CN118460684A - 一种用于检测rna干扰靶基因后最佳取样时间点的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测RNA干扰靶基因后最佳取样时间点的方法及其应用，首先根据靶基因设计干扰靶位点，合成靶位点的引物；利用引物合成双链小干扰RNA；将体外转录获得的双链小干扰RNA注射到实验材料；对实验材料进行取样：取一次干扰前的样品，然后注射干扰试剂后，每隔24h取一次样，连续取5个时间点，直至干扰后120h；将RNA反转录成cDNA；获得双链小干扰RNA留存量和靶基因相对表达量之间的关系，获得最佳取样时间点。通过构建的本发明RNA干扰的方法能够确定最佳取样的时间点。利用本发明的技术方案，能够为不同组织的靶基因干扰后，获得最佳取样点提供指导作用。
Description
技术领域
本发明属于生物基因技术领域，具体涉及一种用于检测RNA干扰靶基因后最佳取样时间点的方法及其应用。
背景技术
三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）属甲壳纲、十足目、梭子蟹科，俗称梭子蟹，是我国重要的海水经济蟹类。三疣梭子蟹生长性状具有明显的性别二态性。研究生殖及生长相关基因的功能能够为分子育种提供靶标基因。RNA干扰技术是研究三疣梭子蟹的重要手段。
RNA干扰（RNA interference , RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已经被广泛应用于探索基因功能和疾病等领域。RNA干扰在甲壳动物基因功能研究方面有重要应用。然而，对于干扰个体注射双链短RNA之后，短链RNA能够在体内存在多久，什么时间发挥作用，什么时间是最佳取样时间点，干扰后不同组织的最佳取样时间点缺乏理论依据，这些问题一直是开展RNA干扰的核心问题。
发明内容
本发明的目的是提供了一种用于检测RNA干扰靶基因后最佳取样时间点的方法及其应用，本发明通过注射短双链小干扰RNA对靶基因干扰后，确定不同组织的最佳取样时间点。利用本发明提供的技术方案，通过检测双链小干扰RNA存留量和靶基因的表达量来确定该组织的最佳取样时间点，对于RNA干扰技术的实施具有重要指导意义。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了一种用于检测RNA干扰靶基因后最佳取样时间点的方法，所述方法包括以下步骤：
（1）根据靶基因设计干扰靶位点，合成靶位点的引物；利用引物合成双链小干扰RNA；
（2）将体外转录获得的双链小干扰RNA注射到实验材料内；
（3）对实验材料进行取样：取一次干扰前的样品，然后注射干扰试剂后，每隔24h取一次样，连续取5个时间点，直至干扰后120h；
（4）将RNA反转录成cDNA；
（5）通过荧光定量PCR检测双链小干扰RNA的留存量和靶基因的相对表达量；根据双链小干扰RNA留存量和靶基因相对表达量之间的关系，获得最佳取样时间点。
进一步的，所述步骤（1）中经过退火生成转录模版和利用转录模版进行体外转录生成双链小干扰RNA。
进一步的，所述步骤（2）中注射的剂量浓度为0.9-1.1μg/g。
进一步的，所述步骤（5）中在进行RNA干扰之后，双链小干扰RNA的留存量降低，靶基因的表达量逐渐降低；当双链小干扰RNA留存量低到一定程度后，靶基因的表达量后面会随着时间的推移逐渐升高，选取靶基因的表达量从最低开始逐渐升高的转折点对应的时间点为最佳取样点。
本发明还提供了所述的方法在检测双链小干扰RNA干扰靶基因后最佳取样时间点中的应用。
进一步的，所述双链小干扰RNA在梭子蟹促雄性腺中发挥干扰作用的最佳取样时间点为注射后48h。
进一步的，所述双链小干扰RNA在梭子蟹精巢中发挥干扰作用的最佳取样时间点为注射后48h。
进一步的，所述双链小干扰RNA在梭子蟹肌肉中发挥干扰作用的最佳取样时间点为注射后72h。
进一步的，所述动物为甲壳类动物。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和技术效果：本发明以三疣梭子蟹为研究对象，以内参基因actin为靶基因，通过注射双链小干扰RNA对actin进行干扰；检测促雄性腺（AG）、精巢、肌肉组织中双链小干扰RNA的存留量和靶基因actin的表达量，通过构建的本发明RNA干扰的方法确定最佳取样的时间点。利用本发明的技术方案，能够为不同组织的靶基因干扰后，最佳取样点提供指导作用，具有重要的现实操作意义。
附图说明
图1是促雄性腺（AG）中miRNA的存留量和靶基因的表达量，其中，A. miRNA在促雄性腺（AG）中的存留量；B. actin基因的表达量；
图2是精巢（Te）中miRNA的存留量和靶基因的表达量，其中，A. miRNA在精巢（Te）中的存留量；B靶基因actin的表达量；
图3是肌肉（Mu）中miRNA的存留量和靶基因的表达量，其中，A. miRNA在肌肉（Mu）中的存留量；B靶基因actin的表达量。
具体实施方式
结合以下具体实例对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学试剂公司购买。
实施例1：
1、实验材料
实验材料来源于昌邑市海丰水产养殖有限责任公司的三疣梭子蟹黄选系列核心育种群，180日龄，体重在150g左右。饲养条件：自然海水，18℃，暂养2 d，连续充气，每天定时投喂蛤蜊，换水清污。
