CN118415924A - 一种黑松露提取物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物提取物领域，具体公开一种黑松露提取物及其制备方法和应用。本发明利用羟丙基‑β‑环糊精辅助水提提取黑松露，得到具有抗皱、抗老、紧致皮肤、保湿、舒缓、平滑皮肤、改善皮肤暗沉、缓解皮肤泛红、修复皮肤屏障等综合功效的黑松露提取物。
Description
技术领域
本发明属于植物提取物领域，具体涉及一种黑松露提取物及其制备方法和应用。
背景技术
黑松露，拉丁名为Tuber melanosporum，英文称为perigord truffle，也称块菌，是一种生长于地下的野生食用真菌。黑松露生长在深山老林里中的松、橡等树下的原生土壤中，与树木根部共生形成菌根，成熟期在每年冬季的十一月到次年的二月。松露的价格十分昂贵，在欧洲被比喻为可以吃的黑钻石。过去两千年里，黑松露在世界上仅发现于欧洲的阿尔卑斯山南部，这是中国人对黑松露陌生的主要原因。上世纪末，中国科学家在喜玛拉雅山脉的东南地区发现了黑松露的分布，轰动了整个世界。从那时中国产黑松露一直全部用于出口。中国黑松露产地主要集中在云南省与四川省及其周边地区，其中产量较大的主产区包括四川省会东会理、高黎贡山、云南永仁县、四川省攀枝花等地。中国黑松露品种复杂，根据《中国块菌属研究概况》指明，我国松露品种多达几十种，但实际具有较高食用价值的仅为5种左右。近年的松露产区民间应用考证表明，几百年来称作“无娘果”的黑松露早已被当地山民用于增强体力、提高性能力、调理妇女经血等，据说功效卓越。
现代科学研究数据显示，黑松露含有丰富的蛋白质、18种氨基酸(包括人体不能合成的8种必需氨基酸)、不饱和脂肪酸、多种维生素、锌、锰、铁、钙、磷、硒等必需微量元素，以及鞘脂类、脑苷脂、神经酰胺、三萜、雄性酮、腺苷、松露酸、甾醇、松露多糖、松露多肽等大量的代谢产物，具有极高的营养保健价值。如目前研究数据表明，我国的云南黑松露中含28％蛋白质、3％脂肪、2.5％还原糖和8％的灰分。不同氨基酸具有多重生物功能，依据目前氨基酸评分，野生云南黑松露第一、二限制性氨基酸分别是蛋氨酸和胱氨酸、亮氨酸；但依据氨基酸比值系数，第一、二限制性氨基酸分别是苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸。
黑松露除了食用保健价值之外，从黑松露中提取出相应的成分并应用于皮肤护理方面也受到了广泛的关注。但是，因黑松露的受限于提取工艺及其成分的复杂性，目前黑松露的提取工艺提取到的黑松露提取物收率低、活性较低、成分不全，且在皮肤护理方面的功效机制也不明确。
发明内容
针对上述现有技术涉及的目前黑松露的提取工艺提取到的黑松露提取物收率低、活性较低、成分不全，且在皮肤护理方面的功效机制也不明确等问题，本发明将提供一种黑松露提取物及其制备方法和应用。
为实现上述目的，具体包括以下技术方案：
一种黑松露提取物的制备方法，包括如下步骤：
将黑松露粉体、水、羟丙基-β-环糊精混合，并在搅拌下进行提取反应，再将白色硅藻土加入到提取反应结束后得到的料液中，搅拌混合，最后经过加压过滤以及灭菌处理，得到黑松露提取物；所述黑松露粉体和水的质量比为(0.001-0.12):1。
在以水为提取溶剂下，利用羟丙基-β-环糊精外部亲水、内部疏水的中空分子结构和良好的水溶性，通过分子吸纳和包合的方式显著增加黑松露中脂溶性成分的水溶性，实现黑松露脂溶性成分的包合提取，从而实现黑松露的全成分的提取，进而实现提取到的黑松露提取物具有更优的皮肤调理功效。
在一实施例中，所述提取反应的温度为40-70℃，所述提取反应的时间为1-5h，优选地，所述提取反应的温度为50-60℃。在上述的提取温度和时间之下，更有利于黑松露中的成分溶出，提高黑松露的收率。上述的提取温度还可以为41、42、43、44、45、46、47、48、49、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64℃、65、66、67、68、69、70等，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。上述的提取时间可以为1、2、3、4、5h等，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
在一实施例中，所述黑松露粉体和水的质量比可以为(0.001:1)、(0.005:1)、(0.01:1)、(0.015:1)、(0.02:1)、(0.025:1)、(0.03:1)、(0.035:1)、(0.04:1)、(0.045:1)、(0.05:1)、(0.055:1)、(0.06:1)、(0.065:1)、(0.07:1)、(0.075:1)、(0.08:1)、(0.085:1)、(0.09:1)、(0.095:1)、(0.1:1)、(0.105:1)、(0.11:1)、(0.115:1)、(0.12:1)等，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
在一实施例中，所述黑松露粉体和水的质量比为(0.005-0.02):1。在上述的提取料液比之下，更有利于黑松露中的成分溶出，提高黑松露的收率。
在一实施例中，所述羟丙基-β-环糊精和黑松露粉体的质量比为(0.025-1.5):1，优选地，所述羟丙基-β-环糊精和黑松露粉体的质量比为(0.05-0.1):1。羟丙基-β-环糊精在水中的溶解度为：50g/100g水(25℃)，其相比其他类型的环糊精(α、β、γ)具有更优的水溶性(小于25克)，赋予其更大的包合能力，最大限度提高脂溶性成分的包合提取效率，达到全成分提取的工艺实施目的。在上述的质量比之下，不仅有利于黑松露成分的溶出和高效提取，而且羟丙基-β-环糊精不会影响黑松露提取物的活性或后续应用。
在一实施例中，所述加压过滤的滤层依次为红色硅藻土滤层、微孔滤膜和滤纸；所述白色硅藻土还经过水洗，所述水洗所用的水的温度为80-100℃，所述加压过滤的压力为1-4Kg。白色硅藻土和红色硅藻土的作用都是助滤剂，但是，渗透率不一样，过滤精度不一样，本发明先后使用白、红色硅藻土，能进一步提高，提取物的纯度。
白色硅藻土加在料液中，红色硅藻土精度更高，是预先在过滤器中做涂层，再依次层叠上0.2微米滤膜和滤纸，滤纸起到的是支撑作用，这样可以形成多级过滤，白色硅藻土、红色硅藻土和0.2微米滤膜的过滤精度依次提高，这样保证得到澄清的过滤液。
在一实施例中，所述黑松露提取物还经过灭菌处理，所述灭菌处理的温度为80-85℃，所述灭菌处理的时间为20-60min。
在一实施例中，所述黑松露粉体的目数为80-100目。
本发明还提供一种黑松露提取液，包括所述的黑松露提取物和多元醇。
在一实施例中，所述多元醇包括丙二醇、丁二醇、戊二醇、己二醇中的至少一种；在黑松露提取液中，所述多元醇的质量百分含量为25-35％。
在黑松露提取物中加入多元醇，起到防腐及稳定效果。
在一实施例中，所述黑松露提取液还包括防腐剂，所述防腐剂包括茴香酸、对羟基苯乙酮中的至少一种，所述防腐剂在所述黑松露提取液中的质量百分含量为0.1-0.5％。
