CN118480526A - 一种转座酶、转座子、转座子系统及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种转座酶、转座子、转座子系统及其应用，所述转座酶为突变转座酶或者融合转座酶，所述突变转座酶与如SEQ ID NO：1所示的野生型PS转座酶相比含有氨基酸突变，所述融合转座酶为在野生型PS转座酶或其突变体上融合了功能多肽，所述转座子与野生型PS转座子相比，含有核苷酸突变和/或TIR多拷贝串联和/或TA多拷贝串联，所述转座子系统含有所述转座酶或编码其的多核苷酸，以及所述转座子或PS转座子。通过上述手段工程化改造野生型PS转座酶所获得的JL转座酶、JL转座子以及含有该JL转座酶和JL转座子的JL转座子系统显著提高了转座基因整合效率，具有极大的转基因产业应用价值。

Description

一种转座酶、转座子、转座子系统及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程化领域，具体涉及一种工程化改造的转座酶、转座子、转座子系统及其应用。

背景技术

可转座遗传元件，也称为转座子，是可以在单细胞内从一个基因组位置移动到另一个基因组位置的DNA区段。转座子根据其转座机制可以被分为两大类：(1)对于被称为反转录转座子的元件，可以通过RNA中间体的反转录而发生转座，以及(2)对于DNA转座子，可以通过侧翼为末端反向重复序列(inverted terminal repeats，TIR或ITR)的DNA的直接转座而发生转座。活性转座子编码转座所需的一种或多种蛋白质，天然活性DNA转座子携带转座酶基因。

转座子作为基因转移载体已被广泛应用于转基因、基因捕获和基因治疗等领域的研究中，并取得了很好的应用效果。转座子可以作为天然的DNA转移载体，可以高效携带外源基因插入基因组，其作用类似于病毒载体的作用，并且转座过程可以通过调节转座酶的供给量来控制。因此对于转座子的使用分为转座子供体载体和转座酶辅助载体，可以将感兴趣的DNA片段，如荧光标记基因GFP/RFP等、基因捕获盒、治疗基因构建等，克隆至两侧TIR之间作为转座子供体载体质粒。转座酶载体则包含启动子、转座酶基因表达框、PolyA等组分，转座酶还可以采用mRNA或蛋白的形式。将转座子供体载体和转座酶共同转染细胞或注射至受体体内，可以实现在靶细胞中稳定的基因插入。

Tc1/Mariner转座子是自然界中分布最广泛的一类DNA转座子超家族，包括细菌、无脊柱动物和脊椎动物。在脊椎动物中，Tc1/Mariner转座子在硬骨鱼类中分布最为广泛。通过生物信息学和实验验证等手段，已报道16个具有天然转座活性的Tc1/Mariner超家族转座子成员，分别是Tc1、Tc3、Minos、Mos1、Bari3、Fot1、impala、Famar1、Osmar5、ISY100、Mboumar-9、Passport、Tana1、Thm3、SB、ZB、PS转座子。

在先申请专利CN110257425A，CN112159822A披露了一种独特的转座催化结构域“D35D”的PS转座子，属于pogo转座子超家族，其可以在哺乳动物细胞中表现出一定的转座活性和剪切活性。虽然上述PS转座子系统已经具备一定的转基因应用价值，但是因为PS转座酶序列为野生型天然氨基酸序列，所以其转座效率较低。在一些类型细胞或基因治疗中，PS与本技术领域内的Piggybac(PB)或Sleeping Beauty(SB)高效转座子相比并没有显著的优势。

众所周知，天然活性转座子可能造成基因组的不稳定，因此在进化中转座子会积累突变，逐渐降低乃至失去活性，例如在高等动物(如哺乳动物)中发现的Tc1/Mariner超家族转座子大部分由于转座酶开放阅读框中存在缺陷(如突变、移码、插入、缺失或存在终止密码子)而失去转座活性。鉴于上述原因，目前在临床基因治疗中应用的最广泛的睡美人(Sleeping Beauty，SB)转座子、PiggyBac转座子往往都是经过生物信息学分子重构和/或工程化改造的高效突变型转座酶/转座子系统。

鉴于上述原因，PS转座子系统仍然需要进行氨基酸/DNA突变和/或工程化改造才能得到更高效和更具有转基因实用价值的转座酶和/或转座子系统。

发明内容

本公开内容一方面提供一种转座酶(JL转座酶)，

其为突变转座酶或者融合转座酶，

所述突变转座酶与如SEQ ID NO：1所示的野生型PS转座酶相比，含有氨基酸突变，所述氨基酸突变为野生型PS转座酶双联DNA结合和寡聚化域中的任意一个或多个氨基酸突变为带正电荷氨基酸；和/或所述氨基酸突变包括选自下组的一个或多个突变：TQS57-59KKA、T129R、T129K、I98K、TQ57-58RK、TQ57-58RK\T129K、TQ57-58RK\T129R、E32K、E32K\T129K、E32K\T129R、TQ57-58RK\I98K、TQ57-58RK\I98K\T129K、TQS57-59KKA\I98K、TQS57-59KKA\I98K\T129K、R123H、Q136K、K16R、E47K、TQ57-58RR、E32K\T57R\Q58R、T57R、T57K、Q58K、Q58R、S59A、M95L、Y46Q、A8S、T187K、I35V、N199H、N193S、T350S、Q22K、T368E、N213D、H24R、T150A、H165D、K55R、K73R、L228M、E335S、K159H、V359L、T129Q、H215K、R51K、A84L、Q69E、I284L、K45R、H215E、H215Q、I237V；；

所述融合转座酶为在野生型PS转座酶或其突变体上融合了功能多肽，所述功能多肽为DNA序列特异性或非特异性结合域和/或细胞核定位信号结构域。

在一个或多个实施方案中，所述带正电荷氨基酸选自组氨酸、赖氨酸或精氨酸，和/或，所述氨基酸突变选自下组的一个或多个突变：TQS57-59KKA、T129R、T129K、I98K、TQ57-58RK、TQ57-58RK\T129K、TQ57-58RK\T129R、E32K、E32K\T129K、E32K\T129R、TQ57-58RK\I98K、TQ57-58RK\I98K\T129K、TQS57-59KKA\I98K、TQS57-59KKA\I98K\T129K、R123H、Q136K、K16R、E47K、TQ57-58RR、E32K\T57R\Q58R、T57R、T57K、Q58K、Q58R、S59A、M95L、Y46Q、A8S、T187K、I35V、N199H、N193S、T350S、Q22K。

在一个或多个实施方案中，所述突变体与如SEQ ID NO：1所示的野生型PS转座酶相比，包括选自下组的一个或多个突变：所述突变体与如SEQ ID NO：1所示的野生型PS转座酶相比，包括选自下组的一个或多个突变：TQS57-59KKA、T129R、T129K、I98K、TQ57-58RK、TQ57-58RK\T129K、TQ57-58RK\T129R、E32K、E32K\T129K、E32K\T129R、TQ57-58RK\I98K、TQ57-58RK\I98K\T129K、TQS57-59KKA\I98K、TQS57-59KKA\I98K\T129K、R123H、Q136K、K16R、E47K、TQ57-58RR、E32K\T57R\Q58R、T57R、T57K、Q58K、Q58R、S59A、M95L、Y46Q、A8S、T187K、I35V、N199H、N193S、T350S、Q22K、T368E、N213D、H24R、T150A、H165D、K55R、K73R、L228M、E335S、K159H、V359L、T129Q、H215K、R51K、A84L、Q69E、I284L、K45R、H215E、H215Q、I237V、Q69R、L100I、K96R、Q162R、A271K、R372K、H20Y、TYCR150-153KFVI、N232K、A363N、A377C、Q346M、A17V、N105G、Q76E、I354V、VS133-134IA、S253K、V370I、SV297-298TE、EH286-286DS、A352S、ANS241-243VHE、S297T、A79I、T147S、I178M、I276V、Q331E、R257E、T339S、A79V、H104L、V74L、S107E、Q142E、R375K、S243E、R195K、Q22E、A328Q、G111A、R110K、I365V、VTE380-382SNA、R190K、RA372-373KS、K73L、K121R、R102K、C152V、IY276-277VW、V292I、K73E、H104M、I239V、K42E、K356Q、T150K、G316S、IY259-260VW、V53M、E108D、V53L、DKV72-74EEL、M280F、S85G、N63K、V91L、K251L、H124N、K308S、N10D、H7R、G112S、H7K、TA327-328KE。

在一个或多个实施方案中，所述突变体与如SEQ ID NO：1所示的野生型PS转座酶相比，包括选自下组的一个或多个突变：TQS57-59KKA、T129R、T129K、I98K、TQ57-58RK、TQ57-58RK\T129K、TQ57-58RK\T129R、E32K、E32K\T129K、E32K\T129R、TQ57-58RK\I98K、TQ57-58RK\I98K\T129K、TQS57-59KKA\I98K、TQS57-59KKA\I98K\T129K、R123H、Q136K、K16R、E47K、TQ57-58RR、E32K\T57R\Q58R、T57R、T57K、Q58K、Q58R、S59A、M95L、Y46Q、A8S、T187K、I35V、N199H、N193S、T350S、Q22K、T368E、N213D、H24R、T150A、H165D、K55R、K73R、L228M、E335S、K159H、V359L、T129Q、H215K、R51K、A84L、Q69E、I284L、K45R、H215E、H215Q、I237V、Q69R、L100I、K96R、Q162R、A271K、R372K、H20Y、TYCR150-153KFVI、N232K、A363N、A377C、Q346M、A17V、N105G、Q76E、I354V、VS133-134IA、S253K、V370I、SV297-298TE、EH286-286DS、A352S、ANS241-243VHE、S297T、A79I、T147S、I178M、I276V、Q331E、R257E、T339S、A79V、H104L、V74L、S107E、Q142E、R375K、S243E、R195K、Q22E、A328Q、G111A、R110K、I365V、VTE380-382SNA。

在一个或多个实施方案中，所述DNA序列特异性或非特异性结合域包含亮氨酸拉链结构域、CRISPR/Cas结构域、TALE域、锌指域、AAV Rep DNA结合域或其任意组合，优选地，所述亮氨酸拉链结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:28-31任一所示，。

在一个或多个实施方案中，所述细胞核定位信号结构域包括SV40 NLS、C-mycNLS、TAF1 NLS、TP53 NLS、STAT3 NLS或其任意组合。

在一个或多个实施方案中，所述功能多肽与PS转座酶蛋白之间包含或不包含连接体连接。

本公开内容又一方面提供编码本文任一实施方案的转座酶的多核苷酸。

在一个或多个实施方案中，所述多核苷酸是DNA或信使RNA。

本公开内容又一方面提供一种转座子，其可被上述任一实施方案的转座酶识别，所述转座子具有选自如下的(1)至(3)的任一项、两项或三项特征：

(1)所述转座子具有突变末端反向重复序列，所述突变末端反向重复序列与SEQID NO：2或3所示的野生型PS转座子末端反向重复序列相比具有1-5个核苷酸突变；

(2)所述转座子在至少一端具有两个以上的末端反向重复序列；

(3)所述转座子在至少一端的末端反向重复序列外侧具有两个以上的TA序列的重复。

在一个或多个实施方案中，所述突变末端反向重复序列如SEQ ID NO:4-27任一所示，优选如SEQ ID NO:4-6任一所示，或为含有SEQ ID NO:3-27中核苷酸突变的任意组合突变的核苷酸序列，或为它们的反向互补序列。

在一个或多个实施方案中，所述转座子在两端各具有两个末端反向重复序列，且在两端的末端反向重复序列外侧各包括四个TA序列重复。

在一些实施方案中，所述转座子包含位于两个末端反向重复序列之间的DNA元件组合，DNA元件组合包括但不局限于启动子、增强子、表达基因、5-UTR、3-UTR等本领域内技术人员所熟知的序列元件。在一些实施方案中，所述两个末端反向重复序列(二者反向互补)任一包含与SEQ ID NO:2具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列。

在一个或多个实施方案中，所述转座子包括或不包括位于末端反向重复序列之间的目的基因(或称外源基因)表达框。目的基因表达框可包含有启动子、目的基因、polyA信号序列等基因功能元件。

在一个或多个实施方案中，所述目的基因编码选自细胞受体、免疫检查点蛋白质、细胞因子、T细胞受体、B细胞受体、嵌合抗原受体及其任意组合的蛋白质。

本公开内容又一方面提供一种转座子系统，包括本文任一实施方案的转座酶或编码所述转座酶的多核苷酸；和转座子，所述转座子为本文任一实施方案的转座子或PS转座子。

在一个或多个实施方案中，编码所述转座酶的多核苷酸是mRNA，优选地，所述mRNA化学修饰的。

在一个或多个实施方案中，所述转座子存在于DNA载体中。优选地，所述DNA载体选自常规环状DNA质粒、线性DNA质粒，或选自微环质粒、纳米质粒、doggybone线性微质粒等不含抗生素或/和复制子DNA序列的DNA形式。优选地，所述DNA载体为无抗微质粒。

在一个或多个实施方案中，所述DNA载体为微载体，其骨架序列长度在600bp以内，减少和/或不含CpG DNA基序。

在一个或多个实施方案中，编码所述转座酶的多核苷酸是DNA，其和所述转座子存在于同一DNA载体或不同DNA载体中。

在一些实施方案中，包含编码JL转座酶和/或转座子TIR序列多核苷酸分子存在于病毒载体中，包括但不局限于AAV、慢病毒、反转录病毒、腺病毒等。

本公开内容又一方面提供一种宿主细胞，包含或能产生本文任一实施方案的转座酶、本文任一实施方案的多核苷酸、本文任一实施方案的转座子、或本文任一实施方案的转座子系统。

本公开内容又一方面提供一种制备细胞的方法，包括：将本文任一实施方案的转座酶、本文任一实施方案的多核苷酸、本文任一实施方案的转座子、或本文任一实施方案的转座子系统引入细胞中的步骤。

