CN118459577A - 逆转录包膜蛋白GALV env蛋白及其抗体的制备 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物制药技术领域，具体涉及一种逆转录包膜蛋白GALV env蛋白及其抗体的制备。本发明制备得到GALV env蛋白和抗GALV env的兔单克隆抗体C9、F8、H6抗体。上述GALV env蛋白的制备包括合成GALV env蛋白基因，然后通过分子克隆重组表达得到。上述抗GALV env的兔单克隆抗体的制备通过以GALV env蛋白为抗原，经兔子免疫后，取血清进行特异B细胞富集，然后经培养筛选以及分子克隆重组表达得到。上述制备得到的抗GALV env的兔单克隆抗体包括C9、F8、H6抗体，可用于开发检测逆转录病毒的方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物制药技术领域，具体涉及一种逆转录包膜蛋白GALV env蛋白及其抗体的制备。
背景技术
目前用于CAR-T细胞生产的逆转录病毒载体是一种包括基于莫洛尼鼠白血病病毒的gag-pol (MuLV-gag-pol) 和长臂猿白血病病毒的胞膜蛋白（GALV env）所构建的复制缺陷型病毒。GALV env是位于病毒粒子表面的膜糖蛋白，能介导病毒颗粒附着在宿主细胞表面，进而与宿主细胞膜表面受体融合，在病毒感染宿主细胞过程中发挥重要作用。如果上述逆转录病毒载体缺失GALV env，就无法获得包膜蛋白，也就无法形成病毒颗粒来实现基因的转移，因此GALV env在基因治疗中具有重要意义。
因此，可通过识别GALV env对上述逆转录病毒进行检测，但目前尚未见到可识别GALV env的抗体，本发明通过制备GALV env抗原蛋白，进行动物免疫，收获可识别GALV env的兔单克隆抗体，该抗体将可用于开发检测逆转录病毒的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种逆转录包膜蛋白GALV env蛋白及其抗体的制备。
为解决上述技术问题，本发明通过合成GALV-env蛋白基因并构建质粒；对质粒电转并进行GALV-env蛋白表达；将表达产物经纯化得到GALV-env蛋白；以GALV env蛋白为抗原进行动物免疫；取免疫动物的外周血单核细胞（PBMCs）进行特异性B细胞的富集；然后培养筛选，并利用分子克隆重组技术获得抗GALV env的兔单克隆抗体。
优选的，GALV env蛋白基因的DNA序列如SEQ ID NO.1。
优选的，GALV env蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2，在GALV-env上1-489aa序列的羧基端接10 × His tag，得到GALV-env蛋白的氨基酸序列。
优选的，抗GALV env的兔单克隆抗体包括C9、F8、H6抗体。
优选的，抗GALV env的兔单克隆抗体C9抗体，其重链可变区（VH）的氨基酸序列如SEQ ID NO.5，C9抗体VH的DNA序列如SEQ ID NO.11。VH包括3个抗原决定簇：VHC9CDR1、VHC9CDR2、VHC9CDR3，其氨基酸序列分别是SYWVS，FITFSATTYYATWAKG，VGDNIPDI。
优选的，抗GALV env的兔单克隆抗体C9抗体，其轻链可变区（VL）的氨基酸序列如SEQ ID NO.6，C9抗体VL的DNA序列如SEQ ID NO.12。VL包括3个抗原决定簇：VLC9CDR1、VLC9CDR2、VLC9CDR3，其氨基酸序列分别是QSSQSLYSSNHLS，DASTLAS，QGGYVCSTVDCWA。
优选的，抗GALV env的兔单克隆抗体F8抗体，其重链可变区（VH）的氨基酸序列如SEQ ID NO.7，F8抗体VH的DNA序列如SEQ ID NO.13。VH包括3个抗原决定簇：VHF8CDR1、VHF8CDR2、VHF8CDR3，其氨基酸序列分别是NYAMD，INAGGSAVYASWAKG，GAYGDL。
优选的，抗GALV env的兔单克隆抗体F8抗体，其轻链可变区（VL）的氨基酸序列如SEQ ID NO.8，F8抗体VL的DNA序列如SEQ ID NO.14。VL包括3个抗原决定簇：VLF8CDR1、VLF8CDR2、VLF8CDR3，其氨基酸序列分别是QSIGNALA，AAANLAS，SAYWSSSSYGYT。