本发明还提供一种所述的黑松露提取物或所述的黑松露提取液作为皮肤抗皱剂、皮肤抗衰老剂、紧致皮肤调理剂、皮肤保湿剂、皮肤舒缓剂、平滑皮肤调理剂、改善皮肤暗沉调理剂、缓解皮肤泛红调理剂、皮肤屏障修复剂的应用。
本发明的黑松露提取物具有抗皱、抗老、紧致皮肤、保湿、舒缓、平滑皮肤、改善皮肤暗沉、缓解皮肤泛红、修复皮肤屏障等综合功效。
本发明还提供一种所述的黑松露提取物或所述的黑松露提取液在化妆品中具有皮肤调理作用的活性成分，所述皮肤调理作用包括如下中的至少一种：(I)抗皱作用；(II)抗衰老作用；(III)紧致皮肤作用；(IV)保湿作用；(V)舒缓作用；(Ⅵ)平滑皮肤作用；(Ⅶ)改善皮肤暗沉作用；(Ⅷ)缓解皮肤泛红作用；(Ⅸ)修复皮肤屏障作用。
在一实施例中，所述抗皱作用包括对SIRT基因表达有促进作用；所述SIRT基因为SIRT1、SIRT4、SIRT5、SIRT4、SIRT7中的至少一种。
在一实施例中，所述紧致皮肤作用包括对VII型胶原蛋白和/或弹性蛋白基因表达有促进作用；所述VII型胶原蛋白为COL7A1基因，所述弹性蛋白基因为ELN基因。
在一实施例中，所述抗衰老作用包括对细胞衰老相关基因表达有抑制作用和/或对β-半乳糖苷酶活性有抑制作用，所述细胞衰老相关基因为p16、p53、p21中的至少一种。
一种化妆品，包括所述的黑松露提取物或所述的黑松露提取液。
在一实施例中，所述化妆品包括乳液、精华液、面膜、面霜、洗面奶、洗手液、沐浴露、化妆水中的任意一种。
在一实施例中，所述化妆品中，所述的黑松露提取物或所述的黑松露提取液的质量百分含量为0.1-10％，优选，0.5-2％，该质量百分含量还可以为0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％等，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
在一实施例中，所述精华液包括如下质量百分含量的组分：黑松露提取液0.1-5％、甘油0.1-6％、防腐剂0.1-1％，余量水。所述防腐剂为常见的防腐剂，如苯氧乙醇、辛甘醇、异戊二醇、1,2-己二醇、对羟基苯乙酮、双丙甘醇中的至少一种。
在一实施例中，所述化妆品还包括珠丝毛蓝耳草根提取物。
在一实施例中，在所述化妆品中含有黑松露提取物或黑松露提取液与珠丝毛蓝耳草根提取物，所述黑松露提取物或黑松露提取液与珠丝毛蓝耳草根提取物的质量比为(0.5-3)：(0.001-0.2)，优选(0.5-2.1)：(0.005-0.1)。
黑松露提取物与珠丝毛蓝耳草根提取物复配，作为皮肤调理剂的活性成分，表现出协同增效的作用。
在一实施例中，所述乳液包括如下质量百分含量的组分：乳化剂1-5％、鲸蜡硬脂醇0.1-1％、甘油硬脂酸酯0.1-1％、辛酸/癸酸甘油三酯2-10％、角鲨烷2-10％、EDTA二钠0.01-0.1％、防腐剂0.5-2％、异戊二醇1-5％、甘油2-10％、增稠剂0.1-0.5％、精氨酸0.1-0.5％、黑松露提取液0.1-10％，余量水。
在一实施例中，所述乳液包括如下质量百分含量的组分：乳化剂1-5％、鲸蜡硬脂醇0.1-1％、甘油硬脂酸酯0.1-1％、辛酸/癸酸甘油三酯2-10％、角鲨烷2-10％、EDTA二钠0.01-0.1％、防腐剂0.5-2％、异戊二醇1-5％、甘油2-10％、增稠剂0.1-0.5％、精氨酸0.1-0.5％、黑松露提取液0.1-10％，珠丝毛蓝耳草根提取物0.005-0.1％，余量水。
在一实施例中，所述增稠剂包括卡波姆。
在一实施例中，所述乳化剂包括聚甘油-6硬脂酸酯、聚甘油-6山嵛酸酯中的至少一种。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：本发明利用羟丙基-β-环糊精辅助水提提取黑松露，得到具有抗皱、抗老、紧致皮肤、保湿、舒缓、平滑皮肤、改善皮肤暗沉、缓解皮肤泛红、修复皮肤屏障等综合功效的黑松露提取物。
附图说明
图1为应用例1中的精华液产品1和2的测试结果图。
图2为应用例2中的不同浓度的黑松露提取物对人原代表皮角质细胞SIRT基因表达的影响图。
图3为应用例3中黑松露提取物对人真皮成纤维细胞胶原蛋白和弹性蛋白基因表达的影响图。
图4为应用例3中黑松露提取物对人真皮成纤维细胞衰老相关基因表达的影响图。
图5为应用例3中不同样品在显微镜下观察细胞衰老β-半乳糖苷酶染色图像(100X)，体现黑松露提取物对人真皮成纤维细胞衰老β-半乳糖苷酶表达的影响。
图6为应用例3中不同样品细胞衰老β-半乳糖苷酶染色图像定量分析结果图。
图7为应用例4中眼角皱纹改善有效例(46号受试者)的Primo CR图。
图8为应用例4中抬头纹改善有效例(39号受试者)的Primo CR图。
图9为应用例4中法令纹改善有效例(40号受试者)的Primo CR图。
图10为应用例4中皮肤纹理改善有效例(39号受试者)VC20plus图。
图11为应用例4中真皮层密度改善有效例(38号受试者)UC22图，其中，内源性荧光物质越多表示真皮层密度越大。
图12为应用例4中的空白对照样品(左)和黑松露乳液(右)的实物图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将通过具体实施例对本发明作进一步说明。实施例和/或对比例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
(1)预处理：将新鲜冻干黑松露(云南产)用粗粉碎机粉碎成黑松露80-100目的细粉，待用；
(2)提取：称取20.0克黑松露细粉，向其中加入1000毫升纯水，开启搅拌，使黑松露固体粉末均匀分散，得到料液；再将料液加热升温至60℃，然后，向料液中加入2克羟丙基β-环糊精，继续搅拌，保温提取3小时；
(4)过滤：提取结束后，为了过滤掉黑松露提取液中不水溶的颗粒物，使提取液达到透明，向料液中加入20克白色硅藻土搅拌10分钟左右使混合均匀，白色硅藻土和料液的质量比为1:50，在3Kg的正压下进行加压过滤，得到黑松露精滤液；精滤液应澄清、透明；
其中，白色硅藻土事先用80℃以上的热水在布氏漏斗上抽滤、洗涤白色硅藻土，除去杂质；加压过滤中，加压过滤前需在加压过滤器内均匀预涂1层约2mm厚的红色硅藻土，并用热水少量多次洗涤红色硅藻土滤层，直至洗涤液澄清为止，红色硅藻土洗涤液弃去，并在该洗涤过的红色硅藻土层上依次放置一张张0.2微米微孔滤膜、2张中速滤纸，形成整体的加压过滤层。
对精滤液称重，取样，并测固含量及pH值；
(5)灭菌：精滤液加热升温至80℃-82℃，保温灭菌30分钟；灭菌结束，将灭菌后的精滤液密闭放置在冰箱中冷藏过夜，观察是否仍澄清、透明；
(6)向灭菌后的精滤液加入1,3-丙二醇，充分搅拌混合均匀，并测试菌落总数及霉菌，符合要求，得到黑松露提取液，黑松露提取液中1,3-丙二醇质量百分含量为30％。
实施例2
与实施例1相比，区别在于，本实施例提取温度为40℃。
实施例3
与实施例1相比，区别在于，本实施例提取温度为50℃。
实施例4
与实施例1相比，区别在于，本实施例提取温度为65℃。
实施例5
与实施例1相比，区别在于，本实施例提取温度为70℃。
实施例6
与实施例1相比，区别在于，本实施例提取时间为1h。
实施例7
与实施例1相比，区别在于，本实施例提取时间为5h。
实施例8
与实施例1相比，区别在于，本实施例称取5.0克黑松露细粉。
实施例9