在一些实施方案中，所述引入包括使所述细胞与所述多核苷酸接触。在一些实施方案中，所述引入包括使所述细胞与含有所述转座子的DNA载体接触。在一些实施方案中，所述引入包括使所述细胞与编码所述转座酶的mRNA和含有所述转座子的质粒载体接触。在一些实施方案中，所述引入包括使所述细胞与含有所述多核苷酸和所述转座子的质粒载体接触。在一些实施方案中，所述引入包括使所述细胞与含有所述多核苷酸的质粒载体和含有所述转座子的质粒载体接触。在一些实施方案中，所述引入包括使所述细胞与所述转座酶接触。

在一些实施方案中，所述细胞是从受试者分离的原代细胞。在一些实施方案中，所述受试者是人。在一些实施方案中，所述受试者是患有疾病的患者。在一些实施方案中，所述受试者已被诊断为患有癌症或肿瘤。在一些实施方案中，所述细胞从所述受试者的血液中分离。在一些实施方案中，所述细胞包含原代免疫细胞。在一些实施方案中，所述细胞包含原代白细胞。在一些实施方案中，所述细胞包含原代T细胞。在一些实施方案中，所述原代T细胞包含γδT细胞、辅助T细胞、记忆T细胞、自然杀伤T细胞、效应T细胞或其任意组合。在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包含CD3+细胞。在一些实施方案中，所述细胞包含干细胞。在一些实施方案中，所述干细胞选自：胚胎干细胞、造血干细胞、表皮干细胞、上皮干细胞、支气管肺泡干细胞、乳腺干细胞、间充质干细胞、肠干细胞、内皮干细胞、神经干细胞、嗅觉成体干细胞、神经嵴干细胞、睾丸细胞及其任意组合。在一些实施方案中，所述干细胞包含诱导多能干细胞。

在一些实施方案中，所述细胞来自动物，例如脊椎动物或无脊椎动物，优选哺乳动物，进一步优选人。在一些实施方案中，所述细胞是免疫细胞，优选T细胞。

在一些实施方案中，所述引入包括借助电穿孔、显微注射、磷酸钙沉淀、阳离子聚合物、树状聚体、脂质体、脂质纳米颗粒(LNP)、微粒轰击、fugene、直接声波加载、细胞挤压、光学转染、原生质体融合、impalefection、磁转染、核转染或其任意组合转染所述细胞。

在一些实施方案中，所述引入包括对所述细胞进行电穿孔。

在一些实施方案中，所述引入包括使细胞与编码权利所述转座酶的mRNA和含有所述转座子的质粒接触，优选地，所述mRNA使用剂量为每1×10⁷细胞1-30μg，所述质粒的使用剂量为每1×10⁷细胞0.1-5μg。最优选的所述mRNA使用剂量为每1×10⁷细胞1-5μg，所述质粒的使用剂量为浓度为每1×10⁷细胞0.1-2μg。

本公开内容的又一方面提供了利用本文任一实施方案的转座酶、本文任一实施方案的多核苷酸、本文任一实施方案的转座子、或本文任一实施方案的转座子系统生产的转基因动物或转基因细胞，转基因表达元件包括基因表达框和两侧的转座子TIR序列元件。

本公开内容又一方面提供一种试剂盒，其包含：本文任一实施方案的转座酶、本文任一实施方案的多核苷酸、本文任一实施方案的转座子、或本文任一实施方案的转座子系统、或本文任一实施方案的细胞。

本公开内容又一方面提供药物组合物，其包含药学上可接受的辅料和本文任一实施方案的方法制备的细胞。

本公开内容又一方面提供本文任一实施方案的转座酶、本文任一实施方案的多核苷酸、本文任一实施方案的转座子、本文任一实施方案的转座子系统、本文任一实施方案的细胞、或本文任一实施方案的细胞的应用，其选自如下的(1)-(6)中任一项：

(1)在制备将目的基因表达框整合到宿主细胞基因组的药物或者试剂中的应用；

(2)在制备将目的基因表达框整合到宿主细胞基因组的工具的应用；

(3)在制备转基因动物、转基因细胞中的应用；

(4)在制备基因组研究、基因治疗、细胞治疗或者干细胞诱导和诱导后分化的药物或制剂中的应用；

(5)在制备基因组研究、基因治疗、细胞治疗或者干细胞诱导和诱导后分化的工具的应用；

(6)在制备试剂盒、工程化的免疫细胞或药物组合物的应用。

本公开内容的又一方面提供了一种治疗方法，其包括：(a)将如本文所述的转座子和识别该转座子的如本文所述的转座酶引入细胞中，从而生成遗传修饰的细胞；(b)将所述遗传修饰的细胞施用于需要所述治疗的患者。在一些实施方案中，所述遗传修饰的细胞包含由所述转座子引入的转基因。在一些实施方案中，所述患者已被诊断为患有癌症或肿瘤。在一些实施方案中，所述施用包括将所述遗传修饰的细胞输注到所述患者的血管中。

本发明技术方案带来的有益效果

1)通过突变和/或融合蛋白多肽等手段工程化改造野生型PS转座酶，最终获得JL转座酶显著提高了转座基因整合效率，更具有转基因产业应用价值。

2)以mRNA形式的工程化JL转座酶应用于细胞治疗和转基因，减少了转座酶在细胞中的表达时间，进一步提高了安全性。

3)通过TIR序列突变、TIR序列多拷贝串联、TA切割位点序列多拷贝串联等手段优化转座子DNA功能序列结构，进一步显著提高了JL转座酶介导的的转座基因整合效率。

4)使用DNA骨架序列长度限制在600bp以内，减少和/或不含CpG DNA基序的微载体作为转座子表达载体，从而进一步提高了JL转座酶介导的基因转座效率。

附图说明

图1为PS转座酶的结构示意图和三维结构图；

图2为本发明一实施方案的JL转座酶的结构示意图(包含亮氨酸拉链结构域和c-myc NLS结构域的融合JL转座酶结构示意图)；

图3为亮氨酸拉链二聚体结构示意图；

图4为包含2倍TIR序列和2倍切割位点序列的JL转座子结构示意图；

图5为野生型PS转座酶表达质粒图谱；

图6为PPS-DT-GFP(ta)质粒示意图；

图7为PS转座酶融合功能性多肽的结构示意图；

图8为融合功能性多肽提高PS转座酶的转座效率的荧光照片；

图9为质粒表达载体PPS-DT-GFP(ta)中转座子TIR元件DNA序列及其侧翼TA剪切识别序列进行n倍的序列重复多拷贝设计的示意图；

图10为实施例2中CHO细胞荧光照片；

图11为实施例2中PBMC细胞测试结果，左图为阳性率，右图为荧光表达强度；

图12为相对于野生型PS转座酶整合效率(阳性率)提升的若干带正电荷氨基酸突变体统计(三次重复)；

图13为实施例4中第14天的EGFP表达情况；

图14为实施例4中突变体和对照组的阳性率和eGFP表达水平；

图15为实施例5中pPG-PGK-NEO(PSTIR0)的质粒结构示意图；

图16为TIR DNA基序突变筛选评价结果；

图17为基序突变TIR DNA基序多拷贝串联筛选评价结果；

图18为实施例6的评价结果，上图为不同组的转座整合阳性率，下图为转座整合eGFP表达量水平；

图19为实施例7的评价结果，各小图分别为CAR阳性率、表达水平、总细胞数、CAR阳性细胞总数，CAR阳性细胞总数变化；

图20为pCpGfree MCS-0637空载微质粒示意图，其对应的核苷酸序列如SEQ IDNO:59所示。

图21为pCpGfree MCS-43009空载微质粒图谱，其对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:60所示。

具体实施方式

因为野生型PS转座酶或PS转座子系统存在转座活性偏低的缺点，无法在转基因或细胞治疗真实应用场景中达到预期的最佳效果，所以本发明通过工程化方法优化转座酶和/或转座子的方式来提高PS转座子系统的整体活性。在本发明中将经工程化的PS转座酶、PS转座子、PS转座子系统分别称为JL转座酶、JL转座子、JL转座子系统。

与免疫细胞(例如T淋巴细胞)的病毒转导相比，通过DNA转座子递送转基因具有多个优点：易用性，递送大基因片段的潜力，实现临床应用速度快以及低生产成本，转基因能长期且高水平稳定的表达，相较逆转录病毒而言显著较少的诱变、非致癌性和可逆性。基于非病毒载体的基因转移递送系统进行的非转化原代人T淋巴细胞的离体遗传修饰极其困难，其需要建立在转座效率达到较高的水平才能实现。目前已报道的成熟案例仅限于Sleeping beauty睡美人转座子、PiggyBac转座子、TcBuster转座子。本发明通过提高JL转座酶介导的转座效率从而使其适用于细胞免疫治疗的临床应用。

在先申请专利CN110257425B(本文将其全部内容以引用的方式纳入本文)证明PS转座子是将转基因整合插入细胞染色体的有效非病毒工具，但对于细胞或基因治疗来说PS转座子系统的转座效率仍然无法满足需求，且使用DNA转染表达转座酶的方式存在安全性风险，使用转座酶编码DNA导致在靶细胞中转座酶蛋白质持续表达时间延长，缺乏控制的转座酶暴露的时间和动力学带来了持续且不受控制的再转座风险，这引起了有关不利的治疗性细胞产品的转化的安全性担忧。为确保转座酶清除和避免输入异常或不稳定的细胞产物，进行中的试验的工程化T细胞在CAR基因递送后被培养2-4周，这会降低细胞适应性和治疗效果。因此，迫切需要提高转座酶/转座子系统的控制性和安全性，这也是一般细胞和基因治疗的关键要求。为了控制这种转座酶暴露风险，本发明一些实施方案中使用了基于mRNA表达工程化改造高活性JL转座酶的方法，该方法缩短了蛋白质表达的时间，降低了免疫细胞、造血干细胞和祖细胞(HSPC)等细胞的细胞毒性。

DNA转座子可以通过非复制性的“切割和粘贴”机制转座。这需要由催化酶即转座酶识别两个末端反向重复序列，该酶可切割其靶标，从而从其供体模板上释放DNA转座子。在切下后，该DNA转座子随后可以整合到被相同转座酶切割的接受体DNA中。在它们的一些天然构型中，DNA转座子的侧翼是两个末端反向重复序列，并且可含有编码催化转座的转座酶的基因。

基于DNA转座子的基因组编辑应用，包括含转座酶组件和转座子组件的二元系统，转座酶组件为转座酶或其编码核酸(mRNA或DNA)，转座子组件为含有侧翼为末端反向重复序列且包括用于插入宿主基因组的目的基因的转座子DNA。将转座子组件和转座酶组件共同递送到靶细胞中实现依赖于切割和粘贴机制的转座整合效果。

本文讨论了使用工程化高活性JL转座酶应用于细胞基因整合，尤其是增强向人造血和/或免疫系统细胞中的基因转移的协同方法有关的各种装置、系统和方法。本公开内容涉及改进的工程化高活性JL转座酶、转座子系统、转座子载体序列、转座酶递送方法和转座子递送方法等。在一个实施方式中，本研究鉴定了用于制备高活性JL转座酶的特定突变位点。在另一个实施方式中，描述了融合多肽的高活性JL转座酶，其中融合多肽的示例包括亮氨酸拉链多肽、和/或核定位信号结构域。在另一个实施方式中，描述了化学修饰的体外转录的mRNA来表达高活性JL转座酶的改进方法。在另一个实施方式中，描述了优化转座子TIRDNA元件进行突变和/或多拷贝串联,和/或TIR侧翼剪切位点TA元件的多拷贝串联的改进方法。在另一个实施方式中，描述了利用DNA微载体来递送JL转座子载体的方法，该微载体的DNA骨架序列不含有抗生素表达框且优选长度限制在600bp以内，减少和/或不含有CpG的DNA基序，减少表达载体的大小进一步提高了JL转座酶介导的基因转座效率，减少和/或不含CpG的DNA基序能降低DNA载体促发的细胞免疫毒性，提高转座效率。上述实施方式可以单独地或组合形式提高转座子对各种靶细胞的基因转移的效率。

JL转座酶

本公开内容的一个方面提供了一种JL转座酶，其与PS转座酶相比包括氨基酸突变和/或融合了多肽。

在一些实施方案中，JL转座酶为与PS转座酶相比包括氨基酸突变的突变转座酶。在一些实施方案中，与野生型PS转座酶(SEQ ID NO：1)相比，JL转座酶可包含一个或多个氨基酸置换。JL转座酶可包含与野生型PS转座酶的全长序列(SEQ ID NO：1)具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，JL转座酶可包含与野生型PS转座酶的全长序列(SEQ ID NO：1)具有至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，与SEQ ID NO：1相比，JL转座酶的一个或多个氨基酸置换突变为带正电荷氨基酸，如组氨酸、赖氨酸或精氨酸。

JL转座酶可包含具有至少一个与野生型PS转座酶的全长序列(SEQ ID NO：1)不同的氨基酸的氨基酸序列。在一些实施方案中，JL转座酶可包含具有至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或更多个与野生型PS转座酶的全长序列(SEQ ID NO：1)不同的氨基酸的氨基酸序列。JL转座酶可以在PS转座酶的双联DNA结合和寡聚化域(两个HTH结构，第1-129个氨基酸)、DDE催化结构域以及结构域之间的域间区域中的任何一个中包含一个或多个氨基酸置换，或其任意组合(如图1所示)。CENPB型HTH结构域是一个约70-75个氨基酸的DNA结合、螺旋转螺旋(HTH)结构域，存在于真核着丝粒蛋白和转座酶中。该结构域以哺乳动物主要着丝粒自身抗原B或着丝粒蛋白B(CENP-B)命名，后者是染色体的基本着丝粒成分。CENP-B的N末端包含两个DNA结合HTH结构域，它们与相邻的DNA主沟结合。CENPB型HTH结构域的结构由三个α螺旋组成。通过匝连接的第二和第三螺旋包括螺旋-匝-螺旋图案。螺旋3被称为识别螺旋，因为它与其他HTH中的DNA主沟结合。优选地，JL转座酶可以在PS转座酶双联DNA结合和寡聚化域置换为带正电荷氨基酸，如组氨酸(H)、赖氨酸(K)或精氨酸(R)。在一些情况下，JL转座酶可在双联DNA结合和寡聚化域、DDE催化结构域、结构域之间的域间区域或其组合中包含一个或多个氨基酸置换。

