CN118389717A - 一种扩增完全氨氧化菌Comammox氨单加氧酶基因的引物及其应用 - Google Patents
一种扩增完全氨氧化菌Comammox氨单加氧酶基因的引物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种扩增完全氨氧化菌Comammox氨单加氧酶基因的引物及其应用。该引物能同时扩增CladeA、CladeB两个分支的氨单加氧酶A亚基基因。本发明提供的引物扩增的特异性好、准确性高、扩增片段长度合适，为完全氨氧化菌的定性和定量检测以及扩增子的高通量测序分析提供了一种准确、便捷、可靠的方法。
Description
技术领域
本发明涉及环境微生物及生态学领域，特别涉及一种扩增完全氨氧化菌Comammox氨单加氧酶基因的引物及其应用。
背景技术
硝化作用即氨通过亚硝酸盐氧化成硝酸盐，是生物地球化学氮循环的重要过程，在生物废水处理和农业生产的氮肥流失控制中起着重要作用。硝化作用一直被认为是由分别氧化氨和亚硝酸盐的微生物协同完成的。完全氨氧化菌(Comammox)是一类新发现的能直接将氨氧化成硝酸盐的微生物，为应对这一发现需要开发新的方法来检测和量化Comammox，以评估它们对硝化作用的贡献及与其它硝化微生物之间的功能关系。
目前已发现的Comammox在分类上都归属于亚硝酸盐氧化细菌的Nitrospira属且不形成单系分支，因此传统的基于16S rRNA基因序列的系统发育分析无法区分完全氨氧化菌与亚硝酸盐氧化细菌。氨单加氧酶(AMO)是完全氨氧化菌执行硝化过程的关键酶，编码AMO亚基A(amoA)的基因是氨氧化细菌和古细菌研究中广泛使用的功能和系统发育标记基因。Comammox的amoA基因序列具有一定的保守性，全长在900bp左右，且在基因组中通常只有1-2个拷贝，因此基于amoA基因的序列可以分析Comammox的多样性，基于amoA基因数量可以间接反应Comammox的数量。针对amoA基因设计特异性引物可以用于对Comammox的定性、定量检测及高通量测序的多样性分析。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种扩增完全氨氧化菌Comammox氨单加氧酶基因的引物。
本发明的另一目的在于，提供上述引物在完全氨氧化菌Comammox的检测、定量及扩增子高通量测序分析中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种扩增完全氨氧化菌Comammox氨单加氧酶基因的引物，为如下引物对中的至少一种：
F1：GACTGGGATTTCTGGNTNGAYTGG；
F2：TATMGGCAGCCATTYGGNGCRAC；
R1：ACCTCGATCATCCGGATRTAYTCNGG；
R2：GAMGAACTKCCCRAWYTGCCACCA；
以上引物两两组合配对，所得到的引物对F1/R1、F1/R2、F2/R1、F2/R2。
所述的扩增完全氨氧化菌Comammox氨单加氧酶基因的引物为简并引物。
所述的扩增完全氨氧化菌Comammox氨单加氧酶基因的引物扩增得到的特异性条带长度为359～576bp；优选的，引物对F1/R1扩增得到的特异性条带长度为467bp，引物对F1/R2扩增得到的特异性条带长度为576bp，引物对F2/R1扩增得到的特异性条带长度为359bp，引物对F2/R2扩增得到的特异性条带长度为465bp。
所述的扩增完全氨氧化菌Comammox氨单加氧酶基因的引物，其核苷酸序列含有简并碱基，其中N指的是该位置的碱基为等比例的A、G、C和T，Y指的是该位置的碱基为等比例的C和T，R指的是该位置的碱基为等比例的A和G，M指的是该位置的碱基为等比例的A和C，K指的是该位置的碱基为等比例的G和T，W指的是该位置的碱基为等比例的A和T。
上述扩增完全氨氧化菌Comammox氨单加氧酶基因的引物在完全氨氧化菌Comammox的检测、定量及扩增子高通量测序分析中的应用。
上述的应用能够同时涵盖完全氨氧化菌Comammox的CladeA和CladeB两个进化分支。
一种检测完全氨氧化菌Comammox的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测样本的基因组DNA；