与实施例1相比，区别在于，本实施例称取10.0克黑松露细粉。
实施例10
与实施例1相比，区别在于，本实施例称取120.0克黑松露细粉。
实施例11
与实施例1相比，区别在于，本实施例向料液中加入0.5克羟丙基β-环糊精。
实施例12
与实施例1相比，区别在于，本实施例向料液中加入1克羟丙基β-环糊精。
实施例13
与实施例1相比，区别在于，本实施例向料液中加入20克羟丙基β-环糊精。
实施例14
与实施例1相比，区别在于，本实施例向料液中加入30克羟丙基β-环糊精。
对比例1
与实施例1相比，区别在于，本对比例不加羟丙基β-环糊精。
对比例2
与实施例1相比，区别在于，本对比例使用等量的β-环糊精替代羟丙基β-环糊精。
对比例3
与实施例1相比，区别在于，本实施例称取200.0克黑松露细粉。
将上述提取得到的提取物进行检测，计算提取率和脂溶性成分的分析，检测方法如下：
(1)提取率：以提取过程中步骤(5)所得精滤液的固含量，减去羟丙基β-环糊精用量后，再除以投料量，计算提取得率。
(2)脂溶性成分：将提取过程中步骤(5)所得精滤液冷冻干燥后，干燥样品再用CO2超临界萃取出脂溶性成分测试提取物中的脂溶性成分含量。
表1
由上述实施例1-14和对比例3可知，本发明的提取方法提取黑松露提取物的提取率为18-33％，提取物中的脂溶性成分含量为0.99-1.145wt.％，提取过程的提取温度、提取时间、料液比(黑松露原粉和水的质量之比)、羟丙基β-环糊精与黑松露原粉的质量之比对黑松露提取物的提取率和提取物中的脂溶性成分含量有一定的影响，特别是料液比，因提取过程中的料液比过大，会降低黑松露原粉在水中的有效成分浸出，降低黑松露提取物的提取率和脂溶性成分含量；提取过程中的料液比过小，降低水的利用率，提取效率较低，因此，本发明的提取方法的料液比可以选择(0.001-0.12):1，优选(0.005-0.02):1。
由实施例1、12-15和对比例1-2可知，利用羟丙基-β-环糊精外部亲水、内部疏水的中空分子结构和良好的水溶性，通过分子吸纳和包合的方式显著增加黑松露中脂溶性成分的水溶性，同时进一步提高提取率，实现黑松露脂溶性成分的包合提取，从而实现黑松露的全成分的提取。因羟丙基-β-环糊精是一种提取过程的辅助成分，但是，因羟丙基-β-环糊精添加过多，其利用率较低，还会降低黑松露提取物的纯度，因此，为了不影响后续黑松露提取物的应用，该羟丙基-β-环糊精添加量需要适当，可以选择羟丙基-β-环糊精和黑松露粉体的质量比为(0.025-1.5):1，优选(0.05-0.1):1，在上述的两者的质量比之下，不仅提取物的提取率和脂溶性成分较高，而且添加的羟丙基-β-环糊精不会对提取物的后续应用产生不利的影响。
应用例1
将实施例1含有30％的1,3-丙二醇的黑松露提取液、以及对比例1当中含有30％的1,3-丙二醇的黑松露提取液(未使用羟丙基β-环糊精提取)，分别与甘油和水混合，再分别加入苯氧乙醇和辛甘醇防腐剂，混合均匀，分别得到精华液产品1和精华液产品2，其中，该2种精华液产品中含提取液2wt.％、甘油5％(v/v)、苯氧乙醇0.6％(v/v)、辛甘醇0.1％(v/v)。
对上述两种精华液产品1-2进行功效测试：
(1)实验对象是年龄在30-52岁的志愿者，共30人，主要皮肤问题表现为干燥缺水、轻微炎症、肤色暗沉、细纹、皱纹、松弛等；
(2)以上志愿者平均分成2组，每组15人，分别使用精华液产品1-2，每天早晚各一次，每次取用0.5mL，均匀涂于脸部皮肤，连续使用28天；观察皮肤的改善状况，填写问卷表并打分，华液产品1-2评分标准如表1；同时，采用皮肤水份测试探头CM825(CK，德国)和皮肤色度测试探头CL400(CK，德国)测试使用后精华液产品1-3皮肤角质层水分含量提高率、皮肤平均红度a值。
表2
上述2组打分统计结果，并以打分总和除以满分，得到效果百分比，结果见附图1，由图1可知，试验结果证明，采用羟丙基-β-环糊精提取制备的黑松露提取液，活性成分包裹溶解更加充分，相对于没有使用羟丙基-β-环糊精提取得到的黑松露提取液，具有更好的保湿、舒缓的效果，同时能够有效地淡化细纹、皱纹，具有紧致皮肤的作用，无皮肤刺激反应。
表3
由表1可知，相比不使用羟丙基-β-环糊精辅助提取，本发明的提取方法提取得到的黑松露提取物作为皮肤调理方面的活性成分表现出更优的功效，特别是本发明提取物在提高皮肤角质层水分含量及降低皮肤红度方面表现更优。
应用例2
黑松露提取物的人原代表皮角质细胞模型测试：
Sirtuins家族是一组由SIRT基因编码的烟酰胺二核苷酸(NAD+)依赖性脱酰基酶，研究显示，Sirtuins可以参与调节诸多细胞过程，包括DNA修复，脂肪分化，葡萄糖代谢，胰岛素敏感性、脂肪酸氧化、神经新生和炎症，因此被认为与哺乳动物的热量限制和衰老有关。本应用例利用人原代表皮角质细胞模型，检测黑松露提取物对SIRT基因表达的影响。
(1)实验试剂
人原代皮肤角质细胞(P3-P5)和培养基购自于Cell Technology公司；CCK试剂购自于同仁生物(Cat#:40203ES80)；12孔和96孔细胞培养板采购自Thermo；RNA提取试剂盒购自于Qiagen(货号714104)、反转录和荧光定量PCR试剂盒购自于Takara(货号RR037A，RR420A)。
(2)主要设备
细胞培养箱，实时荧光定量PCR仪，倒置显微镜，生物安全柜，酶标仪。
(3)样品准备
本次检测共计1个原料样品，即实施例1中的黑松露提取物，该提取物的在4℃保存，在样品制备时使用培养基直接稀释作为样品，各样品中黑松露提取物的质量百分含量分别为0.01％、0.1％、0.5％、1％、2.5％、5％。
(4)实验方法
(4-1)人原代表皮角质细胞毒性测试
人原代表皮角质细胞在5％CO2、37℃的培养条件下，利用角质细胞培养基扩增培养。当细胞生长至80-90％汇合时，用胰酶将其消化并接种于96孔板。继续培养48h后，分别将不同浓度的样品添加到培养基中处理角质细胞(N＝3)。处理24h后，按照说明书加入CCK-8试剂孵育1h，用酶标仪在450nm处读取OD值。通过计算样品组和对照组的平均OD值之比得到相对细胞活性数值，判断样品的细胞毒性作用。
相对细胞活性％＝(样品组OD值/空白对照组OD值)×100％。
(4-2)Sirt基因表达实验
人原代表皮角质细胞在37℃、含5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养。待细胞生长至80％以上汇合后消化接种于12孔板，并继续培养48h用于测试。实验当天选取合适的样品浓度处理角质细胞24h，弃去上清液，用预冷的磷酸缓冲液(PBS)每孔1mL清洗2次，随即用RNA抽提试剂制备细胞裂解液。集齐裂解液样本后统一提取细胞总RNA，反转录为cDNA后利用实时荧光定量PCR检测各个SIRT基因表达水平，所得结果以2-ΔΔCt法进行分析定量，得到各组细胞的基因表达量。
表4引物序列
(4-3)统计方法
所有结果以Mean±SD表示，计量数据差异比较采用unpaired t检验，P<0.05视为差异有统计学意义。测试结果的图表中，*代表p<0.05，**代表p<0.01，***代表p<0.001。
(5)实验结果
(5-1)黑松露提取物对原代表皮角质细胞的活力的影响