在一些实施方案中，JL转座酶包含与全长SEQ ID NO：1相比，在以下位置中的一个或多个位置上具有突变的氨基酸序列：7、8、16、20、22、24、32、35、42、45、46、47、51、55、57、58、59、69、73、74、76、79、84、95、98、123、129、136、159、165、178、187、193、199、213、215、228，其中，所述位置编号为SEQ ID NO：1的位置编号。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸突变为组氨酸、赖氨酸或精氨酸。

在一些实施方案中，JL转座酶包含与全长SEQ ID NO：1相比，在以下位置中的一个或多个位置上具有突变的氨基酸序列：8、16、22、24、32、35、45、46、47、51、55、57、58、59、69、73、84、95、98、123、129、136、150、159、165、187、193、199、213、215、228、237、284、335、359、368，其中，所述位置编号为SEQ ID NO：1的位置编号。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸突变为组氨酸、赖氨酸或精氨酸。

在一些实施方案中，本发明的JL转座酶为与SEQ ID NO：1相比具有以下任意一个或任意组合的突变的JL转座酶：TQS57-59KKA、T129R、T129K、I98K、TQ57-58RK(即同时含有T57R和Q58K)、TQ57-58RK\T129K(即同时含有T57R、Q58K、T129K)、TQ57-58RK\T129R、E32K、E32K\T129K、E32K\T129R、TQ57-58RK\I98K、TQ57-58RK\I98K\T129K、TQS57-59KKA\I98K、TQS57-59KKA\I98K\T129K、R123H、Q136K、K16R、E47K、TQ57-58RR、E32K\T57R\Q58R、T57R、T57K、Q58K、Q58R、S59A、M95L、Y46Q、A8S、T187K、I35V、N199H、N193S、T350S、Q22K、T368E、N213D、H24R、T150A、H165D、K55R、K73R、L228M、E335S、K159H、V359L、T129Q、H215K、R51K、A84L、Q69E、I284L、K45R、H215E、H215Q、I237V。其中，数值表示突变的位置，数值前后的字母表示突变前后的氨基酸残基。

在一些实施方案中，本发明的JL转座酶为与SEQ ID NO：1相比具有以下任意一个或任意组合的突变的JL转座酶：H7K、H7R、A8S、K16R、H20Y、Q22K、Q22E、H24R、E32K、I35V、K42E、K45R、Y46Q、E47K、R51K、K55R、TQ57-58RK(即T57R\Q58K)、TQS57-59KKA(即T57K\Q58K\S59A)、Q69E、Q69R、K73R、K73E、V74L、Q76E、A79I、A84L、M95L、I98K、R123H、T129K、T129R、T129Q、Q136K、K159H、H165D、I178M、T187K、N193S、N199H、N213D、H215Q、H215E、L228M。

在一些实施方案中，本发明的JL转座酶为与SEQ ID NO：1相比具有以下任意一个或任意组合的突变的JL转座酶：A8S、K16R、Q22K、H24R、E32K、I35V、K45R、Y46Q、K55R、TQ57-58RK、TQS57-59KKA、Q69E、K73R、A84L、M95L、I98K、R123H、T129K、T129R、Q136K、K159H、H165D、T187K或H215Q。

在一些实施方案中，与SEQ ID NO：1相比，本发明的JL转座酶在57-58位上具有取代突变。在一些实施方案中，除了第57-58位的取代突变外，本发明的JL转座酶还在选自8、16、22、24、32、35、45、46、47、51、55、59、69、73、84、95、98、123、129、136、150、159、165、187、193、199、213、215、228、237、284、335、359、368的一个或多个位置上具有取代突变，所述位置编号为SEQ ID NO：1的位置编号。优选地，所述第57位的取代突变为R或K，所述第58位的取代突变为R或K。进一步优选地，本发明的JL转座酶还具有选自T129R、T129K、I98K、E32K、R123H、Q136K、K16R、E47K、S59A、M95L、Y46Q、A8S、T187K、I35V、N199H、N193S、T350S、Q22K、T368E、N213D、H24R、T150A、H165D、K55R、K73R、L228M、E335S、K159H、V359L、T129Q、H215K、R51K、A84L、Q69E、I284L、K45R、H215E、H215Q、I237V的一个或多个取代突变。

在一些实施方案中，与SEQ ID NO：1相比，本发明的JL转座酶至少在57-59位上具有取代突变。在一些实施方案中，除了第57-59位的取代突变外，本发明的JL转座酶还在选自8、16、22、24、32、35、45、46、47、51、55、69、73、84、95、98、123、129、136、150、159、165、187、193、199、213、215、228、237、284、335、359、368的一个或多个位置上具有取代突变，所述位置编号为SEQ ID NO：1的位置编号。优选地，所述第57-59位的取代突变为KKA。进一步优选地，本发明的JL转座酶还具有选自T129R、T129K、I98K、E32K、R123H、Q136K、K16R、E47K、M95L、Y46Q、A8S、T187K、I35V、N199H、N193S、T350S、Q22K、T368E、N213D、H24R、T150A、H165D、K55R、K73R、L228M、E335S、K159H、V359L、T129Q、H215K、R51K、A84L、Q69E、I284L、K45R、H215E、H215Q、I237V的一个或多个取代突变。

在一些实施方案中，与SEQ ID NO：1相比，本发明的JL转座酶在57-58和129位上具有取代突变。在一些实施方案中，除了第57-58和129位的取代突变外，本发明的JL转座酶还在选自8、16、22、24、32、35、45、46、47、51、55、59、69、73、84、95、98、123、136、150、159、165、187、193、199、213、215、228、237、284、335、359、368的一个或多个位置上具有取代突变，所述位置编号为SEQ ID NO：1的位置编号。优选地，所述第57位的取代突变为R或K，所述第58位的取代突变为R或K，所述第129位的取代突变为K或R。进一步地，本发明的JL转座酶还具有选自、I98K、E32K、R123H、Q136K、K16R、E47K、S59A、M95L、Y46Q、A8S、T187K、I35V、N199H、N193S、T350S、Q22K、T368E、N213D、H24R、T150A、H165D、K55R、K73R、L228M、E335S、K159H、V359L、T129Q、H215K、R51K、A84L、Q69E、I284L、K45R、H215E、H215Q、I237V的一个或多个取代突变。

在一些实施方案中，与SEQ ID NO：1相比，本发明的JL转座酶至少在98位上具有取代突变。在一些实施方案中，除了第98位的取代突变外，本发明的JL转座酶还在选自8、16、22、24、32、35、45、46、47、51、55、57、58、59、69、73、84、95、123、129、136、150、159、165、187、193、199、213、215、228、237、284、335、359、368的一个或多个位置上具有取代突变，所述位置编号为SEQ ID NO：1的位置编号。优选地，所述第98位的取代突变为K。进一步地，本发明的JL转座酶还具有选自TQS57-59KKA、T129R、T129K、TQ57-58RK、TQ57-58RK\T129K、TQ57-58RK\T129R、E32K、E32K\T129K、E32K\T129R、R123H、Q136K、K16R、E47K、TQ57-58RR、E32K\T57R\Q58R、T57R、T57K、Q58K、Q58R、S59A、M95L、Y46Q、A8S、T187K、I35V、N199H、N193S、T350S、Q22K、T368E、N213D、H24R、T150A、H165D、K55R、K73R、L228M、E335S、K159H、V359L、T129Q、H215K、R51K、A84L、Q69E、I284L、K45R、H215E、H215Q、I237V的一个或多个取代突变。

在一些实施方案中，与SEQ ID NO：1相比，本发明的JL转座酶至少在129位上具有取代突变。在一些实施方案中，除了第129位的取代突变外，本发明的JL转座酶还在选自8、16、22、24、32、35、45、46、47、51、55、57、58、59、69、73、84、95、98、123、136、150、159、165、187、193、199、213、215、228、237、284、335、359、368的一个或多个位置上具有取代突变，所述位置编号为SEQ ID NO：1的位置编号。优选地，所述第129位的取代突变为K或R。进一步地，本发明的JL转座酶还具有选自TQS57-59KKA、I98K、TQ57-58RK、E32K、TQ57-58RK\I98K、TQ57-58RK\I98K\T129K、TQS57-59KKA\I98K、R123H、Q136K、K16R、E47K、TQ57-58RR、E32K\T57R\Q58R、T57R、T57K、Q58K、Q58R、S59A、M95L、Y46Q、A8S、T187K、I35V、N199H、N193S、T350S、Q22K、T368E、N213D、H24R、T150A、H165D、K55R、K73R、L228M、E335S、K159H、V359L、T129Q、H215K、R51K、A84L、Q69E、I284L、K45R、H215E、H215Q、I237V的一个或多个取代突变。

示例性JL转座酶可包含来自表1的一个或多个氨基酸置换。有时，JL转座酶可包含来自表1的至少一个氨基酸置换。JL转座酶可包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少20个、至少30个或更多个来自表1的氨基酸置换。优选地，JL转座酶包含选自以下的一个或多个氨基酸置换或置换组合：H24R、E32K、TQS57-59KKA、TQ57-58RK、I98K、T129K、T187K、N193S、TQ57-58RK\T129K、TQ57-58RK\I98K、TQ57-58RK\I98K\T129K、TQS57-59KKA\T129K、TQS57-59KKA\I98K TQS57-59KKA\I98K\T129K、E32K\T57R\Q58R或E32K\T129K。

发明人还发现，PS转座酶或者其突变体可以融合其它功能性多肽或蛋白结构域，且不影响甚至提高转座酶或转座子基因整合功能。因此，本发明一些实施方案的JL转座酶是一种融合转座酶，其包含PS转座酶或其突变体，和与PS转座酶或其突变体连接的功能多肽。

本发明中，融合转座酶中的PS转座酶突变体没有限制。本发明人发现，在融合了功能多肽(尤其是下文所述的亮氨酸拉链结构域)的情况下，无论PS转座酶何种突变都可以获得比野生型PS转座酶高的基因整合功能。

本文中，一个多肽序列的“突变体”包括与参考序列相比具有一个或多个氨基酸残基插入、取代和/或缺失的氨基酸序列。一些实施方案中，本文所述的“突变体”包括与作为对比的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的突变体。可采用例如NCBI的BLASTp计算两条比对的序列之间的序列同一性。或者，一些实施方案中，与作为对比的序列相比，本文所述的突变体具有一个或多个(如20个以内、15个以内、10个以内、8个以内、5个以内或3个以内，如1-20、1-10等)氨基酸残基插入、取代或缺失。

一些优选实施方案中，融合转座酶中，PS转座酶突变体与PS转座酶相比具有1-5个(例如1、2、3、4、5个)氨基酸突变例如取代。一些优选实施方案中，融合转座酶中，PS转座酶突变体与如SEQ ID NO：1所示的野生型PS转座酶相比，包括选自下组的一个或多个突变：TQS57-59KKA、T129R、T129K、I98K、TQ57-58RK、TQ57-58RK\T129K、TQ57-58RK\T129R、E32K、E32K\T129K、E32K\T129R、TQ57-58RK\I98K、TQ57-58RK\I98K\T129K、TQS57-59KKA\I98K、TQS57-59KKA\I98K\T129K、R123H、Q136K、K16R、E47K、TQ57-58RR、E32K\T57R\Q58R、T57R、T57K、Q58K、Q58R、S59A、M95L、Y46Q、A8S、T187K、I35V、N199H、N193S、T350S、Q22K、T368E、N213D、H24R、T150A、H165D、K55R、K73R、L228M、E335S、K159H、V359L、T129Q、H215K、R51K、A84L、Q69E、I284L、K45R、H215E、H215Q、I237V、Q69R、L100I、K96R、Q162R、A271K、R372K、H20Y、TYCR150-153KFVI、N232K、A363N、A377C、Q346M、A17V、N105G、Q76E、I354V、VS133-134IA、S253K、V370I、SV297-298TE、EH286-286DS、A352S、ANS241-243VHE、S297T、A79I、T147S、I178M、I276V、Q331E、R257E、T339S、A79V、H104L、V74L、S107E、Q142E、R375K、S243E、R195K、Q22E、A328Q、G111A、R110K、I365V、VTE380-382SNA、R190K、RA372-373KS、K73L、K121R、R102K、C152V、IY276-277VW、V292I、K73E、H104M、I239V、K42E、K356Q、T150K、G316S、IY259-260VW、V53M、E108D、V53L、DKV72-74EEL、M280F、S85G、N63K、V91L、K251L、H124N、K308S、N10D、H7R、G112S、H7K、TA327-328KE，优选地，包括选自下组的一个或多个突变：TQS57-59KKA、T129R、T129K、I98K、TQ57-58RK、TQ57-58RK\T129K、TQ57-58RK\T129R、E32K、E32K\T129K、E32K\T129R、TQ57-58RK\I98K、TQ57-58RK\I98K\T129K、TQS57-59KKA\I98K、TQS57-59KKA\I98K\T129K、R123H、Q136K、K16R、E47K、TQ57-58RR、E32K\T57R\Q58R、T57R、T57K、Q58K、Q58R、S59A、M95L、Y46Q、A8S、T187K、I35V、N199H、N193S、T350S、Q22K、T368E、N213D、H24R、T150A、H165D、K55R、K73R、L228M、E335S、K159H、V359L、T129Q、H215K、R51K、A84L、Q69E、I284L、K45R、H215E、H215Q、I237V、Q69R、L100I、K96R、Q162R、A271K、R372K、H20Y、TYCR150-153KFVI、N232K、A363N、A377C、Q346M、A17V、N105G、Q76E、I354V、VS133-134IA、S253K、V370I、SV297-298TE、EH286-286DS、A352S、ANS241-243VHE、S297T、A79I、T147S、I178M、I276V、Q331E、R257E、T339S、A79V、H104L、V74L、S107E、Q142E、R375K、S243E、R195K、Q22E、A328Q、G111A、R110K、I365V、VTE380-382SNA，更优选地，包括选自下组的一个或多个突变：TQS57-59KKA、T129R、T129K、I98K、TQ57-58RK、TQ57-58RK\T129K、TQ57-58RK\T129R、E32K、E32K\T129K、E32K\T129R、TQ57-58RK\I98K、TQ57-58RK\I98K\T129K、TQS57-59KKA\I98K、TQS57-59KKA\I98K\T129K、R123H、Q136K、K16R、E47K、TQ57-58RR、E32K\T57R\Q58R、T57R、T57K、Q58K、Q58R、S59A、M95L、Y46Q、A8S、T187K、I35V、N199H、N193S、T350S、Q22K、T368E、N213D、H24R、T150A、H165D、K55R、K73R、L228M、E335S、K159H、V359L、T129Q、H215K、R51K、A84L、Q69E、I284L、K45R、H215E、H215Q、I237V。