2、合成双链小干扰RNA
（1）根据NCBI数据库中三疣梭子蟹靶标基因actin基因序列设计干扰靶位点：CCCGCCAUGUACGUAACAATT；UUGUUACGUACAUGGCGGGTT。
委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成靶位点的引物序列如下：
A1：GATCACTAATACGACTCACTATAGGGCCCGCCATGTACGTAACAATT；
B2：GATCACTAATACGACTCACTATAGGGTTGTTACGTACATGGCGGGTT；
A2：AATTGTTACGTACATGGCGGGCCCTATAGTGAGTCGTATTAGTGATC；
B1：AACCCGCCATGTACGTAACAACCCTATAGTGAGTCGTATTAGTGATC。
（2）采用试剂盒（诺唯赞，TR102）按照如下体系退火成两个转录模板：
模板A1和A2，模板B1和B2之间必须互补配对。
退火程序为：95℃ 2min；95~22℃，0.1℃/sec；22℃10min。退火后分别得到两个10μM的DNA模板（模板A和模板B）。
（3）按下表配置反应体系进行体外转录：
37℃反应4h。
按下表配制双酶消化体系除掉DNA模板和单链RNA产物：
37℃消化30 min，电泳检测转录产物合格。
（4）磁珠法纯化RNA
将RNA Clean Beads从4℃取出，放置室温平衡30 min。使用前请颠倒或涡旋混匀。向转录产物中加入80 μl的磁珠溶液，用移液器吹打10次以上使溶液充分混匀；再加入200μl的异丙醇，再充分混匀。室温孵育8 min。将PCR管置于磁力架上约5 min，待溶液澄清后，移除上清液。保持PCR管始终处于磁力架上，加入200 μl新配制的80%乙醇，室温孵育30sec，移除上清。再重复加入80%乙醇步骤一次。开盖空气干燥至磁珠表面无水光。将PCR管从磁力架上取下，加入40 μl的RNase-free H2O，用移液器将管壁上的磁珠吹打下来，充分混匀，并室温孵育3 min。将PCR管置于磁力架上，待溶液澄清后，将上清转移至新的RNase-free EP管中。分光光度计测量浓度。
3、注射干扰
将所述体外转录获得的双链小干扰RNA（miRNA）用RNase-free H2O稀释到1000ng/μl。根据每只梭子蟹体重，按1μg/g的剂量注射到梭子蟹的游泳足肌肉中，共注射25只作为实验组；对照组注射等量的生理盐水，共注射25只。整个实验过程都保持充氧，每天投喂适量蛤蜊。
4、实验取样
先取一次干扰前的样品，自注射干扰后开始计时，每隔24h取一次样，分别取促雄性腺（AG）、精巢和肌肉3种组织，液氮速冻，实验组和对照组各有3个生物学重复。连续取5个时间点，直至干扰后120h。用全式金总RNA提取试剂盒提取总RNA，具体实验步骤如下：
（1）在上述各离心管中加入1ml TransZol Up和0.2ml RNA Extraction Agent。于高通量冷冻研磨仪（型号为Xinyi-24N）中研磨。
（2）在高速低温冷冻离心机（型号为CF1524R）中10,000×g 4℃离心15min。
（3）转移上层无色的水相于新离心管中，加入等体积的无水乙醇，轻轻颠倒混匀，然后全部加入到离心柱中，12,000×g室温离心30sec，弃掉流出液（由于体积大于离心柱容量，此步分多次完成）。
（4）加Clean Buffer 9 (CB9)，室温12,000×g离心30sec，弃掉流出液。重复一次。
（5）加入Wash Buffer 9 (WB9)室温12,000×g离心30sec，弃掉流出液。重复一次。
（6）室温12,000×g离心2分钟，彻底去除残留的乙醇。
（7）将离心柱放入RNase-free Tube中，加30 μl RNase-free Water在离心柱的中央，室温静置1分钟。
（8）室温12,000×g离心1分钟，洗脱RNA。重复该步骤一次。利用Nanodrop检测RNA的浓度和纯度(OD260/280比值)，-80℃保存。
5、将RNA反转录成cDNA
（1）采用TaKaRa Mir-X™试剂盒对MicroRNA (miRNA)进行反转录，得到双链小干扰RNA对应的cDNA，用于检测干扰合成的双链小干扰RNA存留量（降解情况）。
使用 DNase I 处理 RNA 样品，在冰上配置如下反应体系：
将上述反应液置于PCR仪中，37℃反应30min，然后加入0.5M EDTA，1μl，80℃反应2min灭活 DNase I。经过经DNase I 处理过的 RNA可以直接进行加 A 尾以及反转录反应，配制如下反应体系：
将上述反应液置于PCR仪中37℃ 1h，85℃ 5min。反应完成后加入 90 μl ddH2O至终体积为 100 μl，即可得到双链小干扰RNA反转后的cDNA。
（2）采用TaKaRa PrimeScript™试剂盒对总RNA进行反转录，得到cDNA，用于检测actin的表达量。
首先去除基因组DNA，在冰上配制如下反应体系：
将上述反应液置于PCR仪中，42℃反应2min。然后继续以该步反应液配制如下反应体系进行反转录反应：
将上述反应液置于PCR仪中37℃ 15min，85℃ 5sec。将反应产物稀释3倍做actin定量反应中的模板。