(2)使用扩增完全氨氧化菌Comammox氨单加氧酶基因的引物对样本的基因组DNA进行PCR扩增，并进行琼脂糖凝胶电泳，若扩增出对应条带，则证明样本中含有完全氨氧化菌Comammox。
一种对完全氨氧化菌Comammox定量的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测样本的基因组DNA；
(2)使用扩增完全氨氧化菌Comammox氨单加氧酶基因的引物对样本的基因组DNA进行PCR扩增，并进行琼脂糖凝胶电泳，切胶纯化回收扩增产物，构建质粒并克隆表达，提取该质粒测定核酸浓度并计算拷贝数浓度，然后进行梯度稀释；
(3)使用扩增完全氨氧化菌Comammox氨单加氧酶基因的引物对质粒进行荧光定量PCR扩增，建立质粒标准品拷贝数浓度与达到荧光域值时的循环数Ct值之间的标准曲线；
(4)使用扩增完全氨氧化菌Comammox氨单加氧酶基因的引物对样本的基因组DNA进行荧光定量PCR扩增，将结果代入上述标准曲线中，获得样本中完全氨氧化菌的数量。
一种通过高通量测序对完全氨氧化菌Comammox氨单加氧酶基因扩增子的多样性进行分析的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测样本的基因组DNA；
(2)使用扩增完全氨氧化菌Comammox氨单加氧酶基因的引物对样本的基因组DNA进行PCR扩增，并进行琼脂糖凝胶电泳，切胶纯化回收，得到扩增产物；
(3)对扩增产物进行高通量测序，并根据测序结果进行多样性分析。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明提供了一种扩增完全氨氧化菌Comammox氨单加氧酶基因的引物及其应用，该引物能同时扩增CladeA和CladeB分支的amoA基因，在应用中极大简化操作步骤；与其它能同时扩增两个分支的引物相比本发明提供的引物表现出更好的扩增效果，在应用中能获得更准确的检测结果。
附图说明
图1是完全氨氧化菌amoA基因参考核苷酸序列构建的系统发育树示意图。
图2是本发明设计的四组引物对样本的PCR扩增产物电泳结果示意图，其中各泳道分别为M：DL2000DNAMarker、A：菜地土、B：茶树土、C：果树土1、D：果树土2、E：滩涂土、F：花土、CK：阴性对照、P：完全氨氧化菌富集培养物。
图3是三组已报道的能同时扩增CladeA和CladeB分支amoA基因的引物comamoAF/comamoAR、A189Y/C576r/CA209f(通过巢式PCR扩增，A189Y/C576r用于第一步扩增，CA209f/C576r用于第二步扩增)、Ntsp-amoA162F/Ntsp-amoA359R和引物F1/R1对样本的PCR扩增产物电泳结果示意图，其中各泳道分别为M：DL2000DNAMarker、A：菜地土、B：茶树土、C：果树土1、D：果树土2、E：滩涂土、F：花土、CK：阴性对照、P：完全氨氧化菌富集培养物。
图4是引物F1/R1用于荧光定量PCR扩增时质粒标准品拷贝数浓度与达到荧光域值时的循环数Ct值之间建立的标准曲线示意图。
图5是引物F1/R1用于荧光定量PCR扩增质粒标准品时的熔解曲线示意图。
图6是引物F1/R1用于6个土壤样本扩增子高通量测序分析的代表序列ASV(read数占各自样本总read数的1％以上)与45条完全氨氧化菌amoA基因参考序列共建的系统发育树示意图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下面实施方案中若未注明具体试验条件，则通常按照常规试验条件或按照试剂公司所建议的试验条件。所使用的材料、试剂等，若无特殊说明，均为从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
完全氨氧化菌Comammox属于未培养和难培养微生物，目前可获得的参考amoA基因序列较少，且amoA基因序列在系统发育上又形成Clade A和Clade B两个分支，因此虽然已报道一些相关的引物但在应用中还存在如下问题：
(1)使用只能扩增Clade A或B分支amoA基因的引物检测样本时需要两种引物分别扩增再合并结果分析，操作繁琐；