优选的，抗GALV env的兔单克隆抗体H6抗体，其重链可变区（VH）的氨基酸序列如SEQ ID NO.9，H6抗体VH的DNA序列如SEQ ID NO.15。VH包括3个抗原决定簇：VHH6CDR1、VHH6CDR2、VHH6CDR3，其氨基酸序列分别是YYSMI，FIDSSANTWYASWVKG，GDSDGWGGYYKGI。
优选的，抗GALV env的兔单克隆抗体H6抗体，其轻链可变区（VL）的氨基酸序列如SEQ ID NO.10，H6抗体VL的DNA序列如SEQ ID NO.16。VL包括3个抗原决定簇：VLH6CDR1、VLH6CDR2、VLH6CDR3，其氨基酸序列分别是QASHSVSSFLA，GASNLES，QHLAFGGGYQVA。
本发明一实施例中，将对质粒电转并进行GALV-env蛋白表达的具体步骤包括：
复苏CHO细胞，传代3-5次后，离心收集细胞沉淀；在细胞沉淀中加入含GALV env基因的质粒和转染液，吹打混匀后；进行电转，得到电转后的细胞；将电转后的细胞转移入含DMEM培养基的摇瓶，静止培养30-60min；然后转移入摇床培养4-6天；离心收集上清，得到GALV env蛋白粗提物。
优选的，转染液包括电转液和 N,N-二甲基甲磺酰胺。在电转过程中N,N-二甲基甲磺酰胺可能利于质粒的转入以及刺激CHO细胞增殖，从而提高了GALV env蛋白抗原的表达量。
优选的，电转液和 N,N-二甲基甲磺酰胺以体积比=1000：1-10混匀得到转染液。
优选的，电转参数为1000-2000V，时间0.1-1S。
优选的，摇床培养条件为30-40℃，100-120rpm，5-8%CO2
更优选的，DMEM培养基中还含有10-6-10-5mol/L的L-苏丁醇。当L-苏丁醇用于培养电转后CHO细胞，可能对电转后损伤的CHO细胞产生保护作用，使CHO细胞能正常生长和增殖，进而能产生较多的GALV env蛋白抗原。
本发明制备得到的抗GALV env的兔单克隆抗体可用于检测逆转录病毒。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明在制备GALV env蛋白过程中，在电转时加入N,N-二甲基甲磺酰胺，提高了CHO细胞表达GALV env蛋白；将电转后的CHO培养在含L-苏丁醇的DMEM培养基中时，对CHO细胞产生保护作用，提高了CHO细胞表达GALVenv蛋白。本发明制备得到抗GALV env的兔单克隆抗体C9、F8、H6抗体，对GALV env蛋白的识别具有特异性好和灵敏度高的优点，上述抗体可用于检测逆转录病毒，可用于开发基于抗体的检测逆转录病毒的方法。
附图说明
图1为GALV env SDS-PAGE的纯度结果。
图2为抗体SDS-PAGE的纯度结果。A、B和C图分别为为C9 、F8和H6抗体的SDS-PAGE结果。
图3为C9 、F8和H6抗体的蛋白浓度和效应(OD值)曲线拟合结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：GALV env蛋白抗原的制备
1、合成GALV env蛋白基因
本发明在GALV env上1-489aa序列的羧基端接10 × His tag，得到GALV env蛋白的氨基酸序列，如SEQ ID NO.2。GALV env蛋白的DNA序列如SEQ ID NO.1，通过南京擎科科技有限公司进行合成。
2、构建含GALV env基因的质粒
将GALV env蛋白的基因作为模板，进行PCR扩增，得扩增产物。PCR酶为TaKaRa ExTaq® RRO01A；引物序列见下表。
将扩增产物和CHO真核表达载体pSecTag2A-BN经EcoR I/Not I酶切后，进行连接，得到连接产物；经酶切鉴定无误后，得到含GALV env基因的连接产物，即含GALV env基因的质粒；将含GALV env基因的质粒转染入感受态细胞，培养得到菌株；然后用快速质粒大提试剂盒提取质粒，将提取得到的含GALV env基因的质粒用NanoDrop仪器测定浓度及纯度，并稀释至500ng/ul。EcoR I和Not I购自NEB。快速质粒大提试剂盒购自倍沃医学科技，货号BW-PD1502-02。