用不同浓度的黑松露提取物样品对角质细胞进行处理24h后，用CCK试剂盒检测细胞活性。数据统计结果和表5所示，所有浓度的黑松露提取物样品对原代表皮角质细胞活力均无明显影响。
根据细胞活力测试结果，后续的基因表达实验采用5％、1％和0.1％三个浓度样品处理细胞。
表5
(5-2)黑松露提取物对人原代表皮角质细胞SIRT基因表达的影响
用5％、1％和0.1％三个浓度的黑松露提取物样品处理角质细胞24h后，收集细胞总RNA，用qPCR法检测SIRT1-7基因表达量。如图3和表6所示，0.1％样品对SIRT1基因表达有明显促进作用，促进率为61.85％(p<0.05)。5％，1％和0.1％三个浓度样品对SIRT4基因表达均有明显促进作用，分别上调53.07％(p<0.001)，39.97％(p<0.01)和51.48％(p<0.01)。1％和0.1％的样品对SIRT5基因表达均有明显促进作用，分别上调25.86％(p<0.01)和29.40％(p<0.01)。0.1％样品对SIRT6基因表达有明显促进作用，促进率为24.30％(p<0.01)。5％、1％和0.1％三个浓度样品对SIRT7基因表达均有明显促进作用，分别上调36.94％(p<0.001)、16.76％(p<0.05)和18.76％(p<0.001)。可见，黑松露提取物或提取液能显著促进人原代表皮角质细胞SIRT1、SIRT4、SIRT5、SIRT6和SITR7基因表达。
表6
应用例3
黑松露提取物的人原代真皮成纤维细胞模型测试：
胶原蛋白是皮肤中的重要的结构蛋白，胶原蛋白不仅可以保持皮肤弹性和紧致度，同时也维持着皮肤组织的正常机械强度。皮肤老化是内源性因素(如遗传和激素水平)和外源性因素(如光老化和环境化学物质)共同作用下产生的。这些因素会引起皮肤内胶原蛋白，弹性蛋白的降解，从而加速皮肤的老化过程。
人体细胞在经历有限的分裂次数后进入生长停滞和功能退化的阶段(cellularsenescence)，这个过程被称为复制性衰老，是衰老的根本原因。细胞周期相关因子如p16、p21、p53、RB、Ki67等对于衰老细胞周期停滞至关重要。积累的磷酸化p53将促使细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(CDKI)的激活并最终导致细胞周期停滞。CDK2的抑制因子p21和CDK4/6的抑制因子p16会在衰老细胞中发生积累，这种积累促使RB家族蛋白持续活化，抑制E2F的反式激活，从而导致无法逆转的细胞周期停滞。此外，衰老细胞通常体积变大，并表达在pH6.0时有高酶活性的β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)。研究显示在不同年龄的人体皮肤样本中，真皮成纤维细胞和表皮角质形成细胞中的β-半乳糖苷酶表达量随年龄增加而增加，因此采用试剂盒检测细胞或组织中的β-半乳糖苷酶活性是评估其老化程度和化学品抗衰老活性的常见方法。
本应用例利用人原代真皮成纤维细胞模型，评估黑松露提取物对抵御细胞老化的功效。
(1)实验试剂
人原代真皮成纤维细胞(P3-P5)和培养基购自于Cell Technology公司；CCK试剂购自于同仁生物(Cat#:40203ES80)；12孔和96孔细胞培养板采购自Thermo；RNA提取试剂盒购自于Qiagen(货号714104)、反转录和荧光定量PCR试剂盒购自于Takara(货号RR037A，RR420A)。细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒购自碧云天(货号C0602)，Etoposide购自碧云天(货号SC0173)。
(2)主要设备
细胞培养箱，实时荧光定量PCR仪，倒置显微镜，生物安全柜，酶标仪。
(3)样品准备
本次检测共计1个原料样品，即实施例1中的黑松露提取液(含30wt.％1,3-丙二醇)，该提取物的在4℃保存，在样品制备时使用培养基直接稀释作为样品，各样品中黑松露提取液的质量百分含量分别为0.1％、1％、2％。
(4)实验方法
(4-1)人原代真皮成纤维细胞基因表达实验
人原代皮肤成纤维细胞在37℃、含5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养。待细胞生长至80％以上汇合后消化接种于12孔板，并继续培养48h用于测试。实验当天选取合适的样品浓度处理人原代皮肤成纤维细胞24h，弃去上清液，用预冷的磷酸缓冲液(PBS)每孔1mL清洗2次，随即用RNA抽提试剂制备细胞裂解液。集齐裂解液样本后统一提取细胞总RNA，反转录为cDNA后利用实时荧光定量PCR检测VII型胶原蛋白基因(COL7A1)，弹性蛋白基因(ELN)以及衰老相关基因p16、p21和p53表达水平，所得结果以2-ΔΔCt法进行分析定量，得到各组细胞的基因表达量。PCR测试的引物序列如表7所示。
表7
(4-2)人原代皮肤成纤维细胞β-半乳糖苷酶染色实验
人原代皮肤成纤维细胞使用培养基在37℃、含5％CO2、湿度为95％的培养箱中培养。待细胞生长至80％以上汇合后消化接种于24孔板，待细胞贴壁并培养48h后，加入不同的样品处理，采用Etoposide(依托泊苷)用于诱导细胞衰老(衰老诱导阴性组)，IGF-1则为抗衰老阳性对照。继续培养48h后，吸去细胞培养上清，用固定液固定细胞，按照说明书使用细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒，对细胞进行染色。在倒置显微镜下按照100×放大倍数拍摄细胞染色图像，每个孔随机选择3个视野拍摄。图像采用ImageJ软件Cell Counter插件程序进行β-半乳糖苷酶阴性、阳性细胞数定量。
β-半乳糖苷酶阳性率％＝阳性细胞数/(阳性细胞数+阴性细胞数)×100％。
(4-3)统计方法
所有结果以Mean±SD表示，计量数据差异比较采用unpaired t检验，p<0.05视为差异有统计学意义。测试结果的图表中，*代表p<0.05，**代表p<0.01，***代表p<0.001。
(5)实验结果
(5-1)黑松露提取液对人原代真皮成纤维细胞基因表达的影响
用2％、1％和0.1％三个浓度的黑松露提取液样品处理人原代真皮成纤维细胞24h后，收集细胞总RNA，用qPCR法检测VII型胶原蛋白和弹性蛋白基因表达量，结果如图3和表8所示，所有检测的样品浓度对COL7A1基因表达有显著促进作用，促进率分别为58％(p<0.05)，68％(p<0.05)和37％(p<0.05)。2％浓度下样品对ELN基因表达有显著促进作用，促进率为39％(p<0.01)。可以证实，本发明的黑松露提取物或提取液对VII型胶原蛋白COL7A1基因和弹性蛋白ELN基因表达有促进作用。
表8
用2％、1％和0.1％三个浓度的黑松露提取液样品处理人原代真皮成纤维细胞24h后，收集细胞总RNA，用qPCR法检测细胞衰老相关基因表达量。如图4和表9所示，2％样品对p16和p53基因表达有明显抑制作用，抑制率分别为35％(p<0.001)和34％(p<0.05)；2％样品对p21基因表达有一定抑制趋势，但差异不显著；1％样品对p16基因表达有显著抑制作用，抑制率为21％(p<0.05)。可以证实，本发明份黑松露提取物或提取液对细胞衰老相关基因p16、p53和p21表达有抑制作用。
表9