6、实时荧光定量PCR
通过荧光定量试剂盒分别检测双链小干扰RNA的存留量和actin的相对表达量，对应的内参基因分别为U6和18S rRNA，引物序列见表1，采用2-ΔCt法进行分析。具体步骤如下，样品qPCR反应按以下试剂体系配制：
反应条件均为：95℃，30sec；（95℃，5sec；60℃，30sec）×45 Cycles；95℃，15sec；60℃，1min；95℃，15sec；60℃，15sec。
表1 qPCR所涉及到的引物序列
7、实验结果
（1）在促雄性腺（AG）中，双链小干扰RNA在注射后24h存留量最高，后面随着时间的推移逐渐降解（图1A），72h后几乎没有；actin基因在48h表达水平最低，干扰效果较好，后面随着时间推移表达水平升高（图1B）。综合miRNA的存留量与actin基因表达量之间的关系，48h应该是促雄性腺中干扰后的最佳的取样时间点。
（2）在精巢中，双链小干扰RNA在注射后24h存留量最高，后面随着时间的推移逐渐降解（图2A）；actin基因在48h表达水平最低，后面随着时间推移表达水平升高（图2B）。综合miRNA的存留量与actin基因表达量之间的关系，48h应该是精巢中干扰后的最佳的取样时间点。
（3）在肌肉中，双链小干扰RNA在注射后48h存留量最高，后面随着时间的推移逐渐降解（图3A）；actin基因在48h和72h表达水平最低，干扰效果较好，后面随着时间推移表达水平升高（图3B）。综合miRNA的存留量与actin基因表达量72h应该是肌肉中干扰后的最佳取样时间点。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
Claims (9)
1.一种用于检测RNA干扰靶基因后最佳取样时间点的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）根据靶基因设计干扰靶位点，合成靶位点的引物；利用引物合成双链小干扰RNA；
（2）将体外转录获得的双链小干扰RNA注射到实验材料内；
（3）对实验材料进行取样：取一次干扰前的样品，然后注射干扰试剂后，每隔24h取一次样，连续取5个时间点，直至干扰后120h；
（4）将RNA反转录成cDNA；
（5）通过荧光定量PCR检测双链小干扰RNA的留存量和靶基因的相对表达量；根据双链小干扰RNA留存量和靶基因相对表达量之间的关系，获得最佳取样时间点。
2.根据权利要求1所述的用于检测RNA干扰靶基因后最佳取样时间点的方法，其特征在于，所述步骤（1）中经过退火生成转录模版和利用转录模版进行体外转录生成双链小干扰RNA。
3.根据权利要求1所述的用于检测RNA干扰靶基因后最佳取样时间点的方法，其特征在于，所述步骤（2）中注射的剂量浓度为0.9-1.1μg/g。
4.根据权利要求1所述的用于检测RNA干扰靶基因后最佳取样时间点的方法，其特征在于，所述步骤（5）中当双链小干扰RNA留存量低到一定程度后，靶基因的表达量后面会随着时间的推移逐渐升高，选取靶基因的表达量从最低开始逐渐升高的转折点对应的时间点为最佳取样点。
5.权利要求1所述的方法在检测双链小干扰RNA干扰靶基因后最佳取样时间点中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述双链小干扰RNA在梭子蟹促雄性腺中发挥干扰作用的最佳取样时间点为注射后48h。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述双链小干扰RNA在梭子蟹精巢中发挥干扰作用的最佳取样时间点为注射后48h。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述双链小干扰RNA在梭子蟹肌肉中发挥干扰作用的最佳取样时间点为注射后72h。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述动物为甲壳类动物。
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| CN202410695332.XA CN118460684A (zh) | 2024-05-31 | 2024-05-31 | 一种用于检测rna干扰靶基因后最佳取样时间点的方法及其应用 |
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Family Applications (1)
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| CN202410695332.XA Pending CN118460684A (zh) | 2024-05-31 | 2024-05-31 | 一种用于检测rna干扰靶基因后最佳取样时间点的方法及其应用 |
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2024
- 2024-05-31 CN CN202410695332.XA patent/CN118460684A/zh active Pending
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