3、含GALV env基因的质粒的转染与GALV env蛋白表达
1）取一支2×108数量的CHO细胞在37℃水浴锅中复苏，接种至125ml摇瓶中，将摇瓶放入摇床培养2天，细胞计数后，继续以2×108密度传代至125ml摇瓶中，将摇瓶放入摇床培养，经过三次传代后，CHO细胞可用于下一步实验。细胞的培养条件为120rpm，8% CO2，37℃。
2）将三次传代后的CHO细胞进行计数，取2.9×109数量的CHO细胞，离心去上清，得细胞沉淀，在细胞沉淀中加入转染液，吹打混匀后，添加含GALV env基因的质粒，得细胞质粒混悬液；取10ml细胞质粒混悬液加入电击杯中进行电转。电击杯的规格为10ml。电转参数为电压1500V，时间0.1s。转染液为7ml电转液。电转液购自LONZA，货号为V4LC-2002。
3）电转完成后，将电击杯内的细胞分装进含有500ml DMEM培养液的摇瓶内，静止孵育40min；然后将摇瓶放入摇床培养24h后，添加25ml补料、2mmol/L丁酸钠、5ml双抗，记为D0天培养，继续培养4d，即D4天培养。细胞的培养条件为37℃，120rpm，8%CO2。补料购自奥普曼，货号为P223635。
4）CHO细胞表达GALV env蛋白，并分泌到培养液中。将D4天培养的含CHO细胞的培养基进行离心，收集上清，即GALV env蛋白粗提物，然后进行下一步纯化。
4、纯化
用PBS平衡Ni亲和层析柱，然后将GALV env蛋白粗提物加入到Ni亲和层析柱中，接着用PBS和pH8.0，5mM的咪唑溶液洗杂；再加入pH8.0，150mM的咪唑溶液进行洗脱，得含咪唑的GALV env蛋白溶液；然后将含咪唑的GALV env蛋白溶液转移入透析袋，将透析袋放置透析液中进行透析，透析结束后，得GALV env蛋白抗原。透析袋的截留分子量为50KDa；透析液为20mM Tris-HCL+0.5M NaCl+6%海藻糖，pH8.0。
实施例2：GALV env蛋白抗原的制备
实施例2和实施例1的不同之处在于，实施例2的转染液由7ml电转液和35ul N,N-二甲基甲磺酰胺混匀得到。
实施例3：GALV env蛋白抗原的制备
实施例3和实施例2的不同之处在于，实施例3的转染液由7ml电转液和70ul N,N-二甲基甲磺酰胺混匀得到。
实施例4：GALV env蛋白抗原的制备
实施例4和实施例3的不同之处在于，实施例4将电转完成后的细胞分装入含有L-苏丁醇的DMEM培养液中，L-苏丁醇在DMEM培养基中的浓度为10-6mol/L。
实施例5：GALV env蛋白抗原的制备
实施例5和实施例4的不同之处在于，实施例5中L-苏丁醇在DMEM培养基中的浓度为10-5mol/L。
实施例6：GALV env蛋白抗原的制备
实施例6和实施例1的不同之处在于，实施例6将电转完成后的细胞分装入含有L-苏丁醇的DMEM培养液中，L-苏丁醇在DMEM培养基中的浓度为10-5mol/L。
实施例7：动物免疫和重组抗体收获
1、动物免疫
1）本发明中的免疫动物为新西兰兔，准备2只新西兰兔，免疫抗原为实施例1制备得到的GALV env蛋白抗原。
2）2只新西兰兔各进行4回免疫，见表1。免疫时，每只兔子注射GALV env蛋白抗原的量为200µg。在第一次免疫时，佐剂采用弗氏完全佐剂，在第二次和第三次免疫时，佐剂采用弗氏不完全佐剂，在第四次免疫，即终免时不加入佐剂。
3）在第一次免疫前，需要提前取2只兔子的各1ml血液，在分离血浆后，得无免血清。在终免后一周，取2只兔子的各1ml血液，在分离血浆后，得终免血清。上述血清添加有0.02%Proclin 300。
表1. 免疫时间表
2、血清的抗体效价检测
1）血清的抗体效价检测采用间接ELISA检测。将终免血清作为待测样品，将无免血清作为对照样品。
2）将抗原A和抗原B的蛋白浓度调至1µg/ml，加入酶标板中，每孔加入100µl，4℃过夜包被。抗原A为GALV env蛋白抗原。抗原B为His-tag无关蛋白。
3）第二天，取出酶标板，加入350µl/孔的洗液，浸泡酶标板30 秒后，弃去孔中液体，拍干酶标板，确保没有洗液残留，完成一次洗板。洗液为pH7.4的PBS。