| 基因相对表达量平均值 | p16 | p21 | p53 |
| 空白组 | 100％ | 100％ | 100％ |
| 2％样品 | 65％ | 78％ | 66％ |
| 1％样品 | 79％ | 107％ | 88％ |
| 0.1％样品 | 91％ | 114％ | 110％ |
| 标准差SD值 | p16 | p21 | p53 |
| 空白组 | 1.31％ | 12.66％ | 11.07％ |
| 2％样品 | 3.93％ | 1.30％ | 7.36％ |
| 1％样品 | 9.02％ | 9.83％ | 13.40％ |
| 0.1％样品 | 14.32％ | 5.14％ | 3.04％ |
| 显著性P值vs.空白组 | p16 | p21 | p53 |
| 2％样品 | 0.0003 | 0.0616 | 0.0213 |
| 1％样品 | 0.0316 | 0.6250 | 0.3754 |
| 0.1％样品 | 0.4416 | 0.2330 | 0.3063 |
(5-2)黑松露提取液对人原代真皮成纤维细胞衰老β-半乳糖苷酶表达的影响
用2％、1％和0.1％三个浓度的黑松露提取液样品处理人原代皮肤成纤维细胞48h，细胞固定后用细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒进行染色，染色图像如图5所示，视野中蓝绿色部分为β-半乳糖苷酶阳性区域、红色为中性红复染后的细胞核区域；染色图像定量分析结果如图6所示。由图5，空白对照组的成纤维细胞β-半乳糖苷酶含量很低，只显示弱阳性染色结果；依托泊苷是一种已知能够诱导成纤维细胞衰老的化学品，本实验中含5μg/mL依托泊苷衰老诱导阴性组有很强的β-半乳糖苷酶活性，而含有IGF-1的阳性对照组β-半乳糖苷酶呈弱阳性，显示依托泊苷具有明显诱导成纤维细胞老化的作用，采用抗衰活性成分IGF-1可降低β-半乳糖苷酶活性。样品组与阴性对照组(衰老诱导阴性组)相比较也显示β-半乳糖苷酶活性受到抑制，降低了细胞群体的老化程度。
由图6可知，定量分析结果与显微镜观察结果一致，5μg/mL依托泊苷组与空白组(NT)相比β-半乳糖苷酶阳性细胞比率显著增加了72.4％，用阳性对照IGF-1处理后，β-半乳糖苷酶阳性率下降至39.5％。样品组细胞经2％和1％样品处理后，β-半乳糖苷酶阳性率显著下降，分别为44.7％和54.8％，与衰老诱导阴性组相比显著下降55.3％(P<0.01)和45.2％(P<0.05)。可以证实，本发明份黑松露提取物或提取液对β-半乳糖苷酶活性有抑制作用。
应用例4
(1)目的
通过招募62例年龄在25岁～55岁，面部皮肤经皮水分流失大于15g/m2/h、面部皮肤满足抬头纹等级≥2级、眼角皱纹等级≥2级、法令纹等级2～5级且存在泛红、粗糙、暗沉、干燥、松弛、缺乏弹性、屏障受损的现象的健康女性受试者连续使用测试样品14天、28天，通过仪器测试、图像分析和自评问卷的方法来观察样品使用前后的变化，从而对连续使用14天、28天样品抗衰、抗皱、紧致功效进行综合评估。
(2)测试方法参考下述的文件：
抗衰：TB-ZGKSL001-2022人体皮肤衰老评价标准；
抗皱：蔡慧珍,李嘉怡,林霁,等.一款含虫草提取物的抗皱眼霜功效评价[J].香料香精化妆品,2022(5):104-107。
(3)测试样品
黑松露乳液、空白对照样品的配方如下：
表10
使用方法：早晚洁面后，取适量本品乳液均匀涂抹于面部、眼部按摩至吸收，每天两次，早晚各一次，连续使用28天。
(4)受试者的选择
按受试者入选和排除标准选择合格的受试者，受试者自愿签署书面知情同意书，了解试验过程并自愿参加试验，确保最终完成有效例人数不低于30人/组。
(4-1)纳入标准：
(4-1-1)健康女性，年龄在25岁～55岁；(4-1-2)面部皮肤经皮水分流失大于15g/m2/h；
(4-1-3)面部皮肤满足抬头纹等级≥2级，眼角皱纹等级≥2级，法令纹等级2～5级且存在泛红、粗糙、暗沉、干燥、松弛、缺乏弹性、屏障受损的现象；4-1-4)能很好配合试验者，在研究期间能保持生活的规律性；(4-1-5)能够阅读和理解知情同意书的所有内容，并自愿签署知情同意书；
(4-2)排除标准：
(4-2-1)面部有皮肤疾病而可能影响对试验结果判断者；(4-2-2)正在接受治疗的呼吸道疾病患者和正在接受皮肤科治疗的人群；(4-2-3)妊娠、哺乳或在测试期间打算怀孕的女性者；(4-2-4)有严重心、肝、肾功能损害及严重免疫功能低下者；(4-2-5)有精神疾病、严重内分泌疾病者以及口服避孕药者；(4-2-6)30天内参加药物临床试验者或其它试验者，或近一周内有系统用对试验结果有影响的药物者；(4-2-7)14天内有口服和外用可能对试验结果有影响的美容产品者；(4-2-8)胰岛素依赖性糖尿病患者；(4-2-9)不能配合试验者；(4-2-10)研究者认为不适于参加本研究者；(4-2-11)其他相应的排除标准。
(5)测试设备
人体皮肤快速光学成像系统PRIMOS CR(LMI，加拿大)；皮肤表面纹理分析系统VC20plus(CK，德国)；皮肤水份测试探头CM825(CK，德国)；皮肤水分流失测试探头TM Hex(CK，德国)；皮肤弹性测试仪MPA580(CK，德国)；皮肤光泽度测试探头GL200(CK，德国)；皮肤黑色素和血红素测试探头MX18(CK，德国)；皮肤色度测试探头CL400(CK，德国)；皮肤超声测试仪UC22(CK，德国)。
(6)功效测试的指标
表11功效测试指标
表12受试者自我评估问卷指标
(7)测试环境
本次测试环境温度为20.0℃～22.0℃，环境湿度为40.0％～60.0％，符合方案设计的要求。
(8)测试过程
表13
(9)统计方法
应用统计分析软件进行数据的统计分析。计量资料表示为：均值±标准差，并进行正态分布检验，符合正态分布要求，自身前后的比较采用配对t检验，否则采用两个相关样本秩和检验；试验产品和对照组之间比较采用独立样本t检验或秩和检验。上述统计分析均为双尾检验，显著性水平为α＝0.05。
显著性标注方法：“n.s”表示无显著性差异，p>0.05；“*”表示有显著性差异，0.01<p≤0.05；“**”表示有非常显著性差异，0.001<p≤0.01；“***”表示有极显著性差异，p≤0.001。
(10)测试结果
(10-1)样本完成情况
对照组：入组31名受试者，最终完成31名受试者，有效测试人数为31名(N)，平均年龄为(39.5±10.6)岁。
样品组：入组31名受试者，最终完成31名受试者，有效测试人数为31名(N)，平均年龄为(37.3±7.2)岁。
(10-2)样品使用及耐受性反馈情况
每名受试者在28天内按要求使用测试样品，根据不良反应记录显示无任何不良反应出现。
(10-3)仪器测试结果及统计分析结果
(10-3-1)眼角皱纹的测试结果
表14眼角皱纹体积测试结果
表15眼角皱纹体积测试结果分析方法及测试结果评估
结合表14-15和图7可知，续使用测试样品14天，受试者的眼角皱纹体积与基础值相比有极显著性下降(p≤0.001)，下降率为13.94％；连续使用测试样品28天，受试者的眼角皱纹体积与基础值相比有非常显著性下降(0.001<p≤0.01)，下降率为14.47％；连续使用对照样品14天及28天，受试者的眼角皱纹体积与基础值相比无显著性变化(p>0.05)。