(2)已知的可同时扩增Clade A和B分支amoA基因的引物，其特异性较差，应用于样本PCR扩增检测时出现假阳或假阴性的结果，用于荧光定量PCR(Q-PCR)扩增时会高估或低估样本中Comammox的数量；
(3)引物扩增序列长度过短，能获得的序列信息有限，不适合应用于PCR扩增的测序分类鉴定和扩增子的高通量测序分析Comammox多样性。
为了解决上述问题，本发明根据实验室前期实验经验，设计了一种同时扩增完全氨氧化菌Comammox Clade A和B分支的高特异性引物，具体如下：
从NCBI检索下载完全氨氧化菌的基因组，从基因组中搜索获得共45条amoA基因核苷酸序列，将序列导入MEGA11中构建系统发育树，如图1所示，获得的序列涵盖CladeA和CladeB两个分支。将序列翻译成氨基酸序列，选取保守的区域，手工设计扩增两个分支的amoA基因的简并引物，如表1所示：
表1引物序列及扩增信息
注：引物的核苷酸序列含有简并碱基，其中N指的是该位置的碱基为等比例的A、G、C和T，Y指的是该位置的碱基为等比例的C和T，R指的是该位置的碱基为等比例的A和G，M指的是该位置的碱基为等比例的A和C，K指的是该位置的碱基为等比例的G和T，W指的是该位置的碱基为等比例的A和T。
实施例2引物扩增效果的验证实验
根据实施例1设计得到的简并引物的扩增原理，可以两两配对实现对完全氨氧化菌amoA基因的扩增，为了验证其效果，实现在复杂的土壤样本中准确地检出完全氨氧化菌，现设计实验扩增土壤基因组以验证引物的扩增效果，具体步骤如下：
(1)采集6个土壤样本，包括A：菜地土、B：茶树土、C：果树土1、D：果树土2、E：滩涂土、F：花土；
(2)取0.5g土样使用Soil DNA Kit(Omega)按照说明书流程提取基因组DNA，一式三份，然后将每种土样提取得到的三份基因组DNA混合成一份备用；
(3)收集完全氨氧化菌富集培养物的菌体，使用CTAB法提取基因组DNA备用，该富集培养物是基于实验室前期工作经验从水处理厂污泥中富集培养得到的，经理化活性测定及克隆子测序验证样本中含有CladeA分支的完全氨氧化菌，作为样本P组；
(4)将实施例1设计得到的引物两两配对，分别使用F1/R1、F1/R2、F2/R1、F2/R2对7个样本进行PCR扩增，以验证引物的特异性，反应体系及反应条件如表2、表3所示：
表2 PCR反应体系
表3 PCR反应条件
| 步骤1 | 94℃，5min |
| 步骤2 | 94℃，30s |
| 步骤3 | 60℃，30s |
| 步骤4 | 72℃，40s |
| 步骤5 | 步骤2-4重复20个循环，且每次循环步骤3温度减0.5℃ |
| 步骤6 | 94℃，30s |
| 步骤7 | 50℃，30s |
| 步骤8 | 72℃，40s |
| 步骤9 | 步骤6-8重复15个循环 |
| 步骤10 | 72℃，5min |
(5)对PCR扩增产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，每个泳道上样量4μL。结果如图2所示，实验结果显示，引物F1/R2对环境样本扩增失败，证明无法实现有效检测；其余3组引物中，F2/R2和F2/R1组虽然也能实现一定的扩增效果，但条带不清晰，且无法扩增部分样本；F1/R1组的扩增效果最好，对所有样本的扩增条带清晰明亮。
实施例3与其他类似引物的扩增效果对比验证
选取3组文献中已报道的能同时扩增CladeA和CladeB分支的amoA基因的引物comamoA F/comamoA R(引自Abundance and community composition of comammoxbacteria in different ecosystems by a universal primer set[J].Science of thetotal environment,2019,691:146-155.)、A189Y/C576r/CA209f(引自Ubiquity anddiversity of complete ammonia oxidizers(comammox)[J].Applied andEnvironmental Microbiology,2018,84(24):e01390-18，通过巢式PCR扩增，A189Y/C576r用于第一步扩增，CA209f/C576r用于第二步扩增)和Ntsp-amoA162F/Ntsp-amoA359R(引自Comammox Nitrospira are abundant ammonia oxidizers in diverse groundwater-fedrapid sand filter communities[J].Environmental microbiology,2018,20(3):1002-1015.)