4）加入2%BSA进行封闭，确保15分钟内完成上样，室温孵育2小时后，弃去孔中液体，加入350µl/孔的洗液，洗板5次。
5）将待测样品与对照样品从1：2000梯度按照4倍梯度稀释到1：5120000，然后以表5的顺序加入酶标板对应孔中，100µl/孔。其中，Blank组加入PBS，100µl/孔。室温孵育1小时后，弃去孔中液体，加入350µl/孔的洗液，洗板5次。
6）将二抗以1：40000稀释后加入酶标板中，100µl/孔，室温孵育20分钟后，弃去孔中液体，加入350µl/孔的洗液，洗板5次。二抗为Anti-Rabbit IgG Fc MonoclonalSecondary Antibody HRP conjugated，购自GenScript，货号A01856。
7）提前10分钟将显色液恢复至室温，接着将显色液加入酶标板中，100µl/孔，室温避光孵育15分钟待显色。显色液购自Solarbio，货号为PR1200。
8）然后加入50µl/孔终止液至酶标板中，此时颜色由蓝转黄，轻轻震动酶标板至显色均匀，10分钟内读取450nm的光吸收值。终止液为2M硫酸。
3、血清的抗体效价结果
阳性孔判定标准：待测样品OD450值大于对照样品OD450读值且读值大于0.5。
血清的抗体效价检测结果如表2所示。在经过四次免疫后，兔子体内的血清的抗体效价达到105。确认效价后，取终免后的新西兰兔的血液进行B细胞收集和克隆。
表2. 血清的抗体效价测定结果
注：A为GALV env-his蛋白抗原，B为His-tag无关蛋白（阴性对照）。
4、B细胞克隆
实验流程：从免疫后的兔子中取出15-30ml新鲜血液，进行PBMCs收集，然后对PBMCs进行富集培养，富集得到抗原阳性的B细胞，接着将抗原阳性的B细胞接种到96孔板中，进行一轮B细胞克隆，然后用间接ELISA方法，检测抗原阳性的B细胞的培养上清的抗体效价。
1）用PBS稀释抗原A和B，将抗原A和B从500ng/ml开始4倍梯度稀释至0.488ng/ml，然后将不同浓度的抗原A和B经0.22μm滤膜过滤后，加入不同的100mm培养皿中并做好标记，封口膜密封，4℃包被过夜。抗原A为GALV env。抗原B为His-tag无关蛋白。
2）第二天，取出上述培养皿，用PBS洗涤2次。在 37℃下用封闭缓冲液封闭培养皿2h，得抗原包被的培养皿。封闭缓冲液为5%BSA。
3）根据接收的血量，将组织标本分装进15 mL管，5mL/管，在Ficoll的上层加入5mL血液，以800g，升3降3，离心20min。离心后，将淋巴细胞层移到一个新的50 mL离心管中，加入适量PBS，按1500rpm，升9降7，离心5min。弃上清液，加入红细胞裂解缓冲液重悬细胞，室温避光孵育15min，然后加入适量的PBS以停止反应。以1500rpm，升9降7，离心5min，丢弃上清液。加入适量的CM培养基，完全悬浮PBMC，并计数细胞两次。将获得的PBMC加入到上述抗原包被的培养皿中，置于37℃培养箱中进行富集培养。
4）将富集得到抗原阳性的B细胞悬浮于CM培养基中，并与饲养细胞混合，得细胞悬液。将细胞悬液置于96孔细胞培养板中，在二氧化碳培养箱中37℃，5%CO2下培养。饲养细胞为小鼠胸腺淋巴瘤细胞(EL-4-B5)。
5、培养上清的抗体效价检测
在抗原阳性的B细胞铺板培养后的第6天，取96孔板中的培养上清进行ELISA实验，测定方法如本实施例中2—血清的抗体效价检测中所述，但不同之处在于，将培养上清作为待测样品。
若培养上清稀释512000倍后的OD450值大于1.3，说明对应该培养上清的96孔板中的B细胞的抗体效价较好，筛选得到C9、F8、H6这3株抗原阳性的B细胞，结果见表3。然后提取C9、F8、H6细胞的总RNA，进行抗体测序。
表3. C9、F8、H6培养上清的抗体效价
注：A为GALV env-his蛋白，B为His-tag无关蛋白。
6、阳性克隆抗体测序
1）按照TRIzol®试剂技术手册分别提取C9、F8、H6细胞的总RNA，得到C9、F8、H6细胞各自的总RNA。通过琼脂糖凝胶电泳对C9、F8、H6细胞各自的总RNA的提取情况进行分析。