同时，采用另一种Mann-Whitney U检验眼角皱纹体积，结果如表16和图8。
表16眼角皱纹体积测试结果
可知，连续使用测试样品14天后的样品区域与对照区域相比，受试者的眼角皱纹体积有非常显著性下降(0.001<p≤0.01)；连续使用测试样品28天后的样品区域与对照区域相比，受试者的眼角皱纹体积有非常显著性下降(0.001<p≤0.01)。可见，本发明的黑松露提取物或乳液具有显著的眼角纹抗皱功效。
(10-3-2)抬头纹的测试结果
表17抬头纹体积测试结果
表18抬头纹体积测试结果分析方法及测试结果评估
由表17-18和图11可知，连续使用测试样品14天，受试者的抬头纹体积与基础值相比有极显著性下降(p≤0.001)，下降率为9.85％；连续使用测试样品28天，受试者的抬头纹体积与基础值相比有极显著性下降(p≤0.001)，下降率为18.26％。连续使用对照样品14天及28天，受试者的抬头纹体积与基础值相比无显著性变化(p>0.05)。
同时，采用另一种独立样本T检验抬头纹体积，结果如表19和图8。
表19抬头纹体积测试结果
连续使用测试样品14天后的样品区域与对照区域相比，受试者的抬头纹体积无显著性变化(p>0.05)；连续使用测试样品28天后的样品区域与对照区域相比，受试者的抬头纹体积有非常显著性下降(0.001<p≤0.01)。可见，本发明的黑松露提取物或乳液具有显著的抬头纹抗皱功效。
(10-3-3)法令纹的测试结果
表20法令纹体积测试结果
表21法令纹体积测试结果分析方法及测试结果评估
连续使用测试样品14天，受试者的法令纹体积与基础值相比有极显著性下降(p≤0.001)，下降率为16.80％；连续使用测试样品28天，受试者的法令纹体积与基础值相比有极显著性下降(p≤0.001)，下降率为18.44％。连续使用对照样品14天及28天，受试者的法令纹体积与基础值相比无显著性变化(p>0.05)。
同时，采用另一种Mann-Whitney U检验法令纹体积，结果如表22。
表22法令纹体积测试结果
连续使用测试样品14天后的样品区域与对照区域相比，受试者的法令纹体积有非常显著性下降(0.001<p≤0.01)；连续使用测试样品28天后的样品区域与对照区域相比，受试者的法令纹体积有非常显著性下降(0.001<p≤0.01)。可见，本发明的黑松露提取物或乳液具有显著的法令纹抗皱功效。
(10-3-4)皮肤皱纹参数Sew结果
表23皮肤皱纹参数SEw测试结果
表24皮肤皱纹参数SEw测试结果分析方法及测试结果评估
连续使用测试样品14天，受试者的皮肤皱纹参数SEw与基础值相比有非常显著性下降(0.001<p≤0.01)，下降率为11.27％；连续使用测试样品28天，受试者的皮肤皱纹参数SEw与基础值相比有极显著性下降(p≤0.001)，下降率为22.75％；连续使用对照样品14天，受试者的皮肤皱纹参数SEw与基础值相比有非常显著性下降(0.001<p≤0.01)，下降率为5.40％；连续使用对照样品28天，受试者的皮肤皱纹参数SEw与基础值相比无显著性变化(p>0.05)。
同时，采用独立样本T检验分析，结果如下：
表25皮肤皱纹参数SEw测试结果
连续使用测试样品14天后的样品区域与对照区域相比，受试者的皮肤皱纹参数SEw无显著性变化(p>0.05)；连续使用测试样品28天后的样品区域与对照区域相比，受试者的皮肤皱纹参数SEw有极显著性下降(p≤0.001)。可见，本发明黑松露提取物或乳液具有显著的皮肤抗皱功效。
(10-3-5)皮肤平滑度SEsm结果。
表26皮肤平滑度SEsm测试结果
表27皮肤平滑度SEsm试结果分析方法及测试结果评估
连续使用测试样品14天，受试者的皮肤平滑度SEsm与基础值相比有极显著性下降(p≤0.001)，下降率为7.28％；连续使用测试样品28天，受试者的皮肤平滑度SEsm与基础值相比有极显著性下降(p≤0.001)，下降率为17.23％。连续使用对照样品14天，受试者的皮肤平滑度SEsm与基础值相比有非常显著性下降(0.001＜p≤0.01)，下降率为3.81％；连续使用对照样品28天，受试者的皮肤平滑度SEsm与基础值相比有极显著性下降(p≤0.001)，下降率为7.66％。
同时，采用独立样本T检验分析，结果如下：
表28皮肤平滑度SEsm测试结果
连续使用测试样品14天后的样品区域与对照区域相比，受试者的皮肤平滑度SEsm无显著性变化(p>0.05)；连续使用测试样品28天后的样品区域与对照区域相比，受试者的皮肤平滑度SEsm有非常显著性下降(0.001<p≤0.01)。可见，本发明黑松露提取物或乳液具有显著的平滑皮肤功效。
(10-3-6)皮肤角质层水分含量(C.U.)
表29皮肤角质层水分含量测试结果
表30皮肤角质层水分含量测试结果
连续使用测试样品14天，受试者的皮肤角质层水分含量与基础值相比有极显著性上升(p≤0.001)，上升率为20.75％；连续使用测试样品28天，受试者的皮肤角质层水分含量与基础值相比有极显著性上升(p≤0.001)，上升率为38.11％。连续使用对照样品14天，受试者的皮肤角质层水分含量与基础值相比无显著性变化(p>0.05)；连续使用对照样品28天，受试者的皮肤角质层水分含量与基础值相比有非常显著性下降(0.001<p≤0.01)，下降率为9.32％。
同时，采用独立样本T检验分析，结果如下：
表31皮肤角质层水分含量测试结果
连续使用测试样品14天后的样品区域与对照区域相比，受试者的皮肤角质层水分含量有极显著性上升(p≤0.001)；连续使用测试样品28天后的样品区域与对照区域相比，受试者的皮肤角质层水分含量有极显著性上升(p≤0.001)。可见，本发明黑松露提取物或乳液具有显著的皮肤保湿功效。
(10-3-7)皮肤经皮水分流失(g/m2/h)
表32皮肤经皮水分流失测试结果
表33皮肤经皮水分流失测试结果
连续使用测试样品14天，受试者的皮肤经皮水分流失与基础值相比有极显著性下降(p≤0.001)，下降率为14.47％；连续使用测试样品28天，受试者的皮肤经皮水分流失与基础值相比有极显著性下降(p≤0.001)，下降率为32.66％。连续使用对照样品14天及28天，受试者的皮肤经皮水分流失与基础值相比无显著性变化(p>0.05)。
同时，采用Mann-Whitney U检验、独立样本T检验分析，结果如下：
表34皮肤经皮水分流失测试结果
连续使用测试样品14天后的样品区域与对照区域相比，受试者的皮肤经皮水分流失有极显著性下降(p≤0.001)；连续使用测试样品28天后的样品区域与对照区域相比，受试者的皮肤经皮水分流失极显著性下降(p≤0.001)。可见，本发明黑松露提取物或乳液具有显著的防止皮肤经皮水分流失的功效。
(10-3-8)皮肤弹性R2
表35皮肤弹性R2测试结果
表36皮肤弹性R2测试结果
连续使用测试样品14天，受试者的皮肤弹性R2与基础值相比有显著性上升(0.01<p≤0.05)，上升率为6.27％；连续使用测试样品28天，受试者的皮肤弹性R2与基础值相比有极显著性上升(p≤0.001)，上升率为31.58％。连续使用对照样品14天，受试者的皮肤弹性R2与基础值相比非常显著性下降(0.001<p≤0.01)，下降率为8.16％；连续使用对照样品28天，受试者的皮肤弹性R2与基础值相比有显著性下降(0.01<p≤0.05)，下降率为6.18％。