，以及本发明提供的引物F1/R1对实施例2所述的6个土壤样本和1个富集培养物样本的基因组DNA进行PCR扩增。已报道的3组引物序列及扩增长度信息如表4所示，其PCR反应体系及条件与引物出处的报道相同，F1/R1的扩增方法参照实施例2。
表4三组引物的序列及扩增长度
将4组引物的扩增产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，每个泳道上样量4μL。结果如图3所示，实验结果显示，引物comamoA F/comamoA R和Ntsp-amoA162F/Ntsp-amoA359R扩增得到的条带较暗，且存在非特异性扩增；引物A189Y/C576r/CA209f的扩增条带明亮，但也存在非特异性扩增，且该引物通过巢式PCR分两步扩增，操作繁琐，无法用于荧光定量PCR；引物F1/R1对所有样本的扩增条带单一且明亮，表明了该引物及反应条件具有良好的扩增效果，适用于PCR扩增检测样本中的完全氨氧化菌。
实施例4引物用于荧光定量PCR扩增的验证实验
使用本发明提供的引物F1/R1对实施例2所述的完全氨氧化菌富集培养物样本的基因组DNA进行PCR扩增，扩增方法参照实施例2，然后进行凝胶电泳，对长度为467bp的条带切胶纯化回收。
参照说明书流程使用TA Zero Background Fast Cloning Kit(庄盟)和DH5α感受态细胞(庄盟)将回收的片段克隆表达，培养后收集菌体使用Fast Plasmid Miniprep Kit(庄盟)提取质粒；使用分光光度计测量质粒核酸浓度为154.652ng/μL，经由式1换算质粒的拷贝数浓度为6.0489×1010copies/μl，然后按10倍梯度稀释制备标准品，获得6.0489×108、6.0489×107、6.0489×106、6.0489×105、6.0489×104、6.0489×103copies/μl系列浓度的质粒标准品。
式1：质粒标准品拷贝数浓度计算公式
式中：
N为质粒拷贝数浓度(copies/μL)；
C为测得的质粒DNA浓度(ng/μL)；
L为1拷贝质粒DNA的碱基数(bp/copy)；
660为一个碱基对的道尔顿(Daltons/bp)；
Daltons为道尔顿，质量单位，1g约为6.02×1023Daltons。
使用引物F1/R1对质粒标准品在荧光定量PCR仪(AppliedBiosystemsTMQuantStudio1)上进行Q-PCR扩增，每个浓度的标准品均设3个平行样，扩增体系如表5所示，扩增条件为：94℃预变形4min；扩增反应94℃15s、60℃15s、72℃34s，共40个循环；熔解曲线反应条件为：95℃15s、60℃60s、95℃1s。
表5 Q-PCR反应体系
扩增完成后由QuantStudioTMDesign&Analysis Software程序自动建立标准品初始模板数与达到荧光域值时的循环数Ct值之间的标准曲线。可以看到标准曲线线性关系较好，R2为0.999，斜率为-3.552，扩增效率为91.223％(如图4所示)，且扩增的熔解曲线峰性单一(如图5所示)，表明扩增的特异性良好。由此可见，引物F1/R1及反应条件符合Q-PCR试验要求，可以用于完全氨氧化菌的定量检测。
实施例5引物用于扩增子高通量测序及扩增产物质控的验证实验
为了验证引物F1/R1对土壤样本扩增结果的准确性及该引物是否适用于完全氨氧化菌amoA基因的扩增子高通量测序分析，使用引物F1/R1对实施例2中的6种土壤样本基因组DNA进行PCR扩增，方法参照实施例2。对扩增的产物进行凝胶电泳验证后切胶纯化回收长度467bp的目的片段，然后送往商业公司完成测序文库构建及Miseq PE300双端扩增子高通量测序。