2）确认提取的C9、F8、H6细胞各自的总RNA正常后，按照Prime Script TM 1stStrand cDNA Synthesis Kit的技术手册，采用Oligo dT Primer进行逆转录聚合酶链反应，分别将C9、F8、H6细胞各自的总RNA反转录成C9、F8、H6细胞各自的cDNA，然后按照RACE(rapid-amplification of cDNA ends)标准操作流程，对C9、F8、H6细胞各自的cDNA进行扩增，得到C9、F8、H6抗体各自的VH和VL的DNA片段。
3）使用标准分子克隆程序将C9、F8、H6抗体各自的VH和VL的DNA片段单独克隆到pMD™19-T Vector 中。
4）然后转化培养，并通过菌落PCR筛选出具有正确大小插入片段的克隆菌株，接着提取该克隆菌株的质粒，送南京擎科科技有限公司测序。
7、重组抗体表达和纯化
1）将C9抗体VH和VL的DNA片段通过重叠延伸聚合酶链式反应，用连接肽(G4S)3连接，构建得到C9抗体的VH-(G4S)3-VL区序列，按同样的操作通过构建得到F8抗体和H6抗体的VH-(G4S)3-VL区序列，然后将C9、F8、H6抗体各自的VH-(G4S)3-VL区序列克隆到哺乳动物表达载体pCMV-2上进行表达，获得分别含C9、F8和H6抗体的VH-(G4S)3-VL区序列的质粒，然后将上述质粒各自转染入感受态细胞中进行扩增，以获得足够量的，分别含C9、F8和H6抗体的VH-(G4S)3-VL区序列的表达质粒。
2）先使用无血清CD培养基培养HEK293细胞，连续传代3次后，可用于下一步实验。无血清CD培养基购自义翘神州，货号SMM 293-TI。
3）将含C9抗体的VH-(G4S)3-VL区序列的表达质粒转染入HEK293细胞。转染当天将HEK293细胞用无血清CD培养基调节至细胞密度2×106/ml，培养体系为40ml。然后将含C9抗体的VH-(G4S)3-VL区序列的表达质粒与转染试剂TF1以1：10（w/v）混合后加入40ml HEK293细胞中开始转染，记为第0天，转染试剂使用参考试剂说明书。转染开始后在第1，3和5天添加补料液，补料液使用参考试剂说明书，由此得到表达C9抗体的细胞。按同样的操作步骤分别对含F8和H6抗体的VH-(G4S)3-VL区序列的表达质粒进行转染，分别得到表达F8抗体和H6抗体的细胞。补料液购自义翘神州，货号为 M293-SUPI-100。转染试剂TF1购自义翘神州，货号STF02。上述细胞在摇床中培养，培养条件为5%CO2，150rpm。
4）将表达C9、F8和H6抗体的细胞各自培养5天，然后各自进行蛋白纯化。蛋白纯化步骤如下：
离心收获上清并用0.22um的滤器过滤去除剩余不溶物，得抗体溶液。然后将层析柱平衡后，上样抗体溶液进行过柱纯化。经洗杂、洗脱，收集抗体蛋白，然后将抗体蛋白脱盐，得抗体。
纯化得到的抗体分别为C9抗体、F8抗体和H6抗体。
实施例8：Biotin标记抗体
采用Thermo Scientific™EZ-Link™ Sulfo-NHS-LC-生物素化试剂盒对上述3种抗体进行生物素标记。
1）根据说明书，将所用试剂和上述3种抗体恢复室温。
2）根据说明书的计算方法，分别用PBS将适量上述3种抗体的浓度调至2mg/ml，准备0.5ml溶液。
3）根据说明书制备10mM的生物素试剂溶液。
4）在上述3种2mg/ml的抗体中各加入适量的10mM生物素试剂溶液。
5）在室温下孵育30分钟完成抗体与生物素的偶联，得到生物素偶联抗体，即C9-biotin抗体、F8-biotin抗体和H6-biotin抗体。
6）偶联结束后，用紫外可见分光光度计测定生物素偶联抗体的浓度。
试验例1：测定电转后CHO细胞的生长情况
在96孔板中加入200µL实施例1-6中D0天培养的CHO细胞的细胞悬液，在37℃，8%CO2下培养48h，然后通过CCK-8试剂盒检测上述CHO细胞的的增殖情况，结果见表4。
实施例1和实施例2、3相比，能看到实施例2、3的OD450nm高于实施例1，这说明实施例2、3的CHO细胞增殖较好，这可能是因为N,N-二甲基甲磺酰胺对CHO细胞发挥作用，N,N-二甲基甲磺酰胺可能在CHO细胞电转过程中对CHO细胞产生刺激作用，能促进CHO细胞在后续培养中生长。其中，当转染液中电转液与N,N-二甲基甲磺酰胺的体积比为100：1时，CHO细胞增殖较好。