同时，采用独立样本T检验分析，结果如下：
表37皮肤弹性R2测试结果
连续使用测试样品14天后的样品区域与对照区域相比，受试者的皮肤弹性R2有极显著性上升(p≤0.001)；连续使用测试样品28天后的样品区域与对照区域相比，受试者的皮肤弹性R2有极显著性上升(p≤0.001)。可见，本发明黑松露提取物或乳液具有显著提高皮肤弹性(R2)的功效。
(10-3-9)皮肤弹性R7
表38皮肤弹性R7测试结果
表39皮肤弹性R7测试结果
连续使用测试样品14天，受试者的皮肤弹性R7与基础值相比有显著性上升(0.01<p≤0.05)，上升率为7.82％；连续使用测试样品28天，受试者的皮肤弹性R7与基础值相比有极显著性上升(p≤0.001)，上升率为30.94％。连续使用对照样品14天及28天，受试者的皮肤弹性R7与基础值相比无显著性变化(p>0.05)。
同时，采用独立样本T检验分析，结果如下：
表40皮肤弹性R7测试结果
连续使用测试样品14天后的样品区域与对照区域相比，受试者的皮肤弹性R7有非常显著性上升(0.001<p≤0.01)；连续使用测试样品28天后的样品区域与对照区域相比，受试者的皮肤弹性R7有极显著性上升(p≤0.001)。可见，本发明黑松露提取物或乳液具有显著提高皮肤弹性(R7)的功效。
(10-3-10)皮肤紧致度F4
表41皮肤紧致度F4测试结果
表42皮肤紧致度F4测试结果
连续使用测试样品14天，受试者的皮肤紧致度F4(绝对值)与基础值相比有极显著性下降(p≤0.001)，下降率为33.27％；连续使用测试样品28天，受试者的皮肤紧致度F4与基础值相比有极显著性下降(p≤0.001)，下降率为59.15％。连续使用对照样品14天及28天，受试者的皮肤紧致度F4(绝对值)与基础值相比无显著性变化(p>0.05)。
同时，采用Mann-Whitney U检验分析，结果如下：
表43皮肤紧致度F4测试结果
连续使用测试样品14天后的样品区域与对照区域相比，受试者的皮肤紧致度F4有极显著性下降(p≤0.001)；连续使用测试样品28天后的样品区域与对照区域相比，受试者的皮肤紧致度F4有极显著性下降(p≤0.001)。可见，本发明黑松露提取物或乳液具有显著提高皮肤紧致的功效。
(10-3-11)皮肤光泽度
表44皮肤光泽度测试结果
表45皮肤光泽度测试结果
连续使用测试样品14天，受试者的皮肤光泽度与基础值相比有极显著性上升(p≤0.001)，上升率为12.71％；连续使用测试样品28天，受试者的皮肤光泽度与基础值相比有极显著性上升(p≤0.001)，上升率为26.17％。连续使用对照样品14天，受试者的皮肤光泽度与基础值相比无显著性变化(p>0.05)；连续使用对照样品28天，受试者的皮肤光泽度与基础值相比有非常显著性下降(0.001<p≤0.01)，下降率为8.08％。
同时，采用独立样本T检验分析，结果如下：
表46皮肤光泽度测试结果
连续使用测试样品14天后的样品区域与对照区域相比，受试者的皮肤光泽度有极显著性上升(p≤0.001)；连续使用测试样品28天后的样品区域与对照区域相比，受试者的皮肤光泽度有极显著性上升(p≤0.001)。可见，本发明黑松露提取物或乳液具有显著提高皮肤光泽度的功效。
(10-3-12)皮肤黑色素含量
表47皮肤黑色素含量测试结果
表48皮肤黑色素含量测试结果
连续使用测试样品14天及28天，受试者的皮肤黑色素含量与基础值相比无显著性变化(p>0.05)。连续使用对照样品14天，受试者的皮肤黑色素含量与基础值相比有极显著性上升(p≤0.001)，上升率为19.73％；连续使用对照样品28天，受试者的皮肤黑色素含量与基础值相比有非常显著性上升(0.001＜p≤0.01)，上升率为16.56％。
同时，采用独立样本T检验分析，结果如下：
表49皮肤黑色素含量测试结果
连续使用测试样品14天后的样品区域与对照区域相比，受试者的皮肤黑色素含量有极显著性下降(p≤0.001)；连续使用测试样品28天后的样品区域与对照区域相比，受试者的皮肤黑色素含量有非常显著性下降(0.001<p≤0.01)。可见，本发明黑松露提取物或乳液可以显著降低皮肤黑色素含量。
(10-3-13)皮肤血红素含量
表50皮肤血红素含量测试结果
表51皮肤血红素含量测试结果
连续使用测试样品14天，受试者的皮肤血红素含量与基础值相比有极显著性下降(p≤0.001)，下降率为11.32％；连续使用测试样品28天，受试者的皮肤血红素含量与基础值相比有极显著性下降(p≤0.001)，下降率为25.85％。连续使用对照样品14天及28天，受试者的皮肤血红素含量与基础值相比无显著性变化(p>0.05)。
同时，采用独立样本T检验分析，结果如下：
表52皮肤血红素含量测试结果
连续使用测试样品14天后的样品区域与对照区域相比，受试者的皮肤血红素含量有极显著性下降(p≤0.001)；连续使用测试样品28天后的样品区域与对照区域相比，受试者的皮肤血红素含量有极显著性下降(p≤0.001)。可见，本发明黑松露提取物或乳液可以显著降低皮肤血红素含量的功效。
(10-3-14)皮肤红度a值
表53皮肤红度a值测试结果
表54皮肤红度a值测试结果
连续使用测试样品14天，受试者的皮肤红度a值与基础值相比有极显著性下降(p≤0.001)，下降率为13.97％；连续使用测试样品28天，受试者的皮肤红度a值与基础值相比有极显著性下降(p≤0.001)，下降率为19.20％。连续使用对照样品14天，受试者的皮肤红度a值与基础值相比有极显著性下降(p≤0.001)，下降率为10.01％；连续使用对照样品28天，受试者的皮肤红度a值与基础值相比有极显著性下降(p≤0.001)，下降率为13.01％。
同时，采用Mann-Whitney U检验、独立样本T检验分析，结果如下：
表55皮肤红度a值测试结果
连续使用测试样品14天后的样品区域与对照区域相比，受试者的皮肤红度a值有显著性下降(0.01<p≤0.05)；连续使用测试样品28天后的样品区域与对照区域相比，受试者的皮肤红度a值有非常显著性下降(0.001<p≤0.01)。可见，本发明黑松露提取物或乳液可以显著降低皮肤红度a值的功效。
(10-3-15)皮肤真皮层密度
表56皮肤真皮层密度测试结果
表57皮肤真皮层密度测试结果
连续使用测试样品14天，受试者的皮肤真皮层密度与基础值相比无显著性变化(p>0.05)；连续使用测试样品28天，受试者的皮肤真皮层密度与基础值相比有极显著性上升(p≤0.001)，上升率为21.44％。连续使用对照样品14天及28天，受试者的皮肤真皮层密度与基础值相比无显著性变化(p>0.05)。
同时，采用独立样本T检验分析，结果如下：
表58皮肤真皮层密度测试结果
连续使用测试样品14天后的样品区域与对照区域相比，受试者的皮肤真皮层密度无显著性变化(p>0.05)；连续使用测试样品28天后的样品区域与对照区域相比，受试者的皮肤真皮层密度有非常显著性上升(0.001<p≤0.01)。可见，本发明黑松露提取物或乳液可以显著提高皮肤真皮层密度的功效。
(10-4)自我评估结果及统计分析结果
表59受试者使用测试样品28天的评价如下：