对高通量测序的数据使用Qiime2中的DADA2插件进行降噪、嵌合体过滤及序列拼接处理，获得扩增子高通量测序的代表序列ASVs和特征表。选取样本中read数占各自样本总read数1％以上的代表序列213条与实施例1所述的来自基因组的45条完全氨氧化菌amoA基因序列一起使用Qiime2中的phylogeny插件构建系统发育树。
结果如图6所示，实验结果显示，扩增子代表序列与CladeA和CladeB两个分支的amoA基因参考序列聚类成簇，表明引物F1/R1能够准确地同时扩增两个分支的完全氨氧化菌amoA基因，验证了该引物的高特异性，也表明引物F1/R1适用于完全氨氧化菌amoA基因的扩增子高通量测序分析的试验要求。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种扩增完全氨氧化菌Comammox氨单加氧酶基因的引物，其特征在于为如下引物对中的至少一种：
F1：GACTGGGATTTCTGGNTNGAYTGG；
F2：TATMGGCAGCCATTYGGNGCRAC；
R1：ACCTCGATCATCCGGATRTAYTCNGG；
R2：GAMGAACTKCCCRAWYTGCCACCA；
以上引物两两组合配对，所得到的引物对F1/R1、F1/R2、F2/R1、F2/R2。
2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于：
所述的引物为简并引物。
3.根据权利要求1所述的引物，其特征在于：
所述的引物扩增得到的特异性条带长度为359～576bp。
4.根据权利要求1所述的引物，其特征在于：
所述的引物的核苷酸序列含有简并碱基，其中N指的是该位置的碱基为等比例的A、G、C和T，Y指的是该位置的碱基为等比例的C和T，R指的是该位置的碱基为等比例的A和G，M指的是该位置的碱基为等比例的A和C，K指的是该位置的碱基为等比例的G和T，W指的是该位置的碱基为等比例的A和T。
5.权利要求1～4任一所述的引物在完全氨氧化菌Comammox的检测和/或定量中的应用。
6.权利要求1～4任一所述的引物在完全氨氧化菌Comammox的扩增子高通量测序分析中的应用。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于：
所述的应用能够同时涵盖完全氨氧化菌Comammox的CladeA和CladeB两个进化分支。
8.一种检测完全氨氧化菌Comammox的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)提取待测样本的基因组DNA；
(2)使用权利要求1～4任一所述的扩增完全氨氧化菌Comammox氨单加氧酶基因的引物对样本的基因组DNA进行PCR扩增，并进行琼脂糖凝胶电泳，若扩增出对应条带，则证明样本中含有完全氨氧化菌Comammox。
9.一种对完全氨氧化菌Comammox定量的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)提取待测样本的基因组DNA；
(2)使用权利要求1～4任一所述的扩增完全氨氧化菌Comammox氨单加氧酶基因的引物对样本的基因组DNA进行PCR扩增，并进行琼脂糖凝胶电泳，切胶纯化回收扩增产物，构建质粒并克隆表达，提取该质粒测定核酸浓度并计算拷贝数浓度，然后进行梯度稀释；
(3)使用扩增完全氨氧化菌Comammox氨单加氧酶基因的引物对质粒进行荧光定量PCR扩增，建立质粒标准品拷贝数浓度与达到荧光域值时的循环数Ct值之间的标准曲线；
(4)使用扩增完全氨氧化菌Comammox氨单加氧酶基因的引物对样本的基因组DNA进行荧光定量PCR扩增，将结果代入上述标准曲线中，获得样本中完全氨氧化菌的数量。
10.一种通过高通量测序对完全氨氧化菌Comammox氨单加氧酶基因扩增子的多样性进行分析的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)提取待测样本的基因组DNA；
(2)使用权利要求1～4任一所述的扩增完全氨氧化菌Comammox氨单加氧酶基因的引物对样本的基因组DNA进行PCR扩增，并进行琼脂糖凝胶电泳，切胶纯化回收，得到扩增产物；
(3)对扩增产物进行高通量测序，并根据测序结果进行多样性分析。
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