而进一步比较实施例3、4、5，能看到实施例4、5的OD450nm高于实施例3，这可能是因为用含L-苏丁醇的DMEM培养基在培养CHO细胞时发挥作用，当L-苏丁醇用于培养电转后CHO细胞，可能对电转后损伤的CHO细胞产生保护作用，通过降低氧化应激等，使CHO细胞能正常生长和增殖。其中，当DMEM培养基含有10-5mol/L L-苏丁醇时，CHO细胞增殖较好。
此外，实施例1和实施例6相比，能看到实施例6的OD450nm高于实施例1，同样表明L-苏丁醇在CHO细胞培养过程中发挥作用。
表4. CHO细胞增殖情况
试验例2：测定GALV env蛋白抗原的蛋白量
通过BCA蛋白定量试剂盒检测实施例1-6中的GALV env蛋白抗原的蛋白量，结果见表4。BCA蛋白定量试剂盒购自生工，货号为C503021-0500。
实施例1和实施例2和3相比，能看到实施例2和3有较高的GALV env蛋白抗原的蛋白量，这可能是因为N,N-二甲基甲磺酰胺在电转时发挥作用，进而提高了GALV env蛋白抗原的蛋白量，N,N-二甲基甲磺酰胺可能通过促进质粒转染以及刺激CHO细胞生长，来提高GALV env蛋白抗原的表达。其中，当转染液中电转液与N,N-二甲基甲磺酰胺的体积比为100：1时，能较好地提高GALV env蛋白抗原的蛋白量。
而实施例3与实施例4、5对比，能看到实施例4、5有较高的GALV env蛋白抗原的蛋白量，这可能是因为用含L-苏丁醇的DMEM培养基在培养CHO细胞时发挥作用，当L-苏丁醇用于培养电转后CHO细胞，可能对电转后损伤的CHO细胞产生保护作用，通过降低氧化应激等，使CHO细胞能正常生长和增殖，进而能产生较多的GALV env蛋白抗原。其中，当DMEM培养基含有10-5mol/L L-苏丁醇时，能较好地提高GALV env蛋白抗原的蛋白量。
此外，实施例1和实施例6相比，能看到实施例6的GALV env蛋白抗原的蛋白量高于实施例1，同样表明L-苏丁醇可能在CHO细胞培养过程中发挥作用。
表5. GALV env蛋白抗原的蛋白量
试验例3：测定GALV env蛋白抗原的纯度
通过SDS-PAGE对实施例1得到的GALV env蛋白抗原进行纯度检测，结果如图1所示。从SDS-PAGE结果能看到GALV env蛋白抗原的纯度较好，纯度高于95%。
试验例4：测定C9、F8和H6抗体的纯度和浓度
测定纯化得到的抗体（C9抗体、F8抗体和H6抗体）的纯度和浓度。
1）通过SDS-PAGE检测重组抗体纯度。
3种抗体的纯度结果如图2所示。A为C9抗体的SDS-PAGE的结果；B为F8抗体的SDS-PAGE的结果；C为H6抗体的SDS-PAGE的结果。
上述结果表明3种抗体纯度较好，高于95%。
2）通过BCA蛋白定量试剂盒测定3种抗体的蛋白浓度，得到C9抗体的蛋白量为5.09mg，F8抗体的蛋白量为6.84mg，H6抗体的蛋白量为3.24mg。
试验例5：测定生物素偶联抗体的亲和力
通过ELISA实验，测定方法如实施例7中2—血清的抗体效价检测中所述，但不同之处在于，将C9-biotin抗体、F8-biotin抗体和H6-biotin抗体作为待测样品，然后将C9-biotin抗体、F8-biotin抗体和H6-biotin抗体从2µg/ml以3倍梯度稀释至0.011ng/ml。
亲和力测试结果如图3，根据OD450值与对应抗体浓度用GraphPad进行分析作图，非线性回归曲线拟合得到剂量-效应曲线。以此来计算这条曲线上效应达到最大效应一半时所对应的抗体浓度即EC50值。此次实验的EC50曲线拟合采用Graphpad8.0软件进行分析，C9-biotin抗体、F8-biotin抗体和H6-biotin抗体的EC50分别为2.130ng/ml、2.569ng/ml、和3.181ng/ml。
试验例6：C9、F8和H6抗体的氨基酸序列
C9抗体的VH氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。C9抗体的VH包括3个抗原决定簇：VHC9CDR1、VHC9CDR2、VHC9CDR3，其氨基酸序列分别为：SYWVS，FITFSATTYYATWAKG，VGDNIPDI；
C9抗体的VL氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。C9抗体的VL包括3个抗原决定簇：VLC9CDR1、VLC9CDR2、VLC9CDR3，其氨基酸序列分别为：QSSQSLYSSNHLS，DASTLAS，QGGYVCSTVDCWA。