在优选实施方案中，PS转座酶的突变体为本文任一实施方案所述的突变转座酶。

本文所述“功能多肽”指具有其本身功能的多肽，例如DNA序列特异性或非特异性结合域和/或细胞核定位信号结构域(NLS)。所述DNA序列特异性或非特异性结合域指基于DNA序列特异性或非特异性发挥功能的结构域，例如亮氨酸拉链结构域、CRISPR/Cas结构域、TALE域、锌指域、AAV Rep DNA结合域或其任意组合。所述细胞核定位信号结构域包括SV40 NLS、C-myc NLS、TAF1NLS、TP53 NLS、STAT3 NLS或其任意组合。这些细胞核定位信号结构域的氨基酸序列可参见中国专利申请CN202211150935.9等。

在一些实施方案中，所述亮氨酸拉链结构域源自InterPro蛋白数据库(https://www.ebi.ac.uk/interpro/)中的IPR020983的Basic_leucine-zipper_C蛋白家族，IPR004827的bZIP蛋白家族，IPR046347的bZIP_sf蛋白家族中介导同源二聚化的结构域部分。在一些实施方案中，所述亮氨酸拉链结构域选自C/EBPα(在本文中也称为C-EBPO或C/EBPO，其氨基酸序列如SEQ ID NO：28所示，编码其的核苷酸序列如SEQ ID NO:34所示)、LZIP(其氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示，编码其的核苷酸序列如SEQ ID NO:35所示)、CREPT(其氨基酸序列如SEQ ID NO：30所示，编码其的核苷酸序列如SEQ ID NO:36所示)、TEF(其氨基酸序列如SEQ ID NO：31所示，编码其的核苷酸序列如SEQ ID NO:37所示)。

在一些实施方案中，DNA序列特异性或非特异性结合域可以位于转座酶的C端或N端。在一些实施方案中，细胞核定位信号结构域可以位于转座酶的C端或N端，优选N端。在一些实施方案中，DNA序列特异性或非特异性结合域和细胞核定位信号结构域可以位于转座酶的同一端或不同端。当位于转座酶的同一端时，从N端至C端可以是DNA序列特异性或非特异性结合域-细胞核定位信号结构域，也可以是细胞核定位信号结构域-DNA序列特异性或非特异性结合域。当位于转座酶的不同端时，DNA序列特异性或非特异性结合域和细胞核定位信号结构域可以分别位于转座酶的N端和C端，或者C端和N端。

在一个示例性的结构中，如图2所示，当存在C-myc NLS结构域时，从N端-C端分别是亮氨酸拉链结构域、C-myc NLS结构域和转座酶。通过添加亮氨酸拉链结构域，可以介导同源二聚，从而提高转座效率。

在融合转座酶中，所述转座酶、所述DNA序列特异性或非特异性结合域、所述细胞核定位信号结构域之间可以直接连接或被连接体隔开。通常所述连接体包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个或至少50个氨基酸。示例性地，所述连接体的序列为(GGGS)_n或A(EAAAK)_nA，n为大于0的正整数，例如1、2、3、4或5；优选地，所述连接体的序列为GGGS。

本文所述转座酶的序列可以是经过修饰的多肽序列。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

应理解，在基因克隆操作中，常常需要设计合适的酶切位点，这势必在所表达的氨基酸序列末端引入了一个或多个不相干的残基，而这并不影响目的序列的活性。为了构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化，常常需要将一些氨基酸添加至重组蛋白的N-末端、C-末端或该蛋白内的其它合适区域内，例如，包括但不限于，适合的接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸等。因此，本发明的转座酶的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本文。例如，所述的标签可以是FLAG，HA，HA1，c-Myc，Poly-His，Poly-Arg，Strep-TagII，AU1，EE，T7，4A6。这些标签可用于对蛋白进行纯化。

本发明实施方案的JL转座酶具有比野生型PS转座酶更高的活性。如本文所用的，“更高的活性”可指与具有氨基酸序列SEQ ID NO：1的野生型PS转座酶相比具有增加的转座效率。

转座效率可以根据宿主细胞群体中发生的成功转座事件的百分比来衡量，该百分比用引入该宿主细胞群体中的转座子和转座酶的量进行归一化。在许多情况下，当比较两种或更多种转座酶的转座效率时，针对宿主细胞在相同或相似转染条件下的转染，将相同的转座子构建体与两种或更多种转座酶中的每一种进行配对。可以通过各种方法检查宿主细胞中的转座事件的量。例如，转座子构建体可以被设计成含有位于末端反向重复序列之间的报道基因，并且该报道基因呈阳性的转染细胞可以被计数为发生成功转座事件的细胞，这可以得出转座事件的量的估计值。在一些实施方案中，当比较两种或更多种不同转座子的转座效率时，可以针对宿主细胞在相同或相似转染条件下的转染，将相同的转座酶与每种不同的转座子进行配对。可以使用类似的方法来测量转座效率。也可以实施本领域技术人员已知的其它方法来比较转座效率。

编码JL转座酶的多核苷酸分子

本发明提供多核苷酸分子，其编码本发明所述的JL转座酶。本发明也提供转座酶的编码序列的互补序列。该多核苷酸可以是重组核酸分子，也可以是合成的；其可包含DNA、RNA以及PNA(肽核酸)并且可以是其杂合体。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。本发明也包括编码JL转座酶的多核苷酸序列的简并变异体，即编码相同的氨基酸序列但核苷酸序列有所不同的核苷酸序列。

在一些实施方案中，所述多核苷酸分子包含编码所述JL转座酶的DNA。在一些实施方案中，所述多核苷酸存在于核酸构建物例如DNA载体中。载体可以是克隆载体，也可以是表达载体。表达载体包含转座酶的表达框，其为一种核酸构建体即含有启动子、转座酶编码序列和PolyA加尾信号序列。表达载体中通常还含有载体通常所含的其它元件，例如多克隆位点、抗性基因、复制起始位点等。核酸构建体中还可含有其它表达所需的原件，包括但不限于增强子等。所述DNA载体包括常规环状DNA质粒、线性DNA质粒，还包括微环质粒、纳米质粒、doggybone线性微质粒等不含抗生素和/或复制子DNA序列的DNA形式。在一些实施方案中，所述多核苷酸存在于病毒载体中，包括但不局限于AAV、慢病毒、反转录病毒、腺病毒等。在一些实施方案中，所述DNA载体为DNA微载体，该微载体的DNA骨架序列不含有抗生素表达框且优选长度限制在600bp以内，和/或不含有CpG的DNA基序。

在一些实施方案中，所述多核苷酸包含编码所述JL转座酶的信使RNA(mRNA)。在一些实施方案中，所述mRNA是化学修饰的，例如假尿苷(ψ)，N1-甲基假尿苷(m1ψ)，5-甲基胞嘧啶核苷(m5C)，5-甲氧基尿苷(5moU)等。

本发明还涉及与上述多核苷酸序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严谨条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严谨条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

可采用本领域常规的方法制备得到多核苷酸分子，并构建相应的载体，通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。或者，可以如上得到融合转座酶的各部分的序列后再连接得到CAR的全长。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。可使用本领域技术人员熟知的方法来构建重组载体，参见例如Sambrook等、Ausubel(1989)或其他标准教科书中描述的技术。含有本发明的核酸分子的载体可通过熟知的方法转移至宿主细胞中，其根据细胞宿主的类型而变化。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电转可用于其它细胞宿主，可参见Sambrook等。

此外，可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明也涉及核酸构建物，该核酸构建物含有本文所述的多核苷酸分子的核酸序列，以及与这些序列操作性连接的一个或多个调控序列。本发明所述的核酸构建物可以多种方式被操作以保证所述转座酶的表达。在将核酸构建物插入载体之前可根据表达载体的不同或要求而对核酸构建物进行操作。本领域知晓通过DNA或mRNA来表达蛋白所需的调控序列和操作方式。利用重组DNA方法来改变多核苷酸序列的技术是本领域已知的。

在某些实施方案中，所述核酸构建物是载体，例如克隆载体、表达载体和整合载体。通常通过可操作地连接本发明的多核苷酸序列至表达载体，实现本发明多核苷酸序列的表达。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。整合载体含有将靶序列整合到细胞基因组上的组件。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。载体通常含有用于质粒维系和用于克隆与表达外源性核苷酸序列的序列。所述序列(在某些实施方案中总称为“侧翼序列”)通常包括一个或多个以下核苷酸序列：启动子、一个或多个增强子序列、复制起点、转录终止序列、含有供体和受体剪接位点的完全内含子序列、编码用于多肽分泌的前导序列的序列、核糖体结合位点、聚腺苷酸化序列、用于插入编码将要表达的抗体的核酸的多连接子区和可选标记元件。

载体的类型不受限制，例如，质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒，可根据待导入的宿主细胞而改变。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，NewYork)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。

为了评估转座酶的表达，被引入细胞的载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。

JL转座子

本公开内容的JL转座子与野生型PS转座子相比，包含以下任意一项、两项或三项特征：(1)至少一个末端反向重复序列的核苷酸突变(即突变型末端反向重复序列)；(2)至少在一端具有重复的末端反向重复序列；(3)至少在一端的末端反向重复序列外侧包括重复的TA序列。

一些实施方案中，所述突变末端反向重复序列与SEQ ID NO：2(野生型PS转座子5’TIR)或SEQ ID NO：3(野生型PS转座子3’TIR)相比具有1-5个、优选1-4个、更优选1-3个核苷酸突变；和/或与SEQ ID NO：2或3具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列。一些实施方案中，所述突变末端反向重复序列选自但不局限于SEQ ID NO:4-27任一所示，或含有SEQ ID NO:4-27相较于野生型PS TIR的核苷酸突变的任意组合突变(称为组合突变序列)；或为SEQ ID NO:4-27或组合突变序列的反向互补序列。优选地，所述突变末端反向重复序列选自SEQ ID NO:4-6及其反向互补序列。

应理解，转座子两端的末端反向重复序列可以是其中一个末端反向重复序列具有核苷酸突变，也可以是其中的多个或所有具有核苷酸突变，且各个末端反向重复序列的核苷酸突变可以相同，也可以不同。

一些实施方案中，JL转座子末端反向重复序列各自独立地选自SEQ ID NO：3-27或与SEQ ID NO：3-27具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列，或它们的反向互补序列。

在一个或多个实施方案中，所述转座子DNA序列在两端中的一端或两端具有多倍末端反向重复序列(即末端反向重复序列的多拷贝串联)，可表述为(TIR)n，n≥2，例如为2、3、4等。所述多倍包括但不限于2倍、3倍或4倍等。两端的末端反向重复序列的拷贝数可以相同，也可以不同，例如每一端各自独立具有1段、2段、3段、4段或更多段重复的末端反向重复序列，且两端不同时为1段末端反向重复序列。该重复的末端反向重复序列相比野生型末端反向重复序列可含有或不含有上述核苷酸突变。在一些实施方案中，转座子DNA两端包括2倍的末端反向重复序列，结构示意图如图4所示，其中5’PST指5’端的TIR，3’PST指3’端的TIR，5’PST5’PST和3’PST3’PST是指具有2倍的末端反向重复序列。JL转座子的末端反向重复序列长度较短，通过增加末端反向重复序列的数量，延长JL转座酶可识别的序列长度，可以提高转座效率。

在一个或多个实施方案中，所述转座子DNA序列两端的末端反向重复序列外具有转座酶的切割位点序列，所述切割位点序列为TA(核苷酸序列)。该末端反向重复序列相比野生型末端反向重复序列可含有或不含有上述核苷酸突变。在一个或多个实施方案中，所述转座子DNA两端中的一端或两端具有多拷贝切割位点序列，表述为(TA)m，m≥2，所述多拷贝值m优选2、3或4。两端的TA重复数可以相同，也可以不同，例如在两端各自独立具有1段、2段、3段、4段或更多段重复的TA序列，且两端不同时为1段TA序列。在一些实施方案中，转座子DNA在两端各包括2倍的切割位点序列，结构示意图如图4所示。其中TA指切割位点序列，TATA指2倍的切割位点序列。在一些实施方案中，转座子DNA包括4倍的切割位点序列，即TATATATA。通过增加切割位点序列的数量，增加JL转座酶切割位点，可以提高转座效率。

在一个或多个实施方案中，JL转座子在左端包括(TA)_m(TIR)_n，在右端包括(TIR)_p(TA)_q，其中m、n、p、q为整数，m≥1，优选为2-4，n≥1，优选为2-4，p≥1，优选为2-4，q≥1，优选为2-4，TIR可以是野生型PS转座子TIR，也可以是突变型TIR，且当TIR为野生型TIR时，m、n、p、q不同时为1(即，m、n、p、q至少有一者≥2)。另外，当TIR有重复时，各重复的TIR可以各自独立选自野生型TIR序列及其突变体中的任一序列。优选实施方案中，m＝2-4，优选为4，n＝2，p＝2-4，优选为4，q为2。更优选实施方案中，TIR为突变型TIR，m＝2-4，优选为4，n＝2。

在一个或多个实施方案中，JL转座子DNA序列优选包括(TA)₂(TIR1)₂，(TA)₃(TIR1)₂，或(TA)₄(TIR1)₂，其中TIR1为一种突变型TIR，最优选(TA)₄(TIR1)₂形式，其核苷酸序列如SEQ ID NO：32所示。在一个或多个实施方案中，JL转座子DNA序列一端或两端含有(TA)₄(TIR1)₂。