*评价指标：1分为“非常不满意”，2分为“不满意”，3分为“一般”，4分为“满意”，5分为“非常满意”，表中为统计N≥4分的人数的占比。*使用测试样品人数＝31。
可见，连续使用测试样品14天，100.00％的受试者对保湿效果、改善皮肤干燥效果、能强化皮肤屏障的效果、减少皮肤水分流失、舒缓皮肤效果、缓解皮肤泛红效果、增加皮肤弹性效果、饱满亮泽肌肤效果、改善皮肤暗沉效果、促进皮肤细腻的效果、使用样品4小时后依旧舒适的效果和样品温和性感到满意，100.00％的受试者对样品总体感到满意，96.77％的受试者对皮肤皱纹有显著抚平的效果感到满意，96.77％的受试者对紧致嫩肤效果感到满意，96.77％的受试者对平滑皮肤效果感到满意。
连续使用测试样品28天，100.00％的受试者对保湿效果、改善皮肤干燥效果、能强化皮肤屏障的效果、减少皮肤水分流失、舒缓皮肤效果、缓解皮肤泛红效果、增加皮肤弹性效果、饱满亮泽肌肤效果、改善皮肤暗沉效果、促进皮肤细腻的效果、使用样品4小时后依旧舒适的效果、样品温和性、皮肤皱纹有显著抚平的效果、紧致嫩肤效果和平滑皮肤效果感到满意，100.00％的受试者对样品总体感到满意。
基于上述的测试，本发明通过62例年龄在25岁～55岁，面部皮肤经皮水分流失大于15g/m2/h、面部皮肤满足抬头纹等级≥2级、眼角皱纹等级≥2级、法令纹等级2～5级且存在泛红、粗糙、暗沉、干燥、松弛、缺乏弹性、屏障受损的现象的健康女性受试者连续使用测试样品14天、28天，由测试结果可得知该测试样品具有以下功效：
仪器测试评估结果显示：
表60
综上所述仪器测试评估结果和自我评估结果，连续使用黑松露乳液14天和28天，可具有皮肤保湿、改善皮肤干燥效果，防止皮肤经皮水分流失、减少皮肤水分流失效果，提高皮肤弹性、皮肤光泽度效果、平滑皮肤效果，降低皮肤黑色素、改善皮肤暗沉效果，降低皮肤血红素含量、舒缓皮肤效果，降低皮肤红度a值、缓解皮肤泛红效果，提高皮肤真皮层密度、能强化皮肤屏障的效果，实现抗老、抗衰、抗皱、舒缓、改善暗沉、平滑皮肤、保湿等综合效果。
(10-5)不良反应/事件处理
通过人体试用试验来观察样品对人体皮肤安全性，受试者回访时，仔细询问、检查并记录受试者在使用样品期间所发生的任何不良事件，包括不良事件的表现、发生时间、处理措施及转归，并对不良事件与所使用样品的关系做出判断。
表61人体试用试验皮肤不良反应
| 皮肤反应 | 分级 | 第0天 | 第14天 | 第28天 |
| 无反应 | 0 | 62例 | 62例 | 62例 |
| 微弱红斑 | 1 | 0例 | 0例 | 0例 |
| 红斑、浸润、丘疹 | 2 | 0例 | 0例 | 0例 |
| 红斑、水肿、丘疹、水疱 | 3 | 0例 | 0例 | 0例 |
| 红斑、水肿、大疱 | 4 | 0例 | 0例 | 0例 |
结果显示，62名受试者进行28天人体试用试验研究，未见上述任何皮肤不良反应。
应用例5-7和对比例4-5
黑松露提取物复配珠丝毛蓝耳草(CYANOTIS ARACHNOIDEA)根提取物在抗衰、抗皱、舒缓、紧致等皮肤调理方面功效测试：
本应用例和对比例中的测试方法、设备、指标及相应的人员要求参照应用例4，测试样品的配方如下表62所示。测试了使用应用例5-7和对比例4-5样品28天后的仪器测试结果，如表63所示，其中，表中的改善率表示相应的指标相比于基础值的提高率或降低率。
表62(以wt％计)
表63连续使用测试样品28天
由上述应用例4-7和对比例4-5可知，本发明的黑松露提取物可以与珠丝毛蓝耳草根提取物复配，在皮肤调理方面具有协同作用，可以显著改善皮肤问题，特别是抗皱、舒缓皮肤方面，具有更优的改善率。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (15)
1.一种黑松露提取物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将黑松露粉体、水、羟丙基-β-环糊精混合，并在搅拌下进行提取反应，再将白色硅藻土加入到提取反应结束后得到的料液中，搅拌混合，最后经过加压过滤以及灭菌处理，得到黑松露提取物；
所述黑松露粉体和水的质量比为(0.001-0.12):1。
2.如权利要求1所述的黑松露提取物的制备方法，其特征在于，所述提取反应的温度为40-70℃，所述提取反应的时间为1-5h。
3.如权利要求1所述的黑松露提取物的制备方法，其特征在于，所述黑松露粉体和水的质量比为(0.005-0.02):1。
4.如权利要求1所述的黑松露提取物的制备方法，其特征在于，所述羟丙基-β-环糊精和黑松露粉体的质量比为(0.025-1.5):1。
5.如权利要求1所述的黑松露提取物的制备方法，其特征在于，所述加压过滤的滤层依次为红色硅藻土滤层、微孔滤膜和滤纸；所述白色硅藻土还经过水洗，所述水洗所用的水的温度为80-100℃，所述加压过滤的压力为1-4Kg。
6.如权利要求1所述的黑松露提取物的制备方法，其特征在于，所述灭菌处理的温度为80-85℃，所述灭菌处理的时间为20-60min；所述黑松露粉体的目数为80-100目。
7.一种权利要求1-6任意一项所述的黑松露提取物的制备方法制得的黑松露提取物。
8.一种黑松露提取液，其特征在于，包括权利要求7所述的黑松露提取物和多元醇。
9.如权利要求8所述的黑松露提取液，其特征在于，所述多元醇包括丙二醇、丁二醇、戊二醇、己二醇中的至少一种；在黑松露提取液中，所述多元醇的质量百分含量为25-35％；所述黑松露提取液还包括防腐剂。
10.一种化妆品，其特征在于，包括权利要求7所述的黑松露提取物或权利要求8-9任意一项所述的黑松露提取液。
11.如权利要求10所述的化妆品，其特征在于，所述化妆品包括乳液、精华液、面膜、面霜、洗面奶、洗手液、沐浴露、化妆水中的任意一种。
12.如权利要求10所述的化妆品，其特征在于，还包括珠丝毛蓝耳草根提取物。
13.如权利要求12所述的化妆品，其特征在于，在所述化妆品中含有黑松露提取物或黑松露提取液与珠丝毛蓝耳草根提取物，黑松露提取物或黑松露提取液与珠丝毛蓝耳草根提取物的质量比为(0.5-3)：(0.001-0.2)。
14.一种权利要求7所述的黑松露提取物或权利要求8-9任意一项所述的黑松露提取液在制备化妆品中的应用，其特征在于，所述黑松露提取物或所述黑松露提取液在化妆品中具有皮肤调理作用的活性成分，所述皮肤调理作用包括如下中的至少一种：(I)抗皱作用；(II)抗衰老作用；(III)紧致皮肤作用；(IV)保湿作用；(V)舒缓作用；(Ⅵ)平滑皮肤作用；(Ⅶ)改善皮肤暗沉作用；(Ⅷ)缓解皮肤泛红作用；(Ⅸ)修复皮肤屏障作用。
15.如权利要求14所述的应用，其特征在于，包括如下中的至少一种：
所述抗皱作用包括对SIRT基因表达有促进作用；所述SIRT基因为SIRT1、SIRT4、SIRT5、SIRT4、SIRT7中的至少一种；
所述紧致皮肤作用包括对VII型胶原蛋白和/或弹性蛋白基因表达有促进作用；所述VII型胶原蛋白为COL7A1基因，所述弹性蛋白基因为ELN基因；
所述抗衰老作用包括对细胞衰老相关基因表达有抑制作用和/或对β-半乳糖苷酶活性有抑制作用，所述细胞衰老相关基因为p16、p53、p21中的至少一种。
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