷、栝楼萜二醇、苦杏仁苷及其复合药物组的A549细胞相较Model组，NF-kB、TLR4的mRNA表达下降，结果具有显著性差异。

4.7WB

WB结果如图7所示，模型组与正常对照组相比，磷酸化NF-kB、TLR4的蛋白相对表达量显著升高；与模型组比较，牛蒡子苷组、栝楼萜二醇组、苦杏仁苷组、牛蒡子苷+栝楼萜二醇组、牛蒡子苷+栝楼萜二醇+苦杏仁苷组均可降低磷酸化NF-kB、TLR4的蛋白相对表达量；并且牛蒡子苷+栝楼萜二醇联用组、牛蒡子苷+栝楼萜二醇+苦杏仁苷联用组对磷酸化NF-kB、TLR4的蛋白相对表达量的降低作用显著优于牛蒡子苷、栝楼萜二醇、苦杏仁苷单用组。

综合可以看出，本发明药物组合物能够显著改善肺炎症状，大幅提升肺炎的治疗效果。这表明将牛蒡子苷、栝楼萜二醇和苦杏仁苷联用后，具有显著的协同增效作用。本发明的药物组合物还具有较少的毒副作用，且服用方便，具有开发成治疗小儿肺炎药物的前景，具有重要的社会效益和经济效益。

显然，上述实施例仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims

1.一种用于治疗肺炎的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含活性成分牛蒡子苷和栝楼萜二醇，所述牛蒡子苷、栝楼萜二醇的重量比为2.5-7.5：1。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述牛蒡子苷、栝楼萜二醇的重量比为3-7：1。

3.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述牛蒡子苷、栝楼萜二醇的重量比为4-6：1。

4.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还可包含活性成分苦杏仁苷。

5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中牛蒡子苷、栝楼萜二醇和苦杏仁苷的重量比为2.5-7.5：1：25-75。

6.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中牛蒡子苷、栝楼萜二醇和苦杏仁苷的重量比为4-6：1：40-60。

7.一种药物制剂，其特征在于，所述药物制剂包含权利要求1至6中任一项所述的药物组合物，以及药学上可接受的载体。

8.根据权利要求7所述的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂的剂型为口服剂型。

9.根据权利要求8所述的药物制剂，其特征在于，所述口服剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂或糖浆剂。

10.权利要求1至6中任一项所述的药物组合物或者权利要求7至9中任一项所述的药物制剂在制备治疗肺炎的药物中的应用，所述肺炎是小儿肺炎。