JL转座子可包含位于末端反向重复序列之间的DNA元件组合，例如目的基因表达框。DNA元件组合包括但不局限于启动子、增强子、目的基因(表达基因)、5-UTR、3-UTR等本领域内技术人员所熟知的序列元件。如本文全文所用的术语“外源基因”或“目的基因”，指与靶基因或作为导入对象的宿主细胞不天然相关联的核酸或蛋白质序列，包括位于非天然产生的基因组位置的天然产生的核酸序列，或天然产生的核酸(例如，DNA序列)的非天然产生的多个拷贝。

在一些实施方案中，所述DNA元件组合包含表达基因。相应地，所述DNA元件组合还可包含启动子，其选自但不限于CMV、EFS、MND、EF1α、CAGC、PGK、UBC、U6、H1和Cumate。在一些实施方案中，所述表达基因编码选自细胞受体、免疫检查点蛋白质、细胞因子及其任意组合的蛋白质。在一些实施方案中，所述表达基因编码选自细胞受体、免疫检查点蛋白质、细胞因子、T细胞受体(TCR)、B细胞受体(BCR)、嵌合抗原受体及其任意组合的蛋白质。

在一些实施方案中，表达基因编码CAR。CAR可依次包含结合抗原结合域、铰链区、跨膜区和胞内信号区。可采用本领域周知的用于构建CAR的铰链区、跨膜区和胞内信号区来构建本发明的CAR。通常，抗原结合域能够以中等亲和力结合肿瘤细胞广泛表达的膜抗原，该多肽通常插入有抗原表位，插入的位置选自如下3个位置中的任意1个、2个或3个：所述多肽的N端、所述多肽和所述铰链区之间和所述多肽内部。所述抗原结合域可为天然多肽或人工合成多肽。嵌合抗原受体可针对如下抗原中的一种或多种：CD19、CD20、CEA、GD2、FR、PSMA、PMEL、CA9、CD171/L1-CAM、IL-13RL1、MART-1、ERBB2、NY-ESO-1、AFP、MUC1、CD22、CD23、CD30、CD33、CD44v7/8、CD70、VEGFR1、VEGFR2、IL-11R/、EGP-2、EGP-40、FBP、GD3、PSCA、FSA、PSA、HMGA2、LeY、EpCAM、MSLN、IGFR1、EGFR、EGFRvIII、ERBB3、ERBB4、CA125、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CA242、CA50、CYFRA21-1、SCC、AFU、EBV-VCA、POA和PROGRP。

在一些实施方案中，所述抗原结合域可包含抗体、抗体模拟物、蛋白质支架或其片段。在某些实施方式中，所述抗体是嵌合抗体、重组抗体、人源化抗体或人抗体。在某些实施方式中，所述抗体经亲和性调节(affinity-tune)。本发明抗体的非限制性示例包括单链可变片段(scFv)、VHH、单域抗体(sdAB)、小模块免疫药物(SMIP)分子，或纳米抗体。在某些实施方式中，VHH是骆驼科的。或者或此外，在某些实施方式中，VHH是人源化的。本发明抗体片段的非限制性示例包括互补决定区、可变区、重链、轻链，或其任何组合。本发明抗体模拟物的非限制性示例包括：亲和体(affibody)、Afflilin分子、粘合素(affimer)、Affitin分子，阿尔法体(alphabody)、抗运载蛋白(anticalin)，和Avimer分子、DARPin、Fynomer、Kunitz结构域肽，或单体(monobody)。本发明蛋白质支架的非限制性示例包括Centyrin。

在一些实施方案中，适用于本发明的CAR可参考CN 202111681582.0，本文将其全部内容以引用的方式纳入本文。

在一些实施方案中，表达基因编码免疫检查点抑制剂，例如PD-1抗体、CTLA-4抗体等。所述抗体的非限制性示例包括单链可变片段(scFv)、VHH、单域抗体(sdAB)、小模块免疫药物(SMIP)分子，或纳米抗体。

在一些实施方案中，适用于本发明的PD-1抗体可参考CN 202111681582.0，本文将其全部内容以引用的方式纳入本文。

在一些实施方案中，表达基因编码如CN 202111681582.0中所述的CAR和PD-1抗体。

转座子通常以核酸构建物，特别是DNA载体的形式提供，在此方面，可使用本领域任何便于将转座子引入细胞的DNA载体，包括但不局限于常规环状DNA质粒，线性DNA质粒，微环质粒、纳米质粒、Doggybone等不含抗生素或/和复制子DNA序列的DNA形式等。在一些实施方案中，所述DNA载体为DNA微载体，该微载体的DNA骨架序列不含有抗生素表达框且优选长度限制在600bp以内，和/或不含有CpG的DNA基序。在一些实施方案中，所述DNA载体为无抗微质粒，即无抗生素抗性基因的微质粒(无抗生素表达框微质粒)，也称为或太质粒(tiny或tiniplasmid)。适用于本发明的无抗微质粒可参考上海吉量医药工程有限公司等于2023年1月13日递交的名为“一种无抗微质粒及其制备方法和应用”中国专利申请(申请号为：202310072956.1)，本申请将其全部内容以引用的方式纳入本文。在一些实施方案中，所述无抗微质粒包含编码抗毒素蛋白的核苷酸序列和复制子；所述抗毒素蛋白的氨基酸序列含有如下序列：(1)如SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:49相比具有E24D、I35V、V43I的一个或多个突变的氨基酸序列；或(2)如SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:50相比具有T6I、T43A、K47E、A50S、E51D、G52A、N54K的一个或多个突变的氨基酸序列；所述复制子的长度≤800bp、优选≤600bp或≤300bp。在一些实施方案中，所述抗毒素蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:49-55任一所示。在一些实施方案中，所述复制子选自ColE1、ColE2、pMB1、pSC101、RSF、R6K、pUC57、RK2和p15A；优选为R6K或pUC57。在一些实施方案中，所述无抗微质粒的质粒骨架的长度≤1000bp，优选≤900bp、≤800bp或≤600bp。在一些实施方案中，所述编码抗毒素蛋白的核苷酸序列不含CpG基序，优选地，所述编码抗毒素蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:56或SEQ ID NO:57所示。在一些实施方案中，所述复制子的核苷酸序列不含有CpG基序。在一个优选的实施方案中，所述无抗微质粒的骨架序列的长度≤600bp，复制子为不含CpG基序的R6K复制子。不含CpG基序的R6K复制子的核苷酸序列例如如SEQ ID NO：58所示。在一些实施方案中，无抗微质粒(空载)的核苷酸序列如SEQ IDNO:59或60所示；图谱结构如图20或21所示。

转座子系统

本文还涉及一种用于基因组编辑系统(转座子系统)，其包含转座酶和可被该转座酶识别的转座子。一些实施方案中，提供一种转座子系统，其包含JL转座酶或编码其的多核苷酸，和可被该转座酶识别的转座子。一些实施方案中，提供一种转座子系统，其包含JL转座子和可识别该转座子的转座酶或编码其的多核苷酸。一些实施方案中，提供的转座子系统为JL转座子系统，其包含：(1)如本文所述的JL转座酶，或编码其的多核苷酸，和(2)如本文所述的JL转座子或者野生型PS转座子。

一些实施方案中，转座子系统的转座子末端反向重复序列各自独立地选自SEQ IDNO：2-27或与SEQ ID NO：2-27具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列，或它们的反向互补序列。

一些实施方案中，转座子可以存在于表达载体中。在许多情况下，该表达载体可以是DNA质粒，包括但不局限于常规环状DNA质粒，线性DNA质粒，微环质粒、纳米质粒、Doggybone等不含抗生素或/和复制子DNA序列的DNA形式等。有时，该表达载体可以是小环载体。如本文所用的术语“小环载体”可指小环状质粒衍生物，其不含大多数(如果不是全部的话)原核载体部分(例如，原核来源的控制序列或非功能序列)。在某些情况下，通过使用如本文所述的“小环”可以减轻通过转染或电穿孔产生的对细胞的毒性。在一些实施方案中，表达载体为DNA微载体，该微载体的DNA骨架序列不含有抗生素表达框且优选长度限制在600bp以内，和/或不含有CpG的DNA基序。在一些实施方案中，表达载体为上述任一实施方案的无抗微质粒。

一些实施方案中，转座子系统的编码转座酶的多核苷酸可为DNA，其可存在于表达载体中，并且可以与转座子存在于同一表达载体或不同表达载体中。表达载体可如文中任一实施方案所述。

一些实施方案中，转座子系统的编码转座酶的多核苷酸可为信使RNA(mRNA)。mRNA可以通过本领域普通技术人员熟知的许多方法产生，例如但不限于体内转录和RNA纯化、体外转录和从头合成。在许多情况下，mRNA可以被化学修饰。化学修饰的mRNA可以比未修饰的或天然的mRNA具有降解抗性，或者可以更快地降解。在许多情况下，mRNA的化学修饰可以使mRNA以更高的效率翻译。mRNA的化学修饰可以使用本领域技术人员可获得的公知技术或由商业供应商进行。

本公开的JL转座酶、JL转座子或JL转座子系统比野生型PS转座酶、PS转座子或PS转座系统在整合效率和转基因表达量方面都有显著提高。本公开的JL转座酶可以以病毒、质粒DNA、mRNA或蛋白等形式应用于稳定转染细胞、细胞系发育、基因组修饰、基因治疗、细胞治疗、转基因动物等方面。

宿主细胞

本文中，在表达外源核酸序列时，“宿主细胞”是指原核或真核细胞，其能够复制载体和/或表达由载体编码的外源基因。宿主细胞可用作载体或mRNA的受主。宿主细胞可以是“转染的”或“转化的”，其指外源性核酸转染或转导到宿主细胞中的过程。转化的细胞包括原代对象细胞及其后代。本文所用的术语“工程改造的”和“重组的”细胞或宿主细胞往往指其中已经导入外源性核酸序列，例如载体或mRNA的细胞。因此，重组细胞可与不含导入的重组核酸的天然存在的细胞相区分。

本文中，宿主细胞包括携带和/或产生本文所述转座酶或其编码序列、转座子或转座子系统的细胞。具体而言，本发明提供携带本发明所述转座酶和/或其编码序列的细胞。所述细胞还可包含编码可被所述转座酶识别的转座子的核酸序列。

细胞的种类不受限制，只要能表达本文所述转座酶或能利用本文所述转座酶实现对转座子的转座即可。在一些实施方案中，所述细胞是从受试者分离的原代细胞。所述受试者是健康对象或已被诊断为患有疾病(例如癌症或肿瘤)。

在一些实施方案中，所述细胞从所述受试者的血液中分离，例如PBMC或其衍生细胞。所述细胞可包含原代免疫细胞，例如原代白细胞。在一些实施方案中，所述细胞包含原代T细胞。所述原代T细胞包含γδT细胞、辅助T细胞、记忆T细胞、自然杀伤T细胞、效应T细胞或其任意组合。在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包含CD3+细胞。

在一些实施方案中，所述细胞包含干细胞。所述干细胞选自：胚胎干细胞、造血干细胞、表皮干细胞、上皮干细胞、支气管肺泡干细胞、乳腺干细胞、间充质干细胞、肠干细胞、内皮干细胞、神经干细胞、嗅觉成体干细胞、神经嵴干细胞、睾丸细胞及其任意组合。所述干细胞包含诱导多能干细胞。

可将本发明的转座酶或其编码序列、转座子或转座子系统引入感兴趣的细胞中。本文中，引入的方法包括借助于电穿孔、显微注射、磷酸钙沉淀、阳离子聚合物、树状聚体、脂质体、脂质纳米颗粒(LNP)、微粒轰击、fugene、直接声波加载、细胞挤压、光学转染、原生质体融合、impalefection、磁转染、核转染或其任意组合转染所述细胞。在某些实施方案中，引入采用电穿孔。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的JL转座酶。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。在使用诱导型启动子表达转座酶的实施方案中，当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

方法

本文还涉及制备细胞的方法，包括：将如本文所述的JL转座子系统引入细胞中的步骤。

在一些实施方案中，所述引入包括使所述细胞与编码所述JL转座酶的多核苷酸接触。所述多核苷酸包含编码所述JL转座酶的DNA或信使RNA(mRNA)。

在一些实施方案中，所述引入包括使所述细胞与所述JL转座酶接触，优选通过将所述JL转座酶直接添加至含有所述细胞的培养基(优选地添加至靶生物细胞的细胞培养基)中来提供转座酶蛋白质。在根据本发明的JL转座酶与靶细胞直接接触中，可以不使用任何改变蛋白质跨过细胞膜的穿透的试剂、载体或方法。

在一些实施方案中，所述引入包括使所述细胞与含有所述转座子的DNA载体接触。在一些实施方案中，所述DNA载体包括微载体质粒，优选微载体的DNA骨架序列不含有抗生素表达框且优选长度限制在600bp以内，和/或不含有CpG的DNA基序。在一些实施方案中，所述引入包括使所述细胞与含有所述转座子和编码所述JL转座酶的多核苷酸的质粒载体接触。在一些实施方案中，所述引入包括使所述细胞与编码所述转座酶的mRNA和含有所述转座子的质粒载体接触。在一些实施方案中，所述引入包括使所述细胞与含有所述多核苷酸和所述转座子的质粒载体接触。在一些实施方案中，所述引入包括使所述细胞与含有所述多核苷酸的质粒载体和含有所述转座子的质粒载体接触。

在一些实施方案中，本文所述的转座子系统可以通过病毒，包括逆转录病毒(如慢病毒等)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、疱疹病毒等递送给细胞。转座子和转座酶基因可以一起包含在同一个重组病毒基因组上；一次感染就可以传递转座子系统的两个部分，这样转座酶的表达就可以引导转座子从重组病毒基因组中裂解出来，随后插入细胞染色体中。在另一个例子中，转座酶和转座子可以通过病毒和/或非病毒系统(如含脂质试剂)的组合分别传递。在这些情况下，转座子和/或转座酶基因可以由重组病毒传递。在每一种情况下，表达的转座酶基因指导转座子从其载体DNA(病毒基因组)中解放出来，插入染色体DNA。本发明的JL转座酶很小，尤其适合用AAV来递送。