F8抗体的VH氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。F8抗体的VH包括3个抗原决定簇：VHF8CDR1、VHF8CDR2、VHF8CDR3，其氨基酸序列分别为：NYAMD，INAGGSAVYASWAKG，GAYGDL；
F8抗体的VL氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。F8抗体的VL包括3个抗原决定簇：VLF8CDR1、VLF8CDR2、VLF8CDR3，其氨基酸序列分别为：QSIGNALA，AAANLAS，SAYWSSSSYGYT。
H6抗体的VH氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。H6抗体的VH包括3个抗原决定簇：VHH6CDR1、VHH6CDR2、VHH6CDR3，其氨基酸序列分别为：YYSMI，FIDSSANTWYASWVKG，GDSDGWGGYYKGI；
H6抗体的VL氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。H6抗体的VL包括3个抗原决定簇：VLH6CDR1、VLH6CDR2、VLH6CDR3，其氨基酸序列分别为：QASHSVSSFLA，GASNLES，QHLAFGGGYQVA。
试验例7：C9、F8和H6抗体的DNA序列
C9抗体VH的DNA序列如SEQ ID NO.11所示。C9抗体的VH包括3个抗原决定簇：VHC9CDR1、VHC9CDR2、VHC9CDR3，其DNA序列分别为：AGCTACTGGGTGAGC，TTCATTACTTTTAGTGCTACCACATACTACGCGACCTGGGCGAAAGGC，GTTGGTGATAATATTCCTGACATC；
C9抗体VL的DNA序列如SEQ ID NO.12所示。C9抗体的VL包括3个抗原决定簇：VLC9CDR1、VLC9CDR2、VLC9CDR3，其DNA序列分别为：CAGTCCAGTCAGAGTCTTTATAGTAGCAACCACTTATCC，GATGCATCCACTCTGGCATCT，CAAGGCGGTTATGTTTGTAGTACTGTTGATTGTTGGGCT。
F8抗体VH的DNA序列如SEQ ID NO.13所示。F8抗体的VH包括3个抗原决定簇：VHF8CDR1、VHF8CDR2、VHF8CDR3，其DNA序列分别为：AACTATGCAATGGAC，ATTAATGCTGGTGGTAGCGCAGTCTACGCGAGCTGGGCAAAAGGC，GGAGCATATGGTGATTTG；
F8抗体VL的DNA序列如SEQ ID NO.14所示。F8抗体的VL包括3个抗原决定簇：VLF8CDR1、VLF8CDR2、VLF8CDR3，其DNA序列分别为：CAGGCCAGTCAGAGCATTGGCAATGCATTAGCC，GCTGCAGCCAATCTGGCATCT，AGTGCTTATTGGAGTAGTAGTAGTTATGGTTATACT。
H6抗体VH的DNA序列如SEQ ID NO.15所示。H6抗体的VH包括3个抗原决定簇：VHH6CDR1、VHH6CDR2、VHH6CDR3，其DNA序列分别为：TATTATTCAATGATC，TTCATTGATAGTAGTGCTAACACATGGTACGCGAGTTGGGTGAAAGGC，GGGGATAGTGATGGCTGGGGTGGATACTACAAAGGCATC；
H6抗体VL的DNA序列如SEQ ID NO.16所示。H6抗体的VL包括3个抗原决定簇：VLH6CDR1、VLH6CDR2、VLH6CDR3，其DNA序列分别为：CAGGCCAGTCACAGCGTTAGTAGCTTCTTAGCC，GGTGCATCCAATCTGGAATCT，CAACATTTAGCCTTTGGTGGTGGTTATCAAGTTGCT。