本发明还提供一种利用转座酶对细胞进行基因工程化的方法，其中该方法涉及使转座酶穿透细胞膜但不包含蛋白质转染步骤，特别地，该方法不包含为了将转座酶蛋白质引入细胞中蛋白质转染试剂或程序的使用。该方法包括将转座酶与待接受转座酶的细胞直接接触的过程，例如使用含有转座酶的细胞培养基孵育细胞。本发明的方法包含不使用改变蛋白质跨过细胞膜的穿透(penetration)的任何载体、试剂或方法引入转座酶蛋白质的步骤。

本发明上下文中的术语“蛋白质转染”应被理解为广泛地涉及足以将不能有效地进入靶细胞的蛋白质引入所述靶细胞的任何方法或试剂。普遍的蛋白质转染系统和试剂包括商业蛋白质转染试剂，例如PULSin^TM、ProteoJuice^TM、Xfect^TM和 Pierce^TM蛋白质转染试剂(ThermoFisher)、TransPass^TM，以及蛋白质电穿孔等方法。

本文还提供通过上述方法获得的转基因动物、转基因细胞.。

本文还提供一种治疗方法，其包括：(a)将转座子系统引入细胞中，从而生成遗传修饰的细胞，其包含由所述转座子引入的转基因；(b)将所述遗传修饰的细胞施用于需要所述治疗的患者。在一些实施方案中，所述患者已被诊断为患有癌症或肿瘤。在一些实施方案中，所述施用包括将所述遗传修饰的细胞输注到所述患者的血管中。

本发明还涉及本文所述的JL转座酶、其编码序列(DNA或RNA)或核酸构建物、细胞、或基因组编辑系统在制备产品中的用途，所述产品例如基因编辑试剂盒、工程化的免疫细胞或药物组合物。所述免疫细胞包含γδT细胞、辅助T细胞、记忆T细胞、自然杀伤T细胞、效应T细胞等。

本发明的范围还涵盖包含本文所述的JL转座酶、其编码序列(DNA或RNA)或核酸构建物、细胞、或基因组编辑系统的试剂盒。所述试剂盒还包含可被所述JL转座酶识别的转座子的编码核酸或其核酸构建物(例如包含所述转座子的DNA载体)、宿主细胞、适合宿主细胞的细胞培养基、细胞因子、使用说明书中的一种或多种。

药物组合物和施用

本发明的转座酶、核酸分子、转座子、转座子系统和细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如相关的细胞因子或细胞群结合施用。因此，本发明还提供包含本文所述方法制得的转座酶、核酸构建物、基因编辑系统或细胞和药学上可接受辅料的药物组合物。

本发明中，“药学上可接受的辅料”是用于将本发明的转座酶、核酸分子、转座子、转座子系统或细胞传送给动物或人的药学上或食品上可接受的载体、溶剂、悬浮剂或赋形剂。本文中，药学上可接受的辅料在所采用的剂量和浓度对所述组合物的接受者是无毒的。可包括本领域周知的治疗中常用于递送蛋白、核酸或细胞的各种类型的载体或赋形剂。示例性的辅料可以是液体或固体，包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，碳水化合物，佐剂，抗氧化剂，螯合剂，离子强度增强剂、防腐剂、载剂、助流剂、甜味剂、染料/着色剂、增味剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等渗剂、溶剂或乳化剂。在一些实施方案中，药学上可接受的辅料可以包括一种或多种非活性成分，包括但不限于：稳定剂、防腐剂、添加剂、佐剂、喷雾剂、压缩空气或其它适宜的气体，或其它适宜的与药效化合物合用的非活性成分。参见例如REMINGTON'SPHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版，A.R.Genrmo编，1990，Mack PublishingCompany。可视预期的施用途径、递送方式和所需的剂量来确定最佳的药物组合物。

可选择本发明的药物组合物用于肠胃外递送、用于吸入或通过消化道(诸如经口)递送，例如用于静脉输注递送。所述组合物的制备在本领域的技术内。其它药物组合物将为本领域技术人员显而易见，包括在持续或控制释放递送配制物中包含免疫细胞特别是免疫细胞(例如T细胞)的配制物。本发明的药物组合物还可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。

用于体内施用的药物组合物通常以无菌制剂的形式提供。通过经无菌过滤膜过滤来实现灭菌。用于肠胃外施用的组合物可以冻干形式或在溶液中(例如冻存制剂)储存。肠胃外组合物通常放在具有无菌进入孔的容器中，例如具有皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液带或小瓶。

药物组合物一经配制，就以溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体、晶体、冻存物或以脱水或冻干粉末的形式储存在无菌小瓶中。所述药物配制物(例如，冻存制剂)可储存成即用形式或在施用前进一步配制的形式。例如，适合递送本文所述药物组合物可以是冻存制剂，这样可以耐受远距离运输而不损伤细胞。除了细胞本身外，冻存制剂通常还包括细胞冻存液、人血清白蛋白(HSA)等组分。在施用前(例如静脉输注)，冻存的药物组合物需低温保存(例如置于液氮中)。冻存制剂解冻后可直接或者配制为输注组合物向患者输注。本领域技术人员知晓常规冻存液的组分和浓度。例如，冻存液或输注组合物还可包含二甲亚砜、氯化钠、葡萄糖、醋酸钠、氯化钾或氯化镁等，其浓度可由本领域技术人员(例如有经验的医师)根据细胞、疾病、患者等状况确定。

在本发明的一些实施方案中，本发明遗传修饰的细胞或其组合物可与本领域已知的其它疗法结合。

“患者”、“对象”、“个体”等等在本文中可交换使用，指可引起免疫应答的活有机体，如哺乳动物。例子包括但不限于人、狗、猫、小鼠、大鼠和其转基因物种。

应用

本文提供的主题可以广泛应用于与基因组编辑有关的应用，例如转基因生物体的制备、基因治疗、细胞治疗等。

一个非限制性实例涉及产生用于研究和临床应用的遗传修饰细胞。例如，如上所述，可以使用本文提供的主题制备遗传修饰的T细胞，其可以应用于帮助人们抵抗多种疾病，例如但不限于癌症和传染病。

一个具体实例包括使用本文提供的方法产生遗传修饰的原代白细胞，以及将所述遗传修饰的原代白细胞施用于有需要的患者。遗传修饰的原代白细胞的产生可以包括向白细胞中引入转座子系统，从而产生遗传修饰的白细胞。在许多情况下，该转座子可包含转基因。该转基因可以是细胞受体、免疫检查点蛋白质、细胞因子、抗体及其任意组合。有时，细胞受体可包括但不限于T细胞受体(TCR)、B细胞受体(BCR)、嵌合抗原受体(CAR)或其任意组合。在一些其它情况下，该转座子系统被设计用于删除或修饰内源基因，例如细胞因子、免疫检查点蛋白质、癌基因或其任意组合。原代白细胞的遗传修饰可以被设计为促进针对使患者处于患病状态的传染性病原体或癌细胞的免疫。

另一个非限制性实例涉及产生用于农业、食品生产、医药和药剂学的遗传修饰的生物体。可以遗传修饰的物种范围很广，包括但不限于植物和动物。遗传修饰的生物体，如遗传修饰的作物或牲畜，可以在其生理学性质的某些方面进行修饰。食用作物中的实例包括对某些害虫、病害或环境条件的抗性，腐败的减少，或对化学处理的抗性(例如对除草剂的抗性)，或改善作物的营养物质概况。非食用作物中的实例包括药剂、生物燃料和其它工业上有用的商品的生产，以及用于生物修复。牲畜中的实例包括对某些寄生虫的抗性、某些营养元素的产生、生长速率的增加和乳产量的增加。

本发明通过参考以下实验实施例进一步详细地进行描述。这些实施例仅出于说明性的目的提供，并不意欲为限制性的，除非另有规定。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为包括由于本文提供的教导变得显而易见的任何和全部的变化。实施例中所用的方法和试剂，除非另有说明，否则为本领域常规的方法和试剂。

实施例

本文采用到以下方法。

(1)用于JL突变体制备的定点诱变

High-Fidelity DNA Polymerase(New England BioLabs)用于所有定点诱变。对于单点突变，进行滚环PCR诱变后，使用DpnI限制性内切酶消化，取5μL消化反应产物在TOP10大肠杆菌感受态细胞中进行转化。对于组合突变，使用多个PCR反应诱变后，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天漠生物)纯化PCR产物，使用HieffPlus Multi OneStep Cloning Kit(YEASEN)对纯化的PCR产物进行10μL连接反应，取5μL连接反应产物在TOP10大肠杆菌感受态细胞中进行转化。对于每个突变体挑取3个单克隆进行培养，分别各取一半进行测序鉴定和保菌，对于鉴定序列正确的突变体使用NucleoBond Xtra MiDi EF质粒制备试剂盒(MACHEREY-NAGEL)制备用于转染的质粒。对质粒样品超螺旋比例和内毒素含量进行抽检鉴定。

(2)CHO细胞中的转座效率检测

在电转当天，将CHO-K1细胞用含0.25％EDTA的胰酶将细胞进行消化，收集离心后，用1×DPBS重悬计数，取1.5-2.5×10⁶的细胞，离心后去除上清液。按照Lonza2B电转试剂说明，取100ul的电转液，将4μg转座酶质粒与4μg转座子质粒与电转试剂混合后加入置离心后的细胞沉淀中，重悬后加入至电转杯中，放置于Lonza 2B电转仪中，设置电转程序为H-014。电转后将细胞转入已加入完全培养基的六孔板中培养。在电转后D5-D13天进行荧光拍照，流式检测转座酶在CHO-K1细胞中的转座效率。

(3)PBMC(外周血单个核细胞)细胞转座效率检测

在电转当天，将冻存的PBMC复苏后计数，取1×10⁷的细胞，离心后去除上清液。按照Lonza 2B电转试剂说明，取100ul的电转液，将4μg转座酶质粒与4μg转座子质粒与电转试剂混合后加入置离心后的细胞沉淀中，重悬后加入至电转杯中，放置于Lonza 2B电转仪中，设置电转程序为U-014。电转后将细胞转入已加入完全培养基(AIM-V+2％FBS)的六孔板中培养，补加500U/ml的IL-2。在电转后第5天进行转板，并于D5-D13天进行荧光拍照，计数，流式检测转座酶在PBMC细胞中的转座效率。

实施例1-6中的转座子质粒含有eGFP(在本文中也记载为GFP、EGFP)荧光蛋白表达框。

对于荧光拍照分析，通过在D5、D9、D13天时用奥林巴斯倒置荧光显微镜拍摄GFP荧光，曝光时间为500ms，拍摄倍率为100×，通过GFP荧光细胞数及荧光强弱评估转座酶在细胞中的转座效率。

对于流式细胞分析，通过检测在没有药物选择的情况下生长的细胞中的GFP荧光来评估该基因的稳定整合。在指定的时间点收获转染的细胞，用1×DPBS洗涤1次后，用500ul DPBS重悬加入流式管或96孔板中进行上机检测。使用Cytex的SpectroFlo分析细胞，使用FITC通道评估GFP表达。

(4)CHO细胞中转座酶突变体的筛选

在电转当天，将CHO-K1细胞用含0.25％EDTA的胰酶将细胞进行消化，收集离心后，用1×DPBS重悬计数，取1.5-2.5×10⁶的细胞，离心后去除上清液。按照Lonza2B电转试剂说明，取100ul的电转液，将4μg不同转座酶突变体质粒与4μg转座子质粒(例如：PPS-DT-GFP(ta))与电转试剂混合后加入置离心后的细胞沉淀中，重悬后加入至电转杯中，放置于Lonza 2B电转仪中，设置电转程序为H-014。电转后将细胞转入已加入完全培养基的六孔板中培养。在电转后D3-D14天进行荧光拍照，收获转染的细胞，用1×DPBS洗涤1次后，用500ulDPBS重悬加入流式管或96孔板中进行上机检测。使用Cytex的SpectroFlo分析细胞，使用FITC通道评估GFP表达。根据最终的转座效率来筛选评估不同转座酶突变体。

(5)PBMC细胞中转座酶突变体的筛选

在电转当天，将冻存的PBMC复苏后计数，取1×10⁷的细胞，离心后去除上清液。按照Lonza 2B电转试剂说明，取100ul的电转液，将4μg转座酶质粒与4μg转座子质粒(例如：PPS-DT-GFP(ta))与电转试剂混合后加入置离心后的细胞沉淀中，重悬后加入至电转杯中，放置于Lonza 2B电转仪中，设置电转程序为U-014。电转后将细胞转入已加入完全培养基(AIM-V+2％FBS)的六孔板中培养，补加500U/ml的IL-2。在电转后第5天进行转板，并于D3-D14天进行荧光拍照，计数，收获转染的细胞，用1×DPBS洗涤1次后，用500ul DPBS重悬加入流式管或96孔板中进行上机检测。使用Cytex的SpectroFlo分析细胞，使用FITC通道评估GFP表达。根据最终的转座效率来筛选评估不同转座酶突变体。

实施例1：融合功能性多肽提高PS转座酶的转座效率

试验目的：

转座酶要发挥转座活性时伴随有蛋白和DNA复合物的二聚化过程，这种二聚化效率可能因为天然转座酶的累积突变而降低效率，进而影响转座效率。如图3所示，亮氨酸拉链(leucine zipper)是一种在DNA结合蛋白质结构基元(motif)，常常含有规律性的亮氨酸残基。当来自同一个或不同多肽链的两个两用性的α-螺旋的疏水面相互作用形成一个圈对圈的二聚体结构(Coiled coil region)时就形成了亮氨酸拉链二聚体。本试验利用亮氨酸拉链多肽也有类似的DNA结合和二聚化特征，强化PS转座酶的二聚化效率达到提高转座效率的目的。

实验方法：

本实施例中pLoxP-mPS为野生型PS转座酶表达质粒(质粒图谱如图5所示，序列如SEQ ID NO：33所示)。野生型PS转座酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。融合多肽C/EBPO、LZIP、TEF的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:28、29、31所示，核苷酸序列分别如SEQ ID NO:34、35、37所示。转座子质粒PPS-DT-GFP(ta)的结构如图6所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO:38所示。

在pLoxP-mPS质粒中天然PS转座酶多肽基础上N端或C端融合不同种类的亮氨酸拉链结构域和/或C-myc NLS多肽，结构示意图如图7所示。融合型PS转座酶的转座效率按照本文所述CHO细胞转座效率的检测方法进行，通过荧光拍照和流式细胞术评估eGFP表达，验证亮氨酸拉链结构域对天然PS转座酶的影响。

试验结果

荧光照片及流式细胞检测结果如图8和表1所示。其中，ploxp-MPS是指无亮氨酸拉链结构域的转座酶质粒，ploxp-mps-TEF1、ploxp-mps-LZIP1、ploxp-mps-C/EBPO1是指亮氨酸拉链结构域在转座酶N端，ploxp-mps-C/EBPO2、ploxp-mps-LZIP2是指亮氨酸拉链结构域在转座酶C端，NTC是指对照组。质粒名称中的mps有时也写为mPS或MPS。本说明书及其附图中，一些质粒的命名的英文字母不区分大小写。从结果中可以看出，与野生型PS转座酶组7.17％相比较，N端融合LZIP、TEF、C/EBPO亮氨酸拉链结构域能够大幅提高转座效率，其中C/EBPO亮氨酸拉链结构域提升幅度最高，电转14天阳性率达到40.01％。

表1，融合多肽对PS转座效率的影响

转座酶质粒名称	14天阳性率(eGFP阳性细胞)
		ploxp-mps	7.17％
ploxp-mps-TEF1	13.30％
		ploxp-mps-LZIP1	15.20％
ploxp-mps-C/EBPO1	40.01％
		ploxp-mps-C/EBPO2	4.40％
ploxp-mps-LZIP2	4.21％
		NTC	0.17％

实施例2：优化转座子TIR元件DNA序列能继续提高融合多肽PS转座酶的转座效率

试验目的：优化TIR元件DNA序列及其侧翼的TA剪切识别序列重复多拷贝串联继续提高PS转座酶的转座效率。

试验方法：如图9所示，将质粒表达载体PPS-DT-GFP(ta)中转座子TIR元件DNA序列及其侧翼TA剪切识别序列进行n倍的序列重复多拷贝设计(本实施例中两端的TIR和TA进行相同的设计)，然后按照本文所述CHO/PBMC细胞转座效率的检测方法进行，通过荧光拍照和流式细胞术评估eGFP表达，验证TIR元件DNA序列优化是否能继续提高融合多肽的PS转座酶的转座效率。本实验只采用pLoxP-mPS-C/EBPO1这一种融合多肽的PS转座酶进行测试，其中转座子质粒PO-PST1-DCGEGFP和PO-PST2-DCGEGFP中的PST1、PST2分别代表(TIR)₁(TA)₂和(TIR)₂(TA)₂，由PPS-DT-GFP(ta)质粒按照图9所示改造TIR功能序列而来。ploxp-hTZB+pZB-dCGEGFP是指ZB转座子系统(参见CN105018523A)，简称ZB；pLoxP-fHyPB+pC23S-dCGEGFP是指高效hyPB转座子系统(参见CN105154473A)，简称PB。

CHO细胞试验中每个分组设置3个复孔，在转染后第3-14天通过荧光拍照和流式细胞方法检测；PBMC细胞试验中每个分组设置6个复孔，在转染后第5、第9、第13天通过荧光拍照和流式细胞方法检测，细胞中eGFP表达阳性率和表达量可以反映出转座效率是否提升。

试验结果

在CHO细胞中的结果如图10、表2所示。结果表明基于N端的亮氨酸拉链C/EBPO融合PS转座酶的基础上，优化出TIR元件DNA基序和/或TA基序的重复拷贝串联可以进一步提高转座子系统转座效率，且eGFP荧光强度更强。

表2优化TIR元件DNA基序在CHO细胞中的转座效果(阳性率)

分组	质粒	DAY7	DAY14
				(TIR)1(TA)2	ploxP-MPS-C/EBPO1+PO-PST1-DCGEGFP	60.7％	59.9％
(TIR)2(TA)2	ploxP-MPS-C/EBPO1+PO-PST2-DCGEGFP	84.4％	83.9％
				(TIR)1(TA)1	ploxP-MPS-C/EBPO1+PPS-DT-GFP(ta)	41.8％	41.3％
NTC	无	0.13	0

在PBMC细胞中的结果如图11所示。结果表明优化TIR元件DNA基序和/或TA基序的重复拷贝串联可以进一步提高转座子系统转座效率，且eGFP荧光强度更强，说明这种改进在原代免疫细胞中可以得到重复结果，且和融合型PS转座酶有协同增效作用。

与PB、ZB质粒相比较，pLoxP-mPS-C/EBPO1+PO-PST2-dCGEGFP的细胞阳性略高于PB组，但MFI略低于PB质粒。上述结果表明经过N端的亮氨酸拉链C/EBPO融合PS转座酶，和优化TIR基序和TA基序串联多拷贝的JL转座子系统的转座效率已与PB转座子系统相当。

实施例3：在CHO细胞中筛选高效基因整合的PS转座酶突变体

实施目的：

测试不同PS转座酶突变体在CHO细胞中的转座效率，鉴定高效转座整合的转座酶突变体。

实施方法

本实施例的验证体系的电转质粒包括含有融合野生型PS转座酶表达框的pLoxP-mPS-C-EBPO1及其突变质粒，和包含eGFP荧光蛋白表达框的转座子载体质粒PPS-DT-GFP(ta)。含有融合野生型PS转座酶的载体pLoxP-mPS-C-EBPO1序列如SEQ ID NO:39所示。根据SEQ ID NO:39的序列对相应突变位置氨基酸的密码子进行替换，可获得不同的工程化PS转座酶的载体序列。

为测试不同工程化PS转座酶突变体的转座效率，按照方法4使用电穿孔的方式将构建的工程化转座酶或转座子按一定质量比转染CHO细胞。用融合野生型PS转座酶和未融合的野生型PS转座酶(PS转座酶)作为对照转座酶一并转染CHO细胞。细胞在完全培养基中生长(没有药物选择)，并且在转染后第3-14天通过荧光拍照和流式细胞术评估eGFP表达。

实施结果

根据CHO细胞的试验结果，筛选出转座阳性率相较于融合野生型PS转座酶和和未融合的野生型PS转座酶有所提升的系列融合型PS转座酶突变体，如表3、表4和图12所示。

表3转染后14天优势突变体相对于融合野生型PS转座酶的效率提升

表中的C-EBPO1即为融合野生型PS转座酶mPS-C-EBPO1。

这些突变体中，A8S、I35V、Y46Q、TQS57-59KKA、M95L、I98K、R123H、Q136K、K16R、Q22K、E47K、K55R、TQ57-58RK、T129R、T129K、Q136K等具有明显提高的转座活性。尤其是PS转座酶双联DNA结合和寡聚化域区HTH结构中的氨基酸突变为带正电荷氨基酸如组氨酸(H)、赖氨酸(K)或精氨酸(R)时(如K16R、E32K、T57R、TQ57-58RK、TQS57-59KKA、I98K、R123H、T129K、T129R等)转座效率增加更为显著。

另外，部分融合型PS转座酶突变体的阳性率虽然相对于融合野生型PS转座酶未有所提升，但比野生型PS(mPS)有较大提升，结果如表4所示。

表4转染后14天部分突变体和野生型PS转座酶相对于融合野生型PS转座酶的效率提升

实施例4：在PBMC细胞中验证高效转座基因整合的PS转座酶突变体

实施目的：

将在CHO细胞中的3个优势突变体继续在原代免疫细胞PBMC中进行验证复核，验证突变体在不同类型或原代细胞中是否同样具有显著提升效果。

实验步骤：

本实施例的验证体系的电转质粒包括含有融合野生型PS转座酶表达框的pLoxP-mPS-C-EBPO1及其突变质粒，和包含eGFP荧光蛋白表达框的转座子载体质粒PPS-DT-GFP(ta)。

为测试优势工程化PS转座酶突变体的转座效率，按照方法5使用电穿孔的方式将构建的工程化转座酶或转座子按一定质量比转染PBMC细胞。用融合野生型PS转座酶和PiggyBac(hyPB)转座酶作为对照转座酶一并转染PBMC细胞。细胞在完全培养基中生长(没有药物选择)，并且在转染后第3-14天通过荧光拍照和流式细胞术评估eGFP表达。

实验结果：

电转后第7天和第14天分别取样，流式检测EGFP表达情况，分析数据为第14天样本。如图13所示，综合3组PBMC的细胞数据，PS18，PS114，PS144，无论是以融合野生型PS还是ploxp-fHyPB为参照，阳性率和荧光强度均有一定程度提升。优势PS转座酶突变体18、114、144等基本可以维持在40％的水平，表达量较融合野生型PS转座酶增加一倍。

图14中A\B\C分别显示突变体和对照组的阳性率和eGFP表达水平；PS突变体相对于融合野生型PS转座酶的阳性率和eGFP表达水平提升幅度；PS突变体相对于高效hyPB转座酶的阳性率和eGFP表达水平提升幅度。

实施例5：含TIR DNA基序突变和/或多拷贝，融合突变型PS转座酶的JL转座系统的效率评价

实施目的：

1、将PS转座子TIR DNA基序进行突变在Hela细胞中评价筛选优势突变DNA基序；

2、将筛选到的优势突变TIR DNA基序按(TIR)n(TA)n的形式分组，联合使用融合突变型PS转座酶，最后评价筛选最优的JL转座系统。

试验方法：

构建起始转座子整合质粒pPG-PGK-NEO(PSTIR0)，质粒序列如SEQ ID NO：40所示、依次对TIR进行核苷酸突变分别构建pPG-PGK-NEO(PSTIR1)、pPG-PGK-NEO(PSTIR2)、pPG-PGK-NEO(PSTIR3)。将上述质粒pPG-PGK-NEO(PSTIR1)表示为1TA-1TIR1，按照(TIR)n(TA)n形式分别构建多拷贝串联转座子DNA功能元件：1TA-2TIR1、2TA-1TIR1、2TA-2TIR1、2TA-2TIR1、4TA-1TIR1、4TA-2TIR1。本实施例中两端的TIR和TA进行相同的设计。本实施例中所使用的转座酶质粒为pLoxP-mPS-C-EBPO1中PS转座酶氨基酸突变为PS18突变体序列，即转座酶为N端融合了C-EBPO的PS18突变体。

表6

TIR序号	核苷酸序列
		野生型TIR，PSTIR0	cctaccgtattttccgcactataaggcgcacc(SEQ ID NO:2)
突变TIR，PSTIR1	cctaccgtattttccgcactataagAcgcacc(SEQ ID NO:4)
		突变TIR，PSTIR2	cctaccgtattttccgcaGtataaggcgcacc(SEQ ID NO:5)
突变TIR，PSTIR3	cctaccgtattttccgGactataaggcgcacc(SEQ ID NO:6)

将Hela细胞培养条件10％胎牛血清，0.1mg/mL的青链霉素的高糖培养基DMEM(Gibco，美国)，培养在37℃，5％ CO2细胞培养箱中。在转染前一天以3×10⁵/孔的密度将细胞铺在六孔板上，每组设置三个重复孔。将按照1：5的比例，与Transfectamine 5000转染试剂(AAT Bioquest，美国)混合，并按照说明书进行转染。细胞转染24h后，每孔接种1％细胞至10cm皿中培养。细胞长至10％时，将培养基更换为600ng/μL的G418筛选培养基。此后每三天更换一次筛选培养基，大约2周左右，对照组细胞完全死亡后，对各组进行吉姆萨染色以便于计数。计数时使用ImageJ软件，数据统计分析时使用GraphPad软件。

试验结果：

如图16所示，本实施例证明设计TIR DNA基序核苷酸突变，转座子仍然可以实现转座整合功能，其中TIR1突变可以实现转座效率的提升。如图17所示，将优势筛选TIR1 DNA基序功能元件多拷贝组合串联，可以进一步提高转座系统的基因整合转座效率。

实施例6：工程化JL转座酶mRNA和序列优化的转座子TIR功能序列在PBMC上的转座整合效率评价

1、试验目的：

验证工程化JL转座子系统以JL转座酶mRNA联合使用不同质粒类型转座子整合质粒的效果。

2、试验方法：

选择实施例5中融合型PS18转座酶突变体构建mRNA合成DNA转录模板，按照中国专利CN115197327A RNA修饰嵌合蛋白及其应用中所述合成纯化PS18 mRNA。融合型PS18转座酶突变体PS18 mRNA的序列如SEQ ID NO：41所示。

构建不同质粒类型转座子整合质粒，其中pTini-DPS(CES)-dCGEGFP为无抗微质粒(在实施例中也称为微质粒或太质粒)，其复制子为R6K，并含有抗毒素蛋白的编码序列(抗毒素蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：52所示)，序列如SEQ ID NO：42所示，pTini-DPS(CES)-dCGEGFP含有上述(TIR)₂(TA)₂，与pO-PST2-dCGEGFP的区别在于将标准STD质粒替换为无抗微质粒；pO-PST2-dCGEGFP序列参见上述实施例2，PC23S-dCGEGFP为含有PB转座子TIR的标准STD质粒，序列如SEQ ID NO：43所示。

为测试优势融合型PS转座酶突变体mRNA的转座效率，按照方法5使用电穿孔的方式将构建的工程化转座酶或转座子按一定质量比转染PBMC细胞。用WT PS转座酶和PiggyBac(hyPB)转座酶作为对照转座酶一并转染PBMC细胞。细胞在完全培养基中生长(没有药物选择)，并且在转染后第3-14天通过荧光拍照和流式细胞术评估eGFP表达。分组及质粒使用剂量如下表7所示，mRNA使用剂量为20μg。