本文中应用了具体个例对本申请的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的方法及其核心思想。以上所述仅是本申请的优选实施方式，应当指出，由于文字表达的有限性，而客观上存在无限的具体结构，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以作出若干改进、润饰或变化，也可以将上述技术特征以适当的方式进行组合；这些改进润饰、变化或组合，或未经改进将发明的构思和技术方案直接应用于其他场合的，均应视为本申请的保护范围。
Claims (10)
1. 抗GALV env的兔单克隆抗体，所述抗GALV env的兔单克隆抗体包括C9抗体和/或F8抗体和/或H6抗体，其特征在于，所述C9抗体的VH包括3个抗原决定簇：VHC9 CDR1、VHC9CDR2、VHC9 CDR3，其氨基酸序列分别是SYWVS，FITFSATTYYATWAKG，VGDNIPDI；
C9抗体的VL包括3个抗原决定簇：VLC9 CDR1、VLC9 CDR2、VLC9 CDR3，其氨基酸序列分别是QSSQSLYSSNHLS，DASTLAS，QGGYVCSTVDCWA。
2. 根据权利要求1所述抗GALV env的兔单克隆抗体，其特征在于，所述C9抗体的VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.5；C9抗体的VL的氨基酸序列如SEQ ID NO.6。
3. 根据权利要求1所述抗GALV env的兔单克隆抗体，其特征在于，所述F8抗体的VH包括3个抗原决定簇：VHF8 CDR1、VHF8 CDR2、VHF8 CDR3，其氨基酸序列分别是NYAMD，INAGGSAVYASWAKG，GAYGDL；
F8抗体的VL包括3个抗原决定簇：VLF8 CDR1、VLF8 CDR2、VLF8 CDR3，其氨基酸序列分别是QSIGNALA，AAANLAS，SAYWSSSSYGYT。
4. 根据权利要求1所述抗GALV env的兔单克隆抗体，其特征在于，所述F8抗体的VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.7；F8抗体的VL的氨基酸序列如SEQ ID NO.8。
5. 根据权利要求1所述抗GALV env的兔单克隆抗体，其特征在于，所述H6抗体的VH包括3个抗原决定簇：VHH6 CDR1、VHH6 CDR2、VHH6 CDR3，其氨基酸序列分别是YYSMI，FIDSSANTWYASWVKG，GDSDGWGGYYKGI；
H6抗体的VL包括3个抗原决定簇：VLH6 CDR1、VLH6 CDR2、VLH6 CDR3，其氨基酸序列分别是QASHSVSSFLA，GASNLES，QHLAFGGGYQVA。
6. 根据权利要求1所述抗GALV env的兔单克隆抗体，其特征在于，所述H6抗体的VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.9；H6抗体的VL的氨基酸序列如SEQ ID NO.10。
7. 一种抗GALV env的兔单克隆抗体的制备方法，具体步骤包括：合成GALV-env蛋白基因并构建质粒；对质粒电转并进行GALV-env蛋白表达；将表达产物经纯化得到GALV-env蛋白；以GALV env蛋白为抗原进行动物免疫；取免疫动物的外周血单核细胞（PBMCs）进行特异性B细胞的富集；然后培养筛选，并利用分子克隆重组技术获得抗GALV env的兔单克隆抗体。
8. 根据权利要求7所述的制备方法，所述对质粒电转并进行GALV-env蛋白表达的具体步骤包括：复苏CHO细胞，传代3-5次后，离心收集细胞沉淀；在细胞沉淀中加入含GALV env基因的质粒和转染液，吹打混匀后；进行电转，得到电转后的细胞；将电转后的细胞转移入含DMEM培养基的摇瓶，静止培养30-60min；然后转移入摇床培养4-6天；离心收集上清，得到GALV env蛋白粗提物。
9. 根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述转染液由电转液和 N,N-二甲基甲磺酰胺以体积比1000：1-10混匀得到。
10. 权利要求1-6任一项所述抗GALV env的兔单克隆抗体在检测逆转录病毒上的应用。
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