表7分组及质粒使用剂量

试验结果

如图18所示，JL转座酶mRNA+JL转座子微质粒分组表现出最好的转座效率和整合基因表达水平。JL转座酶mRNA+JL转座子微质粒分组优于JL转座酶mRNA+标准STD质粒分组；JL转座酶mRNA整体优于对照组PB mRNA组。这表明新型JL转座酶以mRNA的形式联合使用微质粒转座子质粒可以进一步提高JL转座子的整体效率。

实施例7：工程化JL转座子系统用于CAR-T免疫细胞的制备及效率评价

试验目的

验证JL转座子系统在CAR-T免疫细胞制备中的转座整合效率和转基因表达量。

试验方法

本实验所使用质粒及分组情况如下表8所示，对应的质粒pC23S-1444-8E、pC24S-1194、pTini-PS(DTS)-1444-8E、pTini-PS(CIT)-1194、pC23S-EGFP-8E的序列分别如SEQ IDNO:44-48所示，其中太质粒中的JL转座子含有(TIR)₁(TA)₂。本实验所用的mRNA与实施例6相同，具体CAR-T为自分泌PD-1纳米抗体的MSLN CAR-T，如专利CN202111681582.0所述，本实施例中用的CAR-T为专利CN202111681582.0的实施例6中的自分泌PD1纳米抗体1194nla的含有间皮素纳米抗体MSLN3[1444]的CAR-T细胞(简称“1444+1194nla”或“1444-1194”)。其中设置PB对照组。

按照方法5使用电穿孔的方式将构建的工程化转座酶或转座子按一定质量比转染PBMC细胞。用PiggyBac(hyPB)转座酶作为对照转座酶一并转染PBMC细胞。细胞在完全培养基中生长(没有药物选择)，并且在转染后第3-14天通过荧光拍照和流式细胞术评估CAR基因表达，ELISA方法检测抗体分泌表达水平。分组及质粒使用剂量如下表所示，mRNA使用剂量为20μg。

表8质粒及分组情况

试验结果

如图19所示，从CAR阳性率、表达水平、阳性细胞总数和绝对数指标上看，JL转座酶都显示出更高效，其中阳性率和表达水平呈剂量依赖性提升，同等转基因效果前提下，采用无抗微质粒为供体DNA时JL转座酶和转座子质粒剂量远低于经典的hyPB系统；表9显示了第3-9天的PD-1纳米抗体表达量，从表9可以看出，使用本发明的JL转座子系统结合无抗微载体(太质粒)，与PB转座子系统相比，可以在减少质粒的用量的同时还大幅度提高自分泌抗体基因的表达水平。

表9D3-D9的自分泌PD-1纳米抗体表达量

综上，新型JL转座子系统(尤其是以无抗微质粒为载体)用于免疫细胞CAR-T制备表现出良好的性能，整体效果远超目前的金标准piggybac转座子系统。无论是基因整合转座效率，转基因表达水平都远高于PB对照组。以无抗微质粒作为转座子供体DNA时，新型高效JL转座子系统在效率和给药剂量上均有优势。

Claims (22)

1.一种转座酶，其为突变转座酶或者融合转座酶，

所述突变转座酶与如SEQ ID NO：1所示的野生型PS转座酶相比，含有氨基酸突变，所述氨基酸突变为野生型PS转座酶双联DNA结合和寡聚化域中的任意一个或多个氨基酸突变为带正电荷氨基酸；和/或所述氨基酸突变包括选自下组的一个或多个突变：TQS57-59KKA、T129R、T129K、I98K、TQ57-58RK、TQ57-58RK\T129K、TQ57-58RK\T129R、E32K、E32K\T129K、E32K\T129R、TQ57-58RK\I98K、TQ57-58RK\I98K\T129K、TQS57-59KKA\I98K、TQS57-59KKA\I98K\T129K、R123H、Q136K、K16R、E47K、TQ57-58RR、E32K\T57R\Q58R、T57R、T57K、Q58K、Q58R、S59A、M95L、Y46Q、A8S、T187K、I35V、N199H、N193S、T350S、Q22K、T368E、N213D、H24R、T150A、H165D、K55R、K73R、L228M、E335S、K159H、V359L、T129Q、H215K、R51K、A84L、Q69E、I284L、K45R、H215E、H215Q、I237V；

所述融合转座酶为在野生型PS转座酶或其突变体上融合了功能多肽，所述功能多肽为DNA序列特异性或非特异性结合域和/或细胞核定位信号结构域。

2.如权利要求1所述的转座酶，所述突变体与如SEQ ID NO：1所示的野生型PS转座酶相比，包括选自下组的一个或多个突变：TQS57-59KKA、T129R、T129K、I98K、TQ57-58RK、TQ57-58RK\T129K、TQ57-58RK\T129R、E32K、E32K\T129K、E32K\T129R、TQ57-58RK\I98K、TQ57-58RK\I98K\T129K、TQS57-59KKA\I98K、TQS57-59KKA\I98K\T129K、R123H、Q136K、K16R、E47K、TQ57-58RR、E32K\T57R\Q58R、T57R、T57K、Q58K、Q58R、S59A、M95L、Y46Q、A8S、T187K、I35V、N199H、N193S、T350S、Q22K、T368E、N213D、H24R、T150A、H165D、K55R、K73R、L228M、E335S、K159H、V359L、T129Q、H215K、R51K、A84L、Q69E、I284L、K45R、H215E、H215Q、I237V、Q69R、L100I、K96R、Q162R、A271K、R372K、H20Y、TYCR150-153KFVI、N232K、A363N、A377C、Q346M、A17V、N105G、Q76E、I354V、VS133-134IA、S253K、V370I、SV297-298TE、EH286-286DS、A352S、ANS241-243VHE、S297T、A79I、T147S、I178M、I276V、Q331E、R257E、T339S、A79V、H104L、V74L、S107E、Q142E、R375K、S243E、R195K、Q22E、A328Q、G111A、R110K、I365V、VTE380-382SNA、R190K、RA372-373KS、K73L、K121R、R102K、C152V、IY276-277VW、V292I、K73E、H104M、I239V、K42E、K356Q、T150K、G316S、IY259-260VW、V53M、E108D、V53L、DKV72-74EEL、M280F、S85G、N63K、V91L、K251L、H124N、K308S、N10D、H7R、G112S、H7K、TA327-328KE。

3.如权利要求1或2所述的转座酶，所述突变体与如SEQ ID NO：1所示的野生型PS转座酶相比，包括选自下组的一个或多个突变：TQS57-59KKA、T129R、T129K、I98K、TQ57-58RK、TQ57-58RK\T129K、TQ57-58RK\T129R、E32K、E32K\T129K、E32K\T129R、TQ57-58RK\I98K、TQ57-58RK\I98K\T129K、TQS57-59KKA\I98K、TQS57-59KKA\I98K\T129K、R123H、Q136K、K16R、E47K、TQ57-58RR、E32K\T57R\Q58R、T57R、T57K、Q58K、Q58R、S59A、M95L、Y46Q、A8S、T187K、I35V、N199H、N193S、T350S、Q22K、T368E、N213D、H24R、T150A、H165D、K55R、K73R、L228M、E335S、K159H、V359L、T129Q、H215K、R51K、A84L、Q69E、I284L、K45R、H215E、H215Q、I237V、Q69R、L100I、K96R、Q162R、A271K、R372K、H20Y、TYCR150-153KFVI、N232K、A363N、A377C、Q346M、A17V、N105G、Q76E、I354V、VS133-134IA、S253K、V370I、SV297-298TE、EH286-286DS、A352S、ANS241-243VHE、S297T、A79I、T147S、I178M、I276V、Q331E、R257E、T339S、A79V、H104L、V74L、S107E、Q142E、R375K、S243E、R195K、Q22E、A328Q、G111A、R110K、I365V、VTE380-382SNA。

4.如权利要求1-3任一项所述的转座酶，其特征在于，所述DNA序列特异性或非特异性结合域包含亮氨酸拉链结构域、CRISPR/Cas结构域、TALE域、锌指域、AAV Rep DNA结合域或其任意组合，优选地，所述亮氨酸拉链结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:28-31任一所示，和/或

所述细胞核定位信号结构域包括SV40 NLS、C-myc NLS、TAF1 NLS、TP53 NLS、STAT3NLS或其任意组合，和/或

所述功能多肽与野生型PS转座酶或其突变体之间包含或不包含连接体连接。

5.编码权利要求1-4中任一项所述的转座酶的多核苷酸；优选地，所述多核苷酸是DNA或信使RNA。

6.一种转座子，其可被权利要求1-4中任一项所述的转座酶识别，所述转座子具有选自如下的(1)至(3)的任一项、两项或三项特征：

(1)所述转座子具有突变末端反向重复序列，所述突变末端反向重复序列与SEQ IDNO：2或3所示的野生型PS转座子末端反向重复序列相比具有1-5个核苷酸突变；

(2)所述转座子在至少一端具有两个以上的末端反向重复序列；

(3)所述转座子在至少一端的末端反向重复序列外侧具有两个以上的TA序列的重复。

7.如权利要求6所述的转座子，所述突变末端反向重复序列如SEQ ID NO:4-27任一所示，优选如SEQ ID NO:4-6任一所示，或为含有SEQ ID NO:3-27中核苷酸突变的任意组合突变的核苷酸序列，或为它们的反向互补序列。

8.如权利要求6或7所述的转座子，所述转座子在两端各具有两个末端反向重复序列，且在两端的末端反向重复序列外侧各包括四个TA序列重复。

9.如权利要求6-8中任一项所述的转座子，所述转座子包括位于末端反向重复序列之间的目的基因表达框，优选地，所述目的基因编码选自细胞受体、免疫检查点蛋白质、细胞因子、T细胞受体、B细胞受体、嵌合抗原受体及其任意组合的蛋白质。

10.一种转座子系统，包括权利要求1-4中任一项所述的转座酶或权利要求5所述的编码所述转座酶的多核苷酸；和转座子，所述转座子为PS转座子或权利要求6-9中任一项所述的转座子。

11.如权利要求10所述的转座子系统，编码所述转座酶的多核苷酸是mRNA，优选地，所述mRNA化学修饰的，包括但不局限于假尿苷(ψ)，N1-甲基假尿苷(m1ψ)，5-甲基胞嘧啶核苷(m5C)，5-甲氧基尿苷(5moU)等。

12.如权利要求10或11所述的转座子系统，编码所述转座酶的多核苷酸和/或所述转座子存在于DNA载体中，优选地，所述DNA载体为质粒载体或小环DNA载体，优选为无抗微质粒载体；和/或所述DNA载体为微载体，其骨架序列长度在600bp以内，减少和/或不含CpG DNA基序；或者

编码所述转座酶的多核苷酸和/或所述转座子存在于病毒载体中，优选地，所述病毒载体选自腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、单纯疱疹病毒载体或痘苗病毒载体。

13.如权利要求12所述的转座子系统，编码所述转座酶的多核苷酸和所述转座子存在于同一载体或不同载体中。

14.一种宿主细胞，包含或能产生权利要求1-4任一项所述的转座酶、权利要求5所述的多核苷酸、权利要求6-9中任一项所述的转座子、或权利要求10-13任一项所述的转座子系统。

15.一种制备细胞的方法，包括：将权利要求1-4任一项所述的转座酶、权利要求5所述的多核苷酸、权利要求6-9中任一项所述的转座子、或权利要求10-13任一项所述的转座子系统引入细胞中的步骤，

优选地，

所述引入包括使所述细胞与所述多核苷酸接触，和/或

所述引入包括使所述细胞与含有所述转座子的DNA载体接触，和/或

所述引入包括使所述细胞与编码所述转座酶的mRNA和含有所述转座子的质粒载体接触，和/或

所述引入包括使所述细胞与含有所述多核苷酸和所述转座子的质粒载体接触，和/或

所述引入包括使所述细胞与含有所述多核苷酸的质粒载体和含有所述转座子的质粒载体接触，和/或

所述引入包括使所述细胞与所述转座酶接触。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述细胞来自动物，例如脊椎动物或无脊椎动物，优选哺乳动物，进一步优选人；和/或所述细胞是免疫细胞，优选T细胞。

17.如权利要求15或16所述的方法，其特征在于，所述引入包括借助电穿孔、显微注射、磷酸钙沉淀、阳离子聚合物、树状聚体、脂质体、脂质纳米颗粒、微粒轰击、fugene、直接声波加载、细胞挤压、光学转染、原生质体融合、impalefection、磁转染、核转染、病毒介导的转化或其任意组合转染所述细胞。

18.如权利要求16或17所述的方法，其特征在于，所述引入包括对所述细胞进行电穿孔。

19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述引入包括使细胞与编码权利所述转座酶的mRNA和含有所述转座子的质粒接触，优选地，所述质粒为微载体，其骨架序列长度在600bp以内，减少和/或不含CpG DNA基序，和/或所述质粒为无抗微质粒。

20.一种试剂盒，其包含：权利要求1-4任一项所述的转座酶、权利要求5所述的多核苷酸、权利要求6-9中任一项所述的转座子、或权利要求10-13任一项所述的转座子系统、或权利要求14所述的细胞。

21.一种药物组合物，其包含药学上可接受的辅料和权利要求15-19任一项所述的方法制备的细胞。

22.权利要求1-4任一项所述的转座酶、权利要求5所述的多核苷酸、权利要求6-9任一项所述的转座子、权利要求10-13任一项所述的转座子系统、权利要求14所述的细胞、或权利要求21所述的药物组合物的应用，其选自如下的(1)-(6)中任一项：

(1)在制备将目的基因表达框整合到宿主细胞基因组的药物或者试剂中的应用；

(2)在制备将目的基因表达框整合到宿主细胞基因组的工具的应用；

(3)在制备转基因动物、转基因细胞中的应用；

(4)在制备基因组研究、基因治疗、细胞治疗或者干细胞诱导和诱导后分化的药物或制剂中的应用；

(5)在制备基因组研究、基因治疗、细胞治疗或者干细胞诱导和诱导后分化的工具的应用；

(6)在制备试剂盒、工程化的免疫细胞或药物组合物的应用。